CN105400851A - α-熊果苷的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开α-熊果苷的制备方法，以淀粉类物质和对苯二酚为原料，加入生物酶进行酶法转化反应；反应液经过除酶后，加入酵母菌发酵去除反应液中的葡萄糖；发酵液除菌后，通过一次结晶得到α-熊果苷粗品，溶解α-熊果苷粗品进行二次或多次重结晶可得到纯度99％以上的α-熊果苷。本发明使用酶法转化生产α-熊果苷，转化效率高；使用酵母菌发酵除糖替代了传统的柱层析除糖工艺，避免了柱层析过程中使用的酸、碱或者有机溶剂，而且大大节约了纯水的使用量；使用多次结晶工艺纯化α-熊果苷方法简便，产品纯度可控。
Description
技术领域
本发明属于绿色环保生产工艺技术领域，更加具体地说，涉及一种α-熊果苷的制备新工艺，整个工艺流程中没有使用任何有机溶剂。
背景技术
α-熊果苷是β-熊果苷的差向异构体，其化学名为4-羟苯基-α-D吡喃葡萄糖苷，其氧苷键在空间的方向与β-熊果苷的方向相比正好相反，α-熊果苷的旋光度[α]20D为+176～184°，β-熊果苷为-63～-67°。α-熊果苷对黑色素合成酶——酪氨酸酶具有很好的抑制作用，对人体肌肤的美白作用是β-熊果苷的10倍以上，并且不会抑制人体细胞的生长，无毒副作用。经研究发现α-熊果苷对紫外线灼伤导致的瘢痕有较好的治疗功效，有较好的抗炎、修复和美白的作用。2000年以来，许多国际知名的化妆品牌，如日本知名品牌DHC、资生堂等，开始使用α熊果苷作为美白产品的增白剂。α-熊果苷比β-熊果苷稳定，能够比较方便的添加到美白化妆品中。目前合成熊果苷的方法主要有四种，有机合成法、植物提取法、生物转化法和酶合成法。其中有机合成法和植物提取法主要获得β-熊果苷，而α-熊果苷目前获取途径主要是生物转化法和酶合成法。利用一分子的葡萄糖和一分子的氢醌结合形成单一的α-熊果苷。
目前，国际上应用于美白化妆品中的α-熊果苷主要由日本江琦格力高工厂提供，江琦采用酶法转化生产α-熊果苷，后提取工艺主要采用有机溶剂萃取分离未反应的对苯二酚，层析柱吸附α-熊果苷及糖，采用不同浓度甲醇洗脱分离糖及糖苷(EP1260211A1)，由于后提取工艺过程复杂，成本较高，α-熊果苷的国际售价一直居高不下。国内也有一些公司生产α-熊果苷，主要采用黄单胞菌细胞催化法(CN200510080364)，后提取采用大孔吸附树脂分离提纯(CN200410090980.5)，亦使用有机溶剂洗脱，以及大量酸碱再生树脂，生产成本较高，产品质量不稳定，难以实现大规模生产。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种α-熊果苷的制备新工艺，整个工艺流程中没有使用任何有机溶剂，工艺过程绿色环保，而且成本较低。
本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现：
α-熊果苷的制备方法，按照下述步骤进行：
步骤1，将淀粉类物质作为糖基供体分散在蒸馏水中，加入对苯二酚作为糖基受体进行均匀混合，并调节反应溶液的pH为5—6，加入淀粉类物质的生物酶进行反应。
在步骤1中，选择在40—60℃下反应24—48h，优选在50—60摄氏度下反应30—40h，酶法转化生产α-熊果苷，转化效率高于细胞催化，工艺流程被极大地缩短，反应产物中不仅有α-熊果苷，还有对羟基苯麦芽糖苷，对羟基苯麦芽三糖苷，对羟基苯麦芽四糖苷等副产物。
