CN104561092A - 表达猪瘟病毒e2蛋白重组prrs病毒基因工程疫苗的构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组质粒的构建方法，以及根据该重组质粒构建的基因工程疫苗。基于反向遗传操作平台，根据猪瘟石门株和猪瘟兔化弱毒株C株的E2基因，以及高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞致弱疫苗株HuN4-F112的基因构建了pA-SM-E2和pA-C-E2这两个重组质粒。转染MARC-145细胞后，成功拯救出活病毒，并且发现重组病毒(vA-SM-E2和vA-C-E2)与亲本毒vHuN4-F112具有相似的病毒学特性。选取vA-SM-E2进行了猪体免疫实验，发现其对猪体具有较好的安全性，免疫后可以有效诱导机体产生免疫应答，产生高水平的针对PRRSVN蛋白和CSFV？E2蛋白的抗体，是一种良好的基因工程疫苗候选株。

Description

表达猪瘟病毒E2蛋白重组PRRS病毒基因工程疫苗的构建方法和应用

背景技术：

本发明属于生物工程领域，具体地说，涉及一种病毒的重组质粒和基因工程疫苗，更具体地说，涉及一种能够表达CSFV E2蛋白的PRRS病毒重组质粒和基因工程疫苗。

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是一种严重影响养猪业的接触性传染病，给世界各国造成的经济损失巨大。其病原PRRSV一直处于不断的变异及进化过程中。目前，反向遗传操作被广泛应用于研究PRRSV的生物学特性、致病机理、毒力决定因子以及不断变异的分子机制，而其基因组作为外源基因表达载体的研究也被广泛开展。PRRSV的基因组中除ORF1和ORF2以及ORF4和ORF5外，具结构蛋白编码框架之间有少则几个多则逾百的碱基重叠(overlap)。相关研究表明：ORF重叠区的影响会导致嵌合病毒失去感染性，因此可选择非重叠区或者将重叠区拉开作为外源基因的***位点。需要注意的是外源基因的***原则应以能在最小程度上改变病毒基因组为基础。但即便如此，***外源基因也会在传代过程中逐渐丢失编码序列以致无法发挥其功能。呈现遗传不稳定性。Dr.Dongwan Yoo 2009年报道了其在ORF1b和ORF2之间***了GFP基因，如果在其3′端下游***一个二级结构简单的(由其自身及周围序列形成)转录调控序列6(TRS6)的拷贝，让外源基因的表达被一个独立的转录子所引导。所构建的突变体克隆能够在至少37代次的传达过程中保遗传稳定。Dr.Chengbao Wang的研究则表明TRS6拷贝的***同样能够使在其他位点***的外源序列稳定。

猪瘟病毒(CSFV)的囊膜糖蛋白E2(gp55)基因编码的蛋白具有很强的免疫原性，能够诱导产生中和抗体，是引起动物机体产生保护性免疫的主要抗原蛋白。目前已被批准生产的猪瘟标记疫苗是Advasure(Pfizer，UK)和Porcilis Pesti(Intervet，the Netherlands)二者均是以猪瘟病毒E2蛋白为基础开发的亚单位疫苗。

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)和猪瘟(CSF)都是临床上非常重要的猪传染病，本发明旨在高致病性PRRSV细胞致弱疫苗株HuN4-F112的全长感染性克隆骨架上，***CSFV的E2基因，获得能够稳定表达E2蛋白的重组PRRS病毒，对其进行一系列病毒特性分析及遗传稳定性检测；并在病毒复制、转录、翻译水平对其与亲本病毒进行比较分析。继而在动物体内进行免疫保护性试验以评估其作为疫苗候选株的可行性。因为临床上PRRSV和CSFV两种单苗使用不当会有干扰，而本研究中获得的重组疫苗可以回避这种干扰，达到“一针防两病”的效果。

发明内容：

本发明的目的在于，提供一种表达猪瘟E2基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒的构建方法。

本发明的构建表达猪瘟E2基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合重组质粒的方法，为根据猪瘟石门株和猪瘟兔化弱毒株C株的E2基因，以及高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞致弱疫苗株HuN4-F112的基因序列设计SOE PCR引物，在HuN4-F112的ORF1b和ORF2之前***CSFV的E2基因，并在外源基因3′端下游***此病毒的转录调控序列6(TRS6)。将扩增出的两个嵌合E2片段通过Asc I和EcoR V双酶切，然后回收PCR产物连接到HuN4-F112的Asc I和EcoR V双酶切载体上，从而获得了两个嵌合重组质粒pA-SM-E2和pA-C-E2。

