CN105420175A - 枯草工程菌Bacillus subtilis及其构建以及利用其生产脱毛酶制剂的方法 - Google Patents

枯草工程菌Bacillus subtilis及其构建以及利用其生产脱毛酶制剂的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105420175A
CN105420175A CN201510890412.1A CN201510890412A CN105420175A CN 105420175 A CN105420175 A CN 105420175A CN 201510890412 A CN201510890412 A CN 201510890412A CN 105420175 A CN105420175 A CN 105420175A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacillus subtilis
engineering bacteria
depilation
fermentation
withered grass
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201510890412.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105420175B (zh
Inventor
郑翔
胡美荣
刘春卯
陶勇
薛刚
马清河
秦艳梅
胡常英
杨何宝
李江燕
董聪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hebei Institute Of Microbiology Co ltd
Institute of Microbiology of CAS
Original Assignee
HEBEI RESEARCH INSTITUTE OF MICROBIOLOGY
Institute of Microbiology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HEBEI RESEARCH INSTITUTE OF MICROBIOLOGY, Institute of Microbiology of CAS filed Critical HEBEI RESEARCH INSTITUTE OF MICROBIOLOGY
Priority to CN201510890412.1A priority Critical patent/CN105420175B/zh
Publication of CN105420175A publication Critical patent/CN105420175A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105420175B publication Critical patent/CN105420175B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C14—SKINS; HIDES; PELTS; LEATHER
    • C14C—CHEMICAL TREATMENT OF HIDES, SKINS OR LEATHER, e.g. TANNING, IMPREGNATING, FINISHING; APPARATUS THEREFOR; COMPOSITIONS FOR TANNING
    • C14C1/00—Chemical treatment prior to tanning
    • C14C1/06—Facilitating unhairing, e.g. by painting, by liming
    • C14C1/065—Enzymatic unhairing

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于微生物发酵，特别是指一种枯草工程菌Bacillus？subtilis及其构建以及利用其生产脱毛酶制剂的方法。是利用基因工程技术构建皮革脱毛用枯草工程菌Bacillus？subtilis？CGMCC？No.11625，将其接种于含有碳源、氮源、必要的营养元素及抗生素的无菌发酵培养基中经通气发酵制成发酵液，发酵液经后处理制成脱毛酶制剂。本发明有效解决了现有技术存在的现有脱毛酶制剂中胶原蛋白酶水解生皮中胶原蛋白而造成的烂皮、粒面破损的技术难题。具有各原料组分来源容易、制备方法及后处理工艺简单、所制备的酶制剂安全环保、对生皮质量损害较小等优点。

