CN105408749B - 免疫色谱法中使用光反射材料的检测光的增强方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于：提供可使被检测物质的高灵敏度检测与简单的试验片的结构这样的通常难以相容的项目并存的免疫色谱法试验片。免疫色谱试验片，其含有固定有作为与被检测物质结合的配体的捕捉物质的膜，使用结合有与被检测物质结合的配体的不溶性载体颗粒，通过将该不溶性载体颗粒捕捉至固定于膜上的捕捉物质而使其聚集，将光照射至膜，检测在该不溶性载体颗粒聚集的部位或不溶性载体颗粒聚集的部位以外的周围的部位发出的光，由此测定被检测物质，其中，在膜的照射光的一侧的相反侧设置光反射材料。

Description

免疫色谱法中使用光反射材料的检测光的增强方法
技术领域
本发明涉及用于特异性且迅速地检测样品中的被检测物质的方法和使用该方法的试剂盒。
背景技术
免疫色谱法是利用如下原理，通过目视或检测装置检测有无不溶性载体颗粒的聚集，从而分析有无被检测物质的免疫学方法：使用结合有特异性地识别被检测物质的配体的不溶性载体颗粒，该载体颗粒捕捉被检测物质，利用毛细管现象在具有纤维结构的试验片中移动，与在试验片中的规定位置固定的特异性地结合被检测物质的捕捉物质结合，由此凝集的不溶性载体颗粒在试验片中的规定位置聚集。由于它的简便性，被广泛用作非实验室用的POCT (即时检验(Point Of Care Test))的体外诊断用药品。
以往，作为标记特异性地识别被检测物质的配体的对象的颗粒，使用金胶体、铂金胶体、着色聚苯乙烯颗粒等不溶性载体颗粒，利用各种颗粒的色调，使用目视或专用的装置判断有无颗粒的聚集。
以进一步高灵敏度化作为课题，有人提出了使用发射荧光的微粒发挥免疫凝集反应的简便性以提高灵敏度(参照专利文献1)。
另外，在使用发射荧光的微粒的情况下，为了其高灵敏度检测而需要专用的装置。其便携性在考虑作为POCT利用的情况下是非常重要的课题。
为了解决该课题，还有人提出了极具便携性、廉价且耐用的灵敏度高的荧光检测用装置(参照专利文献2)。
虽然提出了使用这种发射荧光的颗粒或装置用于免疫色谱法的高灵敏度检测方法，但在检测在试验片上的规定位置聚集的发射荧光的颗粒受到光照射被激发而从上述颗粒产生的光的试验***中，尚未有人提出可通过改良其试验片和储存试验片的盒子(而非颗粒)进行高灵敏度检测的技术。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2012-32263号公报
专利文献2：日本特表2005-515429号公报。
发明内容
发明所要解决的课题
在使用专用的检测装置高灵敏度化时，检测装置侧的检测结构多数不得不复杂化，另一方面使用含有被检测物质的来源于生物体的物质进行了试验的试验片(POCT试剂盒本体)在使用后必须废弃。为了在临床现场广泛普及并可在各领域应用，希望试验片的处理简便且廉价。因此，试验片的结构必须简单。
本发明的目的在于提供一种免疫色谱试验片，其可使被检测物质的高灵敏度检测与简单的试验片结构这样的通常难以相容的项目并存。
解决课题的手段
在使用荧光检测装置等检测装置的测定中，从检测装置所含有的光源向试验片照射一定波长的激发光。试验片上聚集的发射荧光的颗粒接受该激发光，发出特定波长的荧光。通过检测装置检测从该发射荧光的颗粒发出的特定波长的光。
虽然从检测装置照射的激发光照射试验片上的发射荧光的颗粒聚集的部位，但此时并不是所有的激发光照射到颗粒，多数的光会穿越至试验片下部，无助于荧光的产生而会降低光强度。
本发明的试验片通过在试验片下部设置反射照射光的光反射材料来反射会穿越至该试验片下部的照射光，有效地将照射光照射到聚集的发射荧光的颗粒，从而增强产生的荧光、即最终检测的光。本发明的试验片与以往的试验片相比无大的变化，其不具有复杂的结构而具有简单的结构，但是，通过设置反射材料，使得可高灵敏度地检测被检测物质。
另外，在使用着色成可见光区域的颜色的颗粒而不是发射荧光的颗粒的情况下，通过在试验片下部设置反射照射光的光反射材料，在颗粒聚集的部位照射的光的反射光因颗粒的存在而衰减，另一方面，在颗粒聚集的部位以外的周围的部位反射后被检测的光的强度增强，最终检测的光增强，使得可高灵敏度地检测被检测物质。
即，本发明如下所述。
[1] 免疫色谱试验片，其含有固定有作为与被检测物质结合的配体的捕捉物质的膜，使用结合有与被检测物质结合的配体的不溶性载体颗粒，通过将该不溶性载体颗粒捕捉至固定于膜上的捕捉物质而使其聚集，将光照射至膜，检测在该不溶性载体颗粒聚集的部位或不溶性载体颗粒聚集的部位以外的周围的部位发出的光，由此测定被检测物质，其中，在膜的照射光的一侧的相反侧设置光反射材料。
[2] [1]的免疫色谱试验片，其中，不溶性载体颗粒为进行了荧光标记的不溶性载体颗粒，照射激发光作为照射光，通过检测从不溶性载体颗粒聚集的部位发出的荧光来测定被检测物质。
[3] [1]的免疫色谱试验片，其中，不溶性载体颗粒为着色的不溶性载体颗粒，通过照射照射光并检测在不溶性载体颗粒聚集的部位和不溶性载体颗粒聚集的部位以外的周围的部位反射的反射光，测定被检测物质。
[4] [1]~[3]中任一项的免疫色谱试验片，其使用照射光的总反射率为85%以上的光反射材料。
[5] [1]~[4]中任一项的免疫色谱试验片，其还具有试样添加部位、吸收带和标记部位。
[6] [1]~[5]中任一项的免疫色谱试验片，其中，光反射材料为由金属制成的反射材料。
[7] [6]的免疫色谱试验片，其中，金属为铝或铜。
[8] [7]的免疫色谱试验片，其中，在金属为铝的情况下使用250nm~1000nm的照射光，在金属为铜的情况下使用600nm~1000nm的照射光。
[9] [1]~[8]中任一项的免疫色谱试验片，其中，光反射材料与膜的照射照射光的一侧的相反侧接触而设置。
[10] 免疫色谱试验片，其是收纳在储存容器中的[1]~[9]中任一项的免疫色谱试验片，其中，在作为储存容器的内面且位于膜的照射照射光的一侧的相反侧的储存容器内面设置光反射材料。
[11] [10]的免疫色谱试验片，其中，光反射材料具有在免疫色谱试验片的检测部位附近聚集反射的照射光的结构。
[12] [10]或[11]的免疫色谱试验片，其中，储存容器本身由光反射材料制成。
[13] [1]~[12]中任一项的免疫色谱试验片，其中，被检测物质和与被检测物质结合的配体为：抗原和抗体，或抗体和抗原。
[14] 增强检测光的方法，其中，在免疫色谱法中通过在膜的照射光的一侧的相反侧设置光反射材料来增强检测光，所述免疫色谱法含有固定有作为与被检测物质结合的配体的捕捉物质的膜，使用结合有与被检测物质结合的配体的不溶性载体颗粒，通过将该不溶性载体颗粒捕捉至固定于膜上的捕捉物质而使其聚集，将光照射至膜，检测在该不溶性载体颗粒聚集的部位或不溶性载体颗粒聚集的部位以外的周围的部位发出的光，由此测定被检测物质。
[15] [14]的增强检测光的方法，其中，不溶性载体颗粒为进行了荧光标记的不溶性载体颗粒，照射激发光作为照射光，通过检测从不溶性载体颗粒聚集的部位发出的荧光来测定被检测物质。