本发明的嵌合CSFV E2的PRRSV的基因工程活疫苗候选株，是能够稳定表达CSFV石门株E2蛋白的高致病性PRRSV细胞传代致弱株HuN4-F112嵌合重组弱毒疫苗株。

本发明的表达CSFV石门株E2的PRRSV基因工程活疫苗的构建方法包括以下步骤：首先通过SOE PCR的方法扩增出含有CSFV石门株E2的PRRSV突变片段，然后将扩增出的PCR片段和高致病性PRRSV细胞传代致弱疫苗株HuN4-F112进行Asc I和EcoR V酶切，最后将酶切后的突变PCR片段和HuN4-F112的双酶切片段进行连接，并转化TOP10感受态细胞，然后通过筛选获得基因工程活疫苗vA-SM-E2，从而提供了相应的构建方法。

本发明同时提供一种猪瘟E2基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合疫苗的制备方法，所述方法按以下步骤进行：(1)制苗用细胞的传代与培养：将Marc145或MA104细胞系经EDTA胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成单层时，备用；(2)细胞毒种的繁殖：将病毒液按1/10的体积量接入已经生长成良好细胞单层的细胞瓶，吸附1小时后，加入细胞维持液于细胞系单层，继续培养，当70-80％细胞出现病变后收获，收获的毒液冻融2-3次后置-15℃以下保存，取少量做半成品检验；(3)配苗、分装及冻干：将检验合格的病毒培养液，与常规稳定剂按1∶1的体积比在一容器内混合，充分摇匀，定量分装；每头份含细胞毒液不少于10^5.0TCID₅₀，分装后进行冷冻干燥即得成品。

使用本发明所构建的重组质粒pA-SM-E2和pA-C-E2，转染MARC-145细胞后所拯救出来的病毒具有和亲本病毒vHuN4-F112相似的病毒生物学特性。并且在至少连续20代次的传代过程中能够保持遗传稳定性。同时，基于上述重组质粒，构建的一株嵌合重组疫苗株vA-SM-E2对猪体具有较好的安全性，免疫后可有效诱导机体产生免疫应答，不仅能够产生高水平的与亲本疫苗相似的PRRSV N蛋白抗体，而且能够产生显著的抗CSFV E2的抗体水平，这些抗体在免疫猪体七天后即可以产生，在28天-35天左右抗体水平达到峰值，具有良好的免疫效果。

附图说明

图1是CSFV E2嵌合重组质粒构建示意图

图2是SOE PCR引物扩增CSFV石门株E2和C株E2基因不同的PCR片段的电泳检测结果，其中，图2a为由pHuN4-F112为模板，引物HF11559和CSFV-E2-R1获得的长度约为450bp的PCR产物SOE-1和以pHuN4-F112为模板，引物CSFV-E2-F4和HR13090获得的长度约为1100bp的PCR片段SOE-4；图2b为由石门株和C株猪瘟病毒cDNA为模板，CSFV-E2-F2和CSFV-E2-R2/R3为上下游引物所获得的1200bp的PCR产物SOE-2；图2c为以SOE-1和SOE-2回收产物为模板，引物HF11559和CSFV-E2-R2/R3为引物扩增出的1650bp长度的PCR产物；图2d为由SOE-3和SOE-4的回收产物为模板，引物HF11559和HR13090扩增出的2750bp长度的PCR产物SOE-5；图2e为由SOE-5的EcoR V和Asc I双酶切电泳结果。

图3a是构建好的嵌合重组质粒pA-SM-E2、pA-C-E2以及亲本质粒pHuN4-F112的EcoR V和Asc I双酶切鉴定结果，图3b是对嵌合重组质粒的Swa I线性化电泳结果，图3c是对线性化模板的体外转录RNA的电泳鉴定。