Description

枯草工程菌Bacillus subtilis及其构建以及利用其生产脱毛酶制剂的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵，特别是指一种枯草工程菌Bacillussubtilis及其构建以及利用其生产脱毛酶制剂的方法。
背景技术
皮革作为畜牧业的副产品，越来越多的引起人们重视。随着科学技术的进步，皮革制品档次日新月异，成品革面料向着薄、软、有力度方向发展。市场需要促进制革业发展，同时也要求制革业发展建立在节能减排、低碳环保的基础上，目前制革多采用灰碱法脱毛，灰碱法以硫化钠为主，将毛溶解，废水自然排出。一个转鼓每月要排除5吨盐碱废水，碱浓度高达25％以上，仅河北省蠡县一个制革区每月要排污水2000吨，全国要排1300万吨废水，一年排放约1.5亿吨废水，且未采取污水处理手段。经有关管理部门对制革区深井水测定，100米以上均被污染，污染物超过饮用水标准，对环境造成的污染严重危害了人体健康。中性蛋白酶能够消解生皮毛囊周围与表皮、真皮连结的蛋白，削弱毛与表皮、真皮的紧密依附，达到脱毛的目的。中性蛋白酶脱毛制剂项目的研发被业内专家普遍认为是节能、减排、治污制革理想的新技术，而且微生物酶制剂易得，资源丰富，制备过程没有污染，用于制革业完全符合国家节能减排的发展战略。推广使用后可节约水资源并减少污水排放量50％以上，有效的缓解制革业对环境的污染。
中性蛋白酶脱毛制剂具有广阔的前景，但由于野生菌株AS1.398发酵产蛋白酶系中胶原蛋白酶的存在，能水解生皮中胶原蛋白，不可避免损伤真皮的结构，影响皮制品的性能；而分离蛋白酶系中胶原蛋白酶工艺复杂，增加了酶制剂成本；且分离纯化工艺精细，不宜工厂化操作进而限制了酶制剂的推广应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种不含胶原蛋白酶基因但可以表达中性蛋白酶的枯草工程菌BacillussubtilisCGMCCNo.11625。
本发明的目的之二是提供一种上述工程菌的构建方法。
本发明的目的之三是提供一种利用枯草工程菌BacillussubtilisCGMCCNo.11625生产脱毛酶制剂的方法。
本发明的整体技术构思是：
一种枯草工程菌BacillussubtilisCGMCCNo.11625。
本发明中的菌种申请人已于2015年11月6日提交位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，该保藏单位的简称为CGMCC，保藏编号为：CGMCCNo.11625。
枯草工程菌的构建方法，该方法包括如下工艺步骤：
A、中性蛋白酶基因npr的扩增
根据NCBI中供体菌——解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensCGMCCNo.1.398的中性蛋白酶基因npr序列设计引物如下，上游引物为：5’-CCGATTACAAAAACATCAGCCGTAGGATCCCATCAGCTTAAAGAGAATCAAAC-3’，其中下划线部分为BamHI酶切位点，53bp；下游引物为：5’-CCCGCTCATTAGGCGGGCTGCCCCGGGTTACAATCCAACAGCATTCCAGGCTG-3’，其中下划线部分为SmaI酶切位点，53bp；进行PCR扩增，PCR扩增产物利用1％琼脂糖凝胶电泳进行分析；
B、重组载体的构建
将PCR扩增产物回收后，与用BamHI和SmaI双酶切的载体pHT43经Gibson连接后转化至大肠埃希氏菌EscherichiacoliBL21Rosetta感受态中，通过10-100μg/mlAmp抗性筛选重组质粒，将测序正确的重组质粒命名为pHT43-npr；
C、将上述构建好的重组表达质粒pHT43-npr通过Spizizen盐法转化到受体菌——枯草芽孢杆菌BacillussubtilisWB800N中，在10-100μg/ml氯霉素抗性的LB平板上筛选转化子，挑取阳性转化子接种在脱脂牛奶平板上，菌落周围产生水解圈的为目标转化子，得到枯草工程菌BacillussubtilisCGMCCNo.11625；
其中npr基因供体菌选用解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensCGMCCNo.1.398，购自中国科学院微生物研究所；大肠埃希氏菌EscherichiacoliBL21Rosetta购自普如汀生物技术(北京)有限公司；受体菌为枯草芽孢杆菌表达宿主BacillussubtilisWB800N及质粒pHT43，购自MoBiTec公司。
利用枯草工程菌BacillussubtilisCGMCCNo.11625制备脱毛酶制剂的方法，是将所述的菌种接种于含有碳源、氮源、必要的营养元素及抗生素的无菌发酵培养基中经通气发酵制成发酵液，发酵液经后处理制成脱毛酶制剂。
本发明的具体技术构思还有：
所述的发酵培养基采用如下单位质量百分含量的原料组成：麦麸2％-6％；玉米粉2％-5％；蛋白胨1％-2％；NaH2PO40.2％-0.4％；K2HPO40.02％-0.04％；豆油0.01％-0.05％；余量为水；发酵培养基消前pH＝5.5-6.6，消后pH＝6-7。
