CN113801831B - 一株高产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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CN113801831B CN202110330246.5A CN202110330246A CN113801831B CN 113801831 B CN113801831 B CN 113801831B CN 202110330246 A CN202110330246 A CN 202110330246A CN 113801831 B CN113801831 B CN 113801831B
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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一株高产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株及其应用。所述枯草芽孢杆菌是通过紫外诱变方法筛选获得的中性蛋白酶产量显著提高的突变菌株，保藏编号为CGMCC No.19499。所述菌株可广泛应用于中性蛋白酶的发酵生产，有利于降低该酶的生产成本，应用前景广阔。

Description

一株高产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一株高产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株及其应用。
背景技术
六十年代末欧美诸国将蛋白酶加入洗涤剂内，促进了洗涤剂工业一次大的变革，七十年代随着生物工程的兴起和发展，拓展了核酸和蛋白质工程的新领域，兴起了工具酶新型产业，而生物技术用于改造酶的产生菌，则进一步促进了酶学研究和酶制剂工业的发展，因此酶已成为有关国际学术会议的中心议题。由于碱性蛋白酶和酸性蛋白酶所要求的反应条件限制了它的广泛应用，从八十年代初开始，国内外相继开展对中性蛋白酶的研究。
中性蛋白酶是最适作用 pH 介于 6.0-7.5 之间的一类蛋白酶，作为一种生物催化剂，它具有催化的反应速度快，无工业污染等优点。而且耐热性相对较低，在食物蛋白水解物的生产过程中成为控制酶活力的关键。大多数微生物中性蛋白酶是含有金属元素，部分酶蛋白含有一分子锌，起着酶同底物之间的桥梁作用，有些酶的分子中尚含若干原子钙，钙离子能增加中性蛋白酶的稳定性。
蛋白酶的来源广泛，如动植物、微生物均可产生蛋白酶。从动物的体内获取蛋白酶需要宰杀大量动物，而从植物体内纯化酶工艺难度较大，因此动植物来源性的蛋白酶的应用受限制。而微生物生长的繁殖速度快，而且微生物来源的蛋白酶大部分为外源酶，提取工艺相对简单，所以关于微生物发酵产蛋白酶的研究成为蛋白酶研究的一个热点。 微生物来源的蛋白酶分为细菌性中性蛋白酶、真菌性中性蛋白酶以及其它来源的中性蛋白酶，大多数市售中性蛋白酶大都产自于芽孢杆菌属，比如 Bacillus subtilis, B.thuringiensis, B. pumilus, B. polymyxa, B. licheniformis等。很多真菌都能产生中性蛋白酶，比如米曲霉、根霉和毛霉等。
目前中性蛋白酶已被广泛的应用于食品、皮革、毛皮、化妆品、医药等行业。其中，在畜禽饲料配方中添加中性蛋白酶，可有效提高蛋白质的利用率和降低饲养成本；另外，中性蛋白酶具有较强的脱毛能力，能够避免传统的皮革加工使用硫酸钠进行处理造成的环境污染；中性蛋白酶应用于啤酒生产中，可排除蛋白质产生的“冷浑浊”现象；在洗涤剂用品中加入中性蛋白酶可大大提高洗涤效果；在医药行业中，中性蛋白酶还可作为消化、消炎、化痰止咳等药物，以及用于治疗跌打伤、水肿血肿，消除坏死组织等。
蛋白酶商品的生产最早可以追溯到 20 世纪初期，1956 年以来我国也陆续选育出了一大批优良的产蛋白酶菌株，如枯草杆菌 1.398、放线菌 166 等。目前，市场上大部分中性蛋白酶均来源于芽孢杆菌属。但经过长期的传代都面临菌种退化、产酶能力下降、发酵不稳定等问题。如何获得新的产中性蛋白酶菌株、提高菌株产酶能力仍是当前的研究重点。
发明内容
本发明的目的是提供一株高产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）及其应用。申请人首先构建得到重组表达中性蛋白酶基因的枯草芽孢杆菌工程菌，然后进一步对其进行紫外诱变，筛选获得中性蛋白酶产量显著提高的突变菌株，从而有利于降低该酶的生产成本，促进其广泛应用。
本发明一方面提供了一种枯草芽孢杆菌工程菌株，其携带有表达中性蛋白酶的重组质粒。
所述中性蛋白酶的基因序列为SEQ ID NO:3。
本发明一方面提供了一种突变菌株枯草芽孢杆菌QJNP（Bacillus subtilis QJNP），已于2020年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.19499。
本发明一方面提供了所述枯草芽孢杆菌在生产中性蛋白酶中的应用。
本发明还提供了一种生产中性蛋白酶的方法，是以所述枯草芽孢杆菌为发酵菌株。
有益效果
本发明首先将中性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌宿主中表达，构建得到重组表达该酶的工程菌株枯草芽孢杆菌NP。该菌株摇瓶发酵和20L罐发酵上清液中中性蛋白酶酶活分别达到15490 U/mL和37280 U/mL。
为了提高中性蛋白酶的产量，申请人以枯草芽孢杆菌NP为出发菌株，进一步通过紫外诱变的方法筛选获得一株突变菌枯草芽孢杆菌QJNP。该突变菌株摇瓶发酵上清液中中性蛋白酶酶活高达24410 U/mL，比出发菌提高57.6%；其20 L罐发酵粗酶液中中性蛋白酶酶活高达52750 U/mL，比出发菌提高了41.5%，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌株可广泛应用于中性蛋白酶的生产，有利于降低中性蛋白酶的生产成本，促进该酶的应用。
