CN105440163A - 一种制备及纯化依诺肝素钠的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种依诺肝素钠制备及纯化的方法，依诺肝素钠的粗品在经离心分离和醇沉除杂后，就可以得到满足药典标准的依诺肝素钠成品。本发明收率高、操作简便，产品澄清度好，可以满足制药工业的需要。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体地涉及一种依诺肝素钠的生产及纯化方法。
背景技术
肝素自上世纪80年代以来一直是预防和治疗血栓类药物的首选药物。低分子肝素是由普通肝素通过特异性的化学切割和纯化分离制成，由于其疗效确切，副作用小而且可预测等优点，逐步取代了传统肝素的市场地位。
依诺肝素钠(EnoxaparinSodium)属于低分子肝素，主要特征为分子中有一个4-烯吡喃糖醛酸结构。本品抗血栓作用强、出血危险性小，是目前抗凝血、抗血栓形成的主要治疗药物之一。
依诺肝素钠通过对猪肠黏膜肝素的苄基酯衍生物进行碱解聚而获得，其基本步骤为：以猪黏膜肝素为起始原料，经肝素季铵盐制备、肝素苄酯制备、对肝素苄酯进行碱解聚，以酸中和、醇沉淀，精制、脱色，脱水干燥，得到依诺肝素钠成品。其中，在酸中和、醇沉淀后得到的依诺肝素钠中间体，其澄清度往往很差，如果不加以精制纯化，就无法达到药典中澄清度的要求。
现有的纯化方法主要分为以下几种：（1）将依诺肝素钠用活性炭脱色，经大孔树脂过滤，滤液冻干得到纯化依诺肝素钠，该方法脱色效果较好，但缺点是会有大量的产品吸附在活性炭和树脂中，收率仅能达到60%左右；（2）将依诺肝素钠用氢氧化钠调pH，用双氧水脱色，经氯化钠和乙醇洗涤后冻干，得到纯化依诺肝素钠，该方法需要用到氧化性极强的双氧水，在除去色素的同时容易导致其他副产物的产生，并且对环境污染较大，很难达到环评要求；（3）将依诺肝素钠依次通过疏水层析柱和阴离子交换树脂，经纳滤脱盐后，沉淀、干燥获得纯化的依诺肝素钠，该方法需过多次层析柱，产品损耗很大；（4）将依诺肝素钠依次通过过滤、微滤和超滤装置，冻干后得到纯化依诺肝素钠，该方法产品损失较小，但这种分级超滤的操作压力较大，不适宜在工业上应用；（5）将依诺肝素钠用氯化钠溶液和甲醇反复处理，最终获得澄清度达标的依诺肝素钠，该方法操作简便，容易在工业上实现，但其纯化效果较差，而且每次反复处理的次数难以准确确定，不利于生产标准的建立。
由于依诺肝素钠广阔的市场前景和现有纯化技术存在诸多弊端，开发一种能够适合工业生产使用的、快速简便的纯化依诺肝素钠的方法就成为了亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种收率高、操作简便的提高依诺肝素钠纯度的方法。
一种依诺肝素钠制备及纯化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将依诺肝素钠粗品，放入氯化钠溶液中溶解，得到依诺肝素钠粗品溶液，过滤；
（2）将步骤（1）所得滤液经离心分离，得上清液和沉淀物；
（3）将乙醇或甲醇加入到步骤（2）中获得的上清液中，搅拌并静置后得到沉淀物；
（4）将沉淀物用纯化水溶解成10wt~15wt%的溶液，用0.1μm滤膜过滤后，喷雾干燥得依诺肝素钠成品。
步骤（1）中氯化钠溶液的浓度为5-15%，依诺肝素钠粗品与氯化钠溶液的重量/体积比为1:5-10。
步骤（2）中离心分离的转速为1000~3000r/min，离心时间为10min~60min。
步骤（3）中乙醇或甲醇与上清液的体积比为1-5:1，搅拌时间为1~3h，静置时间为3-10h。