通气发酵条件如下：按照质量百分比为1％的接种量接种，压力0.03-0.05MPa，搅拌转速为150-250转/分钟，在发酵液中OD600＝0.5时添加终浓度为0.5-2.5mmol的IPTG作为诱导剂，当发酵液中酶活下降为发酵终点；
通风量的条件如下：
0-12小时内：通风量1：0.5-0.7vvm；
12-24小时：通风量1：0.8-1.0vvm；
24-40小时：通风量1：0.9-1.2vvm；
40小时至发酵结束：通风量1：0.8-1.0vvm；
温度条件如下：
0-8小时：温度为32℃-35℃；
8-14小时：温度为35℃-37℃；
14小时至发酵结束：温度为37℃。
为降低生产成本，优选且较为常见的技术方案是，所述的通气发酵前包括扩大培养。
所述的扩大培养包括如下步骤：
A、将菌种制成摇瓶种子；
B、将摇瓶种子制成一级种子；
所述的菌种培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨1％-5％；牛肉膏1％-5％；Nacl1％-5％；余量为水；pH＝6.8-7.5；
菌种的培养条件为：温度30℃-37℃，培养12-24h。
所述的步骤A是将OD600＝5的LB培养基菌液与质量百分比为20％-50％的甘油混合后制成液体菌种，将液体菌种接种至无菌的摇瓶种子培养基培养后制成摇瓶种子；
所述的摇瓶种子培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨1％-5％；牛肉膏1％-5％；Nacl1％-5％；余量为水；抗生素选用浓度为10-100μg/ml的氯霉素；pH＝6.8-7.5；
培养条件如下：摇瓶装量体积比为10％-25％，温度33℃-37℃，转速为180-220转/分钟，培养周期12小时-18小时。
所述的步骤B是将摇瓶种子接种至无菌种子培养基经通气发酵制成种子液；
所述的种子培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨1％-5％；牛肉膏1％-5％；Nacl1％-5％；余量为水；抗生素选用浓度为10-100μg/ml的氯霉素；pH＝6.8-7.5；
培养条件如下：接种量的质量百分比为1％，种子罐装量体积比为40％-60％，温度32℃-37℃，转速为150-250转/分钟，压力为0.03-0.05MPa，培养周期12小时-18小时。
采用本发明的方法所制备的发酵液酶活达2000u/ml,因发酵液酶系中不含对生皮损伤的胶原蛋白酶，无需进行分离纯化工艺。后处理包括过滤层析、喷雾干燥，即为脱毛酶制剂粉末成品。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
本发明通过基因工程技术构建皮革脱毛用枯草工程菌，工程菌株重组表达中性蛋白酶，可以水解生皮毛孔中粘蛋白，削弱毛与表皮、真皮的紧密依附，达到脱毛的目的；该菌株经验证不表达胶原蛋白酶，这种特性可以有效解决现有技术中因生皮中胶原蛋白的水解而造成的烂皮、粒面破损的技术难题，且发酵液中酶活可达2000u/ml以上，因此重组工程菌株可以作为脱毛专用菌株应用于市场。
本发明中的菌种申请人已于2015年11月6日提交位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，该保藏单位的简称为CGMCC。
附图说明
图1是本发明中所选用的上游引物及下游引物的序列表。
图2是在牛奶平皿验证中性蛋白酶的表达的示意图。
由图2可见，受体菌——枯草芽孢杆菌BacillussubtilisWB800N无水解圈，说明枯草芽孢杆菌BacillussubtilisWB800N菌株不含中性蛋白酶基因。而供体菌——解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensCGMCCNo.1.398可见水解圈，重组菌株WB800N/pHT43-npr1-8号菌株均有水解圈出现，说明中性蛋白酶基因已转入受体菌中并成功表达。
图3是明胶平皿验证胶原蛋白酶的活性的示意图。
由图3可见，供体菌——解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensCGMCCNo.1.398在滴加氯化汞之后菌落周围出现水解圈，且已知供体菌——解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensCGMCCNo.1.398可表达胶原蛋白酶。而受体菌——枯草芽孢杆菌BacillussubtilisWB800N与重组菌株WB800N/pHT43-npr菌落周围则无出现水解圈，说明重组菌株不表达胶原蛋白酶。
图4是酶活力随发酵时间变化的示意图。
由图4可见，重组菌株经发酵培养后在42小时左右，酶活力达到高峰，最高酶活达2100u/ml。
图5是不同温度对于本发明中的脱毛酶制剂的影响效果示意图。
由图5可见，本发明中的脱毛酶制剂的最适温度在50℃左右，且在70℃及以上时，酶活损失较大。
图6是不同pH对于本发明中的脱毛酶制剂的影响效果示意图。