[16] [14]的增强检测光的方法，其中，不溶性载体颗粒为着色的不溶性载体颗粒，通过照射照射光并检测在不溶性载体颗粒聚集的部位和不溶性载体颗粒聚集的部位以外的周围的部位反射的反射光，测定被检测物质。
[17] [14]~[16]中任一项的增强检测光的方法，其使用照射光的总反射率为85%以上的光反射材料。
[18] [14]~[17]中任一项的增强检测光的方法，其中，光反射材料为由金属制成的反射材料。
[19] [18]的增强检测光的方法，其中，金属为铝或铜。
[20] [19]的增强检测光的方法，其中，在金属为铝的情况下使用250nm~1000nm的照射光，在金属为铜的情况下使用600nm~1000nm的照射光。
[21] [14]~[20]中任一项的增强检测光的方法，其中，被检测物质和与被检测物质结合的配体为：抗原和抗体，或抗体和抗原。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本国专利申请2013-161691号的说明书和/或附图中记载的内容。
发明效果
在免疫色谱试验中，本发明在免疫色谱试验片上的不溶性载体颗粒聚集的部位的下侧设置光反射材料，所述免疫色谱试验使用荧光色素标记的不溶性载体颗粒或着色的不溶性载体颗粒，使该颗粒在免疫色谱试验片上聚集，检测从该颗粒发出的荧光，或者，使用着色的不溶性载体颗粒，使该颗粒在免疫色谱试验片上聚集，在含有该颗粒聚集的部位和聚集的部位以外的周围的部位的部位检测反射光。因此，在使用荧光色素标记的不溶性载体颗粒的情况下，即使在照射至荧光色素标记的不溶性载体颗粒聚集的部位的激发光透过膜的情况下，也可通过光反射材料反射，照射至荧光色素，从而激发荧光色素。另外，产生的荧光的一部分被光反射材料反射，作为检测光被检测。结果，作为荧光的检测光的强度增强。另外，在使用着色的不溶性载体颗粒的情况下，由于照射光被不溶性载体颗粒吸收，所以照射的光的反射光因不溶性载体颗粒而衰减，而另一方面，照射光在不溶性载体颗粒聚集的部位以外的周围的部位反射，反射的光作为增强的检测光被检测。结果，可提高被检测物质的检测灵敏度。
附图说明
图1是示出使用本发明的具备光反射材料的免疫色谱试验片的情况下检测光的增强原理的图。A示出使用荧光标记的不溶性载体颗粒的情况，B示出使用着色的不溶性载体颗粒的情况。
图2是示出各种金属的总反射率的图。
图3是示出本发明的含有光反射材料的免疫色谱试验片、装置中光反射材料的位置和形状的图。
图4是示出本发明的含有光反射材料的免疫色谱试验片和以往的免疫色谱法试验片的结构的图。
图5是示出本发明的含有光反射材料的免疫色谱试验片和以往的免疫色谱法试验片的检测部位的荧光的图。
图6是示出本发明的含有光反射材料的免疫色谱试验片和以往的免疫色谱法试验片的结构、以及实施例2的切断部位的图。
图7是示出使用各种金属箔作为光反射材料的情况下的反射效果的图。
图8是示出使用各种金属箔作为光反射材料的情况下的反射效果的图。
图9-1是示出使用着色的聚苯乙烯颗粒的情况下使用光反射材料的反射效果的图。
图9-2是示出使用着色的聚苯乙烯颗粒的情况下照射的光的反射光因颗粒导致的衰减的图。
具体实施方式
以下详细地说明本发明。
本发明为用于通过免疫色谱法检测被检测物质的试验片。在免疫色谱法中，利用如下原理，在含有不溶性载体颗粒聚集的部位的试验片上照射光，将在试验片上的部位发出的光作为检测光通过检测装置或目视来测定，检测有无不溶性载体颗粒的聚集，从而分析有无被检测物质：使用固定有特异性地识别并结合被检测物质的配体的试验片和与特异性地识别被检测物质的配体结合的不溶性载体颗粒，该不溶性载体颗粒与被检测物质结合，利用毛细管现象在具有纤维结构的试验片中移动，与在试验片中的规定部位固定的与被检测物质特异性结合的捕捉物质结合，由此在试验片上的规定部位形成捕捉物质-被检测物质-不溶性载体颗粒的复合物，凝集的不溶性载体颗粒聚集。
本发明的免疫色谱试验片的特征在于，在试验片上的照射光的一侧的相反侧具备光反射材料。在被检测物质存在的情况下，不溶性载体颗粒在试验片上的固定有捕捉物质的部位、即检测部位聚集。通过具备光反射材料，增强在试验片上的不溶性载体颗粒聚集的检测部位发出并通过光检测装置或目视检测的检测光。即，增强在试验片上的不溶性载体颗粒聚集的检测部位发出的光，或者，与在该检测部位发出的光相比，在该检测部位以外的周围的部位发出的光的强度增强，结果增强检测光的强度。在这里，检测光是指在试验片上照射光后从试验片上发出并通过光检测装置或目视检测的光。具体而言，通过使用具备光反射材料的免疫色谱试验片，在试验片上的不溶性载体颗粒聚集的检测部位发出的光的强度与在该检测部位以外的周围的部位发出的光的强度的对比度变大，结果可检测在检测部位聚集的不溶性载体颗粒的存在。在本发明中，在提及“在试验片上的不溶性载体颗粒聚集的检测部位发出的光”时，既含有从在检测部位聚集的不溶性载体颗粒本身产生的光，也含有在检测部位反射的光、或被在试验片的照射光的一侧的相反侧具备的光反射材料反射并通过检测部位被检测的光。另外，“在试验片上的检测部位以外的周围的部位发出的光”含有在检测部位的周围的部位、即试验片上的不溶性载体颗粒未聚集的部位反射的光，或被在试验片的照射光的一侧的相反侧提供的光反射材料反射并通过检测部位以外的部位被检测的光。
不溶性载体颗粒指颗粒本身为液体不溶性且成为结合并保持抗原或抗体的载体的颗粒。在本发明中，可使用在检测试剂等技术领域中使用的胶乳颗粒。胶乳颗粒指形成胶体状地分散在水中的乳浊液的颗粒。颗粒的材质无限制，可使用在检测试剂等技术领域中用于结合抗体、抗原、配体、受体等蛋白质的固相载体材料的材质。例如，可列举出聚苯乙烯、苯乙烯-丙烯酸共聚物等苯乙烯共聚物、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸亚甲酯(PMMA)、聚乙烯基甲苯等树脂，二氧化硅，纤维素等。其中，优选将苯乙烯作为基料的颗粒。将苯乙烯作为基料的颗粒指聚苯乙烯、或者苯乙烯或苯乙烯的衍生物与聚合性不饱和羧酸或聚合性不饱和磺酸等的共聚物。作为苯乙烯的衍生物，可列举出氯甲基苯乙烯、二乙烯基苯等，作为聚合性不饱和羧酸，可列举出丙烯酸、甲基丙烯酸等，作为聚合性不饱和磺酸，可列举出苯乙烯磺酸钠等。在本发明中，将苯乙烯作为基料的胶乳颗粒称为聚苯乙烯胶乳颗粒。
使用的颗粒的粒径为10nm~数百nm，优选为30nm~500nm。
在不溶性载体颗粒中含有用荧光色素标记了的荧光标记的不溶性载体颗粒和用着色色素着色了的着色的不溶性载体颗粒。
作为荧光标记的不溶性载体颗粒，可使用通过结合荧光色素作为荧光标记剂而用荧光色素标记了的颗粒。结合的荧光色素的种类无限制，可使用在检测试剂等领域使用的荧光色素。
例如，作为用于荧光标记的荧光色素，可列举出具有荧光素、罗丹明、香豆素、Cy染料、Alexa (注册商标) Fluor、EvoBlue、嗪、Carbopyronin、萘、联苯、蒽、菲、芘、咔唑等作为基本骨架的有机荧光色素或该荧光色素的衍生物。另外，也可使用铕(EU3+)螯合物或铽(Tb3+)螯合物等稀土类络合物。作为铕(EU3+)螯合物，可使用具有氨基的ATBTA-EU3+等。此外，还可使用绿色荧光蛋白(GFP)等荧光蛋白质。