研究发现，影响依诺肝素钠澄清度的杂质主要来源于肝素钠中的大分子蛋白和小分子的寡糖，这些杂质在依诺肝素钠的制备过程中，其分子中的醛基经“美拉德反应”会产生有色物质。本发明先采用高速低温离心除去了大分子的蛋白，再通过醇沉法除去寡糖等小分子杂质，从而达到了纯化依诺肝素钠的目的。
与现有纯化方法相比，本发明所述方法收率可达90%以上，且产品澄清度好，纯化操作简便，非常适合制药工业生产。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：依诺肝素钠粗品的制备
步骤（1）：肝素苄索氯铵盐的制备
在反应罐中投入肝素钠1kg和纯化水20L，搅拌约20分钟，溶解完全后，转移到消去罐中。在反应罐中投入苄索氯铵2.5kg和纯化水20L，搅拌约20分钟，溶解完全后，将苄索氯铵溶液抽入消去罐中，搅拌反应30分钟。将补充的纯化水60L加入消去罐中，继续搅拌10分钟，静置30分钟。将反应混合液过滤，滤饼用纯化水打浆3次（50kg、50kg、60kg）。收集滤饼，在60℃±2℃热水、真空度大于0.08MPa下真空干燥10小时，得肝素苄索氯铵盐2.1kg。
步骤（2）：肝素苄基酯的制备
在洁净干燥的酯化罐中投入肝素苄索氯铵盐2.1kg和二氯甲烷20L，搅拌状态下升温至35℃±1℃，保温反应1小时。投入氯化苄9kg，继续保温反应25小时。反应毕，加入醋酸钠-甲醇溶液，加毕继续反应30分钟。反应液过滤，滤饼用甲醇打浆2次，再洗涤一次。收集滤饼，在室温下真空干燥10小时，得肝素苄基酯1.3kg。
步骤（3）：肝素苄基酯的降解
在降解罐中投入肝素苄基酯1.3kg和纯化水10L，搅拌状态下升温至60℃±2℃。在配碱罐中投入氢氧化钠150g和纯化水1L，搅拌溶解，控温至60℃±2℃。将配碱罐中的氢氧化钠溶液抽入降解罐中，保温反应2小时。反应毕，冷却至室温，滴加2N盐酸酸化，调节反应液pH至6~7，继续搅拌5分钟，过滤。滤液中加入氯化钠0.5kg，搅拌30分钟，溶解完全后转移到沉淀罐中，加入5L甲醇，加毕，继续搅拌5分钟，过滤，收集滤饼，干燥得依诺肝素钠粗品1.1kg。
实施例2依诺肝素钠的纯化
将实施例1制备得到的依诺肝素钠粗品1.1kg放入5L10%的氯化钠溶液中搅拌溶解，得到依诺肝素钠粗品溶液，过滤得到滤液。将滤液在2000r/min的离心机中30min，得上清液和沉淀物。将10L乙醇加入到上清液中，搅拌1h后静置3h，得沉淀物。将沉淀物用纯化水溶解成10wt~15wt%的溶液，用0.1μm滤膜过滤后，喷雾干燥得依诺肝素钠成品1.02kg，纯化收率92.7%。
实施例3依诺肝素钠的纯化
将实施例1制备得到的依诺肝素钠粗品1.1kg放入10L5%的氯化钠溶液中搅拌溶解，得到依诺肝素钠粗品溶液，过滤得到滤液。将滤液在2000r/min的离心机中30min，得上清液和沉淀物。将10L甲醇加入到上清液中，搅拌1.5h后静置5h，得沉淀物。将沉淀物用纯化水溶解成10wt~15wt%的溶液，用0.1μm滤膜过滤后，喷雾干燥得依诺肝素钠成品1.01kg，纯化收率91.8%。
实施例4成品检验
按照欧洲药典8.0（EP8.0）记载的方法对本发明制备得到的依诺肝素钠成品进行了检测：重均分子量：4350-4500
小于2000的分子量：14%-18%
2000-8000分子量：72%-77%
抗Xa效价：106-120IU/mg
抗IIa效价：25-29IU/mg
抗Xa与抗IIa的比为：3.5-4.0
pH：6.5-7.0
231nm吸光度：17-18
苯甲醇残留：<0.05%
钠含量：11.5%-12.5%
澄清度：浅于1号浊度标准液
以上指标均达到了EP8.0的标准，尤其是澄清度一项，远高于EP8.0中记载的不高于6号浊度标准液的要求。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (6)