由图6可见，本发明中的脱毛酶制剂的最适pH在7.5左右。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例做进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书作出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
实施例1
一种枯草工程菌BacillussubtilisCGMCCNo.11625。
本实施例中的菌种申请人已于2015年11月6日提交位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，该保藏单位的简称为CGMCC，保藏编号为：CGMCCNo.11625。
枯草工程菌BacillussubtilisCGMCCNo.11625的构建方法，该方法包括如下工艺步骤：
A、中性蛋白酶基因npr的扩增
根据NCBI中供体菌——解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensCGMCCNo.1.398的中性蛋白酶基因npr序列设计引物如下，上游引物为：5’-CCGATTACAAAAACATCAGCCGTAGGATCCCATCAGCTTAAAGAGAATCAAAC-3’，其中下划线部分为BamHI酶切位点，53bp；下游引物为：5’-CCCGCTCATTAGGCGGGCTGCCCCGGGTTACAATCCAACAGCATTCCAGGCTG-3’，其中下划线部分为SmaI酶切位点，53bp；进行PCR扩增，PCR扩增产物利用1％琼脂糖凝胶电泳进行分析；
B、重组载体的构建
将PCR扩增产物回收后，与用BamHI和SmaI双酶切的载体pHT43经Gibson连接后转化至大肠杆菌BL21Rosetta感受态中，通过10-100μg/mlAmp抗性筛选重组质粒，将测序正确的重组质粒命名为pHT43-npr；
C、将上述构建好的重组表达质粒pHT43-npr通过Spizizen盐法转化到受体菌——枯草芽孢杆菌BacillussubtilisWB800N中，在10-100μg/ml氯霉素抗性的LB平板上筛选转化子，挑取阳性转化子接种在脱脂牛奶平板上，菌落周围产生水解圈的为目标转化子，得到枯草工程菌BacillussubtilisCGMCCNo.11625；
其中npr基因供体菌选用解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensCGMCCNo.1.398，购自中国科学院微生物研究所；大肠埃希氏菌EscherichiacoliBL21Rosetta购自普如汀生物技术(北京)有限公司；受体菌选用枯草芽孢杆菌表达宿主BacillussubtilisWB800N及质粒pHT43，购自MoBiTec公司。
利用枯草工程菌Bacillussubtilis制备脱毛酶制剂的方法，是将枯草工程菌BacillussubtilisCGMCCNo.11625菌种接种于含有碳源、氮源、必要的营养元素及抗生素的无菌发酵培养基中经通气发酵制成发酵液，发酵液经后处理制成脱毛酶制剂。
所述的发酵培养基采用如下单位质量百分含量的原料组成：麦麸2％；玉米粉2％；蛋白胨1％；NaH2PO40.2％；K2HPO40.02％；豆油0.01％；余量为水；发酵培养基消前pH＝5.5-6.6，消后pH＝6-7。
通气发酵条件如下：按照质量百分比为1％的接种量接种，压力0.03MPa，搅拌转速为150-250转/分钟，在发酵液中OD600＝0.5时添加终浓度为0.5mmol的IPTG作为诱导剂，当发酵液中酶活下降为发酵终点；
通风量的条件如下：
0-12小时内：通风量1：0.5-0.7vvm；
12-24小时：通风量1：0.8-1.0vvm；
24-40小时：通风量1：0.9-1.2vvm；
40小时至发酵结束：通风量1：0.8-1.0vvm；
温度条件如下：
0-8小时：温度为32℃-35℃；
8-14小时：温度为35℃-37℃；
14小时至发酵结束：温度为37℃。
通气发酵前包括扩大培养。
所述的扩大培养包括如下步骤：
A、将菌种制成摇瓶种子；
B、将摇瓶种子制成一级种子；
所述的菌种培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨1％；牛肉膏1％；Nacl1％；余量为水；pH＝6.8-7.5；
菌种的培养条件为：温度30℃，培养12-24h。
所述的步骤A是将OD600＝5的LB培养基菌液与质量百分比为20％的甘油混合后制成液体菌种，将液体菌种接种至无菌的摇瓶种子培养基培养后制成摇瓶种子；
所述的摇瓶种子培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨1％；牛肉膏1％；Nacl1％；余量为水；抗生素选用浓度为10μg/ml的氯霉素；pH＝6.8-7.5；
培养条件如下：摇瓶装量体积比为10％-25％，温度33℃-37℃，转速为180-220转/分钟，培养周期12小时-18小时。
所述的步骤B是将摇瓶种子接种至无菌种子培养基经通气发酵制成种子液；
所述的种子培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨1％；牛肉膏1％；Nacl1％；余量为水；抗生素选用浓度为10-100μg/ml的氯霉素；pH＝6.8-7.5；
