CN105392901B - 连接酶-辅助的核酸环化和扩增 - Google Patents

连接酶-辅助的核酸环化和扩增 Download PDF

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Abstract

本文提供在单一反应容器中从线性DNA生成和扩增单链DNA环，而无需任何***的纯化步骤的方法。单链DNA环经由模板‑非依赖性单链DNA连接而形成。本文提供从血液提取的循环核酸的全基因组扩增。本文还提供用于进行所公开的方法的试剂盒。

Description

连接酶-辅助的核酸环化和扩增
发明领域
本发明主要涉及包括经由模板-非依赖性单链DNA连接，从单链或双链线性DNA生成单链DNA环的核酸测定法。本发明还涉及单链DNA环经由滚环扩增的扩增和/或检测。单链DNA环的生成和后续的DNA扩增在单一反应容器中进行，而无需任何***的分离和/或纯化步骤。还提供用于进行该方法的试剂盒。
背景
DNA扩增是一个复制目标双链DNA (dsDNA)以生成其多个拷贝的过程。因为dsDNA的各条链是反平行的和互补的，每条链可用作其互补链产生的模板链。模板链作为整体或作为截短的部分保留，而互补链通过DNA聚合酶从脱氧核苷三磷酸(dNTP)装配。互补链合成从杂交至模板链的引物序列的3＇末端开始，以5＇→3＇方向进行。
全基因组扩增(WGA)包括目标DNA的非-特异性扩增。WGA往往通过多重置换扩增(MDA)技术，采用在目标DNA的多个位置引发DNA合成的随机寡核苷酸引物连同具有链置换活性的高保真性DNA聚合酶(如，Phi29聚合酶)一起实现。尽管目前可市售获得的WGA***例如GenomiPhi (GE Healthcare, USA)和RepliG (Qiagen)试剂盒提供具有高分子量目标DNA的最佳结果，但当目标DNA短和/或高度片段化时，这些***的性能是差的。当目标DNA被片段化和序列长度少于约1000个核苷酸时，使用常规方法扩增目标DNA导致扩增速度降低，显著的序列丢失(特别是在接近目标DNA的末端)，和高度的序列-偏倚扩增。随着模板DNA的长度减少，在MDA反应中引导该链的可能性成倍地减少。这降低了这些较短片段的扩增潜力。因此，用于非-特异性地扩增短的、片段化DNA的有效方法是高度合乎需要的。
连接-介导的聚合酶链反应(PCR)已被用来扩增片段化dsDNA。然而，在这些反应中，只有小部分的片段化DNA得到扩增，导致基因组覆盖不足。为有效地扩增片段化的目标dsDNA，可首先修复它们，然后通过钝端连接被串联化，以生成长于1000个碱基对(bp)的序列。然而，往往需要相对较高浓度的目标DNA以促进串联化(concatamerization)和后续的扩增。双链目标DNA的环化也被用于各种基于核酸的测定法，包括MDA、WGA、超支化滚环扩增(RCA)和大规模平行DNA测序。为了有效地环化和扩增片段化dsDNA，片段化DNA的双链末端被首先修复，接着经钝端连接，以形成双链DNA环。然而，环化长度少于500 bp的双链DNA片段是困难的。