说明书附图
图1为pDG1662质粒图谱；
图2为pUC19-cat质粒图谱；
图3为pPaprE-npr质粒图谱；
图4为pH-相对酶活曲线；
图5为温度-相对酶活曲线。
具体实施方式
下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，实现本发明的方法不应限于本发明实施例所记载的具体方法步骤。
本发明实施例中所涉及的培养基的配方如下：
GM I配制方法为：1×最低盐溶液96 mL，20%葡萄糖2.5 mL，5%水解酪蛋白0.4 mL，10%酵母粉汁1 mL；其中1×最低盐溶液的配制方法为：K2HPO4 14 g/L，KH2PO4 6 g/L，(NH4)2SO4 2 g/L，柠檬酸三钠1 g/L，MgSO4•7H2O 0.2 g/L，在蒸馏水中依次溶解；
GM II配制方法为：1×最低盐溶液97 mL，20%葡萄糖2.5 mL，5%水解酪蛋白0.08mL，10%酵母粉汁0.04 mL，1 M MgCl2 0.25 mL，1 M CaCl2 0.05 mL；
LB平板：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，琼脂粉1.5%；
脱脂奶粉平板：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，脱脂奶粉1%，琼脂粉1.5%。；
种子培养基：酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，K2HPO4 1.8%，氯霉素5 μg/mL；
发酵培养基：酵母粉1~2%，豆饼粉2~5%，麦芽糊精5~10%，柠檬酸钠0.1~0.5%，CaCl20.1~0.5%，MgSO4 0.1~0.5%，K2HPO4 0.5~2%；
实施例1 用于中性蛋白酶高效分泌表达的信号肽筛选
人工合成含中性蛋白酶基因npr的DNA序列SEQ ID NO: 1，该序列含有P43启动子SEQ ID NO: 2及中性蛋白酶npr的开放阅读框（ORF）SEQ ID NO: 3。其中npr基因的信号肽SEQ ID NO: 4为野生型信号肽。将该序列SEQ ID NO: 1克隆到pUC57质粒中，命名为pUC57-npr。
人工合成含P43启动子及碱性蛋白酶基因信号肽的DNA序列SEQ ID NO: 5，所述碱性蛋白酶基因信号肽序列为SEQ ID NO: 6。将该序列SEQ ID NO: 5克隆到pUC57质粒中，命名为pUC57-P43-SPaprE。
人工合成含P43启动子及枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因信号肽的DNA序列SEQID NO: 7，所述果聚糖蔗糖酶基因信号肽序列为SEQ ID NO: 8。将该序列SEQ ID NO: 7克隆到pUC57质粒中，命名为pUC57-P43-SPsacB。
1.1 采用npr信号肽的中性蛋白酶整合表达质粒pP43-SPnpr-npr构建
设计克隆引物：
npr-F：5'-CACACAAATTAAAAACTGGTCTGATCGGAATGGGTTTTGTTTTTAAGC-3'
npr-Re：5'-GATGATAAGCTGTCAAACATGAGGCTGTTTGCGTTTTTGCCGTG-3'
以pUC57-npr质粒为模板，采用npr-F、npr-Re引物，用NEB公司的Phusion保真酶进行PCR扩增，扩增条件为：98℃预变性2 min，98℃变性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸1 min，30个循环后，72℃延伸5 min。OMEGA凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，命名为P43-SPnpr-npr，大小约2 kb。
将pDG1662质粒用BamHI及EcoRI内切酶进行双酶切，OMEGA凝胶回收试剂盒回收酶切产物pDG1662/BamHI/EcoRI，大小约7 kb。
将P43-SPnpr-npr片段与pDG1662/BamHI/EcoRI片段按照摩尔比3:1比例混匀，用Takara In Fusion试剂盒进行克隆反应，50℃反应15 min，反应体系转化E. coli DH5α感受态细胞，涂布含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板，对转化子进行菌落PCR验证，对***P43-SPnpr-npr片段的转化子提取质粒，并将质粒送往苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，测序正确的质粒命名为pP43-SPnpr-npr。
1.2 采用aprE信号肽的中性蛋白酶整合表达质粒pP43-SPaprE-npr构建
设计克隆引物：
SPaprE-Re：5'-TCGCATCGGCTGCTGAGAATCCTCAGCTTAAAG-3'
SPaprE-F：5'-GGATTCTCAGCAGCCGATGCGATCGATGAACT-3'
以pUC57-npr质粒为模板，采用npr-F、SPaprE-Re引物，用NEB公司的Phusion保真酶进行PCR扩增。OMEGA凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，命名为SPaprE-npr PCR1，大小约1.67 kb。
以pUC57-P43-SPaprE质粒为模板，采用SPaprE-F、npr-Re引物，用NEB公司的Phusion保真酶进行PCR扩增。OMEGA凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，命名为P43-SPaprEPCR2，大小约0.33 kb。
