CN105481950B - 一种达托霉素提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗生素生产技术领域，具体涉及一种达托霉素提取方法。包括如下步骤：步骤(1)将达托霉素发酵液进行陶瓷膜过滤；步骤(2)将过滤液过大孔吸附树脂收集洗脱液；步骤(3)将所得的洗脱液调上NM‑Q阴离子交换树脂洗脱，收集洗脱液；步骤(4)将步骤(3)所得洗脱液过反相硅胶NMsil‑C18柱，用醋酸铵乙醇溶液梯度洗脱柱子，收集洗脱液；步骤(5)将步骤(4)所得的达托霉素洗脱液浓缩，加入乙酸钙和异丙醇，放置，析晶，抽滤，烘干得达托霉素结晶粉。本发明的有益效果在于：本发明的达托霉素提取方法不使用剧毒性的乙腈溶液作为洗脱液，减少对环境和生产人员健康压力，并且酸碱调节试剂使用减少，降低了生产成本。

Description

一种达托霉素提取方法

技术领域

本发明涉及抗生素生产技术领域，具体涉及一种达托霉素提取方法。

背景技术

病原菌对抗生素产生耐药性是当今全球面临的严峻挑战之一，寻找能有效抑制抗药菌的抗生素是解决这一问题的根本途径。万古霉素，曾被认为是抗革兰氏阳性菌的最后一道防线，然而全世界范围内临床上发现了越来越多的耐此药菌。

达托霉素是一类称为环酯肽类新抗生素家族的第一个产品。它是从小链霉菌(Streptomyces parvus)发酵液当中提取得到的十三个氨基酸组成的结构新颖的环脂肽类抗生素，其中十个氨基酸构成环状结构，在环外癸酸和色氨酸发生酯化。它不仅具有新颖的化学结构，且其作用模式也与任一已获准抗生素不同。它能在多个方面破坏细菌细胞膜功能，由此迅速杀死革兰阳性菌。达托霉素除能作用于大多数临床相关革兰阳性菌外，更重要的是在体外对已呈甲氧西林(methicillin)、万古霉素和利奈唑胺等耐药性分离菌株仍具强力活性。

达托霉素(Daptomycin)被公认为在万古霉素之后的最佳备用抗生素，是美国礼莱公司20世纪80年代发现的新型脂肽类抗生素，对MRSA(耐甲西林金黄葡萄球菌)有明显的抑制作用，除抗MRSA之外，达托霉素还对绝大多数的革兰氏阳性菌有抑制作用。据报道，达托霉素对2002～2005年从美国和加拿大各医院收集的19615株临床革兰氏阳性菌中的99％存在抑制作用。自从2003年9月FDA首次批准Cubicin(Daptomycin注射剂)用于治疗复杂皮肤和皮肤结构感染以来，达托霉素在临床上应用越来越多，市场上对达托霉素的需求量越来越大。

但是达托霉素为发酵产物，通过发酵培养得到的发酵滤液，发酵过程中会产生大量的色素及与达托霉素结构相近似的副产物如脱水达托霉素，因此达托霉素的提取纯化方法较复杂。一般达托霉素产生菌，生产能力不稳定，产量较低，发酵副产物较多，杂质较多，导致后提取工作较为复杂，大大地增加了后序的提纯难度，难以获得高纯度的最终产物，从而无法产业化生产。

目前美国cubist制药公司掌握达托霉素的全球独家开发、生产及销售权，国内也有很多家机构正在研究中，但是适用于工业化生产、产能的制备高纯度达托霉素的有效技术还比较缺乏。

公开号为CN1404487A的中国发明专利中，使用正丁醇和水从发酵液中萃取达托霉素，萃取完毕通过HP-20柱，乙腈水溶液洗涤解析，洗脱液Poro D50阴离子交换树脂解析。其中萃取步骤操作较难，发酵液颜色较深，分层无法分辨，萃取的收率较低；而HP-20柱的洗脱液为剧毒的乙腈溶液，另外Poros D50阴离子交换树脂，国内没有该种类树脂且无相近似树脂，国外的价格很高，从生产成本角度而言，乙腈溶液和Poros D50阴离子交换树脂无法工业化。

公开号为CN103724400A、CN102229651A的发明专利等都沿用了CN1404487A中使用乙腈溶液作为洗脱液，生产过程中毒性太大，而公开号为CN102924572A的中国发明专利中虽然摒弃了乙腈溶液，但是还是使用毒性大的甲醇作为洗脱液，皆不利于环境安全和生产人员健康，不适合应用于大生产。

公开号为CN101830970A的中国发明专利公开了运用一种反相硅胶材料把粗品精制成高纯度的达托霉素。该方法仅是达托霉素粗品的精制，而没有公开如何从发酵液制得成品；该方法采用缓冲溶液和达托霉素粗品混合液为上样液，以复合型YT-01反相硅胶填料为层析介质，以强极性的水溶液为洗脱液，得到色谱纯度大于98％的达托霉素。但是硅胶基质不能耐碱性，这限制了它的应用范围。