双链DNA可被变性以产生单链DNA (ssDNA)，其可在模板-依赖性分子内连接反应中使用连接酶而被进一步环化。然而，需要目标DNA的现有序列信息，以进行模板-依赖性环化。ssDNA的模板-非依赖性分子内连接也已有文献记载。例如，TS2126 RNA连接酶(可以商标名ThermoPhageTM RNA连接酶II或ThermoPhageTM ssDNA连接酶(Prokaria, Matis,Iceland)或CircLigaseTM ssDNA连接酶(Epicenter Biotechnologies, Wisconsin, USA)经市售获得)已被用于制备数字(digital) DNA球，和/或DNA，例如基因组DNA的位点-特异性裂解和扩增。从mRNA的5＇-端片段制备的线性单链互补DNA (cDNA)分子在使用TS2126RNA连接酶环化后，也已通过滚环复制扩增。通过适当地将有义RNA聚合酶启动子序列掺入cDNA中，已显示环化的cDNA模板作为转录底物起作用，并因而进行在生物学样本中的mRNA分子的扩增。此外，TS2126 RNA连接酶已被用来扩增用于随机扩增cDNA末端(RACE)的cDNA末端。通过采用TS2126 RNA连接酶，还从有限量的片段化DNA，生成用于滚环扩增的DNA模板。该方法包括使线性的片段化dsDNA变性以获得线性ssDNA片段，用CircLigaseTM ssDNA连接酶连接线性ssDNA以获得单链DNA环，然后使用随机引物和Phi29 DNA聚合酶经由RCA扩增单链DNA环。然而，即使在优化反应条件后，生成的单链环状DNA的量是高度可变和序列依赖性的。例如，在相同的连接条件下，包含5＇G和3＇T核苷酸的寡核苷酸比其包含5＇A和3＇C的互补寡核苷酸显著更好地连接。此外，分子内连接效率在具有相同的或极其类似大小的线性ssDNA序列中变化，但在核苷酸序列中有小的差异。效率在不同大小的线性ssDNA序列(如，序列长度范围从100个碱基至数千碱基大小)中也有变化。而且，连接-扩增反应的所有尝试涉及中间分离、纯化和/或清洁步骤，因而使得连接-扩增工作流程繁琐。例如，通过环化，接着滚环扩增的片段化DNA的法医样本的分析以多步骤进行，包括5＇ DNA磷酸化、接头连接、DNA环化和全基因组扩增。每个步骤反应在进行下一步骤之前要经受反应清理。当连接和扩增在单一反应容器中进行时，未观察到扩增优点。然而，多步骤过程往往造成模板DNA的丢失并导致分析失败。用于在单一反应容器中非-特异性地扩增短的DNA序列，而无任何序列偏倚和任何***的清洁步骤的有效方法因而是高度需要的。
简述
在一些实施方案中，提供一种从线性DNA生成单链DNA环的方法。该方法包括提供线性DNA，通过在磷酸供体的存在下使其与多核苷酸激酶一起孵育将线性DNA末端修复以生成具有在5´末端的磷酸基团和在3´末端的羟基的可连接的DNA序列，和用连接酶对经修复的可连接的DNA序列进行分子内连接以生成单链DNA环的步骤。该方法的所有步骤在单一反应容器中进行，而无需任何***的分离或纯化步骤。磷酸供体可以是鸟苷三磷酸(GTP)、胞苷三磷酸(CTP)、尿苷三磷酸(UTP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)或其组合。线性DNA可以是双链或者单链DNA。DNA可以是片段化DNA例如循环DNA。可连接的DNA，如果呈现为双链形式，则在分子内连接反应之前需要被变性。能够模板-非依赖性的、分子内连接单链DNA序列的预腺苷酸化连接酶可被用于连接反应。