图4是Kas I酶切嵌合重组质粒pA-SM-E2、pA-C-E2以及亲本质粒pHuN4-F112的电泳结果，其中，泳道1是Kas I酶切的pA-SM-E2，泳道2是Kas I酶切的pA-C-E2，泳道3是Kas I酶切的阳性对照pHuN4-F112，泳道4是Marker DL2,000，泳道5是Marker DL15,000。

图5是用重组质粒转染细胞后出现的细胞病变结果。

图6是拯救病毒的N蛋白和CSFV E2蛋白的免疫荧光照片，其中，A是被拯救病毒vA-SM-E2P20代的N蛋白、CSFV E2蛋白免疫荧光照片以及细胞核染图片；B是被拯救病毒vA-C-E2 P20代的N蛋白、CSFV E2蛋白免疫荧光照片以及细胞核染图片；C是vHuN4-F112的N蛋白、CSFV E2蛋白免疫荧光照片以及细胞核染图片；D为阴性对照。

图7是对拯救病毒株与野毒株病毒滴度比较结果，生长曲线的描绘。

图8是试验及对照组猪在表达CSFV E2重组病毒株vA-SM-E2病毒免疫接种后每天的体温变化。

图9是在vA-SM-E2和vHuN4-F112株病毒接种后第0，7，14，21，28，35，42，49天的PRRSVN蛋白抗体变化图。

图10是在vA-SM-E2和vHuN4-F112株病毒接种后第0，7，14，21，28，35，42，49天的CSFV E2蛋白抗体变化图。

图11是在vA-SM-E2和vHuN4-F112株病毒接种后第7，14，21，28天的血清病毒载量变化图。

具体实施方式

在本发明中，所述嵌合重组质粒指的是，利用反向遗传操作技术，将CSFV石门株和C株E2基因***HuN4-F112基因组骨架中所获得的pA-SM-E2和pA-C-E2。

在本发明中，所述嵌合重组病毒指的是，利用基因嵌合技术获得的全长重组质粒pA-SM-E2和pA-C-E2转染MARC-145细胞后拯救出的活病毒。

在本发明中，所述的反向遗传操作指的是：相对于经典遗传学而言的，是在获得的高致病性PRRSV细胞致弱毒株HuN4-F112的感染性克隆骨架上，通过SOE PCR的方法或者定点突变的方法对病毒基因进行必要的加工和修饰，进行外源基因的***，再按组成顺序构建全长病毒基因组，让其装配出具有生物活性的病毒粒子，研究突变病毒与亲本病毒在病毒生物学特性上的变化，以及外源基因***可能对病毒的表型、性状有何种影响等方面的内容。

在本发明中，所述高致病性PRRSV细胞致弱毒株HuN4-F112的Genbank登录号是EF635006。

在本发明中，所述细胞致弱毒株HuN4-F112指的是，参考文献Shanrui Zhang，YanjunZhou，Yifeng Jiang，Guoxin Li，Liping Yan，Hai Yu，Guangzhi Tong.Generation of an infeetiousclone of HuN4-F112，an attenuated live vaccine strain of porcine reproductive and respiratorysyndrome virus的方法所构建的感染性克隆。

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。

在本发明的实施例中，使用的病毒和细胞：MARC-145细胞(非洲绿猴肾细胞系)

在本发明的实施例中，使用的质粒与菌株：pBlueScript II SK(+)载体购自Invitrogen公司，pBS-T载体、TOP10感受态细胞购白TIANGENE公司。

在本发明的实施例中，使用的其他试剂：QIAamp Viral RNA Mini Kit购自QIAGENE公司，pfu II DNA Polymerase购自Strategene公司，T7 mMESSAGE High Yield Capped RNATranscription Kit购自Ambion公司，胶回收试剂盒和Quant ReverseTranscriptase购自TIANGENE公司，rTaq DNA聚合酶，dNTP和限制性内切酶购自TaKaRa公司，质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，DMRIE-C转染试剂购白Invitrogen公司，Opti-MEM购自Invitrogen公司。

在本发明的实施例中，MARC-145单层细胞采用以下方法制备：

MARC-145细胞在含有10％FBS的DMEM培养基的六孔板中贴壁长满单层后，弃培养基，PBS洗两遍后加入0.01MOI的病毒500微升吸附1小时后，弃吸附液，PBS洗两遍后加入维持液(2％FBS的DMEM)培养基，37℃5％CO₂培养箱中培养。