1.一种依诺肝素钠制备及纯化的方法,其特征包括如下步骤：
（1）将依诺肝素钠粗品放入氯化钠溶液中溶解，得到依诺肝素钠粗品溶液，过滤；
（2）将步骤（1）所得滤液经离心分离，得上清液和沉淀物；
（3）将乙醇或甲醇加入到步骤（2）中获得的上清液中，搅拌并静置后得到沉淀物；
（4）将沉淀物用纯化水溶解成10wt~15wt%的溶液，用0.1μm滤膜过滤后，喷雾干燥得依诺肝素钠成品。
2.根据权利要求1所述的一种依诺肝素钠制备及纯化的方法，其中的依诺肝素钠粗品制备方法为：
（1）肝素苄索氯铵盐的制备：在反应罐中投入肝素钠1kg和纯化水20L，搅拌约20分钟，溶解完全后，转移到消去罐中；在反应罐中投入苄索氯铵2.5kg和纯化水20L，搅拌约20分钟，溶解完全后，将苄索氯铵溶液抽入消去罐中，搅拌反应30分钟；将补充的纯化水60L加入消去罐中，继续搅拌10分钟，静置30分钟；将反应混合液过滤，滤饼用纯化水打浆3次，收集滤饼，在60℃±2℃热水、真空度大于0.08MPa下真空干燥10小时，得肝素苄索氯铵盐2.1kg；
（2）肝素苄基酯的制备：在洁净干燥的酯化罐中投入肝素苄索氯铵盐2.1kg和二氯甲烷20L，搅拌状态下升温至35℃±1℃，保温反应1小时，投入氯化苄9kg，继续保温反应25小时，反应毕，加入醋酸钠-甲醇溶液，加毕继续反应30分钟，反应液过滤，滤饼用甲醇打浆2次，再洗涤一次，收集滤饼，在室温下真空干燥10小时，得肝素苄基酯1.3kg；
（3）肝素苄基酯的降解：在降解罐中投入肝素苄基酯1.3kg和纯化水10L，搅拌状态下升温至60℃±2℃；在配碱罐中投入氢氧化钠150g和纯化水1L，搅拌溶解，控温至60℃±2℃；将配碱罐中的氢氧化钠溶液抽入降解罐中，保温反应2小时，反应毕，冷却至室温，滴加2N盐酸酸化，调节反应液pH至6~7，继续搅拌5分钟，过滤，滤液中加入氯化钠0.5kg，搅拌30分钟，溶解完全后转移到沉淀罐中，加入5L甲醇，加毕，继续搅拌5分钟，过滤，收集滤饼，干燥得依诺肝素钠粗品1.1kg。
3.根据权利要求1所述的一种依诺肝素钠制备及纯化的方法，其特征在于：步骤（1）中氯化钠溶液的浓度为5-15%，依诺肝素钠粗品与氯化钠溶液的重量与体积比为1:5-10。
4.根据权利要求1所述的一种依诺肝素钠制备及纯化的方法，其特征在于：步骤（2）中离心分离的转速为1000~3000r/min，离心时间为10min~60min。
5.根据权利要求1所述的一种依诺肝素钠制备及纯化的方法，其特征在于：步骤（3）中乙醇或甲醇与上清液的体积比为1-5:1，搅拌时间为1~3h，静置时间为3-10h。
6.根据权利要求所述的一种依诺肝素钠制备及纯化的方法，生产出的精品肝素钠的特征为：重均分子量：4350-4500；小于2000的分子量：14%-18%；2000-8000分子量：72%-77%；抗Xa效价：106-120IU/mg；抗IIa效价：25-29IU/mg；抗Xa与抗IIa的比为3.5-4.0；pH：6.5-7.0231nm；吸光度：17-18；苯甲醇残留：<0.05%；钠含量：11.5%-12.5%；澄清度：浅于1号浊度标准液。
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|---|---|---|---|---|
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| CN109467621A (zh) * | 2017-09-08 | 2019-03-15 | 山阳县恒瑞肉制品有限公司 | 一种依诺肝素钠的生产及纯化方法 |
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