在一些实施方案中，提供一种从线性DNA生成单链DNA环的方法，其中该方法在分子内连接步骤之前采用DNA预腺苷酸化步骤。线性DNA可在腺苷三磷酸(ATP)的存在下，任选地用多核苷酸激酶孵育，以生成包含在5´末端的磷酸基团和在3´末端的羟基的可连接的DNA序列。如果线性DNA呈现为高度片段化形式，可优先从线性DNA生成可连接的DNA序列。线性DNA或可连接的DNA序列然后在ATP的存在下用腺苷酸化酶孵育，以生成5＇腺苷酸化DNA序列。5＇腺苷酸化DNA序列然后用非-腺苷酸化连接酶孵育，该酶能够进行模板-非依赖性分子内连接5＇腺苷酸化DNA序列，以生成单链DNA环。该方法的所有步骤在单一反应容器中进行，而无需任何***的分离或纯化步骤。如果非-腺苷酸化连接酶是ATP-依赖性连接酶，在分子内连接反应前，ATP可必须从反应混合物中除去(如，通过用磷酸酶处理反应混合物)。如果5＇腺苷酸化DNA呈现为双链形式，则在分子内连接反应前需要变性。
附图
本发明的这些和其它特征、方面和优点，当参照附图阅读以下详细描述时，将变得更易理解。
图1说明片段化dsDNA的连接酶-辅助全基因组扩增的实施方案的示意图。
图2说明从健康个体的血浆分离的循环DNA的大小分布。
图3说明使用不同的连接酶从血液提取的循环DNA的连接酶-辅助全基因组扩增。
图4说明用于4种不同的CODIS位点的灵敏的和平衡的DNA扩增的连接酶-辅助全基因组扩增的效力。
图5说明用于12种不同的CODIS位点的灵敏的和平衡的DNA扩增的连接酶-辅助全基因组扩增的效力。
图6说明在不同的反应和缓冲条件下，连接酶-辅助的全基因组扩增的效率。
图7说明在连接酶-辅助的全基因组扩增中，高分子量基因组DNA扩增的抑制作用。
图8说明连接酶-辅助的全基因组扩增的示意图，其包括使用多核苷酸激酶处理(如，末端修复)片段化DNA，接着是经处理的片段化DNA的连接酶-辅助的扩增。
图9说明在GTP的存在下，采用PNK和CircLigase IITM的片段化DNA的连接酶-辅助扩增的单管反应的示意图。
图10说明使用雄性-雌性血浆/血的单管连接酶-辅助的扩增反应，其中DYS14雄性-特异性标记物使用从输入DNA创立的库检测。
图11说明片段化DNA的磷酸化和预腺苷酸化，接着使用基本上非-腺苷酸化连接酶连接的示意图。
图12说明使用基本上非-腺苷酸化连接酶环化预腺苷酸化DNA序列的提高的效率。
图13说明当目标DNA序列被预腺苷酸化和当使用非-腺苷酸化连接酶进行连接时，连接酶-辅助全基因组扩增的提高的效率。
详细描述
以下详细描述是示例性的并不打算限制本发明或本发明的应用。贯穿整个说明书，具体术语的举例说明应视为非-限制性实例。单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代，除非文中另外清楚地指明。近似语言，如本文贯穿说明书和权利要求书中所用的，可用于修饰任何定量的表示，其可允许变化而不导致其相关基本功能的改变。因此，由术语如“约”修饰的值并不限于所指定的精确值。除非另外指明，否则表示本说明书和权利要求书中所用的成分的量、特性如分子量、反应条件等的所有数字将被理解为在所有的情况下由术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则在以下本说明书和所附权利要求书中提出的数值参数是近似值，其可根据本发明探寻而获得的所需特性而变化。最低限度上，以及不试图限制权利要求书范围的等同原则的适用，每个数值参数应该至少按照报告的有效数字的位数和通过应用普通的四舍五入技术来解释。必要时，提供范围，和那些范围包括之间所有的子范围。为了更清楚地和准确地描述和指出要求保护的发明的主题，对在以下描述和所附权利要求书中使用的具体术语提供以下定义。
