CN105395584B - 片仔癀及其制剂在制备治疗多发性硬化症的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药领域，具体涉及片仔癀及其制剂在制备治疗多发性硬化症的药物中的应用。本发明以多发性硬化症的经典动物模型—MOP诱导的EAE为模型，从神经功能评分、病灶局部组织病理改变、炎症因子表达、细胞凋亡等多方面、多角度评价了片仔癀对多发性硬化症的治疗效果。实验结果表明，片仔癀可以减轻EAE发病程度，降低血清中的IFN‑γ和IL‑17、并升高血清中的IL‑4，减轻脊髓组织的病理损伤，增加脑组织SOD的表达，促进脑组织细胞的凋亡，对多发性硬化症具有一定的治疗作用，可以作为潜在的治疗多发性硬化症的药物。

Description

片仔癀及其制剂在制备治疗多发性硬化症的药物中的应用

技术领域

本发明属于中药领域，具体涉及片仔癀及其制剂在制备治疗多发性硬化症的药物中的应用。

背景技术

多发性硬化症(Multiple sclerosis，MS)是一种以中枢神经***炎性脱髓鞘病变为基础的自身免疫性疾病，病理特征为中枢神经***白质内多发的神经髓鞘破坏及炎性细胞浸润。多发性硬化症的多数患者病程呈复发、缓解型，每次复发后残留程度不同的后遗症，随着发作次数的增多，后遗症逐渐加重，病情呈阶梯式恶化，这也是青壮年致残的主要原因之一。目前，对于多发性硬化症，一般采用糖皮质激素、苯二氮类、肌松剂等进行对症治疗。然而，上述药物存在毒副作用较大、不良反应多等缺点，进而导致患者依从性较差，从而限制了其应用。

片仔癀是国家一级中药保护品种，采用麝香、牛黄、蛇胆、三七等名贵中药精制而成，具有清热解毒、散瘀止血、消肿定痛的功效，临床常用于治疗细菌感染性疾病、病毒性肝炎、支气管炎、恶性肿瘤等疾病。关于片仔癀及其制剂在制备治疗多发性硬化症的药物中的用途未见报道。

因此，研究新型的治疗多发性硬化症的药物具有重要意义。

发明内容

为此，本发明提出片仔癀及其制剂在制备治疗多发性硬化症的药物中的应用。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明提供片仔癀及其制剂在制备治疗多发性硬化症的药物中的应用。

优选地，本发明上述应用，所述治疗多发性硬化症是指减轻多发性硬化症的发病程度。

优选地，本发明上述应用，所述治疗多发性硬化症是指降低血清中的IFN-γ和IL-17、并升高血清中的IL-4。

优选地，本发明上述应用，所述治疗多发性硬化症是指减轻脊髓组织的病理损伤。

优选地，本发明上述应用，所述治疗多发性硬化症是指增加脑组织中SOD的表达。

优选地，本发明上述应用，所述治疗多发性硬化症是指促进脑组织细胞的凋亡。

进一步优选地，本发明上述应用，所述片仔癀按照常规工艺，加入常规辅料制成临床上可接受的制剂。

进一步优选地，本发明上述应用，所述制剂选自锭剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、酊剂、酒剂、煎膏剂或合剂。

所述药学上可接受的辅料为：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素纳等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000、PEG4000、虫蜡等。

进一步优选地，本发明上述应用，所述片仔癀及其制剂的单位制剂中含片仔癀0.3-3.0g。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

本发明以多发性硬化症的经典动物模型—MOP诱导的EAE为模型，从神经功能评分、病灶局部组织病理改变、炎症因子表达、细胞凋亡等多方面、多角度评价了片仔癀对多发性硬化症的治疗效果。实验结果表明，片仔癀可以减轻EAE的发病程度，降低血清中的IFN-γ和IL-17、并升高血清中的IL-4，减轻脊髓组织的病理损伤，增加脑组织中SOD的表达，促进脑组织细胞的凋亡，对多发性硬化症具有一定的治疗作用，可以作为潜在的治疗多发性硬化症的药物。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：