培养条件如下：接种量的质量百分比为1％，种子罐装量体积比为40％-60％，温度32℃-37℃，转速为150-250转/分钟，压力为0.03-0.05MPa，培养周期12小时-18小时。
采用本实施例的方法所制备的发酵液酶活达2000u/ml以上,因发酵液酶系中不含对生皮损伤的胶原蛋白酶，无需进行分离纯化工艺。后处理包括过滤层析、喷雾干燥，即为脱毛酶制剂粉末成品。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：
发酵培养基采用如下单位质量百分含量的原料组成：麦麸6％；玉米粉5％；蛋白胨2％；NaH2PO40.4％；K2HPO40.04％；豆油0.05％；余量为水。
通气发酵条件如下：在发酵液中OD600＝0.5时添加终浓度为2.5mmol的IPTG作为诱导剂，当发酵液中酶活下降为发酵终点；
所述的菌种培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨5％；牛肉膏5％；Nacl5％；余量为水；pH＝6.8-7.5；
所述的摇瓶种子培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨5％；牛肉膏5％；Nacl5％；余量为水；抗生素选用浓度为100μg/ml的氯霉素；pH＝6.8-7.5。
培养条件如下：摇瓶装量体积比为10％-25％，温度33℃-37℃，转速为180-220转/分钟，培养周期12小时-18小时。
所述的种子培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨5％；牛肉膏5％；Nacl5％；余量为水；抗生素选用浓度为100μg/ml的氯霉素；pH＝6.8-7.5。
其余内容与实施例1相同。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：
发酵培养基采用如下单位质量百分含量的原料组成：麦麸4％；玉米粉3.5％；蛋白胨1.5％；NaH2PO40.3％；K2HPO40.03％；豆油0.03％；余量为水。
所述的菌种培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨3％；牛肉膏3％；Nacl3％；余量为水；pH＝6.8-7.5；
所述的摇瓶种子培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨3％；牛肉膏3％；Nacl3％；余量为水；抗生素选用浓度为55μg/ml的氯霉素；pH＝6.8-7.5。
所述的种子培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨3％；牛肉膏3％；Nacl3％；余量为水；抗生素选用浓度为55μg/ml的氯霉素；pH＝6.8-7.5。
其余内容与实施例1相同。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于：
发酵培养基采用如下单位质量百分含量的原料组成：麦麸3％；玉米粉2.5％；蛋白胨1.3％；NaH2PO40.25％；K2HPO40.025％；豆油0.025％；余量为水。
所述的菌种培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨2％；牛肉膏2％；Nacl2％；余量为水；pH＝6.8-7.5；
所述的摇瓶种子培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨2％；牛肉膏2％；Nacl2％；余量为水；抗生素选用浓度为40μg/ml的氯霉素；pH＝6.8-7.5。
所述的种子培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨2％；牛肉膏2％；Nacl2％；余量为水；抗生素选用浓度为40μg/ml的氯霉素；pH＝6.8-7.5。
本实施例1的其余内容与实施例1相同。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于：
发酵培养基采用如下单位质量百分含量的原料组成：麦麸5％；玉米粉4％；蛋白胨1.5％；NaH2PO40.35％；K2HPO40.035％；豆油0.04％；余量为水。
所述的菌种培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨4％；牛肉膏4％；Nacl4％；余量为水；pH＝6.8-7.5；
所述的摇瓶种子培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨4％；牛肉膏4％；Nacl4％；余量为水；抗生素选用浓度为80μg/ml的氯霉素；pH＝6.8-7.5；
所述的种子培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨4％；牛肉膏4％；Nacl4％；余量为水；抗生素选用浓度为80μg/ml的氯霉素；pH＝6.8-7.5。
其余内容同实施例1。