荧光色素对不溶性载体颗粒的标记可通过如下方法来进行：预先在上述不溶性载体颗粒上引入羧基、氨基、磺酸基、巯基、醛基等官能团，在上述荧光色素上也引入官能团，通过官能团彼此的结合反应而使荧光色素与不溶性载体颗粒结合。例如，可通过酰胺键使氨基与羧基结合，或通过二硫键使巯基彼此结合。另外，也可使用交联试剂使官能团彼此结合。作为交联试剂，可列举出N-羟基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺、EDAC (N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐)、戊二醛等。另外，在使用稀土类络合物作为荧光色素的情况下，可使用引入有氨基的ATBTA-EU3+等。此外，在使用荧光蛋白质的情况下，可利用官能团彼此的结合，也可利用物理吸附使荧光蛋白质与不溶性载体颗粒结合。引入有氨基或羧基的荧光色素可使用市售的荧光色素。
以下示出在本发明中能够使用的荧光色素。以激发波长/荧光波长的方式在括号内示出荧光色素各自的激发波长(nm)和荧光波长(nm)。激发波长和荧光波长根据测定条件等而前后变动。可在下列波长的±数十nm (例如±25nm)的范围内测定。这些荧光色素为实例，并不限定于它们，可根据荧光波长使用各种荧光色素。
有机荧光色素
Dylight (注册商标) 405 (400/420)、DY-405 (400/420)、Cascade Blue (400/420)、Alexa Fluor (注册商标) 405 (401/421)、AMCA (353/440)、Alexa-350 (346/442)、AMCA-X (347/447)、Pacific Blue (商标) (405/455)、Marine Blue (365/460)、DY-415(418/467)、Royal Blue (426/480)、ATTO425 (436/484)、Cy (商标) 2 (489/505)、ATTO465 (453/508)、DY-475XL (492/509)、Northern Lights (商标) 493 (493/514)、BODIPY (注册商标) 505/515 (505/515)、DY-490 (490/516)、DyLight (注册商标) 488(493/518)、Alexa-488 (495/519)、5-FITC (494/519)、FAM (495/520)、DY-495-X5 (495/520)、DY-495 (493/521)、荧光素(Fluorescein) (494/521)、FITC (异硫氰酸荧光素)(498/522)、ATTO488 (501/523)、HiLyte Flour (商标) 488 (499/523)、MFP488 (501/523)、ATTO495 (495/527)、OG-488 (496/524)、罗丹明110 (500/525)、OG-514 (511/530)、Oyster (注册商标) 500 (505/530)、Spectrum Green (497/538)、Alexa-430 (431/541)、ATTO520 (525/545)、ATTO532 (532/553)、Cas Y (402/554)、Alexa-532 (530/554)、DY-500XL (505/555)、DY-485XL (485/560)、Alexa-555 (555/565)、HiLyte Plus555 (552/567)、DyLight549 (550/568)、HiLyte Fluor555 (553/568)、Cy3 (550/565)、Dylight547(557/570)、罗丹明 (550/570)、TRITC (550/570)、DY-548 (558/572)、DY-554 (551/572)、DY-555 (547/572)、Alexa Fluor 546 (556/573)、DY-556 (548/573)、NorthernLights557 (557/574)、Oyster 550 (555/574)、5-TAMRA (547/574)、DY-505-X5 (505/574)、DY-547 (557/574)、Oyster 556 (562/575)、DY-549 (560/575)、Alexa-546 (556/575)、ATTO550 (554/576)、PE (488/578)、B-PE (545/578)、R-PE (566/578)、DY-560(559/578)、TAMRA (555/580)、四甲基罗丹明(552/578)、RITC/TMR (555/580)、MFP555(560/585)、Spectrum Orange (559/588)、DY-510XL (509/590)、罗丹明B (570/590)、ATTO565 (563/592)、Cy3.5 (581/596)、ROX (罗丹明红X) (587/599)、DY-590 (580/599)、5-ROX (573/602)、Alexa-568 (578/603)、BODIPY 580/605 (580/605)、Spectrum Red(587/612)、ECD (488/613)、Texas Red (注册商标) (596/615)、DyLight594 (593/618)、Alexa Flour594 (590/619)、HiLyte Fluor TR (591/622)、ATTO590 (594/624)、MFP590(597/624)、DY-610 (610/630)、DY-480XL (500/630)、ATTO610 (615/634)、DY-615 (621/641)、C-Phycocyanin (616/647)、ATTO620 (619/643)、Alexa-633 (632/647)、Phycocianin (620/650)、DY-481XL (515/650)、ATTO633 (629/657)、DY-630 (636/657)、DY-632 (637/657)、DY-633 (637/657)、MFP631 (633/658)、DyLight633 (638/658)、Northern Lights637 (637/658)、DY-631 (637/658)、DY-634 (635/658)、APC (别藻蓝蛋白) (650/660)、APC-XL (650/660)、DY-520XL (520/664)、Alexa-647 (650/668)、Cy5(643/667)、DY-521XL (523/668)、Oyster 645 (650/669)、Quantum Red (488/670)、DY-635 (645/671)、DY-636 (645/671)、DY-647 (653/673)、DyLight647 (652/673)、HiLyteFluor (653/647)、DyLight649 (646/674)、HiLyte Plus647 (649/674)、Oyster650 (655/674)、DY-648 (653/674)、DY-650 (653/674)、PerCP (488/675)、DY-652 (654/675)、DY-649 (655/676)、DY-651 (656/678)、Oyster656 (662/679)、ATTO655 (663/684)、Alexa-660 (663/690)、Cy5.5 (675/694)、DY-677 (673/694)、DY-678 (674/698)、HiLyteFluor680 (678/699)、DY-675 (674/699)、DY-676 (674/699)、IRDye (注册商标) 700DX(689/700)、Alexa-680 (679/702)、DY-681 (691/708)、DY-680 (690/709)、DY-682 (690/709)、DyLight680 (682/715)、Alexa Fluor700 (702/723)、DY-700 (707/730)、DY-701(706/731)、DY-730 (732/758)、DY-732 (736/759)、DY-734 (736/759)、DY-731 (736/760)、DY-752 (748/772)、DY-750 (747/776)、DyLight750 (752/778)、HiLyte Fluor750(751/778)、DY-749 (752/778)、HiLyte Plus750 (751/779)、DY-751 (751/779)、DyLight800 (770/794)、IRDye800CW (774/800)、DY-780 (782/800)、DY-781 (783/800)、DY-782 (784/800)、DY-776 (771/801)、DY-777 (771/801)、IRDye800 (778/806)等
稀土类络合物
ATBTA-EU3+ (335/616)等
荧光蛋白质
Sirius (355/424)、CFP (452/505)、AcGFP (475/505)、EGFP (488/509)、EYFP(513/527)、YFP (514/527)、ZsYellow (529/539)、mOrange (548/562)、DsRed2 (563/582)、AsRed2 (576/592)、mRFP1 (584/607)、mCherry (587/610)、HcRed (588/618)、mRasberry (598/625)、mPlum (590/649)等。
另外，也可使用由能够发出荧光的物质制成的不溶性载体颗粒。作为这样的颗粒，例如可列举出由将铕(Eu)、铽(Tb)等稀土类元素活化的MIMIIO4或MIAl5O12 (MI为钇(Ｙ)、镧(La)或钆(Gd)，MII为铌(Nb)、磷(P)或钒(V))构成的颗粒，可使用日本特开2012-32263号公报中记载的颗粒。在本发明中，这些由能够发出荧光的物质制成的不溶性载体颗粒也包括在荧光色素标记的不溶性载体颗粒中。
在照射上述激发光作为照射光的情况下，荧光标记的不溶性载体颗粒被激发，发出与激发光不同的波长的荧光。因此，在使用荧光标记的不溶性载体颗粒的情况下，将荧光色素发出的光作为检测光进行检测。即，在使用荧光标记的不溶性载体颗粒的情况下，在不溶性载体颗粒聚集的检测部位发出的检测光指从荧光色素产生的荧光。
在使用具备光反射材料的试验片进行试验时，在使用荧光标记的不溶性载体颗粒的情况下，若在含有不溶性载体颗粒聚集的检测部位的试验片上照射作为激发光的照射光，则激发光激发荧光标记的不溶性载体颗粒的荧光色素。另外，一旦照射光的一部分照射至光反射材料，则其被反射而激发荧光标记的不溶性载体颗粒的荧光色素。从激发光照射到的荧光色素产生荧光，并被检测。另外，产生的荧光的一部分被上述光反射材料反射，并被检测。结果，增强作为荧光的检测光的强度。
着色的不溶性载体颗粒为可见光区域着色的不溶性载体颗粒，可见光区域着色的不溶性载体颗粒指由人能够用眼睛观察并识别的颜色着色的不溶性载体颗粒。对于该可见光区域着色的不溶性载体颗粒，通过反射特定的波长的可见光线，人可通过这种反射的可见光线识别颜色。可见光线是波长为380nm~750nm左右的光线。着色颗粒的颜色作为彩色可用色调表现，有红色、橙色、黄色、绿色、蓝色、紫色等，对于各种颜色，通过反射以下特定的波长的可见光线而被人识别为着色成该颜色：
红色 620~750nm
橙色 590~620nm
黄色 570~590nm
绿色 495~570nm
蓝色 450~495nm
紫色 380~450nm。
可见光区域着色的不溶性载体颗粒可通过用各种颜色的色素对上述颗粒进行染色来制备。色素染色可为颗粒表面的染色，但为了防止色素的脱离，优选通过使色素渗入颗粒中而将颗粒内部也染色。另外，可用单独的色素进行染色，但也可通过用多种色素进行染色而得到着色成任意颜色的可见光区域着色的不溶性载体颗粒。例如，可制备红色颗粒、蓝色颗粒、绿色颗粒、黄色颗粒、粉色颗粒等各种颜色的着色的不溶性载体颗粒。用于着色的色素可使用能够用于树脂等的染色的公知的色素，例如可使用苏丹兰、苏丹III、苏丹红IV、醌茜绿、油溶橙等染料或颜料进行着色。另外，市售有由各种材质制成的着色成各种颜色的颗粒，也可使用这些市售的着色的不溶性载体颗粒。
可见光区域着色的不溶性载体颗粒根据颜色反射上述波长范围的光，另一方面，吸收与上述波长范围的光有互补色关系的波长范围的光。例如，红色不溶性载体颗粒吸收与红色有互补色关系的颜色的光。红色光的波长为620~750nm左右。与红色有互补色关系的颜色为蓝色~绿色，蓝色光的波长为450~495nm左右，绿色光的波长为495nm~570nm左右。另外，蓝色不溶性载体颗粒吸收与蓝色有互补色关系的颜色的光。蓝色光的波长为450~495nm左右。与蓝色有互补色关系的颜色为橙色~红色，橙色光的波长为590~620nm左右，红色光的波长为620nm~750nm左右。
在本发明中，在使用着色的不溶性载体颗粒的情况下，为了提高从试验片上的着色的不溶性载体颗粒聚集的检测部位发出的光与从检测部位以外的周围的部位发出的光的强度的对比度，希望照射着色的不溶性载体颗粒能够吸收的波长范围的光、即与着色的不溶性载体颗粒的颜色有互补色关系的颜色的波长范围的光。因此，在照射的光到达着色的不溶性载体颗粒时，光的大部分不被反射而被吸收，照射的光的反射光的强度衰减。另一方面，到达着色的不溶性载体颗粒未聚集的检测部位以外的周围的部位的光不被吸收，透过试验片到达光反射材料，并被反射。反射的光的一部分进一步被着色的不溶性载体颗粒吸收，或被着色的不溶性载体颗粒遮断。因此，在不溶性载体颗粒聚集的检测部位，照射的光的反射光衰减，在检测部位以外的周围的部位发出的检测光增强。换言之，检测部位的反射光变弱，检测部位以外的周围的部位的反射光变强。在使用着色的不溶性载体颗粒的情况下，从不溶性载体颗粒聚集的检测部位发出的光和从检测部位以外的周围的部位发出的光指照射的光反射的光。因此，照射光与反射光的波长相同。