对SPaprE-npr PCR1及P43-SPaprE PCR2片段进行融合PCR，融合PCR过程如下：第一轮，PCR反应体系中各加入200 ng的SPaprE-npr PCR1、P43-SPaprE PCR2片段，不加引物，用NEB公司的Phusion保真酶PCR扩增。第二轮，取10 μl第一轮PCR产物作为模板，加入npr-F、npr-Re引物，用NEB公司的Phusion保真酶PCR扩增。OMEGA凝胶回收试剂盒回收约2 kb的PCR产物，命名为P43-SPaprE-npr。
将P43-SPaprE-npr片段与pDG1662/BamHI/EcoRI片段按照摩尔比3:1比例混匀，用Takara In Fusion试剂盒进行克隆反应，50℃反应15 min，反应体系转化E. coli DH5α感受态细胞，涂布含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板，对转化子进行菌落PCR验证，对***P43-SPaprE-npr片段的转化子提取质粒，并将质粒送往苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，测序正确的质粒命名为pP43-SPaprE-npr。
1.3 采用sacB信号肽的中性蛋白酶整合表达质粒pP43-SPsacB-npr构建
设计克隆引物：
SPsacB-Re：5'-AAGCTTTTGCCGCTGAGAATCCTCAGCTTAAAG-3'
SPsacB-F：5'-GGATTCTCAGCGGCAAAAGCTTGAGTTGCGCC-3'
以pUC57-npr质粒为模板，采用npr-F、SPsacB-Re引物，用NEB公司的Phusion保真酶进行PCR扩增。OMEGA凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，命名为SPsacB-npr PCR1，大小约1.67 kb。
以pUC57-P43-SPsacB质粒为模板，采用SPsacB-F、npr-Re引物，用NEB公司的Phusion保真酶进行PCR扩增。OMEGA凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，命名为P43-SPsacBPCR2，大小约0.34 kb。
对SPsacB-npr PCR1及P43-SPsacB PCR2片段进行融合PCR，融合PCR过程如下：第一轮，PCR反应体系中各加入200 ng的SPsacB-npr PCR1、P43-SPsacB PCR2片段，不加引物，用NEB公司的Phusion保真酶PCR扩增。第二轮，取10 μl第一轮PCR产物作为模板，加入npr-F、npr-Re引物，用NEB公司的Phusion保真酶PCR扩增。OMEGA凝胶回收试剂盒回收约2 kb的PCR产物，命名为P43-SPsacB-npr。
将P43-SPsacB-npr片段与pDG1662/BamHI/EcoRI片段按照摩尔比3:1比例混匀，用Takara In Fusion试剂盒进行克隆反应，50℃反应15 min，反应体系转化E. coli DH5α感受态细胞，涂布含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板，对转化子进行菌落PCR验证，对***P43-SPsacB-npr片段的转化子提取质粒，并将质粒送往苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，测序正确的质粒命名为pP43-SPsacB-npr。
1.4 采用不同信号肽的枯草芽孢杆菌单拷贝整合菌株构建
将pP43-SPnpr-npr质粒用BglII及XhoI内切酶进行双酶切，OMEGA凝胶回收试剂盒回收酶切产物pP43-SPnpr-npr/BglII/XhoI，大小约7.7 kb。
将pP43-SPnpr-npr/BglII/XhoI片段通过普通感受态方法转化枯草芽孢杆菌1A751（Bacillus subtilis 1A751 (apr -, his -, npr -, eglSΔ102, bglT/bglSΔEV)）（Wolf M, et al. Microbiology. 1995 141:281-90）宿主，构建采用npr信号肽的中性蛋白酶枯草芽孢杆菌单拷贝整合菌株，构建过程如下：
1）将枯草芽孢杆菌1A751宿主划线LB平板，37℃培养过夜。
2）次日挑取1个单菌落接种到5 mL GMⅠ溶液，在30℃、125 rpm振荡培养过夜。
3）次日取1 mL过夜培养液转接到9 mL GMⅠ中，37℃、250 rpm培养3.5 h。
4）再取5 mL上一步骤的培养液转接到45 mL GMⅡ中，37℃、125 rpm培养90 min后，5000 g、10 min离心收集菌体。用5 mL原培养液上清液轻轻悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞。
5）在0.2 mL枯草芽孢杆菌宿主感受态细胞中加入约1 μg pP43-SPnpr-npr/BglII/XhoI片段，37℃、200 rpm振荡培养1 h后涂布含5 μg/mL氯霉素的脱脂奶粉平板，37℃培养过夜。
6）次日选取透明圈显著的转化子在含5 μg/mL氯霉素的脱脂奶粉平板划线纯化一次，选取透明圈显著的单菌落用15%~20%的甘油保种，菌株命名为BS-SPnpr-npr。
采用同样的方法将pP43-SPaprE-npr/BglII/XhoI片段通过普通感受态方法转化枯草芽孢杆菌宿主，构建采用aprE信号肽的中性蛋白酶枯草芽孢杆菌单拷贝整合菌株，命名为BS-SPaprE-npr。
采用同样的方法将pP43-SPsacB-npr/BglII/XhoI片段通过普通感受态方法转化枯草芽孢杆菌宿主，构建采用sacB信号肽的中性蛋白酶枯草芽孢杆菌单拷贝整合菌株，命名为BS-SPsacB-npr。