Claims (10)

1.枯草工程菌Bacillussubtilis，其特征在于其保藏编号为CGMCCNo.11625。
2.根据权利要求1所述的枯草工程菌Bacillussubtilis的构建方法，其特征在于该方法包括如下工艺步骤：
A、中性蛋白酶基因npr的扩增
根据NCBI中供体菌——解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensCGMCCNo.1.398的中性蛋白酶基因npr序列设计引物如下，上游引物为：5’-CCGATTACAAAAACATCAGCCGTAGGATCCCATCAGCTTAAAGAGAATCAAAC-3’，其中下划线部分为BamHI酶切位点，53bp；下游引物为：5’-CCCGCTCATTAGGCGGGCTGCCCCGGGTTACAATCCAACAGCATTCCAGGCTG-3’，其中下划线部分为SmaI酶切位点，53bp；进行PCR扩增，PCR扩增产物利用1％琼脂糖凝胶电泳进行分析；
B、重组载体的构建
将PCR扩增产物回收后，与用BamHI和SmaI双酶切的载体pHT43经Gibson连接后转化至大肠杆菌BL21Rosetta感受态中，通过10-100μg/mlAmp抗性筛选重组质粒，将测序正确的重组质粒命名为pHT43-npr；
C、将上述构建好的重组表达质粒pHT43-npr通过Spizizen盐法转化到受体菌——枯草芽孢杆菌BacillussubtilisWB800N中，在10-100μg/ml氯霉素抗性的LB平板上筛选转化子，挑取阳性转化子接种在脱脂牛奶平板上，菌落周围产生水解圈的为目标转化子，得到枯草工程菌BacillussubtilisCGMCCNo.11625；
其中npr基因供体菌选用解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensCGMCCNo.1.398，购自中国科学院微生物研究所；大肠埃希氏菌EscherichiacoliBL21Rosetta购自普如汀生物技术(北京)有限公司；受体菌为枯草芽孢杆菌表达宿主BacillussubtilisWB800N及质粒pHT43，购自MoBiTec公司。
3.利用枯草工程菌Bacillussubtilis制备脱毛酶制剂的方法，其特征在于是将枯草工程菌BacillussubtilisCGMCCNo.11625菌种接种于含有碳源、氮源、必要的营养元素及抗生素的无菌发酵培养基中经通气发酵制成发酵液，发酵液经后处理制成脱毛酶制剂。
4.根据权利要求3所述的利用枯草工程菌Bacillussubtilis制备脱毛酶制剂的方法，其特征在于所述的发酵培养基采用如下单位质量百分含量的原料组成：麦麸2％-6％；玉米粉2％-5％；蛋白胨1％-2％；NaH2PO40.2％-0.4％；K2HPO40.02％-0.04％；豆油0.01％-0.05％；余量为水；发酵培养基消前pH＝5.5-6.6，消后pH＝6-7。
5.根据权利要求4所述的利用枯草工程菌Bacillussubtilis制备脱毛酶制剂的方法，其特征在于通气发酵条件如下：按照质量百分比为1％的接种量接种，压力0.03-0.05MPa，搅拌转速为150-250转/分钟，在发酵液中OD600＝0.5时添加终浓度为0.5-2.5mmol的IPTG作为诱导剂，当发酵液中酶活下降为发酵终点；
通风量的条件如下：
0-12小时内：通风量1：0.5-0.7vvm；
12-24小时：通风量1：0.8-1.0vvm；
24-40小时：通风量1：0.9-1.2vvm；
40小时至发酵结束：通风量1：0.8-1.0vvm；
温度条件如下：
0-8小时：温度为32℃-35℃；
8-14小时：温度为35℃-37℃；
14小时至发酵结束：温度为37℃。
6.根据权利要求3所述的利用枯草工程菌Bacillussubtilis制备脱毛酶制剂的方法，其特征在于所述的通气发酵前还包括扩大培养步骤。
7.根据权利要求6所述的利用枯草工程菌Bacillussubtilis制备脱毛酶制剂的方法，其特征在于所述的扩大培养包括如下步骤：
A、将菌种制成摇瓶种子；
B、将摇瓶种子制成一级种子；
所述的菌种培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨1％-5％；牛肉膏1％-5％；Nacl1％-5％；余量为水；pH＝6.8-7.5；
菌种的培养条件为：温度30℃-37℃，培养12-24h。
8.根据权利要求7所述的利用枯草工程菌Bacillussubtilis制备脱毛酶制剂的方法，其特征在于所述的步骤A是将OD600＝5的LB培养基菌液与质量百分比为20％-50％的甘油混合后制成液体菌种，将液体菌种接种至无菌的摇瓶种子培养基培养后制成摇瓶种子；
所述的摇瓶种子培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨1％-5％；牛肉膏1％-5％；Nacl1％-5％；余量为水；抗生素选用浓度为10-100μg/ml的氯霉素；pH＝6.8-7.5；
培养条件如下：摇瓶装量体积比为10％-25％，温度33℃-37℃，转速为180-220转/分钟，培养周期12小时-18小时。
9.根据权利要求7或8中任一项所述的利用枯草工程菌Bacillussubtilis制备脱毛酶制剂的方法，其特征在于所述的步骤B是将摇瓶种子接种至无菌种子培养基经通气发酵制成种子液；
所述的种子培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蛋白胨1％-5％；牛肉膏1％-5％；Nacl1％-5％；余量为水；抗生素选用浓度为10-100μg/ml的氯霉素；pH＝6.8-7.5；
培养条件如下：接种量的质量百分比为1％，种子罐装量体积比为40％-60％，温度32℃-37℃，转速为150-250转/分钟，压力为0.03-0.05MPa，培养周期12小时-18小时。
10.根据权利要求3所述的利用枯草工程菌Bacillussubtilis制备脱毛酶制剂的方法，其特征在于所述的发酵液后处理包括过滤层析、喷雾干燥。
CN201510890412.1A 2015-12-07 2015-12-07 枯草工程菌Bacillus subtilis及其构建以及利用其生产脱毛酶制剂的方法 Active CN105420175B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510890412.1A CN105420175B (zh) 2015-12-07 2015-12-07 枯草工程菌Bacillus subtilis及其构建以及利用其生产脱毛酶制剂的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510890412.1A CN105420175B (zh) 2015-12-07 2015-12-07 枯草工程菌Bacillus subtilis及其构建以及利用其生产脱毛酶制剂的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105420175A true CN105420175A (zh) 2016-03-23
CN105420175B CN105420175B (zh) 2018-08-31