如本文所用的，术语“核苷”指糖胺化合物，其中核酸碱基(核碱基)连接于糖部分。“核苷酸”指核苷磷酸。核苷酸可使用对应于其核苷的按字母顺序排列的字母(字母代号)表示，如在表1中所述。例如，A表示腺苷(含有核碱基的核苷，腺嘌呤)，C表示胞苷，G表示鸟苷，U表示尿苷，和T表示胸苷(5-甲基尿苷)。W表示A或者T/U，和S表示G或者C。N表示随机核苷和dNTP指脱氧核糖核苷三磷酸。N可以是A、C、G或T/U的任何一个。
表1：各种核苷酸的字母名称。
符号字母 由符号字母表示的核苷酸
G G
A A
T T
C C
U U
R G或A
Y T/U或C
M A或C
K G或T/U
S G或C
W A或T/U
H A或C或T/U
B G或T/U或C
V G或C或A
D G或A或T/U
N G或A或T/U或C
如本文所用的，术语“核苷酸类似物”指在结构上与天然存在的核苷酸类似的化合物。核苷酸类似物可具有改变的磷酸骨架、糖部分、核碱基或其组合。核苷酸类似物可以是天然核苷酸、合成核苷酸、修饰的核苷酸或代用的替换部分(如，肌苷)。一般来说，具有改变的核碱基的核苷酸类似物尤其赋予不同的碱基配对和碱基堆积行为。如本文所用的，术语“LNA (锁定核酸)核苷酸”指核苷酸类似物，其中核苷酸的糖部分含有锁定在核糖核酸(RNA)-模拟糖构型中的双环呋喃糖单位。从脱氧核糖核苷酸(或核糖核苷酸)向LNA核苷酸的结构变化，即在2＇位和4＇位的碳原子之间引入另外的连键(如，2＇-C, 4＇-C-氧基亚甲基连键；见，例如，Singh, S. K.等, Chem. Comm., 4, 455−456, 1998，或Koshkin, A. A.等, Tetrahedron, 54, 3607−3630, 1998.)，从化学角度来看是有限的。在LNA核苷酸中的呋喃糖单位的2＇和4＇位置可经O-亚甲基(如，氧基-LNA: 2＇-O, 4＇-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖基核苷酸)、S-亚甲基(硫代-LNA)或NH-亚甲基部分(氨基-LNA)等连接。这样的连键限制呋喃糖环的构型自由度。LNA寡核苷酸显示对互补单链RNA，和互补单链或双链DNA的增强的杂交亲和性。LNA寡核苷酸可诱导A-型(RNA-样)双螺旋构型。具有改变的磷酸-糖骨架的核苷酸类似物(如，PNA、LNA)往往尤其修饰链特性例如二级结构形成。在字母名称前的星号(*)符号表示，由该字母指定的核苷酸是硫代磷酸酯修饰的核苷酸。例如，*N表示硫代磷酸酯修饰的随机核苷酸。在字母名称前的加(+)号表示，由该字母指定的核苷酸是LNA核苷酸。例如，+A表示腺苷LNA核苷酸，和+N表示锁定的随机核苷酸(即，随机LNA核苷酸)。
如本文所用的，术语“寡核苷酸”指核苷酸的寡聚物。如本文所用的术语“核酸”指核苷酸的聚合物。如本文所用的术语“序列”指寡核苷酸或核酸的核苷酸序列。贯穿整个说明书，每当寡核苷酸或核酸用一系列字母表示时，核苷酸从左至右按5´→3´的顺序。例如，由字母序列(W)x(N)y(S)z表示的寡核苷酸，其中x=2，y=3和z=1，表示寡核苷酸序列WWNNNS，其中W是5＇末端核苷酸和S是3＇末端核苷酸。寡核苷酸或核酸可以是DNA、RNA，或它们的类似物(如，硫代磷酸酯类似物)。寡核苷酸或核酸也可包含修饰的碱基和/或骨架(如，修饰的磷酸连键或修饰的糖部分)。赋予核酸稳定性和/或其它优点的合成骨架的非-限制性实例可包括硫代磷酸酯连键、肽核酸、锁定核酸、木糖核酸或其类似物。