1.5 不同信号肽的枯草芽孢杆菌单拷贝整合菌株摇瓶发酵
将BS-SPnpr-npr、BS-SPaprE-npr、BS-SPsacB-npr菌株划线含5 μg/mL氯霉素的脱脂奶粉平板，次日分别从每个平板选取透明圈显著的单菌落接种于20 mL种子培养基中，37℃、220 rpm振荡培养6 h左右。然后分别取2.5 mL种子培养物接种到50 mL发酵培养基中，34℃、220rpm振荡培养60 h；4000 rpm离心10 min取上清液；采用中华人民共和国国家标准蛋白酶活力的测定方法（GB/T 23527-2009）（福林法）分别测定上述菌株发酵上清液的中性蛋白酶酶活，其中BS-SPsacB-npr重组菌中性蛋白酶酶活5828 U/mL，显著高于BS-SPnpr-npr（3164 U/mL）及BS-SPaprE-npr（4027 U/mL）重组菌，说明sacB信号肽更有利于中性蛋白酶的高效分泌表达。
实施例2 中性蛋白酶整合表达质粒pPaprE-npr构建
挑取新活化的枯草芽孢杆菌168（Bacillus subtilis 168）单菌落接种于5 mL LB液体培养基中，37℃摇床200 rpm振荡培养过夜，按照TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒的说明提取枯草芽孢杆菌168的基因组。该基因组中含aprE启动子（PaprE）的DNA序列SEQ IDNO:9。
设计克隆引物：
cat-F：5'-ACATGCATGCCTGTAATATAAAAACCTTCTTC-3'；
cat-Re：5'-ACGCGTCGACTTTATTCTTCAACTAAAGCAC-3'；
PaprE-F：5'-ACGCGTCGACTGACACAGAAGAAAACGTTGG-3'；
PaprE-Re：5'-TTGATGTTCATTCTTTACCCTCTCCTTTTAAA-3'；
SPsacB-npr-F：5'-GAGGGTAAAGAATGAACATCAAAAAGTTTGCA-3'；
SPsacB-npr-Re：5'-CGCGGATCCGAATGGGTTTTGTTTTTAAGC-3'。
以pDG1662质粒为模板，采用cat-F、cat-Re引物，用NEB公司的Phusion保真酶进行PCR扩增，扩增条件为：98℃预变性2 min，98℃变性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，30个循环后，72℃延伸5 min。OMEGA凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，命名为cat，大小约0.93 kb。
将pUC19质粒用SphI及SalI内切酶进行双酶切，OMEGA凝胶回收试剂盒回收酶切产物pUC19/SphI/SalI，大小约2.7 kb。将cat片段用SphI及SalI内切酶进行双酶切，OMEGA凝胶回收试剂盒回收酶切产物cat/SphI/SalI，大小约0.93 kb。用T4 DNA Ligase对pUC19/SphI/SalI片段及cat/SphI/SalI片段进行连接反应，连接产物转化E. coli DH5α感受态细胞，涂布含100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板，对转化子进行菌落PCR验证，对***cat基因的转化子提取质粒，并将质粒送往苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，测序正确的质粒命名为pUC19-cat。
以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，采用PaprE-F、PaprE-Re引物，用NEB公司的Phusion保真酶进行PCR扩增。OMEGA凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，命名为PaprE，大小约0.65 kb。
以pP43-SPsacB-npr为模板，采用SPsacB-npr-F、SPsacB-npr-Re引物，用NEB公司的Phusion保真酶进行PCR扩增。OMEGA凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，命名为npr，大小约1.67 kb。
对PaprE及npr片段进行融合PCR，融合PCR过程如下：第一轮，PCR反应体系中各加入200 ng的PaprE、npr片段，不加引物，用NEB公司的Phusion保真酶PCR扩增。第二轮，取10μl第一轮PCR产物作为模板，加入PaprE-F、SPsacB-npr-Re引物，用NEB公司的Phusion保真酶PCR扩增。OMEGA凝胶回收试剂盒回收约2.3 kb的PCR产物，命名为PaprE-npr。
将pUC19-cat质粒用SalI及BamHI内切酶进行双酶切，OMEGA凝胶回收试剂盒回收酶切产物pUC19-cat/SalI/BamHI，大小约3.6 kb。将PaprE-npr片段用SalI及BamHI内切酶进行双酶切，OMEGA凝胶回收试剂盒回收酶切产物PaprE-npr/SalI/BamHI，大小约2.3 kb。用T4 DNA Ligase对pUC19-cat/SalI/BamHI片段及PaprE-npr/SalI/BamHI片段进行连接反应，连接产物转化E. coli DH5α感受态细胞，涂布含100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板，对转化子进行菌落PCR验证，对***PaprE-npr片段的转化子提取质粒，并将质粒送往苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，测序正确的质粒命名为pPaprE-npr。中性蛋白酶整合表达质粒构建完成。
