CN105497051B - 一种降血糖的药物配方及其实验方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药行业技术领域，具体涉及一种降血糖的药物配方及其实验方法。一种降血糖的药物配方，由按浓度配比的以下原料制备而成：葛根素100mg/kg.d、大豆苷元25mg/kg.d、黄芩苷100mg/kg.d、黄芩素10mg/kg.d、小檗碱10mg/kg.d、甘草酸5mg/kg.d、甘草苷50mg/kg.d；一种验证降血糖药物配方的实验方法，包括如下实验步骤：1)建立大鼠高血糖模型；2)筛选分组；3)检测指标；4)分析对比和得出结论。本发明中的配方是经过严密的科学实验得来，具有很好的降低血糖、改善胰岛素抵抗的作用，能够为此类经典方剂的二次开发提供研究基础，有着极强的创新性。

Description

一种降血糖的药物配方及其实验方法
技术领域
本发明涉及医药行业技术领域，具体涉及一种降血糖的药物配方及其实验方法。
背景技术
临床和实验研究报道葛根芩连汤对糖尿病具有治疗作用，其中，葛根芩连汤内含有不同极性的黄酮、异黄酮类、生物碱类、皂苷类等大量化合物，完全获得这些物质并进行全面研究非常困难，究竟是哪些化合物在起作用也不清楚。我们根据相关文献，从葛根芩连汤中选取了7个活性较强的化合物：①来源于葛根的黄酮类：葛根素、大豆苷；②来源于黄芩的黄酮类：黄芩苷、黄芩素；③来源于黄连的生物碱：小檗碱；④来源于甘草的甘草酸、甘草苷，我们研究了7个化合物不同配比对高血糖模型大鼠的降糖以及改善胰岛素抵抗的作用，并与原方剂进行比对研究，发现了最佳降血糖化合物的构成和比例。
葛根芩连汤经过临床实践验证，对2型糖尿病和胰岛素抵抗有干预治疗作用，但复方汤剂缺乏对药效物质的微观分析和质量控制，影响临床疗效，本发明对葛根芩连汤的主要活性成分进行配比研究，发现并优化葛根芩连汤干预治疗2型糖尿病最佳有效组分配比，为此类经典方剂的二次开发提供研究基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种降血糖的药物配方及其实验方法。
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：一种降血糖的药物配方，所述药物配方包括葛根素、大豆苷元、黄芩苷、黄芩素、小檗碱、甘草酸、甘草苷七种药物，所述葛根素的剂量浓度为50-500mg/kg.d、大豆苷元的剂量浓度为10-100mg/kg.d、黄芩苷的剂量浓度为10-100mg/kg.d、黄芩素的剂量浓度为10-100mg/kg.d、小檗碱的剂量浓度为10-100mg/kg.d、甘草酸的剂量浓度为5-50mg/kg.d、甘草苷的剂量浓度为10-100mg/kg.d。
优选的，所述药物配方由如下配比浓度的原料药组成：葛根素100mg/kg.d、大豆苷元25mg/kg.d、黄芩苷的剂量浓度为100mg/kg.d、黄芩素的剂量浓度为10mg/kg.d、小檗碱的剂量浓度为10mg/kg.d、甘草酸的剂量浓度为5mg/kg.d、甘草苷的剂量浓度为50mg/kg.d。
一种验证降血糖药物配方的实验方法：包括如下实验步骤：1)建立大鼠高血糖模型；2)筛选分组；3)检测指标；4)分析对比和得出结论。
优选的，所述步骤1)中建立大鼠高血糖模型的大鼠数为110只，且都为雄性大鼠，上述110只雄性大鼠被随机的分为11组，每组10只。
优选的，所述步骤2)中筛选分组共分为十二个组，分别为按照葛根芩连汤各提取物组分配比的八个组合N1-N8、葛根芩连汤原方组N9、二甲双胍组N10、模型组N11、原有空白组N12。
优选的，所述步骤3)中检测的指标为体重、空腹血糖、餐后2h血糖、葡萄糖灌注率、血清胰岛素。
选择健康雄性8-9周龄SD大鼠140只，由第四军医大学动物实验中心提供，体重在280～300g之间，适应性喂养7天，按随机数字表法分为空白组和模型组，空白组10只，模型组130只，空白组喂食普通饲料，其中，普通饲料为常规的啮齿类动物饲料，成分为脂肪10％、蛋白22％、碳水化合物68％、盐0.5％，模型组喂食高脂高糖高胆固醇饲料，其中，高脂高糖高胆固醇饲料配方为：基础饲料73.8％、猪油10％、蔗糖5％、鸡蛋黄10％、胆固醇1％、胆盐0.2％，模型组和空白组均予以普通饮水，按上述条件连续喂养6周，每周测体重及空腹血糖，6周末测体重，禁食12小时后测空腹血糖、空腹血清胰岛素，计算胰岛素抵抗指数和胰岛素敏感指数，使用SPSS19.0统计软件进行数据分析，试验结果中计量资料用均数±标准差，多组之间比较采用单因素方差分析，两组比较采用t检验进行统计学处理，P＜0.05为差异具有显著性。
