CN105463021A - 表达h3n2犬流感ha蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体的构建方法 - Google Patents
表达h3n2犬流感ha蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体的构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域,具体公开了一种表达H3N2犬流感HA蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体的构建方法。本发明将犬流感HA基因依次***pMD18-T、pEGFP-C1、pVAX-E3质粒后,成功将HA基因进行修饰后,再将修饰后的HA基因片段重组到pPoly2-CAV2-△E3载体中,成功构建及病毒包装后在MDCK细胞中获得稳定遗传的pPoly2-CAV2-HA疫苗载体,扩大了犬流感疫苗的研发市场,为后期犬流感疫苗的研制及相关的基础研究提供支持。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体地,涉及一种表达H3N2犬流感HA蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体的构建方法。
背景技术
2004年(Crawfordetal.,2005)首次在美国佛罗里达州猎狗身上分离到马源H3N8病毒,揭示该病毒可通过跨物种转播。时隔一年,人类在犬身上发现H3N8犬流感。之后几年在欧美几个国家均不间断的出现H3N8犬流感,然而在亚洲板块各国却鲜见该亚型病的流行。根据报道,在亚洲主要以H3N2亚型为主。2002年在南韩、2006年中国广州等地先后报道出H3N2犬流感,中国广州华南农业大学兽医学院外科教研室,历经10年不间断地进行犬流感流行情况进行跟踪调查,结果显示,在中国主要以H3N2犬流感流行为主,通过基因序列比对发现,各流行病毒株的基因同源性极其高,毒力检测均未见大幅变化,检测发现TCID50介于103~104之间。面对H5N1、H1N1在犬身上发现的个别案例,及各地逐年递增的H3N2犬流感流行病例,其流行控制仍是重点、不容小视。
发明内容
本发明从本国国情出发,针对主要流行亚型H3N2病毒,开展疫苗研制的前期工作,旨在提供一种表达H3N2犬流感HA蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体,为犬流感防疫做出实施有效的技术参考。
本发明的另一个目的是提供一种表达H3N2犬流感HA蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体的构建方法。
为了实现上述目的,本发明是通过以下技术方案予以实现的:
一种表达H3N2犬流感HA蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体,在pPoly2-CAV2-△E3质粒的SalI和NruI酶切位点之间***SEQIDNO:2所示基因片段。
一种表达H3N2犬流感HA蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体的构建方法,包括如下步骤:
S1.PCR扩增获得SEQIDNO:1所示的犬流感病毒H3N2亚型的HA基因序列;
S2.将权利要求1所述的HA基因***pMD18-T质粒中,构建重组质粒pMD18-T-HA;
S3.同时双酶切重组质粒pMD18-T-HA和pEGFP-C1载体,酶切产物连接后构建重组质粒pEGFP-C1-HA;
S4.同时双酶切重组质粒pEGFP-C1-HA和pVAXE3载体,酶切产物连接后构建重组载体pVAXE3-HA。
优选地,PCR扩增的引物序列如SEQIDNO:3~4所示。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明将犬流感HA基因依次***pMD18-T、pEGFP-C1、pVAX-E3质粒后,成功将HA基因进行修饰后,再将修饰后的HA基因片段重组到pPoly2-CAV2-△E3载体中,成功构建并获得稳定遗传的pPoly2-CAV2-HA疫苗载体,扩大了犬流感疫苗的研发市场,为后期犬流感疫苗的研制及相关的基础研究提供支持。
附图说明
图1为HA基因的PCR扩增产物的凝胶电泳图,1为基因Marker,2为扩增产物条带;3为阴性对照。