图1是本发明实验例中采用SABC免疫组化染色法测定脑组织中SOD的表达情况的结果。

具体实施方式

实施例1

片仔癀按照常规工艺，加入常规辅料制成临床上可接受的片剂。

实施例2

片仔癀按照常规工艺，加入常规辅料制成临床上可接受的锭剂。

实施例3

片仔癀按照常规工艺，加入常规辅料制成临床上可接受的胶囊剂。

实验例 片仔癀对多发性硬化症治疗作用的研究

1、实验材料

MOG33-55多肽购自合肥国肽生物科技有限公司，完全弗氏佐剂、百日咳毒素购自美国Sigma公司，片仔癀由漳州片仔癀药业股份有限公司提供。

2、实验方法

2.1 实验动物

SPF级雌性SJL/J小鼠，6-8周龄，体重20-22g，50只。

2.2 实验性***反应性脑脊髓炎动物模型(EAE)的建立方法

将50μg MOG33-55多肽溶于100μLPBS中，再与等量含有4mg/mL灭活结核菌素H37RA的完全弗氏佐剂充分混合，用注射器反复抽打制成乳化剂。

实验组每只小鼠后背(脊柱两侧)皮下分4个点注射0.2mL乳化剂，并于第1天和第2天分别给实验组小鼠腹腔注射百日咳毒素0.5μg/只；空白组每只小鼠注射生理盐水。

2.3 实验分组

造模成功后，根据小鼠造模成功数量，将实验动物随机分组，分别为EAE模型组(10只)、片仔癀高剂量组(10只)、片仔癀中剂量组(10只)、片仔癀低剂量组(10只)，并设置空白对照组(10只)。

2.4 给药方法

按照小鼠与人体表面积等效剂量折算，片仔癀低剂量组、片仔癀中剂量组、片仔癀高剂量组分别设定给药量为0.117g/kg/d、0.234g/kg/d、0.468g/kg/d。

造模成功后，片仔癀低剂量组、片仔癀中剂量组、片仔癀高剂量组灌胃给药；空白对照组和EAE模型组每天灌服等体积的生理盐水。连续给药40天。

2.5 临床评分标准

EAE模型小鼠的神经功能评价采用Kono 5分法评分标准：(1)不发病记为0分；(2)尾巴无力、脱垂行走，记为1分；(3)轻微后肢无力或单侧后肢拖行，记为2分；(4)严重后肢麻痹或双侧后肢拖行，记为3分；(5)四肢麻痹，记为4分；(6)濒临死亡或死亡，记为5分。

当临床症状介于两个评分之间时，以较低分数加0.5分表示；当达到或超过1分时，为临床EAE发病。

3、检测指标

3.1 一般行为学的观察

每日观察小鼠的一般行为学，并测定小鼠体重随造模及给药时间的变化。神经功能评价采用上述Kono 5分法评分标准。

3.2 血清中IFN-γ、IL-4、IL-17的检测

各组动物分别于造模后20天(发病高峰期)尾部静脉取血，室温静置1小时，低温离心留取血清，-80℃冰箱冻存待用。

ELISA检测血清中IFN-γ、IL-4、IL-17，按照说明书进行操作。

3.3 组织病理学的检测

给药40天后，处死小鼠，分别取各组小鼠脑和脊髓组织，置于4％的多聚甲醛中固定24小时。依次进行石蜡切片、HE染色、Luxol fast blue(LFB)髓鞘染色后进行观察，并比较各组之间的差异。

3.4 免疫组织化学的检测

采用SABC免疫组化染色法测定脑组织中SOD的表达情况。以5个视野每700平方微米的阳性细胞数计数的平均值来进行定量分析。

3.5 TUNEL法对细胞凋亡程度的检测

实验使用试剂盒为过氧化物酶原位细胞凋亡检测试剂盒(美国密理博公司，比尔里卡，马塞诸塞州)。

根据试剂盒的使用说明进行具体操作，切片首先采用二甲苯脱蜡，复水后，用蛋白酶K(20μg/mL)在室温下处理15min。然后用3％过氧化氢淬火后，在末端脱氧核苷转移酶(TdT)的工作溶液中，用生物素偶联的脱氧尿苷三磷酸在37℃于加湿室中处理1小时。反应停止后，在室温下用stop或wash缓冲液处理10分钟来终止反应。采用抗地高辛偶联物室温处理30分钟来检测地高辛-11-dUTP的结合。最后，加入3’，3’-二氨基联苯胺盐酸盐(DAB)底物溶液来显色，并采用数码照相机来对凋亡细胞包括细胞的DNA片段拍照。阴性对照组采用去离子水取代TdT，其余实验步骤不变，阳性对照组采用在室温下用DNase I预处理10分钟。最后，计算5个视野每700平方微米的阳性细胞数的百分比。

3.6 统计学分析

数据以表示，多组比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两均数比较采用LSD-t检验法，P<0.05表明有统计学意义。