本发明的有益效果是：本发明中的配方是经过严密的科学实验得来，具有很好的降低血糖、改善胰岛素抵抗的作用，能够为此类经典方剂的二次开发提供研究基础，有着极强的创新性。
附图说明
图1为本发明中实验方法的步骤图；
图2为均匀实验设计图；
图3为均匀设计的优化方案图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
从图1可以看出本发明中的实验方案如下：
1.高血糖大鼠模型的建立
1.1实验动物分组及造模
健康雄性8-9周龄SD大鼠140只第四军医大学动物实验中心提供，体重在280～300g之间，适应性喂养7天，按随机数字表法分为空白组和模型组，空白组10只，模型组130只，空白组喂食普通饲料，模型组喂食高脂高糖高胆固醇饲料，模型组(RI)和空白组(Normol)均予以普通饮水，按上述条件连续喂养6周，每周测体重及空腹血糖，6周末测体重，禁食12小时后测空腹血糖，空腹血清胰岛素，计算胰岛素抵抗指数和胰岛素敏感指数。
1.2观察指标
1.2.1一般情况观察
观察各组大鼠精神、活动状态、毛发及动物死亡情况，每周用电子天平称量大鼠体重1次，记录并分析体重变化。
1.2.2血糖
给药第6周末，禁食12小时后，用血糖仪测尾静脉血糖。
1.2.3空腹血清胰岛素
用酶联免疫法(ELISA)测空腹血清胰岛素，造模第六周末，禁食12h后，10％水合氯醛腹腔注射麻醉，眶静脉丛采血，取抗凝血，4000r/min，离心5min，获得血浆。酶联免疫吸附法(Enzyme一linked immunosorbent assay，ELISA)测定空腹血清胰岛素(Fasting seruminsulin，FINS)含量。
1.2.4胰岛素抵抗指数
用HOMA模型公式：IRI＝GLU×INS÷22.5计算胰岛素抵抗指数。
1.2.5胰岛素敏感指数
测定空腹血糖(FPG)和空腹胰岛素(FINS)浓度后，进行计算:胰岛素敏感指数(ISI)＝Ln[1/(FPGxFINS)]
1.3实验仪器
ACS-30电子计价秤 永康市华鹰衡器有限公司
胰岛素测试试剂盒 北京北方生物技术研究所产品
KQ2200DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司
TGL-16M台式高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司
磁力加热搅拌器 常州国华电器有限公司
电热鼓风干燥机 上海一恒科学仪器有限公司
电子恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司
HH-S6型电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司
4℃冰箱 合肥美菱股份有限公司
胰岛素测试试剂盒 北京北方生物技术研究所产品
移液器20一200ul，100一1000ul 德国EPPendorf公司
三诺牌血糖仪 长沙三诺生物传感技术有限公司
1.4统计学处理
使用SPSS19.0统计软件进行数据分析，试验结果中计量资料用均数±标准差表示。多组之间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两组比较采用t检验进行统计学处理，P＜0.05为差异具有显著性。
1.5实验结果
一般情况造模过程中，对照组大鼠毛色光滑、柔顺，模型组大鼠活动量明显减少，精神萎靡，体毛无光泽，造模6周后，根据检测指标，剔除造模未成功和死亡的大鼠。两组动物体重比较，在第2-5周，两组体重均在稳步上升，模型组比空白组体重增长的更为迅速，但在第1周，第2周，两组体重比较，P>0.05，差异无统计学意义；动物饲养至第3周、第4周、5周，两组体重比较，P<0.05，差异有统计学意义，至第6周，两组体重比较，P<0.01，差异显著，有统计学意义，见表1。
表1给药前两组体重变化比较(单位：g)
注：与空白组比较*P<0.05,**P<0.01
造模第6周末，模型组的空腹血糖，空腹胰岛素，胰岛素抵抗指数均升高，与空白组比较，P<0.05，差异显著，有统计学意义，胰岛素敏感指数下降，P<0.05，与空白组比较，差异显著，有统计学意义，见表2和表3。
表2两组空腹血糖变化比较(单位：mmol/L)