图2为pMD18-T-HA质粒酶切鉴定结果,1为Marker:6000bp;2,3为pMD18-T-HA经NheI和BamHI双酶切结果;4为pMD18-T-HA质粒。
图3为pEGFP-C1-HA质粒酶切鉴定结果,1为Marker:6000bp;2为pEGFP-C1-HA质粒经AseI和MluI双酶切结果;3为pEGFP-C1-HA质粒。
图4为pVAXE3-HA质粒酶切鉴定结果,1为NheI单酶切质粒;2为XhoI单酶切质粒;3为PpuMI单酶切质粒;4、质粒;5、Marker:1kb;6、Marker:2000bp。
图5为重组病毒pPoly2-CAV2-HA在MDCK细胞上的细胞病变(100X)。
图6为重组病毒pPoly2-CAV2-HA的PCR鉴定,M、Marker:2000bp;1、CAV2病毒DNA为模版;2、H2O为模版;3、重组病毒pPoly2-CAV2-HADNA为模版;4、重组pPoly2-CAV2-HA质粒为模版。
图7为电镜观察重组病毒pPoly2-CAV2-HA的病毒样颗粒(68000X)。
图8为间接免疫荧光检测HA在重组病毒pPoly2-CAV2-HA中的表达,A:PBS感染MDCK;B:重组病毒pPoly2-CAV2-HA感染MDCK;C:CAV-2感染MDCK。
图9为WB检测HA在重组病毒pPoly2-CAV2-HA中的表达。
图10为重组病毒pPoly2-CAV2-HA在MDCK中的病毒滴度稳定性检测。
图11为HA基因在重组病毒pPoly2-CAV2-HA中的表达稳定性检测。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述,所述实施例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,为可从商业途径得到的试剂和材料。
下列实施例中使用到的MDCK细胞购买于ATCC细胞库,pVAXE3载体、pPoly2-CAV2-△E3载体由华南农业大学兽医学院寄生虫教研室袁子国老师惠赠;pMD18T载体购自大连宝生物工程公司;感受态DH5α(天根)购自广州真知生物有限公司。
实施例1
1、HA基因的扩增:通过NCBI上CIVH3N2亚型的HA基因进行比对分析,选取同源系数较高的一株病毒(Canine/Guangdong/1/2006(H3N2))为模版,设计HA基因的ORF序列扩增引物。上游引物加入NheI酶切位点,下游引物加入BamHI酶切位点。
F:5’-GCTAGCATGAAAACTGTTATTGCTTTAAGC-3’;
R:5’-GGATCCTCAAATGCAAATGTTGCACC-3’。
PCR扩增反应的体系和条件参考本领域常规的方法,PCR产物经凝胶电泳检测后结果见图1,切胶回收PCR扩增产物,经测序正确后备用,HA基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
2、pMD18T-HA重组质粒的构建及鉴定:配置下列反应:无菌水1.8μL、pMD18-T载体0.2μL、PCR扩增产物3.0μL、SolutionI5μL,以上成分混匀后,16℃连接过夜,将连接产物转化感受态细胞DH5α,通过液态培养基扩繁,质粒提取试剂盒,获得pMD18T-HA质粒,经NheI和BamHI酶切鉴定(图2)并送件测序结果正确后进行后续实验。
3、pEGFP-C1-HA重组质粒的构建及鉴定:用NheI和BamHI同时双酶切pEGFP-C1载体和pMD18T-HA重组质粒,胶回收纯化载体大片段和HA片段,载体大片段长约4000bp。通过T4连接酶将酶切后的载体大片段和切下的HA片段16℃连接过夜,连接产物转化感受态细胞DH5α,通过液态培养基扩繁,质粒提取试剂盒,获得pEGFP-C1-HA重组质粒,质粒经AseI和MluI双酶切鉴定(如图3),胶回收试剂盒回收酶切后的目的片段,经测序后发现酶切后目的片段长2537bp,-20℃保存用于后续实验。
4、pVAXE3-HA重组质粒的构建及鉴定