在步骤1中，淀粉类物质为蔗糖、支链或者直链淀粉、环糊精、麦芽糊精或者麦芽低聚糖；淀粉类物质的生物酶为蔗糖磷酸化酶、淀粉酶、环糊精葡萄糖基转移酶或者糖基转移酶。
在进行使用时，淀粉类物质的种类选择与所使用的生物酶相关，若使用蔗糖磷酸化酶，则淀粉类物质优选蔗糖；若使用淀粉酶(α-淀粉酶)，则淀粉类物质优选支链或者直链淀粉；若使用环糊精葡萄糖基转移酶(α-环糊精葡萄糖基转移酶)，则淀粉类物质优选环糊精；若选用糖基转移酶(α-糖基转移酶)，则淀粉类物质优选麦芽低聚糖、麦芽糊精。
在步骤1中，采用氢氧化钠水溶液或者氯化氢水溶液进行反应溶液的pH值调节，例如氢氧化钠水溶液，氢氧化钠的质量百分数为1wt％；氯化氢水溶液，氯化氢的质量百分数为1wt％。
在步骤1中，淀粉类物质与对苯二酚的质量比例为(20：1)～(1：10)，优选(10：1)～(1：5)，淀粉类物质的比例高可以提高对苯二酚的转化率，对苯二酚比例高可以提高α-熊果苷的产量，但过高会抑制酶活力，而且会影响后提取除糖工艺中酵母菌的发酵能力，因而优选以上比例。
在步骤1中，淀粉类物质的生物酶加入量按照每g淀粉类物质100—300U淀粉类物质的生物酶进行确定，优选按照每g淀粉类物质150—200U淀粉类物质的生物酶进行确定。
步骤2，待反应结束后，向反应溶液中加入葡萄糖淀粉酶，按照每g淀粉类物质加入1000—3000U的标准加入葡萄糖淀粉酶，50—60℃下水解5—12h，水解后副产物全部水解为α-熊果苷，此时水解后的反应溶液为对苯二酚、葡萄糖、α-熊果苷和酶的混合物；
在步骤2中，按照每g淀粉类物质加入2000—2500U的标准加入葡萄糖淀粉酶。
在步骤2中，在55—60℃下水解6—10h。
步骤3，将步骤2水解后的反应液经过超滤膜过滤除酶后，加入酵母菌进行发酵除去反应液中的葡萄糖，再通过微滤和吸附除去杂质；
在步骤3中，通过微滤除菌后，通过活性炭吸附去除色素等杂质。
在步骤3中，发酵温度为20～35℃，发酵时间为24—48h，优选发酵温度25—30℃，发酵时间30—40h。
在步骤3中，选择能够消耗葡萄糖，且不水解α-熊果苷的酵母菌，酵母菌代谢产物简单，多数醇类代谢产物，便于后续处理，一般为醇类物质的酵母菌，例如干活性酵母菌、啤酒活性干酵母(即啤酒酵母)、葡萄酒干活性酵母菌(即葡萄酒酵母)或者酿酒酵母，酵母菌的使用质量为反应液体积的1—10％(w/v，即酵母菌的质量/反应液体积)，酵母菌添加量太少，会延长发酵时间，降低发酵效率，而且随着发酵时间的延长可能会产生未知代谢产物；酵母菌添加量太多，一是会增加成本，二是会增加后续微滤除菌的难度。
步骤4，经步骤3处理后的反应料液通过减压蒸发进行浓缩，至固含量浓度为40～60wt％，通过结晶得到α-熊果苷粗品，溶解α-熊果苷粗品，进行二次或者多次重结晶即可得到纯度99％以上的α-熊果苷。
在步骤4中，减压蒸发的参数为-0.1Mpa，40～60℃。
在步骤4中，将料液减压蒸发，此时可以将酵母菌发酵产生的少量醇类物质去除，同时将料液浓缩至一定浓度，优选40～60％浓度，在这个浓度范围内降温结晶可以获得较高的收率，同时又能保证初次结晶出的α-熊果苷纯度在80％以上。自然冷却或者控制降温至5～10℃，初次结晶出的α-熊果苷纯度约为80～95％，将该α-熊果苷粗品复溶后，二次结晶或者多次重结晶可获得纯度99％以上的α-熊果苷。