如本文所用的，术语“引物”指与目标核酸序列(如，要扩增的DNA模板)杂交以引发核酸合成反应的短的线性寡核苷酸。引物可以是RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸，或嵌合序列。引物可含有天然的、合成或修饰的核苷酸。引物长度的上限和下限均凭经验确定。引物长度的下限是在核酸扩增反应条件下，在与目标核酸杂交时形成稳定的双螺旋体所需的最小长度。在这样的杂交条件下，极短的引物(通常少于3个核苷酸长)不与目标核酸形成热力学稳定的双螺旋体。上限往往通过在除了目标核酸的预定核酸序列的区域中具有双螺旋体形成的可能性确定。一般来说，合适的引物长度是在约3个核苷酸长至约40个核苷酸长的范围内。
如本文所用的，术语“随机引物”指引物序列的混合物，其通过将寡核苷酸序列的任何给定位置的核苷酸随机化，以给定的位置可由任何可能的核苷酸或其类似物(完全随机化)组成的方式来生成。因此，随机引物是寡核苷酸序列的随机混合物，其由序列中核苷酸的每一种可能的组合组成。例如，一种六聚体随机引物可由序列NNNNNN或(N)6表示。六聚体随机DNA引物由4个DNA核苷酸A、C、G和T的每一种可能的六聚体组合组成，产生包含46(4,096)个独特的六聚体DNA寡核苷酸序列的随机混合物。当目标核酸的序列是未知的或用于全基因组扩增反应时，随机引物可有效地用来引发核酸合成反应。
如本文所述的，术语“部分约束的引物”指引物序列的混合物，其通过将寡核苷酸序列的一些核苷酸(即，核苷酸可以是A、T/U、C、G或其类似物的任何一种)完全随机化，同时约束一些其它的核苷酸的完全随机化而生成(即，在某些位置的核苷酸的随机化在程度上比可能的组合A、T/U、C、G或其类似物更小)。例如，一种由WNNNNN表示的部分约束的DNA六聚体引物，表示引物序列的混合物，其中混合物中所有序列的5＇末端核苷酸是A或者是T。在这里，与完全随机DNA引物(NNNNNN)的最多4种可能的组合(A、T、G或C)形成对比，5＇末端核苷酸被约束至2种可能的组合(A或T)。部分约束的引物的合适引物长度可在约3个核苷酸长至约15个核苷酸长的范围内。
如本文所述的，术语“具有末端错配引物-二聚体结构的部分约束的引物”指部分约束的引物序列，其中当部分约束的引物中的两个独立的引物序列彼此分子间杂交(具有三个或更多个核苷酸的内部同源性)，以形成没有凹缺末端的引物-二聚体结构，或具有单一-核苷酸碱基3＇凹缺末端的引物-二聚体结构，或具有2-核苷酸碱基3＇凹缺末端的引物-二聚体结构时，在引物-二聚体结构的两个3＇末端核苷酸存在核苷酸错配(即，核苷酸未碱基配对)。例如，由WNNNS表示的部分约束的五聚体引物，当其经分子间杂交，形成没有凹缺末端的引物-二聚体结构时，在两个3＇末端核苷酸上提供末端错配。在引物-二聚体结构中，存在3个核苷酸的内部同源性(即，当没有凹缺末端的引物-二聚体结构经分子间杂交形成时，在WNNNS中的3个随机核苷酸可彼此碱基配对)。然而，这种引物实例当其经分子间杂交，形成具有单一-核苷酸碱基3＇凹缺末端的引物-二聚体结构时，不提供末端错配。类似地，由WWNNNS表示的部分约束的六聚体引物当其经分子间杂交，形成没有凹缺末端的引物-二聚体结构时，提供在两个3＇末端核苷酸的末端错配。而且，这种引物实例即使当其经分子间杂交，形成具有单一-核苷酸碱基3＇凹缺末端的引物-二聚体结构时，也提供在两个3＇末端核苷酸的末端错配。由WWWNNNS表示的部分约束的七聚体引物当其经分子间杂交，形成没有凹缺末端的引物-二聚体结构时，提供在两个3＇末端核苷酸的末端错配。此外，这种引物实例当其经分子间杂交，形成具有单一-核苷酸碱基3＇凹缺末端的引物-二聚体结构，或形成具有2个-核苷酸碱基3＇凹缺末端的引物-二聚体结构时，提供在两个3＇末端核苷酸的末端错配。