去磷酸化及粘性末端补平:SspI酶切pVAXE3载体,获得7003bp的线性化片段△pVAXE3。用小肠碱性磷酸酶CIAP进行去磷酸化。具体操作如下:目的片段1~20pmol、10XCIAPbuffer5μL、CIAP(10~30U/μL)1~2μL、无菌水补齐到50μL,将该体系溶液置于37℃水浴锅30min;在加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合液充分混匀后,10000prm离心5min,弃掉上清,如此重复一次;加入氯仿/异戊醇(24:1)50μL充分混匀后,10000prm离心5min,弃掉上清;依次加入5μL的3MNaAc、125μL冰乙酸,-20℃预冷30min,10000prm离心10min,弃掉上清;加入200μL预冷的70%无水乙醇洗涤沉淀,10000prm离心10min,弃掉上清,如此重复一次;超净台中自然晾干;用15μL的无菌水溶解沉淀。-20℃存储备用。
步骤3中回收的2537bp的目的片段含有“CMV-HA-polyA”。用KlenowFragment酶进行补粘性末端。具体操作如下25μL体系:目的片段25ng,无菌水补齐到19μL后,依次加入10XKlenowFragmentbuffer2.5μL、dNTP2.5μL、KlenowFragment1μL,将该体系溶液置于37℃水浴锅3h;在转入65℃水浴锅5min;用无水乙醇沉淀法收集去磷酸化片段。-20℃存储备用。
连接:将平端处理的“CMV-HA-polyA”片段与去磷酸化的△pVAXE3按照摩尔数比值为1:1的比例混合,在T4连接酶的作用下,16℃连接过夜,将连接产物转化感受态细胞DH5α,通过液态培养基扩繁,质粒提取试剂盒,获得pVAXE3-HA重组质粒。分别用NheI、XhoI、PpuMI酶切鉴定(图4),NheI酶切得到4252bp、2177bp、1288bp、1432bp、397bp片段,XhoI酶切得到6100bp、2446bp、1000bp片段;PpuMI酶切得到4396bp、2424bp、1795bp、381bp、332bp、172bp、36bp片段。将鉴定正确的质粒送样测序。
5、pPoly2-CAV2-HA的构建及鉴定:pVAXE3-HA与pPoly2-CAV2-△E3分别用SalI和NruI双酶切后,用胶回收试剂盒收集4016bp、27147bp片段。在T4连接酶下连接两种片段,将连接产物转化感受态细胞DH5α获得更多的克隆子,用去内毒素大提试剂盒提取质粒,经核酸定量检测仪检测浓度及纯度,将合格的重组质粒pPoly2-CAV2-HA置于-20℃备用,pPoly2-CAV2-△E3质粒的SalI和NruI酶切位点之间***的基因片段序列如SEQIDNO:2所示。
实施例2重组病毒pPoly2-CAV2-HA的包装及鉴定
本实施例中使用的Canine/Guangdong/1/2006(H3N2)细胞由华南农业大学兽医学院外科教研室分离留存;CAV-2病毒由广州华南农业大学寄生虫教研室袁子国老师惠赠。
一、重组病毒pPoly2-CAV2-HA的包装:用PmeI和AscI双酶切重组质粒pPoly2-CAV2-HA,通过大片段胶回收试剂盒纯化线性化的大片段,长约28000bp。在纯化酶切后的大片段时必须轻柔操作,最后用洗脱液进行洗脱时,应将同样的洗脱液重复利用洗脱2~3次,可提高洗脱浓度。经紫外分光光度计核酸检测仪测定片段的浓度及OD260/OD280的比值,其比值介于1.7~2.1则结果可行,此法同样适用于重组质粒的定量。
将定量好的重组质粒和线性化片段同时转染MDCK,要求MDCK的转染密度在70~80%,转染前用PBS润洗3次,再加入2mL的无血清的MEM以备用。以6孔板转染为例,用Opti-MEM稀释核酸(总量2.5ug(质粒:片段=1:1))至125μL,按照脂质体Lip2000的量为3μL/孔与122μL/孔的Opti-MEM混合,最后将125μL的核酸稀释液与125μL脂质体稀释液混匀后,室温静置5min。将混合物加入预先润洗好的细胞培养液中,无需换液,每24小时观察一次细胞,以PBS空白对照组的细胞为参照。当空白组细胞死亡50%以上时,可终止观察,并收集实验组细胞和上清液,经反复冻融3次后,将冻融液用0.22μm过滤膜过滤后-80℃保存备用。
本发明解决了大片段、大质粒转染细胞需借用电转或Ca2+等高效率较麻烦的难题,完成了脂质体轻松介导转入大基因的工作。需注意的是1)转染的条件,实则根据载体与大片的摩尔比值来优化,n质粒:n片段=1:1~3之间进行优化,本发明结果显示1:1最佳,1:2次之,故该比值范围可做参考。2)转染操作手法需特别注意,将脂质体稀释液加入核酸稀释液时,应将枪头***液面,缓缓打入,混合时不可用枪吹打,轻柔旋转EP管即可。应用该发明中的操作方法可提高转染效率。
二、重组病毒pPoly2-CAV2-HA的鉴定