公开号为CN102276696A的中国发明专利公开了一种达托霉素的纯化方法，将半纯化的达托霉素用葡聚糖凝胶DEAE Sephadex A-25或琼脂糖凝胶DEAE Sepharose FastFlow纯化，得到达托霉素的纯度高于98％，但是该方法中使用的分离介质为多糖骨架，骨架较软，不可耐高压；而且，葡聚糖凝胶DEAE Sephadex A-25在不同盐浓度下床体积会发生非常明显的变化，并且在该专利中使用了乙腈溶液作为洗脱液，这些在工业应用上有很大的局限。

文献资料《达托霉素发酵液大孔树脂吸附分离的研究》(中国抗生素杂志2008年2月第33卷第2期)介绍了达托霉素发酵液运用大孔树脂富集的方法。这份文献公开的达托霉素的提取纯化方法存在操作步骤复杂，发酵液色素和杂质难去除，最终产品色泽深和纯度不高等问题，而且，不同菌种发酵产生的不同发酵液不一定能用相同的提取方法。

因此寻找更有效的脱色方法和更简便的提取纯化方法，才有可能实现达托霉素的工业化生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种环境友好、成本低的达托霉素的提取方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：提供一种达托霉素提取方法，包括如下步骤：

步骤(1)将达托霉素发酵液进行陶瓷膜过滤，收集过滤液；

步骤(2)将步骤(1)所得过滤液过大孔吸附树脂HZ801柱吸附，吸附完后水洗至漏出液接近无色，用乙醇洗脱树脂收集得到达托霉素单位大于100mg/L的洗脱液；

步骤(3)将步骤(2)所得的洗脱液调PH至4.0-8.0，上NM-Q阴离子交换树脂，纯化水顶洗后，用氯化钠溶液梯度洗脱，收集纯度大于90％的达托霉素洗脱液；

步骤(4)将步骤(3)所得的达托霉素洗脱液过反相硅胶NMsil-C18柱，调其PH至4.0-8.0，流速0.5-6BV/h上柱，用10-300mmol/L醋酸铵乙醇溶液梯度洗脱柱子，收集得到纯度大于97％达托霉素洗脱液；

步骤(5)将步骤(4)所得的达托霉素洗脱液浓缩到达托霉素浓度为20000-80000mg/L得浓缩液，加入浓缩液的达托霉素质量的10％-90％的乙酸钙，浓缩液体积50％-90％的异丙醇，放置36-48h，析晶，抽滤，烘干得达托霉素结晶粉。

优选的，上述的达托霉素提取方法中，所述步骤(1)具体为：将达托霉素发酵液进行陶瓷膜过滤，浓缩至体积一半后，边加水顶洗边过滤，保持加水量和过滤流量一致，持续至总滤液体积为发酵液体积的2-5倍量时，停止过滤，收集过滤液。

优选的，上述的达托霉素提取方法中，所述步骤(2)具体为：将步骤(1)所得过滤液过大孔吸附树脂HZ801柱吸附，流速0.8BV/h，吸附完后水洗至漏出液接近无色，先用体积百分数为20％乙醇溶液预洗，再用体积百分数为60％乙醇溶液进行洗脱树脂收集得到达托霉素单位大于100mg/L的洗脱液。

优选的，上述的达托霉素提取方法中，所述步骤(3)中“用氯化钠溶液梯度洗脱”具体为：依次用25mM氯化钠溶液，50mM氯化钠溶液，60mM氯化钠溶液，90mM氯化钠溶液进行梯度洗脱。

优选的，上述的达托霉素提取方法中，所述步骤(3)中“用氯化钠溶液梯度洗脱”具体为：以5BV/h流速先用25mmol/L氯化钠溶液冲洗10BV除杂质，然后用50mmol/L氯化钠溶液冲洗6BV并收集被洗脱下的达托霉素，用60mmol/L氯化钠溶液冲洗15BV，收集被洗脱下来的达托霉素，最后用90mmol/L氯化钠溶液冲洗6BV。

优选的，上述的达托霉素提取方法中，所述步骤(4)中“用10-300mmol/L醋酸铵乙醇溶液梯度洗脱柱子”具体为：先用含乙醇体积分数为20％的乙醇-20mmol/L醋酸铵溶液预洗1BV，再用含乙醇体积分数为38％乙醇-20mmol/L醋酸铵溶液洗脱。

优选的，上述的达托霉素提取方法中，步骤(5)中“将步骤(4)所得的达托霉素洗脱液浓缩到达托霉素浓度为20000-80000mg/L”具体为：将步骤(4)所得的达托霉素洗脱液浓缩到单位50000mg/L，调其PH到4.8。

优选的，上述的达托霉素提取方法中，还包括步骤(6)：将步骤(5)所得达托霉素结晶粉溶解于水中，过HZ016树脂脱盐，洗脱液按1/10倍量加入活性炭脱色除内毒素，过滤，滤液加入10倍量的异丙醇进行沉淀，将所得达托霉素沉淀粉进行沸腾干燥得到达托霉素成品。其中，步骤5中结晶加入大量醋酸钙，得到的结晶粉灰分超标，需要重新溶解过脱盐树脂除去灰分，再加活性炭除内毒素，最后沉淀干燥得到成品。

优选的，上述的达托霉素提取方法具体包括如下步骤：

步骤(1)将达托霉素发酵液30L，所述达托霉素发酵液达托霉素的含量为2000mg/L，进行陶瓷膜过滤，浓缩至体积一半后，边加水顶洗边过滤，保持加水量和过滤流量一致，持续至总滤液体积为发酵液体积的5倍量时，停止过滤。得到滤液160L，达托霉素含量为340mg/L；