在图1中示出使用本发明的具备光反射材料的免疫色谱试验片的情况下检测光的增强原理。图1A为使用荧光标记的不溶性载体颗粒的情况，图1B为使用着色的不溶性载体颗粒的情况。另外，图中的曲线图在横轴上表示试验片上的位置，在纵轴上表示试验片上某位置的检测到的光的强度。图1A的使用荧光标记的不溶性载体颗粒的情况下的光的强度为荧光强度，图1B的使用着色的不溶性载体颗粒的情况下的光的强度为反射光强度。图中的横轴下方的线条表示不溶性载体颗粒聚集的部位。另外，在图中，以往方法为使用不具备光反射材料的免疫色谱试验片的方法，本发明方法为使用具备光反射材料的免疫色谱试验片的方法。在使用荧光标记的不溶性载体颗粒的情况下，如图1A所示，在不溶性载体颗粒聚集的部位荧光变强，而在本发明方法中，与以往方法相比，该部位的荧光强度增强。另外，在使用着色的不溶性载体颗粒的情况下，如图1B所示，在不溶性载体颗粒聚集的部位，照射的光的反射光因不溶性载体颗粒的存在的影响而衰减，在不溶性载体颗粒聚集的部位以外的周围的部位反射光变强。在本发明方法中，与以往方法相比，在不溶性载体颗粒聚集的部位以外的周围的部位反射光变得更强，而不溶性载体颗粒聚集的部位的照射的光的反射光衰减，因此在不溶性载体颗粒聚集的部位以外的周围的部位反射光的强度增强，结果检测光增强。
本发明的免疫色谱试验片由多孔性的吸水性材质制成，具有由样品试液能够通过毛细管现象移动的材质制成的部件，将该部件称为膜。将荧光标记的不溶性载体颗粒或着色的不溶性载体颗粒聚集的位置称为检测部位，该膜含有固化有能够与被检测物质结合的捕捉物质的检测部位。膜由包含硝酸纤维素、醋酸纤维素、尼龙、聚醚砜、聚乙烯醇、聚酯、玻璃纤维、聚烯烃、纤维素、它们的混合纤维的材质制成，优选由硝酸纤维素膜制成。膜的厚度无特殊限制，优选为100~200μm左右。另外，膜作为长方形的条带(strip)使用，其大小无特殊限制，通常为3mm~9mm×40mm~60mm左右。
膜上的检测部位固定有能够与待检测的被检测物质特异性地结合以捕捉被检测物质的配体。有时也将检测部位称为捕捉部位。在检测部位，配体例如被固定为线状。在本发明中，“试验片上的检测部位以外的周围的部位”指与检测部位毗邻的试验片上的部位。典型地，对于与被检测物质结合的配体，在被检测物质为抗原的情况下为与该抗原特异性地结合的抗体，在被检测物质为抗体的情况下为该抗体特异性地结合的抗原。此外，作为被检测物质-配体的组合，可列举出受体-配体、配体-受体等组合。在提及免疫色谱法的情况下，通常指利用抗体与抗原的结合的试验方法，但在本发明中提及免疫色谱法的情况下，广义地进行解释，也包括使用并非抗原与抗体的组合的被检测物质-配体的组合的试验方法。以下对使用抗原与抗体的组合的试验方法进行说明。在被检测物质为抗原的情况下，只要固定特异性地识别该抗原的抗体即可，在被检测物质为抗体的情况下，只要固定该抗体特异性地识别的抗原即可。抗体或抗原例如只要被线状或点状地固定即可，优选线状地固定。固定可通过用于将蛋白质固定在硝酸纤维素膜等固相上的公知方法来进行。例如，可列举出：使用吸附的方法，利用氨基、羧基等官能团进行化学结合的方法等。抗体可使用纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。抗原可使用纯化的天然抗原或重组抗原。
在存在固定有上述抗原或抗体的检测部位的试验片上，在试验片上的检测部位以外的部分添加含有被检测物质的液体试样和结合有与该被检测物质结合的抗体或抗原的不溶性载体颗粒的混合物，由此不溶性载体颗粒与被检测物质通过抗原抗体反应形成复合物，与此同时通过毛细管现象在试验片上移动。通过抗原或抗体与不溶性载体颗粒结合的被检测物质与在检测部位固定的抗体或抗原结合，在检测部位形成固定的抗体或固定的抗原-被检测物质-不溶性载体颗粒的复合物。通过照射光并测定在试验片上的检测部位或检测部位以外的周围的部位发出的光，可检测该不溶性载体颗粒的存在，从而可检测有无被检测物质。
在膜上也可进一步存在对照显示部位。对照显示部位为显示正确实施了试验的部位。例如，对照显示部位存在于检测部位的下游，样品试样通过检测部位，在到达对照显示部位时通过着色等发出信号。在对照显示部可固定与不溶性载体颗粒所结合的配体结合的物质，或固定在样品试样到达时颜色变化的pH指示剂等试剂。
本发明的免疫色谱试验片可进一步具有试样添加部位、吸收带、标记部位。
试样添加部位为添加样品试液的部位，可将样品试液直接添加至上述膜上，或在试验片上设置有吸水性的材质(例如海绵、玻璃纤维等的无纺布等)的垫并添加至该部分。在使用垫的情况下，可将该垫称为试样垫。试样添加部位优选设置在试验片上的一端。
吸收带也称为吸收垫部位，可设置在本发明的免疫色谱试验片的与试样添加部位不同的一端，在添加至试样添加部位后，通过吸收在试验片上移动的试液而促进试验片上的试液流动。吸收带由吸水性的材质制成，使得可吸收大量的液体，例如可使用由纤维素、玻璃纤维等制成的无纺布等。另外，其大小无特殊限制，通常为3mm~15mm×10mm~40mm，厚度为0.5mm~3mm左右。
标记部位为含有荧光标记的不溶性载体或着色的不溶性载体的部位。标记部位可使用吸水性的材质(例如由海绵和玻璃纤维等制成的无纺布等材质)，其大小无特殊限制，通常为3mm~10mm×3mm~10mm，厚度为0.5mm~3mm左右，以干燥状态含有不溶性载体颗粒。在上述吸水性的材质中含有标记的不溶性载体颗粒并用作标记部位的情况下，可将该标记部位称为缀合垫。标记部位只要在上述吸水性的材质中含浸有不溶性载体颗粒并干燥即可。在将样品试液在试验片上从试样添加部位流至吸收带时的试样添加部位侧作为上游，并将吸收带侧作为下游的情况下，标记部位只要在试样添加部位的下游且设置在检测部位的上游即可。在这种情况下，试样添加部位的试样垫与标记部位的缀合垫可接触或不接触。
若将液体试样添加至试验片的试样样品部位，则液体试样通过毛细管现象移动至标记部位，标记部位所含有的不溶性载体颗粒溶解在液体试样中，与不溶性载体颗粒结合的抗原或抗体与液体试样中的被检测物质结合，从而形成复合物，与此同时在试验片的膜上移动至下游。抗原或抗体与不溶性载体颗粒结合的被检测物质与检测部位所固定的抗体或抗原结合，由此通过检测部位所固定的抗体或抗原捕捉不溶性载体颗粒与被检测物质的复合物，在检测部位不溶性载体颗粒聚集。剩余的液体试样通过检测部位，被吸收带吸收。
本发明的试验片可具有背衬片材。背衬片材也可称为支持片材，为了支持上述膜、试样添加部位、吸收带、标记部位而使用。膜、试样添加部位、吸收带、标记部位可贴附在背衬片材上。背衬片材为由不透过液体的塑料等制成的片材，以膜或其它的试样添加部位等部件保持一定的结构或强度的方式支持，并且可防止试样样品从试验片流出。在有背衬片材的情况下，将背衬片材也包括在内称为试验片。背衬片材可存在于膜与下述光反射材料之间或存在于光反射材料的下侧。在背衬片材存在于光反射材料的下侧的情况下，背衬片材可由不透过光的材料制成，但在背衬片材存在于膜与光反射材料之间的情况下，背衬片材需要由不使光明显衰减而透过的材料(例如透明的塑料)制成。
本发明的免疫色谱试验片可被收纳在储存容器内，通过该储存容器，例如可防止由紫外线或空气中的湿气导致的劣化。另外，在使用可能含有病毒或细菌等感染性微生物的试样作为样品试样的情况下，可通过储存容器防止进行测定的试验者与这些微生物接触。例如，只要使用适当大小的树脂制盒子作为储存容器，并在该盒子中收纳本发明的装置即可。另外，也可用树脂制薄膜等(顶层压板(top laminate))覆盖固定有抗原或抗体的试验片的表面。有将储存容器与其中收纳的试验片作为一个整体称为免疫色谱装置的情况。