实施例3 重组表达中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌工程菌株的构建及发酵验证
3.1 枯草芽孢杆菌整合菌株的构建及摇瓶发酵
采用实施例1.4中的普通感受态制备方法制备枯草芽孢杆菌1A751宿主感受态细胞，在0.2 mL感受态细胞中加入约1 μg pPaprE-npr重组质粒，37℃、200 rpm振荡培养1 h后涂布含5 μg/mL氯霉素的脱脂奶粉平板，37℃培养过夜。次日选取10个透明圈显著的单菌落在含5 μg/mL氯霉素的脱脂奶粉平板上划线纯化，然后每个平板选取透明圈显著的单菌落接种于20 mL种子培养基中，37℃、220 rpm振荡培养8~9 h。然后分别取2.5 mL种子培养物接种到50 mL发酵培养基中，34℃、220rpm振荡培养72 h；4000 rpm离心10 min取上清液；采用中华人民共和国国家标准蛋白酶活力的测定方法（GB/T 23527-2009）（福林法）分别测定上述菌株发酵上清液的中性蛋白酶酶活，其中一株重组菌中性蛋白酶酶活15490 U/mL，显著高于另外9株重组菌。申请人将该菌株命名为枯草芽孢杆菌NP（Bacillus subtilisNP）。
3.2 中性蛋白酶菌株20 L罐发酵验证
将枯草芽孢杆菌NP接种于含500 mL种子培养基中，37℃、220 rpm振荡培养约12h。
将种子液全部转入20 L发酵罐（发酵罐培养基成分：麦芽糊精3%，葡萄糖1%，豆饼粉3%，麸皮3%，Na2HPO4 0.78%，KH2PO4 0.05%，发酵罐消后体积10 L）。温度控制37℃，发酵初始pH 7.2，发酵过程中氨水控制pH不低于7.0。风量1~1.5 vvm，转速300~700 rpm，控制发酵过程中DO不低于10%。3~4 h后开始流加50%葡萄糖，流加速度3 g/L·h。发酵30~35 h，DO、pH均回升后停培。
测定发酵上清液的中性蛋白酶酶活，结果显示，枯草芽孢杆菌NP菌株发酵上清酶活达37280 U/mL。从而说明本发明构建的重组工程菌株枯草芽孢杆菌NP能高效超表达外源中性蛋白酶基因npr。
实施例4 酶学性质分析
4.1 最适作用pH分析
采用pH值分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH值分别为8.5、9.0的硼砂-硼酸缓冲液，将上述重组菌株枯草芽孢杆菌NP发酵上清液进行稀释，底物也分别用对应pH值的缓冲液配制，在40℃条件下进行蛋白酶酶活力测定，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。
结果如图4所示，本发明构建得到的重组菌株枯草芽孢杆菌NP产的蛋白酶最适作用pH值为7.5，为中性蛋白酶，在pH6.5-8.0范围内保持70%以上的酶活。
4.2 最适作用温度分析
分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃，pH 7.5条件下，对上述重组菌株枯草芽孢杆菌NP发酵上清液进行蛋白酶酶活测定，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。
结果如图5所示，本发明构建的重组菌株枯草芽孢杆菌NP产的蛋白酶最适作用温度为50℃，在45-55℃范围内能保持90%以上的相对酶活。
实施例5 中性蛋白酶高产菌株的诱变筛选
紫外诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为紫外诱变所需设备简单、费用少，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。
申请人以实施例3构建得到的重组菌株枯草芽孢杆菌NP为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高其中性蛋白酶的产量。
5.1菌悬液制备
将出发菌枯草芽孢杆菌NP在LB斜面上划线接种，37℃培养24 h；加入5 mL 0.85%的无菌生理盐水，将斜面上的菌体全部冲洗下来，转入无菌的含有玻璃珠的试管中，涡旋振荡10 min，完全打成单细胞菌体；将菌悬液全部转入15 mL离心管，6000 rpm离心3 min收集菌体，取上清，用10 mL生理盐水悬浮菌体；洗涤细胞两次，最后调整细胞浓度至108个/mL。
5.2 紫外诱变处理及诱变剂量确定
打开9 W紫外灯开关，预热约30 min；取直径9 cm无菌平皿，加入上述细胞浓度为108个/mL的菌悬液10 mL，加入一根无菌磁力搅拌转子，打开磁力搅拌器，打开皿盖，在垂直距离为15 cm处，分别搅拌照射0.5 min、1 min、1.5 min、2 min、2.5 min、3 min；盖上平皿盖，关闭紫外灯，黑暗中孵育30 min。
将照射后的菌悬液用0.85%生理盐水梯度稀释至10-1~10-6；取10-4、10-5、10-6三个稀释度的菌悬液各100 μL，涂布脱脂奶粉平板，每个稀释度涂布三个平板；以同样的操作，取未经紫外线照射处理的菌液稀释涂平板作对照。将上述涂布均匀的平板，用黑布或报纸包好后，置于37℃过夜培养。
统计不同照射时间下每个稀释度下平板上长出的单菌落数，若在某个稀释度下长出的单菌落数在30~300个之间，则认为改稀释度合适。将该稀释度下三个平板上长出的单菌落数求平均值，按下列公式计算菌悬液浓度：
菌悬液浓度（CFU/mL）=某个稀释度下的菌落平均数×稀释倍数×10
按下列公式计算某个紫外处理剂量下的致死率：
致死率（%）=（1－某剂量处理后的菌悬液浓度/处理前菌悬液浓度）×100%
经计算，不同紫外诱变剂量下枯草芽孢杆菌NP的致死率如表1所示。
表1 枯草芽孢杆菌NP紫外诱变致死率
时间/min 0.5 1 1.5 2 2.5 3
致死率/% 89.0 96.9 99.5 99.9 99.9 99.9
从表1可以看出，菌悬液经紫外照射1 min后致死率达到95%以上，因此确定最终诱变时间为1 min。
5.3 脱脂奶粉平板透明圈大小初筛
从紫外诱变1 min的脱脂奶粉平板上挑取透明圈显著的菌落，点种于脱脂奶粉平板，每组设3个平行，同时点种出发菌株作为对照。37℃培养10~12 h后，选择透明圈直径与菌落直径的比值大于出发菌的单菌落再次纯化，选择纯化后透明圈直径与菌落直径的比值大于出发菌30%以上的单菌落共50个进行摇瓶复筛。
5.4 摇瓶复筛
将上述筛选得到的50株突变菌分别接种于50 mL摇瓶发酵培养基中，34℃，220rpm发酵培养60 h后，离心取上清液，分别测定发酵上清液中的中性蛋白酶酶活，同时以出发菌株作为对照，选择摇瓶发酵酶活较出发菌株提高15%以上的突变株进行第二轮紫外诱变筛选。
申请人按照上述方法继续进行了9轮紫外诱变筛选，最终获得1株中性蛋白酶产量显著高于出发菌的突变菌株，命名为枯草芽孢杆菌QJNP（Bacillus subtilis QJNP）。该菌株50 mL摇瓶发酵培养基中34℃、220 rpm发酵培养60 h后，发酵上清液中中性蛋白酶酶活高达24410 U/mL，比出发菌提高57.6%；其20 L罐发酵粗酶液中中性蛋白酶酶活高达52750U/mL，比出发菌提高了41.5%，取得了意料不到的技术效果。
申请人已于2020年3月20日将上述突变菌株枯草芽孢杆菌QJNP（Bacillus subtilis QJNP）保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 19499。
序列表
<110> 青岛蔚蓝生物股份有限公司
潍坊康地恩生物科技有限公司
青岛蔚蓝生物集团有限公司
<120> 一株高产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1931
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctgtttgcg tttttgccgt gatttcgtgt atcattggtt tacttatttt tttgccaaag 60
ctgtaatggc tgaaaattct tacatttatt ttacattttt agaaatgggc gtgaaaaaaa 120
gcgcgcgatt atgtaaaata taaagtgata gcggtaccag gagggctgga agaagcagac 180
cgctaacaca gtacataaaa aaggagacat gaacgatggg tttaggtaag aaattgtctg 240
ttgctgtcgc cgcttccttt atgagtttaa ccatcagtct tccgggtgtt caggccgctg 300
agaatcctca gcttaaagaa aacctgacga actttgtgcc gaagcattct ttggtgcaat 360
ctgaattgcc ttcagtcagt gacaaagcaa tcaagcaata cttgaaacaa aacggcaaag 420
tcttcaaagg caacccttct gagagactga agctaattga ccacacgacc gatgatctcg 480
gctacaagca cttccgttat gtgcctgtcg ttaacggtgt gcctgtgaaa gactcgcaag 540
tcattattca cgtcgataaa tccaacaatg tctatgcgat taacggagaa ttaaacaacg 600
atgcttctgc caaaacggca aacagcaaaa aattatctgc aaatcaagcg ctggatcatg 660
cttttaaagc aatcggcaaa tcacctgaag ccgtctctaa cggcaacgtt gcaaacaaaa 720
acaaagccga gctgaaagca gcggccacaa aagacggtaa ataccgactc gcctatgatg 780
taaccatccg ctacatcgaa ccggaaccag ctaactggga agtaaccgtt gatgcggaaa 840
cagggaaagt cctgaaaaag caaaacaaag tggagcatgc cgctgcaacc ggaacaggta 900
cgactcttaa aggaaaaacg gtctcattaa atatttcttc tgaaagcggc aaatatgtaa 960
tgcgtgatct ttctaaacct accggaacgc aaattattac gtacgatctg caaaaccgac 1020
aatataacct gccgggcacg ctcgtatcaa gcactacaaa ccagttcaca acttcttctc 1080
agcgcgctgc cgttgatgcg cattacaatc tcggcaaagt gtacgattat ttctatcaga 1140
cgtttaaacg caacagctac gacaataaag gcggcaaaat cgtatcttcc gttcattacg 1200
gcagcaaata caacaacgcg gcctggatcg gcgaccaaat gatttacggt gacggtgacg 1260
gctcattctt ctcgcctctt tccggttcaa tggacgtaac ggcccatgaa atgacacacg 1320
gtgttacaca ggaaacagcc aacctgaact atgaaaatca accgggtgct ttaaacgaat 1380
ccttctctga tgtattcgga tacttcaatg atactgagga ctgggatatc ggtgaagata 1440
ttacggtcag ccagccggct ctccgcagtt tatccaatcc gacaaaatac ggacagcccg 1500