步骤(2)：步骤(1)得到的滤液过大孔吸附树脂HZ801柱吸附，流速0.8BV/h，吸附完后水洗至漏出液接近无色，先用体积百分数为20％乙醇预洗，再用体积百分数为60％乙醇进行洗脱树脂收集达托霉素单位大于100mg/L的洗脱液，得到洗脱液9L，达托霉素含量为5700mg/L；

步骤(3)：步骤(2)得到的洗脱液，用20000道尔顿的超滤膜进行超滤后，纳滤浓缩，超滤和过滤时温度控制在15-20度，浓缩至达托霉素单位15000-16000，调PH值至6.5，流速5BV/h上NM-Q阴离子交换树脂，纯化水顶洗后，以5BV/h流速先用25mmol/L氯化钠溶液冲洗10BV除杂质，然后用50mmol/L氯化钠溶液冲洗6BV并收集被洗脱下的达托霉素，用60mmol/L氯化钠溶液冲洗15BV，收集被洗脱下来的达托霉素，最后用90mmol/L氯化钠溶液冲洗6BV，收集纯度大于90％的达托霉素洗脱液，得到洗脱液25.2L，达托霉素含量为1650mg/L；

步骤(4)：步骤(3)得到的洗脱液浓缩达托霉素含量至30000mg/L后，过反相硅胶NMsil-C18，调其PH6.5，流速4.2BV/h上柱，先用20％乙醇-20mmol/L醋酸铵溶液预洗1BV，再用38％乙醇-20mmol/L醋酸铵溶液洗脱柱子，收集纯度大于97％的达托霉素洗脱液，得到洗脱液17.2L，达托霉素含量为1790mg/L；

步骤(5)：步骤(4)得到的洗脱液浓缩达托霉素含量至50000mg/L得浓缩液，加入浓缩液的达托霉素质量的45％的乙酸钙，浓缩液体积81％的异丙醇，放置24h析晶，抽滤，烘干，得到达托霉素结晶粉；

步骤(6)：步骤(5)得到的达托霉素结晶湿粉80.03g，溶解于水中，过HZ016树脂脱盐，按1/10倍量加入活性炭脱色除内毒素，过滤，滤液加入10倍量的异丙醇进行沉淀，过滤，所得达托霉素沉淀粉进行沸腾干燥得到达托霉素成品。

本发明的有益效果在于：本发明的达托霉素提取方法不使用剧毒性的乙腈溶液作为洗脱液，减少对环境和生产人员健康压力；并且在提取过程中，pH值维持在7.0左右，接近中性条件，对设备的腐蚀降低，设备折旧减少，并且酸碱调节试剂使用减少，降低了生产成本，所得达托霉素产品纯度高，其纯度在98％左右，收率能达到45％左右，为制剂的制备提供更优良的原料，减少药物使用过程中的副作用。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式予以说明。

本发明最关键的构思在于：本发明的达托霉素提取方法不使用剧毒性的乙腈溶液作为洗脱液，减少对环境和生产人员健康压力；并且在提取过程中，pH值维持在7.0左右，接近中性条件，对设备的腐蚀降低，设备折旧减少，并且酸碱调节试剂使用减少，降低了生产成本。

实施例1

步骤(1)：达托霉素发酵液30L，达托霉素的含量为2000mg/L，进行陶瓷膜过滤，浓缩至体积一半后，边加饮用水顶洗边过滤，保持加水量和过滤流量一致，持续至总滤液体积为发酵液体积的5倍量时，停止过滤。得到滤液160L，达托霉素含量为340mg/L，收率95.5％。

步骤(2)：步骤(1)得到的滤液过大孔吸附树脂HZ801柱(大孔吸附树脂HZ801柱购于上海华震科技有限公司)吸附，流速0.8BV/h，吸附完后水洗至漏出液接近无色，20％乙醇预洗，60％乙醇洗脱树脂收集达托霉素单位大于100mg/L的洗脱液。得到洗脱液9L，达托霉素含量为5700mg/L，收率90.2％。

步骤(3)：步骤(2)得到的洗脱液，用20000道尔顿的超滤膜进行超滤后，纳滤浓缩，超滤和过滤时温度控制在20度以下。浓缩至达托霉素单位15，000左右，调PH值至6.5，流速5BV/h上NM-Q阴离子交换树脂，纯化水顶洗后，以5BV/h流速先用25mmol/L氯化钠溶液冲洗10BV除杂质，然后用50mmol/L氯化钠溶液冲洗6BV并收集被洗脱下的达托霉素，用60mmol/L氯化钠溶液冲洗15BV，收集被洗脱下来的达托霉素，最后用90mmol/L氯化钠溶液冲洗6BV，收集纯度大于90％的达托霉素洗脱液。得到洗脱液25.2L，达托霉素含量为1650mg/L，收率81.0％。