如本文所用的，术语“滚环扩增(RCA)”指经由滚环机制扩增环状核酸模板(如，单链DNA环)的核酸扩增反应。滚环扩增反应通过引物杂交至环状(往往是单链)核酸模板而启动。核酸聚合酶然后延伸引物，所述引物通过围绕环状核酸模板的不断进展被杂交至环状核酸模板，以反复不断地复制核酸模板的序列(滚环机制)。滚环扩增通常产生包含环状核酸模板序列的串联重复单元的串联体(concatamer)。滚环扩增可以是线性RCA (LRCA)，显示出线性扩增动力学(如，使用单一特异性引物的RCA)，或可以是显示指数扩增动力学的指数RCA (ERCA)。滚环扩增也可使用多个引物(多重引物滚环扩增或MPRCA)进行，产生超支化串联体。例如，在双-引物RCA中，一个引物可以是(如在线性RCA中)与环状核酸模板互补的，而另一个可以是与RCA产物的串联重复单元核酸序列互补的。因而，双-引物RCA可作为具有特征为多-杂交的网状级联、引物-延伸和涉及两个引物的链置换事件的指数(几何学)扩增动力学的链反应进行。这往往生成一组离散的串联的双链核酸扩增产物。滚环扩增可在等温条件下，使用合适的核酸聚合酶例如Phi29 DNA聚合酶在体外进行。
如本文所用的，多重置换扩增(MDA)指核酸扩增方法，其中扩增包括使引物与变性的核酸退火，接着链置换核酸合成的步骤。因为核酸通过链置换合成，发生逐渐增加的引发事件数目，形成超支化核酸结构网络。MDA对于从少量的基因组DNA样本生成具有有限的序列偏倚的高-分子量DNA的全基因组扩增是高度有用的。除了其核酸合成活性，具有链置换活性的任何链置换核酸聚合酶，例如Phi29 DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶的大片段可用于MDA。MDA往往在等温反应条件下，使用为获得具有有限的序列偏倚的扩增的随机引物进行。
如本文所用的，术语“预腺苷酸化连接酶”指呈现其腺苷酸化形式的连接酶。在ATP或dATP的不存在下，连接酶的腺苷酸化形式能够分子内连接具有5＇磷酰基和3＇羟基的线性ssDNA分子。使用预腺苷酸化连接酶连接指连接反应，其中用于该反应的高比例的连接酶分子以其腺苷酸化形式存在。通常超过60%的连接酶分子可以其腺苷酸化形式存在。在一些实施方案中，当连接反应使用预腺苷酸化连接酶进行时，用于该反应的超过70%的连接酶分子可以其腺苷酸化形式存在。在一些其它实施方案中，当连接反应使用预腺苷酸化连接酶进行时，用于该反应的超过80%、90%或95%的连接酶分子可以其腺苷酸化形式存在。
如本文所用的术语“腺苷酸化酶”指能够腺苷酸化核酸序列，以生成5＇腺苷酸化核酸的酶。如本文所用的5＇腺苷酸化核酸指在其3＇端具有羟基和在其5＇端具有腺苷酸化末端核苷酸的核酸序列。例如，5＇腺苷酸化DNA (AppDNA)，指在其5＇端被腺苷酸化和在其3＇端具有羟基的DNA序列。