实施例1表达CSFV E2蛋白的嵌合重组质粒的构建

根据GenBank登录号为EF635006和HM175885碱基序列，设计出6条引物，用来进行SOE PCR扩增，过程如图2所示，然后分别通过细胞转染实验，验证了获得的嵌合重组质粒的感染性，具体过程如下：

1.1引物设计

根据GenBank登录号为EF635006的HuN4-F112的碱基序列和登录号为HM175885的猪瘟病毒序列，设计SOE PCR引物，分别命名为：HF11559、HR13090、CSFV-E2-F2、CSFV-E2-R1、CSFV-E2-F4、CSFV-E2-R2/R3，其序列分别如下所示：

HF11559：5′-TCATACATCCGAGTTCCTGTT-3′SEQ ID NO.1

HR13090：5′-GAAATATTGTCATGGCGAGGC-3′SEQ ID NO.2

CSFV-E2-F2：5′-TCATTGAACCAACTTTAGGCCTGAATTGAAatggcattcctcatctgcttg-3′SEQID NO.3

CSFV-E2-R1：5′-caagcagatgaggaatgccatTTCAATTCAGGCCTAAAGTT-3′SEQ ID NO.4

CSFV-E2-F4：5′-cagattacttcgcagaattttgaGTTCCGTGGCAACCCCTTTAACCAGATG-3′SEQID NO.5

CSFV-E2-R2/R3：5′-CATTGTTCCGCTGAAACTCTGGTTAAAGGGGTTGCCACGGAACtcaaaattctgcgaagtaatctg-3′SEQ ID NO.6

具体构建步骤如下：

1.1.1扩增SOE-1PCR产物

以pHuN4-F112作为模板，引物HF11559和CSFV-E2-R1分别作为上游引物和下游引物，PCR扩增突变片段SOE-1，具体如下：

PCR反应体系为：pHuN4-F112质粒模板1μL，上下游引物对(10μM)各1μL，10×pfu Buffer5μL，2.5mM dNTP 4μL，pfu II Turbo DNA聚合酶5units，加水至50μL。

PCR反应参数为：95℃预变性2min，95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸15s，共进行35个循环，然后72℃延伸3min。

取PCR反应产物，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2a所示，根据检测结果，获得的目的片段大小为450bp。

1.1.2扩增SOE-2PCR产物

以石门株和C株猪瘟病毒cDNA为模板，引物CSFV-E2-F2和CSFV-E2-R2/R3分别作为上游引物和下游引物，PCR扩增SOE-2，具体如下：

PCR反应体系为：石门株和C株猪瘟病毒cDNA1μL，上下游引物对(10μM)各1μL，10×pfuBuffer 5μL，2.5mM dNTP 2μL，pfu II Turbo DNA聚合酶5units，加水至50μL。

PCR反应参数为：95℃预变性2min，95℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸20s，进行35个循环，再72℃延伸3min。

取PCR反应产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2b所示，根据检测结果，获得的目的片段大小为1200bp。

1.1.3扩增SOE-4PCR产物

PCR反应体系为：以pHuN4-F112作为模板，以CSFV-E2-F4和HR13090上下游引物对(10μM)各1μL，10×pfu Buffer 5μL，2.5mM dNTP 2μL，pfu II Turbo DNA聚合酶5units，加水至50μL。

PCR反应参数为：95℃预变性2min，95℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸20s，进行35个循环，再72℃延伸3min。

取PCR反应产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2a所示，根据检测结果，获得的目的片段大小为1100bp。

1.1.4扩增SOE-3PCR产物

PCR反应体系为：以SOE-1和SOE-2 PCR回收产物作为模板，以HF11559和CSFV-E2-R2/R3上下游引物对(10μM)各1μL，10×pfu Buffer 5μL，2.5mM dNTP 2μL，pfu IITurbo DNA聚合酶5units，加水至50μL。

PCR反应参数为：95℃预变性2min，95℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸30s，进行35个循环，再72℃延伸3min。

取PCR反应产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2c所示，根据检测结果，获得的目的片段大小为1650bp。