步骤(4)：步骤(3)得到的洗脱液浓缩达托霉素含量至30000mg/L后，过反相硅胶NMsil-C18，调其PH6.5流速4.2BV/h上柱，先用20％乙醇-20mmol/L醋酸铵溶液预洗1BV，再用38％乙醇-20mmol/L醋酸铵溶液洗脱柱子，收集纯度大于97％的达托霉素洗脱液，得到洗脱液17.2L，达托霉素含量为1790mg/L，收率74.0％。脱水达托霉素含量0.3％。

步骤(5)：步骤(4)得到的洗脱液浓缩达托霉素含量至5万单位(即50000mg/L)得浓缩液，加入浓缩液的达托霉素质量的45％的乙酸钙，浓缩液体积81％的异丙醇，放置24h析晶，抽滤，烘干。得到达托霉素结晶粉，纯度为98.6％，收率91％。脱水达托霉素含量0.02％。

步骤(6)：步骤(5)得到的达托霉素结晶湿粉80.03g，溶解于水中，过HZ016树脂脱盐，按1/10倍量加入活性炭脱色除内毒素，过滤，滤液加入10倍量的异丙醇进行沉淀，过滤，达托霉素沉淀粉进行沸腾干燥。得到达托霉素结晶粉，纯度为98.3％，收率95％。脱水达托霉素含量0.3％。

实施例2

发酵液30L，达托霉素的含量为2000mg/L，进行陶瓷膜过滤，浓缩至体积一半后，边加饮用水顶洗边过滤，保持加水量和过滤流量一致，持续至总滤液体积为发酵液体积的2倍量时，停止过滤。

滤液过大孔吸附树脂HZ801柱吸附，流速0.8BV/h，吸附完后水洗至漏出液接近无色，10％乙醇预洗，80％乙醇洗脱树脂收集达托霉素单位大于100mg/L的洗脱液。得到洗脱液。

洗脱液用5，000道尔顿的超滤膜进行超滤后，纳滤浓缩，超滤和过滤时温度控制在20度以下。浓缩至达托霉素单位5，000左右，调PH值至4.0，流速2BV/h上NM-Q阴离子交换树脂，纯化水顶洗后，以5BV/h流速先用25mmol/L氯化钠溶液冲洗10BV除杂质，然后用50mmol/L氯化钠溶液冲洗6BV并收集被洗脱下的达托霉素，用60mmol/L氯化钠溶液冲洗15BV，收集被洗脱下来的达托霉素，最后用90mmol/L氯化钠溶液冲洗6BV，收集纯度大于90％的达托霉素洗脱液。

洗脱液浓缩达托霉素含量至50000mg/L后，过反相硅胶NMsil-C18，调其PH4.0流速0.5BV/h上柱，先用20％乙醇-10mmol/L醋酸铵溶液预洗1BV，再用38％乙醇-30mmol/L醋酸铵溶液洗脱柱子，收集纯度大于97％的达托霉素洗脱液。

洗脱液浓缩达托霉素含量至2万单位得浓缩液，加入达托霉素总量重量比10％的乙酸钙，浓缩液体积比90％的异丙醇，放置24h析晶，抽滤，烘干。得到达托霉素结晶粉。

得到的达托霉素结晶湿粉解于水中，过HZ016树脂脱盐，按1/10倍量加入活性炭脱色除内毒素，过滤，滤液加入10倍量的异丙醇进行沉淀，过滤，达托霉素沉淀粉进行沸腾干燥，得到达托霉素结晶粉，纯度97.2％，脱水达托霉素0.5％，对发酵液的总收率22.5％。

实施例3

发酵液30L，达托霉素的含量为2000mg/L，进行陶瓷膜过滤，浓缩至体积一半后，边加饮用水顶洗边过滤，保持加水量和过滤流量一致，持续至总滤液体积为发酵液体积的2倍量时，停止过滤。

滤液过大孔吸附树脂HZ801柱吸附，流速0.8BV/h，吸附完后水洗至漏出液接近无色，30％乙醇预洗，50％乙醇洗脱树脂收集达托霉素单位大于100mg/L的洗脱液。得到洗脱液。

洗脱液用50，000道尔顿的超滤膜进行超滤后，纳滤浓缩，超滤和过滤时温度控制在20度以下。浓缩至达托霉素单位20，000左右，调PH值至8.0，流速0.5BV/h上NM-Q阴离子交换树脂，纯化水顶洗后，以5BV/h流速先用25mmol/L氯化钠溶液冲洗10BV除杂质，然后用50mmol/L氯化钠溶液冲洗6BV并收集被洗脱下的达托霉素，用60mmol/L氯化钠溶液冲洗15BV，收集被洗脱下来的达托霉素，最后用90mmol/L氯化钠溶液冲洗6BV，收集纯度大于90％的达托霉素洗脱液。

洗脱液浓缩达托霉素含量至5，000mg/L后，过反相硅胶NMsil-C18(C18的反相硅胶，型号为NMSil-C18)，调其PH8.0流速2BV/h上柱，先用20％乙醇-10mmol/L醋酸铵溶液预洗1BV，再用38％乙醇-30mmol/L醋酸铵溶液洗脱柱子，收集纯度大于97％的达托霉素洗脱液。