与现有技术相比，本发明技术方案的整个工艺流程中没有使用任何有机溶剂；与传统的柱层析分离除糖法相比，使用酵母菌发酵除去反应中的糖份，发酵过程容易控制，产物为少量醇类物质，在后续减压蒸发时易于除去，避免了柱层析除糖过程中使用的甲醇等有机溶剂以及树脂再生过程中使用的酸、碱，而且能够大大减少纯水使用量；使用酶法转化合成α—熊果苷，生产效率高，相比于国内普遍使用的细胞催化转化法，工艺流程被极大地缩短；使用多次结晶工艺分离去除产品中的对苯二酚，操作简便，纯度可控。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步描述，实施例是为了更好的说明本发明，而不是对本发明进行限制。
实施例1
20g麦芽糊精加热溶解在100ml蒸馏水中(即麦芽糊精和蒸馏水的质量体积百分数为20％，麦芽糊精质量g/蒸馏水体积ml)，加入1g对苯二酚(即对苯二酚和蒸馏水的质量体积百分数为1％，对苯二酚质量g/蒸馏水体积ml)，调节整个反应溶液pH值为5。
按照每g麦芽糊精加入100U的标准，向体系中加入α-糖基转移酶，在40℃下反应48h；待反应结束后加入葡萄糖淀粉酶(即糖化酶)，按照每g麦芽糊精加入1000U的标准加入糖化酶，55℃下水解5h。水解后的反应溶液为对苯二酚、葡萄糖、α-熊果苷和酶的混合物；反应液中的对苯二酚、α-熊果苷和葡萄糖采用HPLC法检测分析如下：
(1)检测条件为康诺(CoMetro)高压凝胶色谱***，色谱柱:AgilentZORBAXSB-C18(4.6mm×250mm)，流动相:水：甲醇：乙酸＝95:5:1，流速:0.5mL/min，检测器:UV检测器(UV282nm)，柱温:30℃，进样量：10μL，对苯二酚保留时间RT为13.4min，熊果苷RT为9.7min。
(2)检测条件为岛津高压色谱***，色谱柱：AgilentHi-plexCa(7.7mm×300mm)流动相：水，流速0.6mL/min，检测器：示差检测器，柱温：85℃，进样量：10μL，葡萄糖RT为12.4min。
反应液经过超滤膜过滤除去溶液中的酶后，向反应液中加入酵母菌(干活性酵母菌，购于安琪公司)，在反应液中酵母菌的质量体积百分数为1％(酵母菌质量g/反应液体积ml)，在35℃下发酵24h以除去反应液中的葡萄糖；反应液微滤除菌后，通过活性炭吸附去除色素等杂质，得到的料液通过减压蒸发(-0.1Mpa，40℃)至浓度为40wt％，采用阿贝折光仪测量可溶性固形物含量(即固含量，固形物/整个反应体系)，降温至10℃结晶得到α-熊果苷粗品，粗品纯度为92％，溶解α-熊果苷粗品，进行二次蒸发结晶得到纯度99.1％的α-熊果苷，通过旋光计测定产品的旋光度【α】D 20为+179°，即为α-熊果苷。
实施例2
1g淀粉加热溶解在100ml蒸馏水中(即淀粉和蒸馏水的质量体积百分数为1％，淀粉质量g/蒸馏水体积ml)，加入10g对苯二酚(即对苯二酚和蒸馏水的质量体积百分数为10％，对苯二酚质量g/蒸馏水体积ml)，调节整个反应溶液pH值为6。
按照每g淀粉加入100U的标准，向体系中加入α-淀粉酶，在60℃下反应24h；待反应结束后加入葡萄糖淀粉酶(即糖化酶)，按照每g淀粉加入1000U的标准加入糖化酶，55℃下水解12h。水解后的反应溶液为对苯二酚、葡萄糖、α-熊果苷和酶的混合物；反应液中的对苯二酚、α-熊果苷和葡萄糖采用HPLC法检测分析如下：