在本发明的免疫色谱试验片中，通过预先在含有不溶性载体颗粒聚集的检测部位的试验片上的照射光的一侧的相反侧设置光反射材料，使得原本会透过试验片的照射光到达光反射材料而被反射。
光反射材料只要是能够反射照射光的材质，则可使用任意的材质的材料。另外，光反射材料可由反射光的物质形成，或用反射光的物质被覆原本不反射光的材质。作为反射光的物质，可列举出金属或玻璃、云母、二氧化硅等无机物。反射光的物质优选为金属，优选光反射材料本身由金属制成。作为金属，优选光的反射率高的金属，可列举出铝、钽、镍、钨、铜、黄铜、镍钛、金、铂等或它们的合金。光反射材料的表面可进行处理以具有光泽，使得光进行镜面反射，或进行处理以在表面残留粗糙，使得光进行漫反射，但优选进行处理使得进行镜面反射。另外，作为用反射光的物质被覆原本不反射光的材质的实例，可列举出用金属包覆由树脂等物质形成的材料的表面而得到的材质。此外，可用金属粉末涂布表面，形成金属膜。为了在表面形成金属薄膜，可通过电镀、溅射、蒸镀等方法来进行。另外，也可通过非电解镀镍-磷形成厚膜(例如膜厚度为5~20μm)。
反射率高的光线的波长因金属而不同。因此，在使用金属作为光反射材料的情况下，只要根据照射光的波长选择金属的种类即可。即，只要选择照射检测部位的照射光的波长的光的反射率高的金属即可。金属对光的波长的反射率可通过用分光光度计等测定金属的反射光谱来确定。因此，只要测定各金属的反射光谱，使用所用照射光的波长的光的反射率高的金属即可。在图2中示出铝、铜等金属的总反射率(该图引用自Mc Leed.“Thin filmoptical filters (薄膜滤光片)”, A.Hilger, 伦敦, 1985)。在图2中，横轴表示波长，纵轴表示总反射率。例如，可将该图作为参照，选择照射光的波长与金属的组合。
例如，只要使用45度入射的总反射率为80%以上、优选为85%以上、进一步优选为90%以上、特别优选为95%以上的波长与金属的组合即可。
例如，就铝而言，由于在250nm~1000nm的范围内的总反射率为85%以上，所以可用于250nm~1000nm的照射光。另外，就铜而言，由于600nm以上的波长的光的总反射率为90%以上，所以在使用600nm~1000nm的照射光的情况下可使用铜。
需说明的是，由于免疫色谱试验片为每1次用完舍弃，所以为了降低装置的制备成本，金属也优选可低成本地获取的金属，在这一点上优选铝或铜。
在免疫色谱试验片中，光反射材料优选使用片状或箔状的材料。作为这样的光反射材料，可使用铝箔或铜箔，只要使用市售的材料即可。
在照射至免疫色谱试验片的检测部位的照射光透过试验片的情况下，为了反射该照射光而使用光反射材料。因此，光反射材料设置在对免疫色谱试验片照射光的一侧(即光源存在的一侧)的相反侧。通常，免疫色谱试验片使固定有抗体或抗原的面向上，水平地放置使用。因此，光反射材料设置在免疫色谱试验片的下侧。在本申请发明中，有时将设置光反射材料的位置称为试验片的下侧，但试验片的下侧并不基于将重力场面向的方向作为基准的上下来确定，而指照射光的一侧的相反侧。
光反射材料至少设置在试验片上的检测部位的下侧或下部。光反射材料的大小只要是至少能够覆盖试验片上的检测部位的大小即可，优选比检测部位的大小大，使得透过检测部位以外的周围的部位的照射光也可反射，例如使用将试验片的膜整体覆盖的大小的材料。
光反射材料可与试验片为一体，或与试验片的储存容器为一体，另外也可与试验片一起储存在试验片的储存容器中。另外，上述背衬片材本身可为光反射材料，例如只要使用铝箔或铜箔作为背衬片材即可。
在图3中示出在本发明的免疫色谱试验片或包括储存容器的免疫色谱装置中设置光反射材料的位置或光反射材料的形状改变的方式实例。在图3中，a表示吸收带，b表示膜，b’表示膜上的检测部位，c表示缀合垫，d表示试样垫，e表示背衬片材，f表示光反射材料，g表示透过光的背衬片材，h表示储存容器。
图3A示出在不使用光反射材料的以往的免疫色谱法中使用的方式实例。图3B1和图3B2为示出设置有光反射材料的本发明的免疫色谱试验片的方式实例1和2的图，光反射材料与试验片为一体。图3B3、图3B4和图3B5为示出在安装有光反射材料的储存容器中收纳的试验片的方式实例3、4、5的图，在图3B3和图3B4所示的装置中，将光反射材料与试验片一起储存在储存容器中，在图3B5所示的装置中，光反射材料与储存容器为一体。图3B1所示的免疫色谱试验片在膜b的检测部位b’的下侧设置光反射材料f使得与膜b接触，进而在其下侧贴附背衬片材e。图3B2所示的免疫色谱试验片在膜b的下侧贴附背衬片材g，进而在其下侧设置光反射材料f。在图3B1所示的装置中，背衬片材e可为遮断光的材质，但在图3B2所示的装置中，背衬片材g需要由透明且透过光的材质制成。
图3B3、图3B4和图3B5示出在储存容器内收纳有试验片的装置，在储存容器h的内面设置光反射材料f。在图3B3所示的免疫色谱装置中，在相当于试验片的检测部位b’的下侧部分的储存容器h的内面设置光反射材料f。在图3B4所示的免疫色谱装置中，在与图3B3所示的装置相同的位置安装光反射材料f，但是，加工光反射材料f使得具有曲面，因该曲面的存在而将反射的光聚集在试验片上的检测部位b’及其周围的部位。即，图3B3所示的装置的光反射材料f具有反射的光在试验片上的检测部位b’及其周围的部位产生焦点这样的曲面。光反射材料的形状无限制，可为半球状、半圆柱状或具有多面结构。只要通过其结构进行反射，使得照射光有效地到达含有检测部位的免疫色谱试验片即可。此外，在图3B5所示的免疫色谱装置中，储存容器h的内面本身为光反射材料。在这种情况下，储存容器内面的整体可为光反射材料或一部分可为光反射材料。另外，储存容器本身可由铝或铜的光反射材料形成，或可用铝或铜包覆储存容器的内面。
使用本发明的免疫色谱试验片检测的被检测物质或样品试样无限制。例如，样品试液可使用咽头或鼻腔拭液、鼻腔抽吸液、咽头或鼻腔清洗液、唾液、血清、血浆、全血、粪便悬浮液、尿、培养液和用缓冲液将它们稀释而得到的试液等。被检测物质也无任何限制，可为要检测的任意物质。例如，可列举出流感病毒、腺病毒、RS病毒、诺沃克病毒等病毒抗原，军团杆菌属菌、溶血性链球菌、MRSA等细菌抗原，激素等抗原，此外可列举出针对上述细菌、病毒等的抗体。
在使用本发明的免疫色谱试验片的检测方法中，进行免疫色谱试验，将光照射在试验片上的检测部位聚集的荧光标记的不溶性载体颗粒或着色的不溶性载体颗粒。
在使用本发明的免疫色谱试验片的测定中，在使用荧光标记的不溶性载体颗粒的情况下，在含有不溶性载体颗粒聚集的检测部位的试验片上从试验片上部照射激发光。照射的激发光激发在试验片上的检测部位聚集的荧光标记的不溶性载体颗粒的荧光色素而产生荧光。在本发明的免疫色谱法试验片中，由于在试验片上的照射激发光的一侧的相反侧具备光反射材料，所以照射的激发光被光反射材料反射，可增强到达在检测部位聚集的不溶性载体颗粒的荧光色素的激发光的强度。另外，通过激发光的照射而产生的荧光的一部分也被光反射材料反射，作为检测光被检测。因此，有效地激发荧光色素而产生荧光，在试验片上的检测部发出的荧光的强度增强。由于在荧光标记的不溶性载体颗粒不存在的检测部位以外的周围部位不存在荧光色素，所以不发出荧光，在检测部发出的荧光与在检测部位以外的周围的部位发出的荧光的对比度变高，检测的光增强，可高灵敏度地检测试验片上的检测部位的荧光标记的不溶性载体颗粒的聚集。因此，可高灵敏度地检测被检测物质。