1、重组病毒pPoly2-CAV2-HA在MDCK细胞上的细胞病变:将步骤一中疑似包装好的冻融液和对照组(CAV2和PBS)的冻融液分别接种MDCK。37℃、5%CO2培养箱孵育1h后,更换成病毒维持液,每隔24h进行观察,直到正常细胞对照组死亡50%,则可收集细胞及上清液进行冻融处理。如此盲传3~6代,直到重组病毒致使MDCK细胞出现明显的CAV2病变情况,即在48h后出现明显的细胞肿胀变圆,葡萄串样典型的腺病毒病变(见图5)。
2、重组病毒pPoly2-CAV2-HA的PCR鉴定:收集病变细胞,用基因组抽提试剂盒抽提病毒DNA,并以此为模版进行PCR鉴定。PCR扩增引物如下:
HA(F):5’-GCTAGCATGAAAACTGTTATTGCTTTAAGC-3’;
HA(R):5’-GGATCCTCAAATGCAAATGTTGCACC-3’。
PCR扩增程序:94℃预变性1min;94℃变性15s,60℃退火15s,72℃延伸1min,循环35次;72℃终延伸10min。将PCR产物进行凝胶电泳检测(图6)。
3、电镜观察重组病毒pPoly2-CAV2-HA的病毒样颗粒:重组病毒感染MDCK细胞后,经6次盲传纯化后,取第7代病变细胞的上清液。用腺病毒纯化试剂盒进行纯化,配制0.5%磷钨酸溶液进行负染色,置于电镜下观察病毒形态。可见病毒粒子呈正二十面体结构,病毒表面由五邻粒和六邻粒构成的衣壳,此为腺病毒样病毒粒子特征(见图7)。
4、重组病毒pPoly2-CAV2-HA(rCAV2-HA)的血凝特性:收集重组病毒致80%MDCK细胞明显病变的上清液,经0.22μm过滤膜过滤后。与大鼠、猪、豚鼠、兔、人“O”型血进行血凝反应。结果显示,重组腺病毒只与大鼠、人“O”型血凝集,不与其他血发生凝集(见表1)。
表1重组病毒pPoly2-CAV2-HA的血凝特性检测
豚鼠血 | 兔血 | 猪血 | 人“O”血 | 大鼠血 | |
rCAV2-HA | - | - | - | 27 | 25 |
CAV2 | - | - | - | 29 | 27 |
PBS | - | - | - | - | - |
5、间接免疫荧光检测HA在重组病毒pPoly2-CAV2-HA中的表达:重组病毒感染MDCK后,待细胞发生50%的葡萄串样病变时,弃掉上清液,用PBS轻柔洗涤细胞3次。用4%多聚甲醛固定细胞10min,PBS洗三遍,每次5min,
用0.2~0.5%tritonX-100(PBS配制)对细胞进行透化处理10min,PBS洗三遍,每次5min,10%的山羊血清封闭30min,PBS洗涤两遍,加入一抗(鼠源HA单克隆抗体),室温孵育1h,PBS洗三遍,每次5min,加入羊抗鼠IgG-FITC二抗,室温孵育30~45min,PBS洗四遍,每次5min。倒置荧光显微镜下观察HA表达情况(见图8)。
6、蛋白免疫印迹法检测HA在重组病毒pPoly2-CAV2-HA中的表达:重组病毒感染MDCK后,待细胞发生50%的葡萄串样病变时,弃掉上清液,收集病变细胞和正常细胞,总蛋白提取试剂盒提取总蛋白,BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。灌制10%的SDS-PAGE凝胶,蛋白上样量为20μg/孔,蛋白上样前加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液,100℃孵育5min,恢复室温后再上样。上层胶电压为80V,下层胶电压为100V。以200mA45min中的湿转法将胶上蛋白转印到硝酸纤维素膜上。对膜做如下处理:1×TBST洗涤3次,每次10min;5%的脱脂奶粉封闭2h;1×TBST洗涤3次,每次10min;孵育一抗(犬源的CIV(H3N2)多抗),4℃过夜;1×TBST洗涤3次,每次10min;孵育二抗(羊抗狗IgG-HRP抗体)37℃摇床孵育1h;1×TBST进行洗涤3次,每次10min;采用ECL化学发光检测试剂盒进行曝光(如图9),曝光时间为4h。
7、重组病毒pPoly2-CAV2-HA在MDCK中的病毒滴度稳定性检测:经过鉴定成功后的重组腺病毒被接种到MDCK细胞上,待80%细胞出现明显的细胞病变后,收集上清液和细胞,反复冻融三次后,经0.22μm过滤膜过滤,用于继续传代,如此收集第6代到13代之间的病毒,进行TCID50检测,采用Reed-Muench法计算TCID50值(如图10)