(1)检测条件为康诺(CoMetro)高压凝胶色谱***，色谱柱:AgilentZORBAXSB-C18(4.6mm×250mm)，流动相:水：甲醇：乙酸＝95:5:1，流速:0.5mL/min，检测器:UV检测器(UV282nm)，柱温:30℃，进样量：10μL，对苯二酚保留时间RT为13.4min，熊果苷RT为9.7min。
(2)检测条件为岛津高压色谱***，色谱柱：AgilentHi-plexCa(7.7mm×300mm)流动相：水，流速0.6mL/min，检测器：示差检测器，柱温：85℃，进样量：10μL，葡萄糖RT为12.4min。
反应液经过超滤膜过滤除去溶液中的酶后，向反应液中加入啤酒活性干酵母菌(购于安琪公司)，在反应液中酵母菌的质量体积百分数为10％(w/v，酵母菌质量g/反应液体积ml)，在20℃下发酵48h以除去反应液中的葡萄糖；反应液微滤除菌后，通过活性炭吸附去除色素等杂质，得到的料液通过减压蒸发(-0.1Mpa，40℃)至浓度为50wt％，采用阿贝折光仪测量可溶性固形物含量，降温至5℃结晶得到α-熊果苷粗品，粗品纯度为86％，溶解α-熊果苷粗品，进行二次蒸发结晶得到纯度99.5％的α-熊果苷，通过旋光计测定产品的旋光度【α】D 20为+180°，即为α-熊果苷。
实施例3
10g环糊精加热溶解在100ml蒸馏水中(即环糊精和蒸馏水的质量体积百分数为10％，淀粉质量g/蒸馏水体积ml)，加入1g对苯二酚(即对苯二酚和蒸馏水的质量体积百分数为1％，对苯二酚质量g/蒸馏水体积ml)，调节整个反应溶液pH值为5.5。
按照每g环糊精加入100U的标准，向体系中加入α-环糊精葡萄糖基转移酶(购于安琪公司)，在55℃下反应36h；待反应结束后加入葡萄糖淀粉酶(即糖化酶)，按照每g环糊精加入1000U的标准加入糖化酶，55℃下水解10h。水解后的反应溶液为对苯二酚、葡萄糖、α-熊果苷和酶的混合物；反应液中的对苯二酚、α-熊果苷和葡萄糖采用HPLC法检测分析如下：
(1)检测条件为康诺(CoMetro)高压凝胶色谱***，色谱柱:AgilentZORBAXSB-C18(4.6mm×250mm)，流动相:水：甲醇：乙酸＝95:5:1，流速:0.5mL/min，检测器:UV检测器(UV282nm)，柱温:30℃，进样量：10μL，对苯二酚保留时间RT为13.4min，熊果苷RT为9.7min。
(2)检测条件为岛津高压色谱***，色谱柱：AgilentHi-plexCa(7.7mm×300mm)流动相：水，流速0.6mL/min，检测器：示差检测器，柱温：85℃，进样量：10μL，葡萄糖RT为12.4min。
反应液经过超滤膜过滤除去溶液中的酶后，向反应液中加入葡萄酒干活性酵母菌(购于安琪，即安琪牌葡萄酒高活性干酵母)，在反应液中酵母菌的质量体积百分数为5％(w/v，酵母菌质量g/反应液体积ml)，在30℃下发酵36h以除去反应液中的葡萄糖；反应液微滤除菌后，通过活性炭吸附去除色素等杂质，得到的料液通过减压蒸发(-0.1Mpa，60℃)至浓度为60wt％，采用阿贝折光仪测量可溶性固形物含量，自然冷却至5℃析出α-熊果苷粗品，粗品纯度为83％，溶解α-熊果苷粗品，进行三次蒸发结晶得到纯度99.7％的α-熊果苷，通过旋光计测定产品的旋光度【α】D 20为+178°，即为α-熊果苷。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.α-熊果苷的制备方法，其特征在于，按照下述步骤进行：