洗脱液浓缩达托霉素含量至8万单位的浓缩液，加入达托霉素总量重量比60％的乙酸钙，浓缩液体积比50％的异丙醇，放置24h析晶，抽滤，烘干。得到达托霉素结晶粉。

得到的达托霉素结晶湿粉解于水中，过HZ016树脂脱盐，按1/10倍量加入活性炭脱色除内毒素，过滤，滤液加入10倍量的异丙醇进行沉淀，过滤，达托霉素沉淀粉进行沸腾干燥，得到达托霉素结晶粉，纯度96.3％，脱水达托霉素0.9％，对发酵液的总收率为26.4％。

实施例4

发酵液30L，达托霉素的含量为2000mg/L，进行陶瓷膜过滤，浓缩至体积一半后，边加饮用水顶洗边过滤，保持加水量和过滤流量一致，持续至总滤液体积为发酵液体积的4倍量时，停止过滤。

滤液过大孔吸附树脂HZ801柱吸附，流速0.8BV/h，吸附完后水洗至漏出液接近无色，30％乙醇预洗，40％乙醇洗脱树脂收集达托霉素单位大于100mg/L的洗脱液。得到洗脱液。

洗脱液用30，000道尔顿的超滤膜进行超滤后，纳滤浓缩，超滤和过滤时温度控制在20度以下。浓缩至达托霉素单位10，000左右，调PH值至7.0，流速0.5BV/h上NM-Q阴离子交换树脂，纯化水顶洗后，以5BV/h流速先用25mmol/L氯化钠溶液冲洗10BV除杂质，然后用50mmol/L氯化钠溶液冲洗6BV并收集被洗脱下的达托霉素，用60mmol/L氯化钠溶液冲洗15BV，收集被洗脱下来的达托霉素，最后用90mmol/L氯化钠溶液冲洗6BV，收集纯度大于90％的达托霉素洗脱液。

洗脱液浓缩达托霉素含量至30，000mg/L后，过反相硅胶NMsil-C18(C18的反相硅胶，型号为NMSil-C18)，调其PH6.0流速1.0BV/h上柱，先用20％乙醇-10mmol/L醋酸铵溶液预洗1BV，再用38％乙醇-30mmol/L醋酸铵溶液洗脱柱子，收集纯度大于97％的达托霉素洗脱液。

洗脱液浓缩达托霉素含量至4万单位得浓缩液，加入达托霉素总量重量比35％的乙酸钙，浓缩液体积比70％的异丙醇，放置24h析晶，抽滤，烘干。得到达托霉素结晶粉。

得到的达托霉素结晶湿粉解于水中，过HZ016树脂脱盐，按1/10倍量加入活性炭脱色除内毒素，过滤，滤液加入10倍量的异丙醇进行沉淀，过滤，达托霉素沉淀粉进行沸腾干燥，得到达托霉素结晶粉，纯度97.6％，脱水达托霉素0.4％，对发酵液的总收率为28.8％。

实施例5

发酵液30L，达托霉素的含量为2000mg/L，进行陶瓷膜过滤，浓缩至体积一半后，边加饮用水顶洗边过滤，保持加水量和过滤流量一致，持续至总滤液体积为发酵液体积的5倍量时，停止过滤。

得到的滤液过大孔吸附树脂HZ801柱吸附，流速0.8BV/h，吸附完后水洗至漏出液接近无色，20％乙醇预洗，60％乙醇洗脱树脂收集达托霉素单位大于100mg/L的洗脱液。

得到的洗脱液，用20，000道尔顿的超滤膜进行超滤后，纳滤浓缩，超滤和过滤时温度控制在20度以下。浓缩至达托霉素单位15，000左右，调PH值至6.5，流速5BV/h上NM-Q阴离子交换树脂，纯化水顶洗后，以5BV/h流速先用25mmol/L氯化钠溶液冲洗10BV除杂质，然后用50mmol/L氯化钠溶液冲洗6BV并收集被洗脱下的达托霉素，用60mmol/L氯化钠溶液冲洗15BV，收集被洗脱下来的达托霉素，最后用90mmol/L氯化钠溶液冲洗6BV，收集纯度大于90％的达托霉素洗脱液。

得到的洗脱液浓缩达托霉素含量至30，000mg/L后，过反相硅胶NMsil-C18(C18的反相硅胶，型号为NMSil-C18)，调其PH6.5流速4.2BV/h上柱，先用20％乙醇-20mmol/L醋酸铵溶液预洗1BV，再用38％乙醇-20mmol/L醋酸铵溶液洗脱柱子，收集纯度大于97％的达托霉素洗脱液。

得到的洗脱液浓缩达托霉素含量至6万单位得浓缩液，加入达托霉素总量重量比45％的乙酸钙，浓缩液体积比81％的异丙醇，放置24h析晶，抽滤，烘干。得到达托霉素结晶粉。

得到的达托霉素结晶湿粉80.03g，溶解于水中，过HZ016树脂脱盐，按1/10倍量加入活性炭脱色除内毒素，过滤，滤液加入10倍量的异丙醇进行沉淀，过滤，达托霉素沉淀粉进行沸腾干燥，得到达托霉素结晶粉，纯度为98.3％，脱水达托霉素含量0.3％，对发酵液的总收率为44.6％。

对比例1

实验A(公开号为CN 103724400A的中国发明专利中的方案)

将1L达托霉素发酵液经过孔径0.01μm的陶瓷膜过滤除去达托霉素发酵液中的水溶性蛋白、色素等大分子物质，用发酵液3倍体积的水循环洗涤陶瓷膜得到陶瓷膜滤液，所得滤液澄清透明，且颜色为红黄色。