Family

ID=55498718

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510890412.1A Active CN105420175B (zh) 2015-12-07 2015-12-07 枯草工程菌Bacillus subtilis及其构建以及利用其生产脱毛酶制剂的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105420175B (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106479929A (zh) * 2016-10-27 2017-03-08 河北省微生物研究所 解淀粉芽孢杆菌及其在麻山药根腐病防治中的应用
CN107881181A (zh) * 2017-12-14 2018-04-06 河北省微生物研究所 利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因、蛋白、枯草芽孢杆菌及制备和应用
CN108070606A (zh) * 2017-12-14 2018-05-25 河北省微生物研究所 利用分子伴侣prsA构建的中性蛋白酶基因、蛋白、枯草芽孢杆菌及制备和应用
CN108728392A (zh) * 2018-05-30 2018-11-02 江南大学 一种可高效表达角蛋白酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌
CN109321556A (zh) * 2018-11-07 2019-02-12 河北省微生物研究所 脱毛酶制剂的制备方法及其在黄牛皮脱毛中的应用
CN109609484A (zh) * 2018-12-06 2019-04-12 河北省微生物研究所 复合脱毛酶制剂的制备方法及其在含小毛进口黄牛皮脱毛中的应用
CN113801831A (zh) * 2020-06-12 2021-12-17 青岛蔚蓝生物股份有限公司 一株高产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101696394A (zh) * 2009-10-15 2010-04-21 华南农业大学 一种高活性的枯草芽孢杆菌发酵方法及发酵产品

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101696394A (zh) * 2009-10-15 2010-04-21 华南农业大学 一种高活性的枯草芽孢杆菌发酵方法及发酵产品