1.1.5扩增SOE-5PCR产物

PCR反应体系为：以SOE-3和SOE-4 PCR回收产物作为模板，以HF11559和HR13090上下游引物对(10μM)各1μL，10×pfu Buffer 5μL，2.5mM dNTP 2μL，pfu II Turbo DNA聚合酶5units，加水至50μL。

PCR反应参数为：95℃预变性2min，95℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸45s，进行35个循环，再72℃延伸3min。

取PCR反应产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2d所示，根据检测结果，获得的目的片段大小为2750bp。

2.2表达CSFV E2蛋白重组PRRSV质粒的构建

将上述SOE-5的PCR产物使用Asc I/EcoR V进行双酶切，结果见图2e再与经过Asc I和EcoR V双酶切的亲本病毒全长质粒pHuN4-F112的大片段通过T4 DNA连接酶连接，经测序鉴定后筛选出阳性克隆，获得pA-SM-E2和pA-C-E2，构建策略如图3所示。

具体步骤如下：

于37℃水浴中，用Asc I/EcoR V分别对SOE-5的PCR产物和亲本病毒全长质粒pHuN4-F112进行双酶切，反应体系为SOE-5突变片段41μL，Asc I 2μL，EcoR V 2μL，10×NEB Buffer4 5μL；pHuN4-F112 15μL，Asc I 2μL，EcoR V 2μL，10×NEB Buffer4 5μL，ddH₂O26μL。

将SOE-5的PCR产物和相应的载体的Asc I/EcoR V双酶切片段以摩尔比3∶1的比例，以T4 DNA连接酶连接，转化TOP10，挑取独立的菌落进行纯培养，提取质粒DNA，1％凝胶电泳，挑取大小为18kb的质粒进行测序，筛选阳性克隆。

对所获得的待鉴定质粒进行Kas I酶切检测是否有大片段的缺失，酶切体系为：突变质粒41.5μL，Kas I 3μL，ddH2O 0μL，100×BSA 0.5μL，10×NEB Buffer3 5μL)，37℃水浴酶切过夜。对酶切产物进行电泳鉴定，结果见图4所示，测序拼装后确定pA-SM-E2、pA-C-E2的全长序列分别如SEQ ID NO.7、8所示。

1.3病毒RNA的制备

1.3.1质粒的Swa I线性化

于37℃水浴中，用Swa I分别对嵌合重组质粒pA-SM-E2、pA-C-E2以及亲本质粒pHuN4-F112进行线性化酶切(反应体系为：突变质粒41.5μL，Swa I 3μL，ddH2O 0μL，100×BSA 0.5μL，10×NEB Buffer3 5μL)，酶切过夜。参考说明书的方法，用QIAquiek PCRPurification Kit纯化酶切产物，分别获得纯化的线性化质粒，见图3。

1.3.2、体外转录

参考说明书的方法，使用T7 mMESSAGE High Yield Capped RNA Transeription Kit(购自Ambion公司)体外转录纯化后的线性化质粒，并采用RNA电泳鉴定，根据鉴定结果，见图3，获得了pA-SM-E2、pA-C-E2的体外转录RNA。

1.4表达CSFV E2蛋白的PRRSV重组质粒的检测

1.4.1 RNA的转染

接种MARC-145细胞(非洲绿猴肾细胞系，购自美国ATCC)于六孔板中培养，待细胞密度为80-90％时，向每孔中分别加入pA-SM-E2、pA-C-E2的in vitro RNA和2μL DMRIF-C转染试剂，在1mL的Opti-MEM中振荡混匀，然后根据转染试剂说明书的方法，转染MARC-145细胞，并且逐日观察细胞病变。

待出现如图5所示的细胞病变(CPE)后，收取上清并传代，上清收取及传代过程具体如下：MARC-145细胞在含有10％FBS的DMEM培养基的六孔板中贴壁长满单层后，弃培养基，PBS洗两遍，吸取转染过后五天的上清液，将其与维持液(含2％FBS的DMEM)按照1∶10的比例接种上清液200μL，置37℃继续培养并采用上述方法继续传代，并收取第五代的病毒上清，然后按照QIAGEN公司RNA提取试剂盒中的操作方法提取上清病毒RNA，获得病毒vA-SM-E2、vA-C-E2。

根据上述结果，获得的重组质粒vA-SM-E2和vA-C-E2具有感染性，能够从单一的基因组序列成功转变为具有活性的病毒粒子并具有相应的病毒感染性。

1.4.2、间接免疫荧光检测

按照实施例1.4.1中的RNA转染步骤，分别以纯化后1000倍稀释的病毒vA-SM-E2、vA-C-E2，感染单层MARC-145细胞，然后于感染36h后弃去培养基，用冰甲醇固定10min，1％BSA室温封闭30min，分别用PRRSV核衣壳蛋白的特异性单抗(1∶800稀释)和CSFV E2蛋白的特异性单抗(1∶1000倍稀释)室温孵育2h，再加入FITC标记的羊抗鼠的二抗室温孵育1h，PBS洗五遍后，在荧光显微镜下观察，结果如图6所示。

根据图5的结果：vA-SM-E2和vA-C-E2于转染后第5天出现了明显的CPE，以无限稀释法传代纯化嵌合病毒vA-SM-E2和vA-C-E2，并且以间接免疫荧光分别检测感染嵌合病毒vA-SM-E2和vA-C-E236h后的MARC-145细胞，出现了特异性荧光。

同时，利用RT-PCR技术检测原代(P0)和子代(P5、P10、P15、P20)病毒，结果显示，E2基因能够稳定存在于PRRSV基因组中。

上述结果说明：利用反向遗传操作***获得了和亲本毒vHuN4-F112具有相似生长特性的CSFV E2蛋白嵌合的全长重组质粒，同时证明在外源基因CSFV E2的***不影响整个病毒的生长，是可行的。

1.4.3病毒细胞半数感染量(TCID₅₀)测定

参照Pizzi，M.，Sampling variation of the fiftypercent end-point，determinedby theReed-Muench(Behrens)method，Hum Biol，1950.22(3)：p 151-90.中的方法，用96孔组织培养板方法进行感染性滴度的测定。将上述感染细胞后收取的病毒上清用维持液(2％FBS的DMEM)作10倍系列稀释后，将10^-1-10^-9连续稀释的病毒接种96孔细胞培养板上的MARC-145单层细胞，每稀释度接种8孔，每孔0.1mL，再设2列对照(即用维持液代替病毒液)，置37℃5％的二氧化碳培养箱中培养，6-7天后观察感染细胞，记录出现细胞病变的孔数，并按Reed-Muench法计算TCID₅₀。

1.4.4病毒多步生长曲线的绘制

分别以低剂量(0.01MOI)病毒(vA-SM-E2、vA-C-E2和vHuN4-F112)感染MARC-145细胞，分别在感染后不同的时间段(0h、6h、12h、24h、36h、48h、72h、84h、96h、108h、120h)收取细胞培养上清，并进行病毒滴度的测定，收取的每个时间点病毒用TCID₅₀计算滴度，并根据不同时间点病毒的滴度，绘制病毒多步生长曲线，结果如图6所示，根据该图，在感染10h后病毒形成第一个复制高峰期，随后在第50h出现第二个复制高峰期；野毒株vHuN4-F112与嵌合病毒vA-SM-E2、vA-C-E2之间的差异不显著。结果说明利用反向遗传操作技术，获得的全长CSFV E2嵌合重组质粒拯救出来的病毒和亲本毒株在病毒的增殖各个时间点的病毒滴度，指数增长期，平台期等生长曲线方面具有相似的生物学活性，见图7。

根据实施例2，本发明在高致病性PRRSV细胞传代致弱株全长感染性克隆pHuN4-F112的骨架上，利用SOE PCR的方法，在ORF1b和ORF2之间***猪瘟石门株和C株的E2蛋白，获得了两个嵌合质粒pA-SM-E2和pA-C-E2，经病毒拯救，获得了活病毒，经RT-PCR鉴定，嵌合病毒能够稳定传代20次而不发生缺失，因此，上述2个嵌合病毒，可作为新型PRRSV疫苗。