8、HA基因在重组病毒pPoly2-CAV2-HA中的表达稳定性检测:按照步骤7中病毒传代的方法,将病毒传至30代,并收集第10代、20代、30代的感染细胞,用总蛋白提取试剂盒提取总蛋白,BCA定量法标定蛋白量,蛋白加入5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲,100℃孵育5min,恢复室温后再上样,上样量为30μg/孔。按照步骤6中方法进行SDS-PAGE凝胶电泳和蛋白转印。对膜对如下处理:1XTBST洗涤3次,每次10min;5%的脱脂奶粉封闭2h;1XTBST洗涤3次,每次10min;孵育一抗(鼠源的HA(CIVH3N2)单克隆抗体),4℃过夜;1XTBST洗涤3次,每次10min;孵育二抗(IRDye800CWGoatanti-mouseIgG(H+L))37℃摇床孵育1h;1XTBST进行洗涤3次,每次10min。近红外成像仪中采集蛋白表达信息(如图11)。
SEQUENCELISTING
<110>华南农业大学
<120>表达H3N2犬流感HA蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体的构建方法
<130>
<160>6
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>1712
<212>DNA
<213>HA基因序列
<400>1
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cttccaggaaatgaaaataatgctgcaacactatgcctgggacatcatgcagtgccgaac120
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<211>1660
<212>DNA
<213>pPoly2-CAV2-E3***的基因片段序列
<400>2
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caaagactggatcttgtggatttcctttgccatatcatgctttttgctttgtgttgtctt1620
gctgggtttcattatgtggcttgcccagagaggcaaccaa1660
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>引物F
<400>3
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<210>4
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<212>DNA
<213>引物R
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<213>HA(F)
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<210>6
<211>26
<212>DNA
<213>HA(R)
<400>6
ggatcctcaaatgcaaatgttgcacc26
Claims (3)
1.一种表达H3N2犬流感HA蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体,其特征在于,在pPoly2-CAV2-△E3质粒的SalI和NruI酶切位点之间***SEQIDNO:2所示基因片段。
2.一种表达H3N2犬流感HA蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1.PCR扩增获得SEQIDNO:1所示的犬流感病毒H3N2亚型的HA基因序列;
S2.将权利要求1所述的HA基因***pMD18-T质粒中,构建重组质粒pMD18-T-HA;
S3.同时双酶切重组质粒pMD18-T-HA和pEGFP-C1载体,酶切产物连接后构建重组质粒pEGFP-C1-HA;
S4.同时双酶切重组质粒pEGFP-C1-HA和pVAXE3载体,酶切产物连接后构建重组载体pVAXE3-HA。
3.根据权利要求1的构建方法,其特征在于,PCR扩增的引物序列如SEQIDNO:3~4所示。
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2015
- 2015-12-25 CN CN201510988157.4A patent/CN105463021A/zh active Pending
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