荧光的测定可使用含有照射激发光的光照射部件和检测产生的荧光的光检测部件的荧光检测装置进行。作为这样的装置，可使用公知的荧光检测装置。另外，也可适宜地设计这样的装置：其具有收纳有含有试验片或收纳容器的装置的部位，通过在该部位设置试验片或装置来检测荧光。另外，也可通过目视测定。在测定特定的抗原作为被检测物质的情况下，可预先测定在变化抗原浓度的情况下得到的荧光强度，基于该测定值制作标准曲线，由此根据得到的荧光强度确定样品试样中含有的抗原的浓度。
另外，在使用着色的不溶性载体颗粒的情况下，从含有不溶性载体颗粒聚集的检测部位的试验片上的试验片上部照射光。照射的光的一部分被着色的不溶性载体颗粒吸收。另外，照射的光的一部分透过试验片并被在试验片上的照射光的一侧的相反侧具备的光反射材料反射。在反射的光到达着色的不溶性载体颗粒时，则再次被不溶性载体颗粒吸收或被不溶性载体颗粒遮断。另一方面，照射的光的一部分被照射至不溶性载体颗粒聚集的检测部位以外的周围的部位，该光透过试验片并被在试验片上的照射光的一侧的相反侧具备的光反射材料反射，从而不到达不溶性载体颗粒，而作为检测光被检测。因此，照射的光的反射光因在试验片上聚集的不溶性载体颗粒而衰减，在该检测部位发出的光、即反射的光的强度变低，在试验片上的不溶性载体颗粒聚集的检测部位以外的周围的部位发出的光、即反射的光的强度变高。因此，在试验片上的不溶性载体颗粒聚集的检测部位发出的光与在试验片上的不溶性载体颗粒聚集的检测部位以外的周围的部位发出的光的对比度变高，检测的光增强，可高灵敏度地检测试验片上的检测部位的着色的不溶性载体颗粒的聚集。因此，可高灵敏度地检测被检测物质。
反射的照射光的测定可使用含有检测光的光检测部件的光检测装置进行。作为这样的装置，例如可使用免疫色谱专用读数器。另外，也可通过目视测定。在测定特定的抗原作为被检测物质的情况下，可预先测定在变化抗原浓度的情况下得到的光强度，基于该测定值制作标准曲线，由此根据得到的光强度确定样品试样中含有的抗原的浓度。
以下，作为使用本发明的免疫色谱试验片的被检测物质的检测的一个实例，对组合使用图3B2所示的本发明的试验片和荧光标记的不溶性载体颗粒来检测血清中的病毒抗原的方法进行说明。
在膜b上存在线状地固定有抗病毒抗原抗体的检测部位b’。缀合垫c含浸有作为荧光标记的不溶性载体颗粒且结合有抗病毒抗原抗体的不溶性载体颗粒并干燥。将数十μL~数百μL的含有要检测的病毒抗原的样品试液添加至试样垫。样品试液从试样垫流至缀合垫，溶解在缀合垫中干燥地含浸的不溶性载体颗粒。样品试液使不溶性载体颗粒溶解并流至下游，此时与不溶性载体颗粒结合的抗病毒抗原抗体与病毒抗原结合，形成不溶性载体颗粒-病毒抗原的复合物。若该复合物到达膜上的检测部位，则病毒抗原被在检测部位固定的抗病毒抗原抗体捕捉，在检测部位形成抗病毒抗原抗体-病毒抗原-不溶性载体颗粒的复合物。剩余的样品试液通过检测部位，在膜上向下游移动，被吸收带吸收。一旦激发光到达不溶性载体颗粒的荧光色素，则荧光色素发出荧光。此时，通过膜的激发光被在膜下侧设置的光反射材料反射，再次激发荧光色素，荧光强度增强。
在使用着色的不溶性载体颗粒的情况下，也只要相同地在检测部位形成抗病毒抗原抗体-病毒抗原-不溶性载体颗粒的复合物，将光照射至试验片即可。
本发明也还包括含有本发明的免疫色谱试验片或免疫色谱装置的免疫色谱试剂盒。
实施例
通过以下实施例具体地说明本发明，但本发明并不因这些实施例而受到限制。在实施例的记载中，%表示重量%。
实施例1 在免疫色谱试验片下部设置的金属(铝)箔对从荧光聚苯乙烯颗粒发出的检测光的增强
1．用纯化水稀释通过使用A蛋白柱的亲和色谱法纯化的小鼠IgG，使其为1.0mg/mL，在其中加入含有铕(EU3+)螯合物的荧光聚苯乙烯颗粒(Thermo scientific公司制：制品名：FluoroMax)，使其为0.1%，在搅拌后，加入碳二亚胺，使其为1%，进一步搅拌。通过离心操作除去上清液，再次悬浮于50mM Tris (pH9.0)、3% BSA中，得到来源于小鼠的抗体标记的荧光聚苯乙烯颗粒。
2．抗小鼠IgG抗体向硝酸纤维素膜的固定
将用纯化水稀释抗小鼠IgG抗体使其为1.0mg/mL的液体线状地涂布在用PET薄膜支持的硝酸纤维素膜的规定部位，于45℃干燥30分钟，得到固定有抗体的膜(以下作为固定有抗体的膜)。
3．使用免疫色谱法的标记颗粒在固定部位的聚集
将在2.中得到的固定有抗体的膜与背衬片材、吸收带、缀合垫、试样垫贴合，制成试验片，该不含有光反射材料的试验片作为以往的试验片(图4A)。另外，将在固定有抗体的膜的下方且背衬片材的上方夹持并贴合有铝金属箔作为光反射材料制成试验片，该含有光反射材料的试验片作为本发明方法的试验片(图4B)。
在试验片上将50μl的样品悬浮液(10mM Tris (pH7.0)、3% BSA、0.2% Triton X-100)滴加至试验片的试样垫。在静置15分钟后，在UV透照灯(Benchtop 2UV透照灯：UVP公司制)上，通过目视确认荧光。
结果，在固定有抗体的部位上可确认荧光聚苯乙烯颗粒的聚集。在目视中，其发出的光的强度与以往的试验片相比，可确认在本发明方法的试验片中明显增加(图5)。
根据以上结果，可通过使用以本发明方法制作的试验片增强检测光。在本实施例中通过目视判定荧光，但是认为，通过使用装置检测，可更高灵敏度地进行检测。
实施例2 在免疫色谱试验片下部设置的各种金属箔对从荧光聚苯乙烯颗粒发出的检测光的增强
1．用纯化水稀释通过使用A蛋白柱的亲和色谱法纯化的小鼠IgG，使其为1.0mg/mL，在其中加入含有铕螯合物的荧光聚苯乙烯颗粒，使其为0.1%，在搅拌后，加入碳二亚胺，使其为1%，进一步搅拌。通过离心操作除去上清液，再次悬浮于50mM Tris (pH9.0)、3% BSA中，得到来源于小鼠的抗体标记的荧光聚苯乙烯颗粒。
2．抗小鼠IgG抗体向硝酸纤维素膜的固定
将用纯化水稀释抗小鼠IgG抗体使其为1.0mg/mL的液体线状地涂布在用PET薄膜支持的硝酸纤维素膜的规定部位，于45℃干燥30分钟，得到固定有抗体的膜(以下作为固定有抗体的膜)。
3．使用免疫色谱法的荧光聚苯乙烯颗粒在固定部位的聚集
将在2.中得到的固定有抗体的膜与背衬片材、吸收带、缀合垫、试样垫贴合，制成试验片，该不含有光反射材料的试验片作为以往的试验片(图6A)。另外，将在固定有抗体的膜的下方且背衬片材的上方夹持并贴合有金属(铝、铜、不锈钢)箔作为光反射材料，制成试验片，该含有光反射材料的试验片作为本发明方法的试验片(图6B)。
在试验片上将50μl的样品悬浮液(10mM Tris (pH7.0)、3% BSA、0.2% Triton X-100)滴加至试验片的试样垫。在静置15分钟后，对于试验片的固定有抗体的部位，切断用图6的矩形包围的部位(h)，用荧光平板读数器(MTP-650FA MICROPLATE READER：CORONA公司制)照射照射光(365nm)，测定由荧光聚苯乙烯颗粒发出的检测光(615nm)的强度。