注：与空白组比较*P<0.05,**P<0.01
表36周末两组胰岛素、胰岛素敏感指数、胰岛素抵抗指数比较
注：与空白组比较，*P<0.05，有统计学意义
2.葛根芩连汤组分对高血糖模型大鼠糖代谢的影响
2.1动物分组
将造模成功的110只SD雄性大鼠，根据体重编号按随机数字表法分为11组:葛根芩连汤各提取物组分配比的八个组合(N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8)，葛根芩连汤原方组(N9)、二甲双胍组(N10)、模型组(N11)。各组继续予以高脂高糖高胆固醇饲料，原有空白组(N12)继续予以普通饲料，共12组动物，每组各10只，均予以普通饮水。
2.2药物及试剂来源
葛根素(Pue)：西安辉煌植物科技有限公司，纯度:90％
大豆苷元：西安辉煌植物科技有限公司，纯度:90％
黄芩苷：西安辉煌植物科技有限公司，纯度:90％
黄芩素：西安辉煌植物科技有限公司，纯度:90％
小檗碱：西安辉煌植物科技有限公司，纯度:90％
甘草酸：西安辉煌植物科技有限公司，纯度:90％
甘草苷：西安辉煌植物科技有限公司，纯度:90％
葛根芩连汤：各味中药购自陕西中医药大学校医院。
胆固醇：平顶山市慧源生物制品有限公司
胆盐：平顶山市慧源生物制品有限公司
CMC(羧甲基纤维素钠):湖北新河原料有限公司
盐酸二甲双胍(Met):上海医药(集团)有限公司信谊制药总厂
10％葡萄糖注射液:华裕(无锡)制药有限公司
水合氯醛:中国医药集团上海化学试验公司
2.3药品、试剂的配置
葛根芩连汤中有效且活性较强的有以下7个化合物：①来源于葛根的黄酮类：葛根素、大豆苷；②来源于黄芩的黄酮类：黄芩苷、黄芩素；③来源于黄连的生物碱：小檗碱；④来源于甘草的甘草酸、甘草苷。浓度及配比方案如下：葛根素的四个剂量浓度为50，100，250，500(mg/kg)，大豆苷元10，25，50，100(mg/kg)，黄芩苷10，25，50，100(mg/kg)，黄芩素10，25，50，100(mg/kg)，小檗碱10，25，50，100(mg/kg)，甘草酸10，25，50，100(mg/kg)，甘草苷10，25，50，100(mg/kg)。按照均匀设计原则，将葛根芩连汤的七个有效成分，参照每个成分四个浓度范围，原则上水平数应大于因素数，故采用DPS数据处理***，按照7个因素8个水平进行均匀设计，根据均匀设计方案得出优化的方案，如图2和图3所示。
根据葛根芩连汤各药物提取物的七个成分，四个浓度范围，N1-N8组成分配比如下表4：
表4葛根芩连汤各组分配伍浓度表(单位：mg/kg·d)
N9：葛根芩连汤原方组(葛根：黄芩：黄连：甘草)：葛根芩连汤，9.0(4.5：1.69：1.69：1.12)g/kg·d，将葛根芩连汤90(45：16.9：16.9：11.2)g的各味中药，分别加水浸泡20min，先煎葛根，加热回流20min，再加入其余药，加热回流30min，后将药液倒出，加入水二次回流30min，合并药液，将汤药浓缩至100ml(按照10ml/kg·d浓缩中药)，备用。
N10：二甲双胍组，200mg/kg·d.按照10ml/kg·d配置二甲双胍溶液，将二甲双胍片2000mg，加5‰羧甲基纤维素钠(CMC)溶液至100ml，搅拌均匀。
N11：5g/L的羧甲基纤维素钠溶液，10ml/kg灌胃。
N12：5g/L的羧甲基纤维素钠溶液，10ml/kg灌胃。
5‰的羧甲基纤维素钠溶液的配制：将5g羧甲基纤维素钠缓慢加入至1000ml纯净水中，边加边用玻璃棒搅拌，使羧甲基纤维素钠充分溶解，静置1天后使用。
10％水合氯醛的配制：称取10克水合氯醛，用纯净水溶解，再用纯净水稀释到100毫升。
2.4检测指标
2.4.1一般情况观察大鼠的食欲，体重，行为，毛发及死亡情况，实验结束时各大鼠称重后麻醉动物。
2.4.2空腹血葡萄糖(FPG)及餐后2h葡萄糖(PG-2h)动物禁食12h后，剪尾取血，用血糖仪测空腹血糖，测完后，以25％葡萄糖水按2.5g/kg剂量灌胃，用血糖仪测餐后(2h)血糖。
2.4.3空腹血清胰岛素
用酶联免疫法(ELISA)测空腹血清胰岛素，造模第六周末，禁食12h后，10％水合氯醛腹腔注射麻醉，眶静脉丛采血，取抗凝血，4000r/min，离心5min，获得血浆。酶联免疫吸附法(Enzyme一linked immunosorbent assay，ELISA)测定空腹血清胰岛素(Fasting seruminsulin，FINS)含量。
2.4.4葡萄糖输注率(GIR)采用正糖钳技术[28]，大鼠禁食不禁水12h后，称重，以10％水合氯醛溶液(0.3ml/100g)腹腔麻醉。将大鼠仰位固定于手术台上，保持体温在37℃左右，剪开右颈部皮肤，手术分离右颈外静脉，结扎远心端，切口，向近心端方向***胶管(管中预先注入5U/ml肝素生理盐水溶液)，结扎固定插管。从此插管中按0.lml/l00g体重注入1000u/ml肝素生理盐水溶液抗凝，封住插管。另剪开左颈部(近中线)皮肤，分离出左侧颈总动脉，结扎远心端，用动脉夹夹住近心端，切口，往近心端方向***胶管，结扎固定插管，开放动脉夹。
取一小三通，出口端与静脉插管相连，一进口端与输注胰岛素的恒流泵相接，另一进口端与蠕动泵相连接，蠕动泵的进口端连接盛有10％葡萄糖溶液的微量滴定管，待插管手术和输注装置安装完毕，开始实验。测定基础血糖值(BBG)后，从静脉以每分钟4mu/kg恒速输注胰岛素溶液(用生理盐水配置，胰岛素的浓度根据大鼠体重调整)，同时输注10％葡萄糖溶液，每隔5min从动脉取血，用血糖仪测定血糖，根据血糖值调节GIR以维持血糖水平在BBG士0.5mmol/L的范围内，当连续3次血糖值均在上述范围时，即达到稳定状态，记录稳态下最后6次GIR的平均值用于统计对照。
2.5实验结果
2.5.1一般情况给药28天后，各组大鼠正常活动、进食和饮水，无食量减少，模型组(N11组)动物体重增长明显快于空白对照组(N12组)，动物毛色加深，行动反应迟缓，出现明显的肥胖。各组体重变化如下表5：
表5各组体重变化比较(单位：g)
注：与N11组比较*P<0.05,**P<0.01
第6周末(给药前)，各组体重比较，N1至N10组各组间比较，P>0.05，各组间比较无差异，无统计学意义，N1至N10组与N11组(模型组)比较，P<0.05，有显著差异，说明给药前，高糖动物模型分组均衡性好，给药治疗后，各组体重数据的差异主要由药物因素引起。给药治疗28天后，N1组至N10组体重均有降低，与N11组(模型组)比较有明显差异，P<0.05，各组体重组间比较无明显差异(P>0.05)。
2.5.2对空腹血糖和餐后2h血糖的影响
表6各组空腹血糖(单位：mmol/L)
注：*与N11(模型组)比较，P<0.05，**与N11(模型组)比较，P<0.01。
表7各组餐后2h血糖(单位：mmol/L)
注：*与N11(模型组)比较，P<0.05，**与N11(模型组)比较，P<0.01。
实验结果表明：N11组空腹血糖升高，与N12组比较，有极显著性差异(P<0.01)；N1至N10各组与N11比较，均有显著性差异(P<0.05)；N1至N10组各组与N12组比较，无显著性差异(P>0.05)；N1至N10各组间比较，N4组降低空腹血糖疗效优于其他各组，其次是N3组，N9组、N10组疗效优于其他各组(P<0.05)。
各组灌糖后2h血糖比较，N11组2hPh高于N12组，有极显著差异(P<0.01)，N1至N10各组与N11(模型组)比较，均有显著性差异(P<0.05)；各治疗组与空白组比较，无显著性差异；N1至N10各组间比较，以N4组在降低餐后血糖疗效优于其他各组，其次是N3组，N9组、N10组疗效优于其他各组(P<0.05)。
2.5.3对葡萄糖输注率和胰岛素的影响
对葡萄糖输注率和胰岛素的影响详见表8和表9。
表8各组血清胰岛素水平(mmol/L)
注：*与N11(模型组)比较，P<0.05，**与N11(模型组)比较，P<0.01。
表9各组葡萄糖输注率(ul/min)
注：*与N11(模型组)比较，*P<0.05，#与N3(模型组)比较，#P<0.05，Δ与N1、N2组比较，ΔP<0.05。
表5-表9的数据对比可以得出，最佳的降血糖药物的配方为按浓度配比葛根素100mg/kg.d、大豆苷元25mg/kg.d、黄芩苷100mg/kg.d、黄芩素10mg/kg.d、小檗碱10mg/kg.d、甘草酸5mg/kg.d、甘草苷50mg/kg.d。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种降血糖的药物，其特征在于，由葛根素、大豆苷元、黄芩苷、 黄芩素、小檗碱、甘草酸、甘草苷七种药物组成，所述七种药物的重量配比为：葛根素：大豆苷元：黄芩苷：黄芩素：小檗碱：甘草酸：甘草苷=100:25:100:10:10:5:50。
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