accattacaa aaattatcga aaccttccga atactgatgc cggcgactac ggcggcgtgc 1560
atacaaacag cggaattccg aacaaagccg cttacaacac gattacaaaa atcggcgtga 1620
aaaaagcgga gcagatttac taccgtgcac tgacggtata tctcactccg tcatcaagct 1680
ttaaagatgc aaaagcagct ttgattcaat cagcgcggga cctttacggc tctcaagacg 1740
ctgcaagcgt agaagcggcc tggaatgcgg tcggcttgta aacaagaaaa gagaccggag 1800
aaatccggtc tcttttttat atctgaaaca tttcacaatg gcttcaccat gatcatatat 1860
gttttttccc gatcgtcttt ttcaagctta agctgttcaa agccgcattg gcttaaaaac 1920
aaaacccatt c 1931
<210> 2
<211> 215
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctgtttgcg tttttgccgt gatttcgtgt atcattggtt tacttatttt tttgccaaag 60
ctgtaatggc tgaaaattct tacatttatt ttacattttt agaaatgggc gtgaaaaaaa 120
gcgcgcgatt atgtaaaata taaagtgata gcggtaccag gagggctgga agaagcagac 180
cgctaacaca gtacataaaa aaggagacat gaacg 215
<210> 3
<211> 1566
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgggtttag gtaagaaatt gtctgttgct gtcgccgctt cctttatgag tttaaccatc 60
agtcttccgg gtgttcaggc cgctgagaat cctcagctta aagaaaacct gacgaacttt 120
gtgccgaagc attctttggt gcaatctgaa ttgccttcag tcagtgacaa agcaatcaag 180
caatacttga aacaaaacgg caaagtcttc aaaggcaacc cttctgagag actgaagcta 240
attgaccaca cgaccgatga tctcggctac aagcacttcc gttatgtgcc tgtcgttaac 300
ggtgtgcctg tgaaagactc gcaagtcatt attcacgtcg ataaatccaa caatgtctat 360
gcgattaacg gagaattaaa caacgatgct tctgccaaaa cggcaaacag caaaaaatta 420
tctgcaaatc aagcgctgga tcatgctttt aaagcaatcg gcaaatcacc tgaagccgtc 480
tctaacggca acgttgcaaa caaaaacaaa gccgagctga aagcagcggc cacaaaagac 540
ggtaaatacc gactcgccta tgatgtaacc atccgctaca tcgaaccgga accagctaac 600
tgggaagtaa ccgttgatgc ggaaacaggg aaagtcctga aaaagcaaaa caaagtggag 660
catgccgctg caaccggaac aggtacgact cttaaaggaa aaacggtctc attaaatatt 720
tcttctgaaa gcggcaaata tgtaatgcgt gatctttcta aacctaccgg aacgcaaatt 780
attacgtacg atctgcaaaa ccgacaatat aacctgccgg gcacgctcgt atcaagcact 840
acaaaccagt tcacaacttc ttctcagcgc gctgccgttg atgcgcatta caatctcggc 900
aaagtgtacg attatttcta tcagacgttt aaacgcaaca gctacgacaa taaaggcggc 960
aaaatcgtat cttccgttca ttacggcagc aaatacaaca acgcggcctg gatcggcgac 1020
caaatgattt acggtgacgg tgacggctca ttcttctcgc ctctttccgg ttcaatggac 1080
gtaacggccc atgaaatgac acacggtgtt acacaggaaa cagccaacct gaactatgaa 1140
aatcaaccgg gtgctttaaa cgaatccttc tctgatgtat tcggatactt caatgatact 1200
gaggactggg atatcggtga agatattacg gtcagccagc cggctctccg cagtttatcc 1260
aatccgacaa aatacggaca gcccgaccat tacaaaaatt atcgaaacct tccgaatact 1320
gatgccggcg actacggcgg cgtgcataca aacagcggaa ttccgaacaa agccgcttac 1380
aacacgatta caaaaatcgg cgtgaaaaaa gcggagcaga tttactaccg tgcactgacg 1440