如本文所用的，术语“非-腺苷酸化连接酶”指以其非-腺苷酸化形式存在的连接酶。非-腺苷酸化形式的连接酶在ATP或dATP的不存在下，能够分子内连接具有3＇羟基的线性5＇-腺苷酸化ssDNA分子。使用非-腺苷酸化连接酶的连接指一种连接反应，其中用于该反应的高比例的连接酶分子以其非腺苷酸化形式存在。通常超过60%的连接酶分子可以其非-腺苷酸化形式存在。在一些实施方案中，当连接反应使用非-腺苷酸化连接酶进行时，用于该反应的超过70%的连接酶分子可以其非-腺苷酸化形式存在。在一些其它实施方案中，当连接反应使用非-腺苷酸化连接酶进行时，用于该反应的超过80%、90%或95%的连接酶分子可以其非-腺苷酸化形式存在。
在一些实施方案中，提供一种从线性DNA生成单链DNA环的方法。线性DNA可以是片段化的线性DNA。片段化DNA可以是循环DNA、古老的DNA或被环境暴露而降解的DNA、或***-固定的DNA。片段化的线性DNA的长度范围可为从15个核苷酸至21000个核苷酸。片段化的线性DNA可包含具有非-可连接的末端的序列。例如，线性DNA可具有5＇羟基或者3＇磷酰基或二者。在一些实施方案中，该方法包括提供线性DNA，在磷酸供体的存在下通过使其与多核苷酸激酶(PNK)一起孵育末端修复线性DNA以生成具有在5＇末端的磷酸基团和在3＇末端的羟基的可连接的DNA序列，并用连接酶进行可连接的DNA序列的分子内连接以生成单链DNA环的步骤。末端修复可包括5＇末端核苷酸的磷酸化、3＇末端核苷酸的去-磷酸化或二者，以生成可连接的DNA序列。末端-修复的、可连接的DNA，如果呈双链形式，需要在分子内连接反应前被变性。在一些实施方案中，DNA在PNK反应前被变性。单链DNA的磷酸化或去磷酸化通常比双链平端或5＇-凹缺末端的磷酸化或去磷酸化更有效。选择磷酸供体及其在反应混合物中的浓度，以使其不抑制后续的分子内连接反应。例如，并非腺苷三磷酸(ATP)或脱氧腺苷三磷酸(dATP)的任何合适的磷酸供体可被用于采用PNK的末端修复反应。合适的磷酸供体包括，但不限于，鸟苷三磷酸(GTP)、胞苷三磷酸(CTP)、尿苷三磷酸(UTP)或脱氧胸苷三磷酸(dTTP)。在一些实施方案中，预腺苷酸化连接酶被用于连接反应。能够模板-非依赖性的、单链DNA序列的任何预腺苷酸化连接酶可被采用。在一些实施方案中，TS2126 RNA连接酶的基本腺苷酸化形式被用于模板-非依赖性的、分子内连接反应。激酶反应和连接反应在ATP和/或dATP的不存在下进行。该方法的所有步骤在单一反应容器中进行，而无需任何***的分离或纯化步骤。该方法的各个步骤可同时进行或以顺序的方式进行，而无需任何中间纯化或分离步骤。例如，PNK与GTP一起可被加入到含有包含线性目标DNA的核酸溶液的反应容器(如，微量离心管(eppendorf tube))中，以促进线性目标DNA的末端修复。具有5´磷酸化和3´磷酸酶活性的任何PNK (如，T4 PNK)可用于末端修复反应。其各自具有5´磷酸化或3´磷酸酶的PNK的组合也可用于末端修复反应。一旦激酶反应完成，预腺苷酸化连接酶可被加入到相同的反应容器中以促进分子内连接反应。
线性DNA可以是天然或者合成来源的双链或单链DNA。DNA可从体内或体外的生物学样本(如，从生物主体获得的样本)获得或从未知对象(如，在法医调查期间获得的DNA)中发现。例如，它可从(但不限于)体液(如，血、血浆、血清、尿、乳汁、脑脊液、胸腔积液、淋巴液、泪、痰、唾液、粪便、肺穿刺液、咽喉或生殖器拭子)、器官、组织、细胞培养物、细胞部分、切片(如，器官或组织的切片部分)或从生物主体分离或从生物主体的特定区域(如，含有患病细胞或循环肿瘤细胞的区域)获得的细胞。