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
N. VASANTHA ET AL.: "Genes for Alkaline Protease and Neutral Protease from Bacillus amyloliquefaciens Contain a Large Open Reading Frame Between the Regions Coding for Signal Sequence and Mature Protein", 《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》 *
张 敏 等: "中性蛋白酶基因诱导型表达分泌载体的构建", 《中国生物工程杂志》 *
王丽影 等: "基因工程枯草杆菌生产中性蛋白酶的研究", 《华东理工大学学报》 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106479929A (zh) * 2016-10-27 2017-03-08 河北省微生物研究所 解淀粉芽孢杆菌及其在麻山药根腐病防治中的应用
CN106479929B (zh) * 2016-10-27 2019-09-20 河北省微生物研究所 解淀粉芽孢杆菌及其在麻山药根腐病防治中的应用
CN107881181A (zh) * 2017-12-14 2018-04-06 河北省微生物研究所 利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因、蛋白、枯草芽孢杆菌及制备和应用
CN108070606A (zh) * 2017-12-14 2018-05-25 河北省微生物研究所 利用分子伴侣prsA构建的中性蛋白酶基因、蛋白、枯草芽孢杆菌及制备和应用
CN108728392A (zh) * 2018-05-30 2018-11-02 江南大学 一种可高效表达角蛋白酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌
CN109321556A (zh) * 2018-11-07 2019-02-12 河北省微生物研究所 脱毛酶制剂的制备方法及其在黄牛皮脱毛中的应用
CN109321556B (zh) * 2018-11-07 2022-01-18 河北省微生物研究所有限公司 脱毛酶制剂的制备方法及其在黄牛皮脱毛中的应用
CN109609484A (zh) * 2018-12-06 2019-04-12 河北省微生物研究所 复合脱毛酶制剂的制备方法及其在含小毛进口黄牛皮脱毛中的应用
CN109609484B (zh) * 2018-12-06 2022-06-10 河北省微生物研究所有限公司 复合脱毛酶制剂的制备方法及其在含小毛进口黄牛皮脱毛中的应用
CN113801831A (zh) * 2020-06-12 2021-12-17 青岛蔚蓝生物股份有限公司 一株高产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌及其应用
CN113801831B (zh) * 2020-06-12 2023-03-28 青岛蔚蓝生物股份有限公司 一株高产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN105420175B (zh) 2018-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105420175A (zh) 枯草工程菌Bacillus subtilis及其构建以及利用其生产脱毛酶制剂的方法
CN103602616B (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌y10及其应用
Wang et al. Bioflocculants from hydrolysates of corn stover using isolated strain Ochrobactium ciceri W2
CN102517235B (zh) 一种枯草芽孢杆菌
CN105347512A (zh) 一种生活污水处理剂
CN102703351B (zh) 一株芽孢杆菌utm03及其应用
AU2021103470A4 (en) Bacillus subtilis bs40-4 strain and method for composting organic wastes by using the same
CN103058476B (zh) 一种新型的剩余污泥的处理方法
CN106811438B (zh) 一种秸秆降解酸化菌剂及其制备方法
CN109402013B (zh) 一种产脂肪酶的耐高温枯草芽孢杆菌及其在堆肥中的应用
CN106754474A (zh) 一种抗生素菌渣厌氧发酵促进剂及其制备与应用
CN112625959A (zh) 用于有机废弃物好氧发酵的嗜高温复合菌剂
CN105016600A (zh) 一种污泥生物干化方法
CN102766587B (zh) 一种餐厨垃圾消减型乳酸菌及其应用
CN110591974A (zh) 一种用于皮革污泥干化的嗜热微生物菌剂的制备及使用方法
Liu et al. Study on personalized microbial formulation during high-temperature aerobic fermentation of different types of food wastes
CN102766588B (zh) 一种餐厨垃圾消减型微生物复合菌剂及其制备方法和应用
CN104560817B (zh) 一株产植酸酶的嗜热地衣芽孢杆菌utm102及其应用
CN106701837A (zh) 一种农业秸秆和剩余污泥混合微贮稳定化预处理方法
Cai et al. Efficient biodegradation of organic matter using a thermophilic bacterium and development of a cost-effective culture medium for industrial use
CN109609407B (zh) 一种用于原位污泥减量的嗜热微生物菌株及其应用
CN114806926B (zh) 一种厨余垃圾腐熟降解菌剂及其应用
CN103058478B (zh) 一种利用功能菌改善污泥厌氧消化性能并同步扩培的方法
CN104560822A (zh) 一株具有高絮凝活性且对亚甲基蓝有脱色作用的耐冷细菌
CN114540252A (zh) 一种转化畜禽养殖废弃物的微小杆菌p6及应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP03 Change of name, title or address
CP03 Change of name, title or address

Address after: No. 2089, Wusi Middle Road, Baoding City, Hebei Province 071051

Patentee after: Hebei Institute of Microbiology Co.,Ltd.

Patentee after: Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences

Address before: No. 2089, Wusi Middle Road, Jingxiu District, Baoding City, Hebei Province 071051

Patentee before: HEBEI Research Institute OF MICROBIOLOGY

Patentee before: Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences