CN103667524B - 一种用于新城疫病毒class I检测的荧光定量RT-PCR试剂盒及其应用 - Google Patents

一种用于新城疫病毒class I检测的荧光定量RT-PCR试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN103667524B
CN103667524B CN201310598236.5A CN201310598236A CN103667524B CN 103667524 B CN103667524 B CN 103667524B CN 201310598236 A CN201310598236 A CN 201310598236A CN 103667524 B CN103667524 B CN 103667524B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pcr kit
fluorescent quantitative
detection
class
pcr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201310598236.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103667524A (zh
Inventor
曹军平
刘秀梵
王晓泉
刘晓文
朱爱萍
程汉
赵旭庭
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201310598236.5A priority Critical patent/CN103667524B/zh
Publication of CN103667524A publication Critical patent/CN103667524A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103667524B publication Critical patent/CN103667524B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于分析检测领域，涉及一种用于新城疫病毒class I检测的荧光定量RT-PCR试剂盒及其应用。一种用于新城疫病毒class I检测的实时荧光定量RT-PCR试剂盒，包含：上游引物CNPIF：SEQ ID NO.1,下游引物CNPIR：SEQ ID NO.2,以及TaqMan探针CNPIP：5′-JOE-CGGATGAAAGGGGAGAATGCC-TAMRA-3′。本发明选取Class I NP基因保守区设计引物和探针，首次报告建立了一种新的基于NP基因的检测新城疫病毒class I的RRT–PCR试剂盒以及方法，具有高灵敏度、高特异性、搞重复性的优点。

Description

一种用于新城疫病毒class I检测的荧光定量RT-PCR试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于分析检测领域，涉及一种用于新城疫病毒class I检测的荧光定量RT-PCR试剂盒及其应用。
背景技术
新城疫(Newcastle disease,ND)是唯一分布五大洲的O IE A类传染病,我国ND疫情十分严重,仍然是养鸡业发展最直接的威胁[1]，可对家禽生产造成严重损失[2]。
新城疫病毒(NDV)，是新城疫的病原，属禽副粘病毒1型（AMPV-1），有囊膜，基因组为单股负链RNA，大小约15kb，编码6种蛋白质，包括RNA聚合酶（L），血凝素-神经氨酸酶蛋白（HN），融合蛋白（F），基质蛋白（M），磷蛋白（P）和核蛋白（N）。新城疫病毒分离株根据对鸡致病严重程度可分为三个主要致病型（毒力型）[2]：Lentogenic株是低致病力型，可造成鸡轻微呼吸道或肠道感染；Mesogenic株是中等致病力型，主要引起呼吸***疾病；Velogenic株是高致病力型，造成高死亡率，基于病理表现被进一步分为嗜神经或嗜内脏型。高毒力型NDV属于必须报告的O IE A类传染病，它的发生可导致检疫和贸易禁运。NDV只有一个血清型,但是分为2类:class I、class I I,绝大多数常见的都是class II,可分成I-IV10个基因型。class II与class I核酸差异较大。
目前，用鸡胚进行病毒分离，然后用新城疫特异性抗体做血凝抑制试验代表病毒检测的参考标准[3]。虽然病毒分离是一个敏感和特异性的方法，但由于NDV毒力差异大,低毒和无毒株普遍存在,加之弱毒疫苗的普遍使用,对分离毒株血凝抑制试验结果必须结合毒力鉴定才能确诊,一般需要数天才能完成[1]。
将荧光定量RT-PCR应用于新城疫病毒的检测已有报道。Mark G.Wise等「2」建立了RRT-PCR技术检测鸟类临床标本新城疫病毒。检测采用单管水解探针，引物和探针根据M基因保守区序列设计，可检测到大约1000拷贝病毒基因组RNA和10EID50病毒。Beate M.Crossley等「7」建立了高通量的检测外来NDV的RRT-PCR方法。L.Mia Kim等「8」建立了新城疫病毒L基因基础上的RRT-PCR技术，对Mark G.Wise等建立的新城疫病毒M基因RRT–PCR是一个有力的补充。但目前尚未有有关新城疫病毒NP基因RRT–PCR检测的相关报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种用于新城疫病毒class I检测的RT-PCR试剂盒。
本发明的另一目的是提供该试剂盒的应用。
本发明的又一目的是提供一种实时荧光定量检测新城疫病毒class I的方法。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种用于新城疫病毒class I检测的实时荧光定量RT-PCR试剂盒，包含：上游引物CNPIF：5′-CCTCAACTTATTACAACCTC-3′（SEQ ID NO.1）,下游引物CNPIR：5′-TACAGATGCCATACCCATTGC-3′（SEQ ID NO.2）,以及TaqMan探针CNPIP：5′-JOE-CGGATGAAAGGGGAGAATGCC-TAMRA-3′（SEQ ID NO.3）。
所述的试剂盒还包含102、103、104、105、106、107、108拷贝/μL的NP基因阳性质粒作为标准品模板。
所述的NP基因阳性质粒是以pGEM-T载体为出发载体，在其EcoR V位点***序列如SEQ IDNO.4所示的NP基因所得
所述的试剂盒还包含～TaqMan Universal PCR Master Mix Kit为美国ABI公司产品。
本发明所述的试剂盒在实时荧光定量检测新城疫病毒class I中的应用。
一种实时荧光定量检测新城疫病毒class I的方法，将标准品模板和待测样品DNA模板以及分别置于各自的反应体系中，并同时置入PCR仪进行扩增，扩增完毕后由PCR仪自动得出检测结果，其中
进入PCR仪的标准品模板的反应体系为25μl：其中ABI TaqMan Universal PCR Master Mix加入量为12.5μl,模板加入量为3μl，上游引物和下游引物在体系中的终浓度均为0.5μmol/L,探针在体系中的终浓度为0.5μmol/L，其余为无菌去离子水；
进入PCR仪的待测样品DNA模板的反应体系为25μl：其中ABI TaqMan Universal PCR MasterMix加入量为12.5μl,模板加入量为3μl，上游引物和下游引物在体系中的终浓度均为0.5μmol/L,探针在体系中的终浓度为0.5μmol/L，其余为无菌去离子水；
其中所述的上游引物CNPIF：5′-CCTCAACTTATTACAACCTC-3′（SEQ ID NO.1）,下游引物CNPIR：5′-TACAGATGCCATACCCATTGC-3′（SEQ ID NO.2）,以及TaqMan探针CNPIP：5′-JOE-CGGATGAAAGGGGAGAATGCC-TAMRA-3′（SEQ ID NO.3）；
PCR仪中的反应程序为：95℃预变性10min,然后95℃15s,60℃1min43个循环；荧光信号的收集及数据的采集定在60℃。检测结束,根据噪音情况设定和调整基线及阈值,并利用随机软件进行分析,建立标准曲线，根据荧光曲线和Ct值判断结果。
有益效果：
本发明基于NP基因相对比F基因更保守。Class I分离株NP基因之间氨基酸序列的同源性在93.0%-99.5%之间，Class I毒株与Class II毒株NP蛋白同源性在88.2%-92.5%之间；选取Class I NP基因保守区设计引物和探针，首次报告建立了一种新的基于NP基因的检测新城疫病毒class I的RRT–PCR试剂盒以及方法，具有高灵敏度、高特异性、搞重复性的优点。本发明方法对Mark G.Wise等建立的新城疫病毒M基因RRT–PCR也是一个重要的补充。这两个方法结合可以快速检测所有class I和class II新城疫病毒并初步分群。随着NDV分子生物学研究的不断深入,NDV基因序列及功能得到不断的揭示,ND分子生物学检测技术将得到进一步的补充和完善。
附图说明
图1荧光定量RT-PCR扩增动力学曲线
图中，从左至右依次为稀释度102～108的NP基因克隆阳性质粒的扩增曲线。
图2RRT-PCR标准曲线
具体实施方式
实施例1NP基因阳性质粒的构建
化学合成SEQ ID NO.4所示的NP基因511-1274bp获得目的片段,纯化后TA克隆连接到pGEM‐T载体(Promega公司产品)上，转化至E.coli DH5α中，小提质粒，经PCR和酶切鉴定，挑取阳性克隆经测序验证后，抽提纯化质粒DNA，测其核酸浓度，计算出拷贝数，以此作为荧光定量RT-PCR质粒标准品。SEQ ID NO.4所示的NP基因511-1274bp片段也可通过PCR方式扩增得到，以新城疫病毒JS‐10‐06株基因组为模板，经RT-PCR扩增得到。
实施例2
根据GenBank上5株class I NDV NP基因序列，结合本实验室分离鉴定测序的8株classI NDV NP基因序列（表1），选取保守区（靠近5′端）设计引物。采用LASERGENE软件包(DNASTARInc.,Madison,WI,USA)和Primer Premier5.0软件(Premier Biosoft International,PaloAlto,CA)设计和分析引物，合成NDV的1对特异引物及相应的探针，并在NCBI上进行了BLAST比对验证。扩增片段位于NDV class I国际标准分离株DE-R49-99NP基因的800-1086bp,长度为287bp,探针位于NP基因970-990bp，上、下游引物及探针如下所示：
CNPIF：5′-CCTCAACTTATTACAACCTC-3′(SEQ ID NO.1),（800-819bp）
CNPIR：5′-TACAGATGCCATACCCATTGC-3′(SEQ ID NO.2),（1066-1086bp）
Probe：(JOE)5′-CGGATGAAAGGGGAGAATGCC-3′(TAMRA)(SEQ ID NO.3)（970-990bp）;
探针为TaqMan探针,5′端标记的荧光报告基团是JOE,3′端标记的荧光淬灭基团为TAMRA，探针命名为:CNPIP。引物由上海生工有限公司合成,探针由大连宝生物工程有限公司合成。
表1本实验所用NDV标准参考分离株及其它禽病毒株
aL,弱毒;M,中等毒力;V,强毒.NA,不可用.
实施例3
标准品模板的稀释用紫外分光光度计分别测定NP基因阳性重组质粒在260和280nm处的吸光度,并根据公式计算重组质粒的DNA浓度与纯度。将重组质粒进行10倍梯度稀释,以102、103、104、105、106、107、108拷贝/μL作为标准品模板,利用实施例2设计合成的引物对以及探针进行实时荧光定量RT-PCR，RRT-PCR反应体系为：12.5μl ABI TaqManUniversal PCR Master Mix,0.5μmol/L（体系中的终浓度）上游引物,0.5μmol/L（体系中的终浓度）下游引物,0.5μmol/L（体系中的终浓度）探针,模板3μl,加无菌去离子水至反应总体积25μl；反应程序为95℃预变性10m in,然后95℃15s,60℃1min43个循环。利用随机软件进行分析,建立标准曲线，***自动分析软件显示Ct值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系(图1和2)。从图1可见,当标准质粒（NP基因阳性重组质粒）浓度≥1.0copies/μl时仍可出现典型扩增曲线。从图2可见,在较广的范围内(1.0×102-1.0×108copies/μl)C t值与质粒拷贝数的对数之间呈现很好的线性关系,相关系数R2=0.99。将其检测限的Ct值通过标准曲线换算成拷贝数约为1copy/μl,相当于1个NDV颗粒。
分子拷贝数(个/mL)=DNA质量浓度/DNA分子量
DNA分子量=DNA碱基数×324.5
DNA质量浓度=260nm吸光度×50μg/mL×稀释倍数×6.02×1023
实施例4
特异性试验
以AIV、EDS76、IBDV、IBV、ILTV、FPV等常见其它禽病病毒及NDV class II核酸（表1）和健康鸡组织RNA、水为模板,进行荧光定量PCR，反应体系及反应程序同实施例3。结果AIV、EDS76、IBDV、IBV、ILTV、FPV等常见其它禽病病毒及NDV class II核酸、健康鸡组织RNA、水显示没有发现有效扩增。而NDV class I光信号明显。
重复性试验
批内重复性试验:分别取等量的3份不同滴度(102、104、106拷贝/μL)的重组质粒进行荧光定量PCR检测,每份样品做5个重复；批间重复性试验:取以上3份样品,在同一反应条件下进行5次独立的荧光定量PCR检测。结果，批内变异系数CV为0.43%—0.99%,批间变异系数为0.95%—1.39%，表明误差都非常小,扩增效率稳定。数据见表2和表3。
表2用荧光定量RT-PCR检测3份不同病毒含量标准品的批内和批间重复检测结果
表3用荧光定量RT-PCR检测3份不同病毒含量标准品的批间重复检测结果
实施例5
用表1中所列毒株接种SPF鸡胚,收集尿囊液进行血凝试验[1](Hemagglutination test,HA)和NDV血凝抑制试验[1](Hemagglutination inhibition test,HI),同时用样品做RRT-PCR试验，计算2种方法的符合率。RRT-PCR与病毒分离结果见表1,可见2种方法检测33株NDV符合率为100.0%。
参考文献
[1]殷震，刘景华.动物病毒学，第二版.北京:科学出版社，1997，329‐330。

Claims (4)

1.一种用于新城疫病毒class I检测的实时荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于包含：上游引物CNPIF：SEQ ID NO.1, 下游引物CNPIR：SEQ ID NO.2,以及TaqMan探针CNPIP：5′- JOE-CGGATGAAAGGGGAGAATGCC- TAMRA -3′。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还包含102 、103 、104 、105 、106、107、108拷贝/μL 的NP基因阳性质粒作为标准品模板。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的NP基因阳性质粒是以pGEM-T载体为出发载体，在其EcoR V位点***序列如SEQ ID NO.4所示的NP基因所得。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还包含TaqMan Universal PCR Master Mix Kit 为美国ABI 公司产品。
CN201310598236.5A 2013-11-22 2013-11-22 一种用于新城疫病毒class I检测的荧光定量RT-PCR试剂盒及其应用 Expired - Fee Related CN103667524B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310598236.5A CN103667524B (zh) 2013-11-22 2013-11-22 一种用于新城疫病毒class I检测的荧光定量RT-PCR试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310598236.5A CN103667524B (zh) 2013-11-22 2013-11-22 一种用于新城疫病毒class I检测的荧光定量RT-PCR试剂盒及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103667524A CN103667524A (zh) 2014-03-26
CN103667524B true CN103667524B (zh) 2015-06-10

Family

ID=50306294

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310598236.5A Expired - Fee Related CN103667524B (zh) 2013-11-22 2013-11-22 一种用于新城疫病毒class I检测的荧光定量RT-PCR试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103667524B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108531652A (zh) * 2018-04-20 2018-09-14 山东省农业科学院家禽研究所（山东省无特定病原鸡研究中心） 一种水禽重要疫病定量检测标准品的制备方法及应用
CN111118212B (zh) * 2020-01-07 2023-11-14 河北农业大学 检测新城疫病毒的引物和探针组合以及试剂盒和检测方法
CN112458182A (zh) * 2020-11-27 2021-03-09 扬州大学 实时荧光绝对定量检测家禽cGAS蛋白的试剂盒、检测方法及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101798602B (zh) * 2010-03-18 2012-04-25 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 复合检测禽流感和新城疫病毒的试剂盒及检验方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101798602B (zh) * 2010-03-18 2012-04-25 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 复合检测禽流感和新城疫病毒的试剂盒及检验方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Class I新城疫病毒核衣壳蛋白在体外细胞感染过程中表达定位的检测;孙英杰等;《中国预防兽医学报》;20110228;第33卷(第2期);第85-88页 *
Real-time PCR-based Pathotyping of Newcastle Disease Virus by Use of TaqMan Minor Groove Binder Probes;T.Farkas;《Journal of Clinical Microbiology》;20090731;第47卷(第7期);第2114-2123页 *
吴艳涛等.新城疫病毒F48E8株核衣壳蛋白基因的序列分析.《扬州大学学报(自然科学版)》.2008,第3卷(第3期),第28-30页. *
基于M基因的新城疫病毒实时荧光定量RT-PCR的建立及其对临床样本中新城疫病毒检测的研究;曹军平等;《畜牧兽医学报》;20091231;第40卷(第7期);第1120-1125页 *
荧光定量RT-PCR检测中、强毒力新城疫病毒方法的建立及验证;曹军平等;《中国动物检疫》;20121231;第29卷(第4期);第32-36页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103667524A (zh) 2014-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Creelan et al. Detection and differentiation of pathogenicity of avian paramyxovirus serotype 1 from field cases using one-step reverse transcriptase-polymerase chain reaction
Pham et al. Rapid detection and differentiation of Newcastle disease virus by real-time PCR with melting-curve analysis
CN107299155A (zh) 一种鹅星状病毒实时荧光定量pcr检测的引物和探针
Wang et al. Differentiation of canine distemper virus isolates in fur animals from various vaccine strains by reverse transcription-polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism according to phylogenetic relations in china
CN106811551A (zh) 荧光定量PCR检测FAdV‑4型禽腺病毒的引物对、探针、试剂盒及方法
AU2005252615A1 (en) Diagnostics primers and method for detecting avian influenza virus subtype H5 and H5N1
CN105039323A (zh) 一种人感染h7n9禽流感病毒全基因组序列及其制备方法和用途
Alvarado et al. Molecular characterization of avian infectious bronchitis virus strains isolated in Colombia during 2003
De Battisti et al. Rapid pathotyping of Newcastle Disease Virus by pyrosequencing
CN103667524B (zh) 一种用于新城疫病毒class I检测的荧光定量RT-PCR试剂盒及其应用
CN113564280A (zh) 一种用于检测禽腺病毒i群12个血清型的raa引物及其检测方法
CN105002298B (zh) 一种鲤春病毒血症病毒的荧光定量pcr检测方法
Nidzworski et al. Detection and differentiation of Newcastle disease virus and influenza virus by using duplex real-time PCR
CN111926113B (zh) 一种用于快速检测禽呼肠孤病毒的引物组和探针、试剂盒及方法
CN110343784A (zh) 基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的组合物及试剂盒
Steyer et al. A diagnostic method based on MGB probes for rapid detection and simultaneous differentiation between virulent and vaccine strains of avian paramyxovirus type 1
Istimewa Molecular pathotyping of Newcastle disease virus from naturally infected chickens by RT-PCR and RFLP methods
CN105950785A (zh) 禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的三重荧光rt-pcr检测试剂盒及引物、探针
CN101487061B (zh) A型流感病毒流行毒株检测和分型基因芯片及使用方法
KR102231338B1 (ko) 조류인플루엔자, 뉴캐슬병 및 닭전염성 기관지염 바이러스를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 조류인플루엔자, 뉴캐슬병 및 닭전염성 기관지염 바이러스의 검출 방법
CN113249517A (zh) 一种牛疫病实时荧光定量pcr检测用引物和探针及试剂盒
CN108998575B (zh) 鸡细小病毒和鸡新城疫病毒二重pcr检测方法的建立
CN105525038A (zh) 新城疫病毒强、弱毒一步法实时荧光rt-pcr检测试剂盒
CN108842000A (zh) 用于鉴别DAdV-3和DAdV-A的引物组
CN114381551A (zh) 一种用于检测大口黑鲈虹彩病毒的实时荧光raa引物、探针及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20150610

Termination date: 20151122

EXPY Termination of patent right or utility model