将滤液用稀乙酸调节pH至6.0，过FPDA13树脂，水洗树脂并用pH为6.5的0.06N乙酸钠溶液及0.2N氯化钠溶液洗脱，收集达托霉素单位大于100mg/L的洗脱液。

实验B(本发明技术方案的相关步骤：步骤(1)和(2))

1L达托霉素发酵液进行陶瓷膜过滤，浓缩至体积一半后，边加饮用水顶洗边过滤，保持加水量和过滤流量一致，持续至总滤液体积为发酵液体积的3倍量时，收集过滤。

滤液过大孔吸附树脂HZ801柱吸附，流速0.8BV/h，吸附完后水洗至漏出液接近无色，20％乙醇预洗，60％乙醇洗脱树脂收集达托霉素单位大于100mg/L的洗脱液。

实验C(公开号为CN 102924572A的中国发明专利中的方案)

取发酵单位为1960μg/mL的达托霉素发酵液100L，在上述发酵液中加入3000g珍珠岩作为助滤剂，搅拌1h后板框过滤，得到达托霉素滤液。

将达托霉素滤液以40L/h的流速导入大孔树脂D312柱(装量为20L)进行吸附富集，吸附完毕先用35％的乙醇水溶液洗涤，再用72％的乙醇水溶液解吸，解吸流速控制在10L/h，当HPLC检测解吸液中达托霉素浓度高于200μg/mL时开始收集，当浓度低于200μg/mL时，停止收集。

实验D(公开号为CN 102241736A的中国发明专利中的方案)

取达托霉素发酵浓缩液1L，用1N盐酸调节pH3.6。搅拌下加入200g聚丙烯酸，加80g硅藻土，控制温度10℃搅拌3小时，过滤得到滤饼，滤饼重新溶解过滤得到滤液。

滤液过大孔吸附树脂HZ801柱吸附，流速0.8BV/h，吸附完后水洗至漏出液接近无色，20％乙醇预洗，60％乙醇洗脱树脂收集达托霉素单位大于100mg/L的洗脱液。

实验结果：实验A的达托霉素收率为78％，且最后达托霉素的洗脱液纯度比较低只有52％；实验B的达托霉素收率为85％，得到的达托霉素纯度70％；实验C的达托霉素收率为65％，得到的达托霉素纯度66％，板框过滤过程很难过滤，耗时很长，损失较大；实验D的达托霉素收率为72％，得到的达托霉素纯度70％。实验C和实验D都需要加入助滤剂，增加了工艺的复杂性；而实验A在FPDA13树脂前后的操作步骤需要调节pH值，以及2种洗脱液洗脱，增加了工艺的复杂性。

而实验B所述的达托霉素粗提方法不需要调节pH值和加入助滤剂，使用的试剂种类少，操作简便，并且回收率高，纯度也高，优于实验A、C和D的达托霉素粗提方法。

对比例2(本发明技术方案的相关步骤：步骤(3))

对比实施例1实验B所得的洗脱液500ml用20000道尔顿的超滤膜进行超滤后，纳滤浓缩，超滤和纳滤时温度控制在20度以下。浓缩至达托霉素单位10，000mg/L左右，调PH6.5流速5BV/h上NM-Q阴离子交换树脂，纯化水顶洗后，用氯化钠溶液洗脱树脂，收集纯度大于90％的达托霉素洗脱液。

经过试验，若高于20度在室温下进行超滤和纳滤，达托霉素容易降解，脱水达托霉素及β-异构体增加。

实验E：氯化钠溶液洗脱树脂的具体方法为：以3mL/min流速先用25mM氯化钠溶液冲洗12.0BV除杂质，然后用50mM氯化钠溶液冲洗7.0BV并收集被洗脱下的达托霉素，最后用500mM氯化钠溶液冲洗3.0BV(参考中国专利CN102993273A)。

实验F：氯化钠溶液洗脱树脂的具体方法为：以5BV/h流速先用25mmol/L氯化钠溶液冲洗10BV除杂质，然后用50mmol/L氯化钠溶液冲洗6BV并收集被洗脱下的达托霉素，用60mmol/L氯化钠溶液冲洗15BV，收集被洗脱下来的达托霉素，最后用90mmol/L氯化钠溶液冲洗6BV。

实验结果：实验F与实验E相比，在于洗脱液氯化钠溶液的洗脱体积和浓度存在差异，这些差异导致实验E的达托霉素收率为55％；实验F的达托霉素收率为80％，这些差异导致实验F的达托霉素收率比实验E提高了45.5％，提高了将近一半，达托霉素的收率差异说明实验F优于实验E的方法。

对比例3(本发明技术方案的相关步骤：步骤(2)和(3))

实验G：步骤(2)+(3)

1L达托霉素发酵液进行陶瓷膜过滤，浓缩至体积一半后，边加饮用水顶洗边过滤，保持加水量和过滤流量一致，持续至总滤液体积为发酵液体积的3倍量时，收集过滤。

滤液过大孔吸附树脂HZ801柱吸附，流速0.8BV/h，吸附完后水洗至漏出液接近无色，20％乙醇预洗，60％乙醇洗脱树脂收集达托霉素单位大于100mg/L的洗脱液；