4、实验结果

4.1 对EAE发病程度的影响

采用如2.2所示的方法建立的EAE发病率为100％。

与正常对照组相比，EAE模型组出现精神萎靡、皮毛不光滑、活动减少，还出现尾巴无力、脱垂行走、轻微后肢无力或单侧后肢拖行、严重后肢麻痹或双侧后肢拖行、四肢麻痹、死亡等多种临床表现。

各组临床评分结果如表1所示。

表1 各组临床评分结果

注：给药组与模型组比较，△P<0.05。

由表1可知，片仔癀低剂量组、片仔癀中剂量组、片仔癀高剂量组的小鼠的平均最高临床评分均明显改善(P<0.05)。这表明，片仔癀可以降低EAE的发病程度。

4.2 对血清中IFN-γ、IL-4、IL-17的影响

各组血清中IFN-γ、IL-4、IL-17的含量如表2所示。

表2 各组血清中IFN-γ、IL-4、IL-17

注：正常组与模型组比较，＊P<0.05；给药组与模型组比较，△P<0.05。

由表2可知，(1)与正常对照组相比，EAE模型组的血清中IFN-γ、IL-17升高，IL-4水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)；(2)与EAE模型组相比，片仔癀低剂量组、片仔癀中剂量组和片仔癀高剂量组的发病高峰期小鼠血清中IFN-γ、IL-17降低，IL-4升高，差异有统计学意义(P<0.05)。这表明，片仔癀可以降低血清中IFN-γ和IL-17、并升高IL-4。

4.3 对EAE小鼠脊髓组织的病理损伤的影响

各组的脊髓组织HE染色病理学检查结果显示，(1)与正常对照组相比，EAE模型组病灶处小血管周围出现大量炎性细胞浸润，呈典型的“血管周袖套状”改变；(2)片仔癀低剂量组、片仔癀中剂量组和片仔癀高剂量组的小鼠病灶处的炎性细胞浸润明显减轻，病灶数减少，其中以片仔癀高剂量组对EAE小鼠脊髓组织的病理损伤的减轻效果最好。这表明，片仔癀可以减轻脊髓组织的病理损伤。

4.4 对脑组织中SOD的表达的影响

采用SABC免疫组化染色法测定脑组织中SOD的表达情况的结果如图1所示。

由图1可知，片仔癀低剂量组、片仔癀中剂量组和片仔癀高剂量组的小鼠脑组织SOD的表达量明显增加，其中以片仔癀高剂量组小鼠脑组织SOD的表达量增加最多。

采用SABC免疫组化染色法测定脑组织中SOD的表达情况的定量结果如表3所示。

表3 脑组织SABC免疫组化SOD表达量的定量结果

注：给药组与EAE组比较，△P<0.05，△△P<0.01。

由表3可知，片仔癀高剂量组小鼠脑组织SOD的表达量增加最多。

这表明，片仔癀可以增加脑组织中SOD的表达。

4.5 对脑组织细胞凋亡的影响

TUNEL法分析脑组织细胞凋亡的定量结果如表4所示。

表4 TUNEL法分析脑组织细胞凋亡的定量结果

注：给药组与EAE组比较，△P<0.05，△△P<0.01。

由表4可知，片仔癀低剂量组、片仔癀中剂量组和片仔癀高剂量组，均促进了小鼠脑组织细胞凋亡，其中以片仔癀高剂量组对小鼠脑组织细胞凋亡的崔进效果最好。这表明，片仔癀可以促进脑组织细胞的凋亡。

综上，片仔癀可以减轻EAE发病程度，降低血清中的IFN-γ和IL-17、并升高血清中的IL-4，减轻脊髓组织的病理损伤，增加脑组织SOD的表达，促进脑组织细胞的凋亡，对多发性硬化症具有一定的治疗作用，可以作为潜在的治疗多发性硬化症的药物。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.片仔癀及其制剂在制备治疗多发性硬化症的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗多发性硬化症是指减轻多发性硬化症的发病程度。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述治疗多发性硬化症是指降低血清中的IFN-γ和IL-17、并升高血清中的IL-4。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述治疗多发性硬化症是指减轻脊髓组织的病理损伤。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述治疗多发性硬化症是指增加脑组织中SOD的表达。

6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述治疗多发性硬化症是指促进脑组织细胞的凋亡。

7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述片仔癀按照常规工艺，加入常规辅料制成临床上可接受的制剂。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述制剂选自锭剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、酊剂、酒剂、煎膏剂或合剂。

9.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述片仔癀及其制剂的单位制剂中含片仔癀0.3-3.0g。