步骤1，将淀粉类物质作为糖基供体分散在蒸馏水中，加入对苯二酚作为糖基受体进行均匀混合，并调节反应溶液的pH为5—6，加入淀粉类物质的生物酶进行反应；在步骤1中，淀粉类物质为蔗糖、支链或者直链淀粉、环糊精、麦芽糊精或者麦芽低聚糖；淀粉类物质的生物酶为蔗糖磷酸化酶、淀粉酶、环糊精葡萄糖基转移酶或者糖基转移酶；淀粉类物质与对苯二酚的质量比例为(20：1)～(1：10)，选择在40—60℃下反应24—48h；淀粉类物质的生物酶加入量按照每g淀粉类物质100—300U淀粉类物质的生物酶进行确定；
步骤2，待反应结束后，向反应溶液中加入葡萄糖淀粉酶，按照每g淀粉类物质加入1000—3000U的标准加入葡萄糖淀粉酶，50—60℃下水解5—12h，水解后副产物全部水解为α-熊果苷，此时水解后的反应溶液为对苯二酚、葡萄糖、α-熊果苷和酶的混合物；
步骤3，将步骤2水解后的反应液经过超滤膜过滤除酶后，加入酵母菌进行发酵除去反应液中的葡萄糖，再通过微滤和吸附除去杂质；发酵温度为20～35℃，发酵时间为24—48h，选择能够消耗葡萄糖，且不水解α-熊果苷的酵母菌，酵母菌的使用质量为反应液体积的1—10％(w/v，即酵母菌的质量/反应液体积)；
步骤4，经步骤3处理后的反应料液通过减压蒸发进行浓缩，至固含量浓度为40～60wt％，通过结晶得到α-熊果苷。
2.根据权利要求1所述的α-熊果苷的制备方法，其特征在于，在步骤1中，在50—60摄氏度下反应30—40h。
3.根据权利要求1所述的α-熊果苷的制备方法，其特征在于，在步骤1中，采用氢氧化钠水溶液或者氯化氢水溶液进行反应溶液的pH值调节，例如氢氧化钠水溶液，氢氧化钠的质量百分数为1wt％；氯化氢水溶液，氯化氢的质量百分数为1wt％。
4.根据权利要求1所述的α-熊果苷的制备方法，其特征在于，在步骤1中，淀粉类物质的种类选择与所使用的生物酶相关，若使用蔗糖磷酸化酶，则淀粉类物质优选蔗糖；若使用淀粉酶(α-淀粉酶)，则淀粉类物质优选支链或者直链淀粉；若使用环糊精葡萄糖基转移酶(α-环糊精葡萄糖基转移酶)，则淀粉类物质优选环糊精；若选用糖基转移酶(α-糖基转移酶)，则淀粉类物质优选麦芽低聚糖、麦芽糊精。
5.根据权利要求1所述的α-熊果苷的制备方法，其特征在于，在步骤1中，淀粉类物质与对苯二酚的质量比例为(10：1)～(1：5)。
6.根据权利要求1所述的α-熊果苷的制备方法，其特征在于，在步骤1中，按照每g淀粉类物质150—200U淀粉类物质的生物酶进行确定。
7.根据权利要求1所述的α-熊果苷的制备方法，其特征在于，在步骤2中，按照每g淀粉类物质加入2000—2500U的标准加入葡萄糖淀粉酶；在55—60℃下水解6—10h。
8.根据权利要求1所述的α-熊果苷的制备方法，其特征在于，在步骤3中，发酵温度25—30℃，发酵时间30—40h；通过微滤除菌后，通过活性炭吸附去除色素等杂质；酵母菌为干活性酵母菌、啤酒活性干酵母、葡萄酒干活性酵母菌或者酿酒酵母。
9.根据权利要求1所述的α-熊果苷的制备方法，其特征在于，在步骤4中，减压蒸发的参数为-0.1Mpa，40～60℃。
10.根据权利要求1所述的α-熊果苷的制备方法，其特征在于，经步骤4制备的α-熊果苷粗品经溶解后，进行二次或者多次重结晶即可得到纯度99％以上的α-熊果苷。
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