洗脱液用20000道尔顿的超滤膜进行超滤后，纳滤浓缩，超滤和纳滤时温度控制在20度以下。浓缩至达托霉素单位10000左右，调PH6.5流速5BV/h上NM-Q阴离子交换树脂，纯化水顶洗后，用氯化钠溶液洗脱树脂，收集纯度大于90％的达托霉素洗脱液。

实验H：步骤(3)+(2)

1L达托霉素发酵液进行陶瓷膜过滤，浓缩至体积一半后，边加饮用水顶洗边过滤，保持加水量和过滤流量一致，持续至总滤液体积为发酵液体积的3倍量时，收集过滤。

滤液用20000道尔顿超滤膜进行超滤后，调PH值至6.5，流速5BV/h上NM-Q阴离子交换树脂，纯化水顶洗后，用氯化钠溶液洗脱树脂，收集达托霉素单位大于100mg/L的洗脱液；

洗脱液用20000都尔顿的超滤膜进行超滤后，纳滤浓缩，超滤和纳滤时温度控制在20度以下。浓缩至达托霉素单位10000mg/L左右，过大孔吸附树脂HZ801柱吸附，流速0.8BV/h，吸附完后水洗至漏出液接近无色，20％乙醇预洗，60％乙醇洗脱树脂，收集达纯度大于90％的达托霉素洗脱液。

实验结果：实验G和实验H的差异仅在于实施步骤的顺序不同，但是实施步骤的不同导致实验G的达托霉素收率为42％，而实验H的达托霉素收率高达为68％；实验H的达托霉素收率与实验G相比提高了61.9％，提高了一半多。达托霉素的收率说明实验G的实施顺序优于实验H的实施顺序。

对比例4(本发明技术方案的相关步骤：步骤(4))

实验I：(参考中国专利CN 102924572A)

对比实施例3实验G所得的洗脱液注入聚合物纳米微球UNIPS30RPC柱(装量为1L)进行层析分离，然后依次用浓度分别为35％、55％的甲醇水溶液作为洗脱剂对UNIPS30RPC柱进行梯度洗脱，并分析洗脱液的HPLC含量。根据HPLC检测结果，收集HPLC纯度大于等于97％的洗脱液。

实验J：实施例3实验G所得的洗脱液过反相硅胶NMsil-C18(C18的反相硅胶，型号为NMSil-C18)，调其PH值至6.5，流速0.5～2BV/h上柱，先用20％乙醇-20mmol/L醋酸铵溶液预洗1BV，再用38％乙醇-20mmol/L醋酸铵溶液洗脱，收集纯度大于97％的洗脱液。

实验结果：实验I的达托霉素收率为66％；实验J的达托霉素收率为74％。实验J优于实验I。

对比例5(本发明技术方案的相关步骤：步骤(4))

实施例3实验G所得的洗脱液过反相硅胶NMsil-C18，调其PH值至6.5，流速0.5～6BV/h上柱，水顶洗树脂，用洗脱液洗脱柱子，收集纯度大于97％的洗脱液。

表1

洗脱液名称	收率	纯度	颜色	脱水达托霉素含量
					洗脱液1	74％	97.8	浅黄色	0.5
洗脱液2	60％	97.5	黄色	0.6
					洗脱液3	48％	97.1	黄色	0.7
洗脱液4	43％	97.0	黄色	0.8
					洗脱液5	59％	97.5	黄色	0.6

表1各洗脱液洗脱方式：

洗脱液1：先用20％乙醇-20mmol/L醋酸铵溶液预洗1BV，再用38％乙醇-20mmol/L醋酸铵溶液洗脱；

洗脱液2：用38％乙醇-20mmol/L醋酸铵溶液洗脱；

洗脱液3：用乙醇洗脱；

洗脱液4：用异丙醇洗脱；

洗脱液5：先用20％异丙醇-20mmol/L醋酸铵溶液预洗1BV，再用38％异丙醇-20mmol/L醋酸铵溶液洗脱；

从表1的数据可以看出，洗脱液1-5洗脱时收集纯度大于97％的洗脱液，醋酸乙醇梯度和醋酸异丙醇洗脱的收率和所得的达托霉素中脱水达托霉素的含量都略优于其他组的，但是在所得的达托霉素颜色上，洗脱液1梯度梯度洗脱所得的颜色最浅，脱色效果最优，因此选择洗脱液1梯度作为反相硅胶NMsil-C18的洗脱液。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.一种达托霉素提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤(1)：将达托霉素发酵液进行陶瓷膜过滤，收集过滤液；

步骤(2)：将步骤(1)所得过滤液过大孔吸附树脂HZ801柱吸附，吸附完后，水洗至漏出液接近无色，用乙醇洗脱树脂收集得到达托霉素单位大于100mg/L的洗脱液；

步骤(3)：将步骤(2)所得的洗脱液调PH至4.0-8.0，上NM-Q阴离子交换树脂，纯化水顶洗后，依次用25mM氯化钠溶液，50mM氯化钠溶液，60mM氯化钠溶液，90mM氯化钠溶液进行梯度洗脱，收集得到纯度大于90％的达托霉素洗脱液；