gtatatctca ctccgtcatc aagctttaaa gatgcaaaag cagctttgat tcaatcagcg 1500
cgggaccttt acggctctca agacgctgca agcgtagaag cggcctggaa tgcggtcggc 1560
ttgtaa 1566
<210> 4
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Gly Leu Gly Lys Lys Leu Ser Val Ala Val Ala Ala Ser Phe Met
1 5 10 15
Ser Leu Thr Ile Ser Leu Pro Gly Val Gln Ala
20 25
<210> 5
<211> 296
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctgtttgcg tttttgccgt gatttcgtgt atcattggtt tacttatttt tttgccaaag 60
ctgtaatggc tgaaaattct tacatttatt ttacattttt agaaatgggc gtgaaaaaaa 120
gcgcgcgatt atgtaaaata taaagtgata gcggtaccag gagggctgga agaagcagac 180
cgctaacaca gtacataaaa aaggagacat gaacgatgaa gaaaccgttg gggaaaattg 240
tcgcaagcac cgcactactc atttctgttg cttttagttc atcgatcgca tcggct 296
<210> 6
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile
1 5 10 15
Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala
20 25
<210> 7
<211> 302
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gctgtttgcg tttttgccgt gatttcgtgt atcattggtt tacttatttt tttgccaaag 60
ctgtaatggc tgaaaattct tacatttatt ttacattttt agaaatgggc gtgaaaaaaa 120
gcgcgcgatt atgtaaaata taaagtgata gcggtaccag gagggctgga agaagcagac 180
cgctaacaca gtacataaaa aaggagacat gaacgatgaa catcaaaaag tttgcaaaac 240
aagcaacagt attaaccttt actaccgcac tgctggcagg aggcgcaact caagcttttg 300
cc 302
<210> 8
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Asn Ile Lys Lys Phe Ala Lys Gln Ala Thr Val Leu Thr Phe Thr
1 5 10 15
Thr Ala Leu Leu Ala Gly Gly Ala Thr Gln Ala Phe Ala
20 25
<210> 9
<211> 650
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgacacagaa gaaaacgttg gatagagctg ggtaaagcct atgaattctc cattttcttc 60
tgctatcaaa ataacagact cgtgattttc caaacgagct ttcaaaaaag cctctgcccc 120
ttgcaaatcg gatgcctgtc tataaaattc ccgatattgg ttaaacagcg gcgcaatggc 180
ggccgcatct gatgtctttg cttggcgaat gttcatctta tttcttcctc cctctcaata 240
attttttcat tctatccctt ttctgtaaag tttatttttc agaatacttt tatcatcatg 300
ctttgaaaaa atatcacgat aatatccatt gttctcacgg aagcacacgc aggtcatttg 360
aacgaatttt ttcgacagga atttgccggg actcaggagc atttaaccta aaaaagcatg 420
acatttcagc ataatgaaca tttactcatg tctattttcg ttcttttctg tatgaaaata 480
gttatttcga gtctctacgg aaatagcgag agatgatata cctaaataga gataaaatca 540
tctcaaaaaa atgggtctac taaaatatta ttccatctat tacaataaat tcacagaata 600
gtcttttaag taagtctact ctgaattttt ttaaaaggag agggtaaaga 650

Claims (3)

1.一种枯草芽孢杆菌突变菌株，其特征在于，，所述的突变菌株的保藏编号为CGMCCNo. 19499。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌突变菌株在生产中性蛋白酶中的应用。
3.一种生产中性蛋白酶的方法，是以权利要求1所述的枯草芽孢杆菌突变菌株为发酵菌株。
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