从上述两个嵌合病毒中，任取一个进行动物实验，以验证其对猪繁殖与呼吸综合征病毒是否具有免疫作用，在本发明的实施例3中，使用的是pA-SM-E2。

1.4.5、动物免疫试验

将14头30日龄的健康猪分为三组。第一组(A组)由5头CSFV以及PRRSV抗原抗体双阴性的猪组成，作为本次试验的HuN4-F112-E2免疫组，每头肌肉注射嵌合病毒HuN4-F112-E2(TCID₅₀10⁵/mL)1mL。第二组(B组)由5头PRRSV抗原抗体阴性的猪组成，作为HuN4-F112免疫组，每头肌肉注射HuN4-F112(TCID₅₀10⁵/mL)1mL。第三组(C组)由4头CSFV以及PRRSV抗原抗体双阴性的猪组成(注射DMEM)，作为完全阴性对照组，每头肌肉接种DMEM 2mL。三组隔离饲喂，每天测量体温并进行临床观察，并在免疫后每隔7天进行采血，使用IDEXX猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征ELISA检测试剂盒，分别检测三组的CSFVE2抗体水平和PRRSV N蛋白抗体水平。

A，B，C三组体温，精神状况均正常，剖检未见明显病理变化。具体体温变化见图8，PRRSV抗体水平见图9，CSFV E2抗体水平见图10。

由图9可见，HuN4-F112为骨架构建的嵌合病毒HuN4-F112-E2，在接种后能够达到与HuN4-F112相当的PRRSV抗体水平，并在接种后28天，抗体阳性率达到百分之百。重组毒除了具有与其亲本毒HuN4-F112相同的较高的PRRSV抗体水平外，还具有很高的CSFV抗体水平，见图10，在接种后的第七天就已经能够达到CSFV抗体阳性率百分之百，并且平行实验的5头猪都具有相似的极为显著的抗体水平，抗体阳性率高达百分之百。为了验证嵌合病毒与其亲本毒是否引起病毒血症，评价其安全性，通过绝对定量荧光定量PCR对二者的病毒载量进行检测与比较，对重组毒与其亲本毒进行病毒拷贝数的检测，结果表明二者病毒拷贝数都在很低的水平，接近阴性阈值(图11)，说明二者都不会引起病毒血症，并且其在病毒拷贝数方面基本持平，说明重组毒的病毒复制能力并未因为外源基因的***而受到明显的影响。

Claims (7)

1.一种猪瘟E2基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合重组质粒的制备方法，所述制备方法为利用SOE PCR制备嵌合重组质粒。

2.如权利要求1所述的制备方法，所述方法具体为：根据猪瘟石门株或猪瘟兔化弱毒株C株的E2基因，以及高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞致弱疫苗株HuN4F112的基因序列设计SOE PCR引物，在HuN4-F112的ORF1b和ORF2之前***CSFV的E2基因，并在外源基因3′端下游***此病毒的转录调控序列6；将扩增出的两个嵌合E2片段通过Asc和EcoR V双酶切，然后回收PCR产物连接到HuN4-F112的Asc I和EcoR V双酶切载体上，从而获得了嵌合重组质粒。

3.利用权利要求1或2的方法制备获得的嵌合重组质粒。

4.如权利要求3所述的嵌合重组质粒，所述嵌合重组质粒为pA-SM-E2和pA-C-E2。

5.一种猪瘟E2基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合疫苗的制备方法，所述方法按以下步骤进行：(1)制苗用细胞的传代与培养：将Marc145或MA104细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成单层时，备用；(2)细胞毒种的繁殖：将病毒液按1/10的体积量接入已经生长成良好细胞单层的细胞瓶，吸附1小时后，加入细胞维持液于细胞系单层，继续培养，当70-80％细胞出现病变后收获，收获的毒液冻融2 3次后置-15℃以下保存，取少量做半成品检验；(3)配苗、分装及冻干：将检验合格的病毒培养液，与常规稳定剂按1∶1的体积比在一容器内混合，充分摇匀，定量分装；每头份含细胞毒液不少于10^5.0TCID₅₀，分装后进行冷冻干燥即得成品。

6.如权利要求6所述的制备方法，所述病毒液的制备方法为：将pA-SM-E2和pA-C-E2质粒Swa I线性化；体外转录；RNA的转染；待出现细胞病变后，收取上清并传代获得病毒vA-SM-E2、vA-C-E2。

7.利用权利要求5或6的方法制备得到的猪瘟E2基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合疫苗。