步骤(4)：将步骤(3)所得的达托霉素洗脱液过反相硅胶NMsil-C18柱，调其PH至4.0-8.0，流速0.5-6BV/h上柱，先用20％乙醇-20mmol/L醋酸铵溶液预洗1BV，再用38％乙醇-20mmol/L醋酸铵溶液洗脱，收集得到纯度大于97％达托霉素洗脱液；

步骤(5)：将步骤(4)所得的达托霉素洗脱液浓缩到达托霉素浓度为20000-80000mg/L得浓缩液，加入浓缩液的达托霉素质量的10％-90％的乙酸钙，浓缩液体积50％-90％的异丙醇，放置36-48h，析晶，抽滤，烘干得达托霉素结晶粉。

2.如权利要求1所述达托霉素提取方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为：将达托霉素发酵液进行陶瓷膜过滤，浓缩至体积一半后，边加水顶洗边过滤，保持加水量和过滤流量一致，持续至总滤液体积为发酵液体积的2-5倍量时，停止过滤，收集过滤液。

3.如权利要求1所述达托霉素提取方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为：将步骤(1)所得过滤液过大孔吸附树脂HZ801柱吸附，流速0.8BV/h，吸附完后水洗至漏出液接近无色，先用体积百分数为20％乙醇溶液预洗，再用体积百分数为60％乙醇溶液进行洗脱树脂收集得到达托霉素单位大于100mg/L的洗脱液。

4.如权利要求1所述达托霉素提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中“用氯化钠溶液梯度洗脱”具体为：以5BV/h流速先用25mmol/L氯化钠溶液冲洗10BV除杂质，然后用50mmol/L氯化钠溶液冲洗6BV并收集被洗脱下的达托霉素，用60mmol/L氯化钠溶液冲洗15BV，收集被洗脱下来的达托霉素，最后用90mmol/L氯化钠溶液冲洗6BV。

5.如权利要求1所述达托霉素提取方法，其特征在于，步骤(5)中“将步骤(4)所得的达托霉素洗脱液浓缩到达托霉素浓度为20000-80000mg/L”具体为：将步骤(4)所得的达托霉素洗脱液浓缩到单位50000mg/L，调其PH到4.8。

6.如权利要求1所述达托霉素提取方法，其特征在于，还包括步骤(6)：将步骤(5)所得达托霉素结晶粉溶解于水中，过HZ016树脂脱盐，洗脱液按1/10倍量加入活性炭脱色除内毒素，过滤，滤液加入10倍量的异丙醇进行沉淀，将所得达托霉素沉淀粉进行沸腾干燥得到达托霉素成品。

7.如权利要求1所述达托霉素提取方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

步骤(1)：将达托霉素发酵液30L，所述达托霉素发酵液达托霉素的含量为2000mg/L，进行陶瓷膜过滤，浓缩至体积一半后，边加水顶洗边过滤，保持加水量和过滤流量一致，持续至总滤液体积为发酵液体积的5倍量时，停止过滤，得到滤液160L，达托霉素含量为340mg/L；

步骤(2)：步骤(1)得到的滤液过大孔吸附树脂HZ801柱吸附，流速0.8BV/h，吸附完后水洗至漏出液接近无色，先用体积百分数为20％乙醇预洗，再用体积百分数为60％乙醇进行洗脱树脂收集达托霉素单位大于100mg/L的洗脱液，得到洗脱液9L，达托霉素含量为5700mg/L；

步骤(3)：步骤(2)得到的洗脱液，用20000道尔顿的超滤膜进行超滤后，纳滤浓缩，超滤和过滤时温度控制在15-20度，浓缩至达托霉素单位15000-16000，调PH值至6.5，流速5BV/h上NM-Q阴离子交换树脂，纯化水顶洗后，以5BV/h流速先用25mmol/L氯化钠溶液冲洗10BV除杂质，然后用50mmol/L氯化钠溶液冲洗6BV并收集被洗脱下的达托霉素，用60mmol/L氯化钠溶液冲洗15BV，收集被洗脱下来的达托霉素，最后用90mmol/L氯化钠溶液冲洗6BV，收集纯度大于90％的达托霉素洗脱液，得到洗脱液25.2L，达托霉素含量为1650mg/L；

步骤(4)：步骤(3)得到的洗脱液浓缩达托霉素含量至30000mg/L后，过反相硅胶NMsil-C18，调其PH6.5，流速4.2BV/h上柱，先用20％乙醇-20mmol/L醋酸铵溶液预洗1BV，再用38％乙醇-20mmol/L醋酸铵溶液洗脱柱子，收集纯度大于97％的达托霉素洗脱液，得到洗脱液17.2L，达托霉素含量为1790mg/L；

步骤(5)：步骤(4)得到的洗脱液浓缩达托霉素含量至50000mg/L得浓缩液，加入浓缩液的达托霉素质量的45％的乙酸钙，浓缩液体积81％的异丙醇，放置24h析晶，抽滤，烘干，得到达托霉素结晶粉；

步骤(6)：步骤(5)得到的达托霉素结晶湿粉80.03g，溶解于水中，过HZ016树脂脱盐，按1/10倍量加入活性炭脱色除内毒素，过滤，滤液加入10倍量的异丙醇进行沉淀，过滤，所得达托霉素沉淀粉进行沸腾干燥得到达托霉素成品。