结果，发出的荧光的强度与以往的试验片相比，因使用铝箔而明确地增强，对于铜、不锈钢箔，也发现增强。若将3者进行比较，则检测光的增强程度为铝箔最明显(图7)。
存在光反射材料固有的各波长的反射率(图2)。在本实施例中使用的铝将365nm的照射光有效地反射约90%，另一方面铜对365nm的照射光的反射率为40%以下。
在本实施例中铝对检测光的增强程度比铜大，这表示在本发明方法中重要的是光反射材料具有的对照射光的反射效率。
在本实施例中使用365nm作为照射光，但并不将照射光的波长限定于365nm。在使用600nm作为照射光的情况下，铜与铝相同地有效地反射约90%，可以说铜作为光反射材料对600nm的照射光有效。在使用在570nm激发并发出600nm的荧光的颗粒、照射490nm的照射光并检测615nm的荧光时，铜与铝相同地增强检测光(图8)。
无论使用的照射光的波长如何，重要的是选择有效地反射该波长的材料。
实施例3 使用着色的聚苯乙烯颗粒的情况下在免疫色谱试验片下部设置的光反射材料对检测光的增强
1．用纯化水稀释通过使用A蛋白柱的亲和色谱法纯化的小鼠IgG，使其为1.0mg/mL，在其中加入着色成红色的聚苯乙烯颗粒，使其为0.1%，在搅拌后，加入碳二亚胺，使其为1%，进一步搅拌。通过离心操作除去上清液，再次悬浮于50mM Tris (pH9.0)、3% BSA中，得到来源于小鼠的抗体标记的着色的聚苯乙烯颗粒。
2．抗小鼠IgG抗体向硝酸纤维素膜的固定
将用纯化水稀释抗小鼠IgG抗体使其为1.0mg/mL的液体线状地涂布在用PET薄膜支持的硝酸纤维素膜的规定部位，于45℃干燥30分钟，得到固定有抗体的膜(以下作为固定有抗体的膜)。
3．使用免疫色谱法的着色的聚苯乙烯颗粒在固定部位的聚集
将在2.中得到的固定有抗体的膜与背衬片材、吸收带、缀合垫、试样垫贴合，制成试验片，该不含有光反射材料的试验片作为以往的试验片(图4A)。另外，将在固定有抗体的膜的下方且背衬片材的上方将光反射材料与膜夹持并贴合，制成试验片，该含有光反射材料的试验片作为本发明方法的试验片(图4B)。
在试验片上将50μl的样品悬浮液(10mM Tris (pH7.0)、3% BSA、0.2% Triton X-100)滴加至试验片的试样垫。在静置15分钟后，在试验片的固定有抗体的部位及其周围部位，使用免疫色谱专用读数器，照射照射光(绿色LED)并测定通过试验片和着色的聚苯乙烯颗粒反射的检测光的强度。
在图9-1中示出免疫色谱试验片上的位置与该位置的反射光的强度的关系。在图9-1中示出以往方法的试验片的结果和本发明方法的试验片的结果。中央的反射光强度低的部位(位置201~251附近)表示着色的聚苯乙烯颗粒聚集的部位。另外，图9-2是表示在图9-1的曲线图中反射光因着色的聚苯乙烯颗粒的影响而衰减，从而反射光强度降低的部位的峰面积的图。如图9-1所示，在着色的聚苯乙烯颗粒聚集的部位以外的周围的部位发出的反射光的强度与以往的试验片相比，在使用本发明方法的情况下明确地增强。另外，如图9-2所示，对于反射光因着色的聚苯乙烯颗粒的影响而衰减，反射光强度降低的部位的峰面积，本发明方法中比以往方法高。该结果表示：可更明确地检测照射的光的反射光因着色的聚苯乙烯颗粒所致的衰减。
标记说明
a 吸收带
b 膜
b’ 检测部位
c 缀合垫
d 试样垫
e 背衬片材
f 反射材料
g 背衬片材
h 切断部位
本说明书中引用的所有的出版物、专利和专利申请均直接作为参考引入本说明书中。

Claims (21)

1.免疫色谱试验片，其含有固定有作为与被检测物质结合的配体的捕捉物质的膜，使用结合有与被检测物质结合的配体的不溶性载体颗粒，通过将所述不溶性载体颗粒捕捉至固定于膜上的捕捉物质而使其聚集，将光照射至膜，检测在所述不溶性载体颗粒聚集的部位或不溶性载体颗粒聚集的部位以外的周围的部位发出的光，由此测定被检测物质，其中，在膜的照射光的一侧的相反侧设置光反射材料。
2.权利要求1的免疫色谱试验片，其中，不溶性载体颗粒为进行了荧光标记的不溶性载体颗粒，照射激发光作为照射光，通过检测从不溶性载体颗粒聚集的部位发出的荧光来测定被检测物质。
3.权利要求1的免疫色谱试验片，其中，不溶性载体颗粒为着色的不溶性载体颗粒，通过照射照射光并检测在不溶性载体颗粒聚集的部位和不溶性载体颗粒聚集的部位以外的周围的部位反射的反射光，测定被检测物质。
4.权利要求1的免疫色谱试验片，其使用照射光的总反射率为85%以上的光反射材料。
5.权利要求1的免疫色谱试验片，其还具有试样添加部位、吸收带和标记部位。
6.权利要求1的免疫色谱试验片，其中，光反射材料为由金属制成的反射材料。
7.权利要求6的免疫色谱试验片，其中，金属为铝或铜。
8.权利要求7的免疫色谱试验片，其中，在金属为铝的情况下使用250nm~1000nm的照射光，在金属为铜的情况下使用600nm~1000nm的照射光。
9.权利要求1的免疫色谱试验片，其中，光反射材料与膜的照射照射光的一侧的相反侧接触而设置。
10.免疫色谱试验片，其是收纳在储存容器中的权利要求1的免疫色谱试验片，其中，在作为储存容器的内面且位于膜的照射照射光的一侧的相反侧的储存容器内面设置光反射材料。
11.权利要求10的免疫色谱试验片，其中，光反射材料具有在免疫色谱试验片的检测部位附近聚集反射的照射光的结构。
12.权利要求10的免疫色谱试验片，其中，储存容器本身由光反射材料制成。
13.权利要求1的免疫色谱试验片，其中，被检测物质和与被检测物质结合的配体为：抗原和抗体，或抗体和抗原。
14.增强检测光的方法，其中，在免疫色谱法中通过在膜的照射光的一侧的相反侧设置光反射材料来增强检测光，所述免疫色谱法含有固定有作为与被检测物质结合的配体的捕捉物质的膜，使用结合有与被检测物质结合的配体的不溶性载体颗粒，通过将所述不溶性载体颗粒捕捉至固定于膜上的捕捉物质而使其聚集，将光照射至膜，检测在所述不溶性载体颗粒聚集的部位或不溶性载体颗粒聚集的部位以外的周围的部位发出的光，由此测定被检测物质。
15.权利要求14的增强检测光的方法，其中，不溶性载体颗粒为进行了荧光标记的不溶性载体颗粒，照射激发光作为照射光，通过检测从不溶性载体颗粒聚集的部位发出的荧光来测定被检测物质。
16.权利要求14的增强检测光的方法，其中，不溶性载体颗粒为着色的不溶性载体颗粒，通过照射照射光并检测在不溶性载体颗粒聚集的部位和不溶性载体颗粒聚集的部位以外的周围的部位反射的反射光，测定被检测物质。
17.权利要求14的增强检测光的方法，其使用照射光的总反射率为85%以上的光反射材料。
18.权利要求14的增强检测光的方法，其中，光反射材料为由金属制成的反射材料。
19.权利要求18的增强检测光的方法，其中，金属为铝或铜。
20.权利要求19的增强检测光的方法，其中，在金属为铝的情况下使用250nm~1000nm的照射光，在金属为铜的情况下使用600nm~1000nm的照射光。
21.权利要求14的增强检测光的方法，其中，被检测物质和与被检测物质结合的配体为：抗原和抗体，或抗体和抗原。
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