含有或疑似含有目标线性DNA (即，关注的线性DNA)的生物学样本可具有真核来源、原核来源、病毒来源或噬菌体来源。例如，目标线性DNA可从昆虫、原生动物、鸟、鱼、爬行动物、哺乳动物(如，大鼠、小鼠、牛、狗、豚鼠或兔)，或灵长类动物(如，黑猩猩或人)获得。线性DNA可以是基因组DNA或cDNA (互补DNA)。cDNA可使用逆转录酶从RNA模板(如，mRNA、核糖体RNA)生成。线性DNA可以是片段化DNA并可具有非-可连接的末端核苷酸。例如，线性DNA可包含5´羟基和/或3´磷酸基团，以致DNA连接酶不能进行分子内连接反应。线性DNA可分散于溶液中或可被固定在固体支持物上，例如在印迹法、测定法、阵列、载玻片、微量滴定板或ELISA板中。例如，线性DNA可通过引物固定在基质上，然后可被环化和扩增。
当线性DNA呈现为双链形式时，它需要在分子内连接反应之前经变性为单链形式。这可通过使用任何本领域公认的将dsDNA转化为ssDNA序列的方法实现。例如，dsDNA可经热变性、化学变性，或同时热变性和化学变性。dsDNA可使用降低dsDNA的解链温度的变性剂(如，甘油，乙二醇、甲酰胺、脲或其组合)进行化学变性。变性剂在每10% (vol./vol.)的变性剂加入到反应混合物中时，可降低解链温度5℃-6℃。变性剂或变性剂的组合(如，10%甘油和6-7%乙二醇)可占反应混合物(vol./vol.)的1%、5%、10%、15%、20%或25%。降低杂交严格性的盐可以低浓度包含在反应缓冲液中，以在低温下使dsDNA化学变性。dsDNA可例如，于95℃加热dsDNA经热变性。
在变性步骤后，生成的ssDNA可在模板的不存在下，用能够分子内连接ssDNA底物的DNA或RNA连接酶处理，以形成单链DNA环。可被用于连接反应的合适的连接酶包括，但不限于，TS2126 RNA连接酶、T4 DNA连接酶、T3 DNA连接酶或大肠杆菌(E. coli) DNA连接酶。将线性的单链DNA分子转化为单链DNA环使用连接酶例如T4 RNA连接酶，经由模板-依赖性分子内连接反应常规地进行。然而，单链DNA或单链RNA的模板-依赖性分子内连接只有有限的成功，特别是当ssDNA分子的环化将在未知序列和/或大小的ssDNA分子群中进行时。即使噬菌体T4 RNA连接酶I显示出模板-非依赖性分子内连接活性，这种活性对于在从线性ssDNA分子生成环状ssDNA分子中的实际应用是极其低且效率差的。
在一些实施方案中，ssDNA转化为单链DNA环用热稳定的RNA连接酶进行，所述酶具有良好的用于具有5′磷酰基和3′羟基的线性ssDNA和/或ssRNA底物的模板-非依赖性的、分子内连接活性。连接酶可以基本上预腺苷酸化形式存在。例如，源自感染嗜热细菌水管致黑栖热菌(Thermus scotoductus)的栖热菌属噬菌体TS2126的TS2126 RNA连接酶，可被用于将片段化线性ssDNA经模板-非依赖性环化为环状ssDNA。TS2126 RNA连接酶是比许多嗜温性RNA连接酶如T4 RNA连接酶更加热稳定的(在至多约75℃是稳定的)。对于TS2126 RNA连接酶活性的温度范围可大于约40℃，例如，从约50℃至约75℃。由于这一点，TS2126 RNA连接酶可在较高的温度下使用，这进一步减少ssDNA的不需要的二级结构。线性ssDNA的环化也可使用并非TS2126 RNA连接酶的连接酶或通过使用具有DNA连接活性的任何其它酶如拓扑异构酶实现。在一些实施方案中，片段化的、单链DNA分子的环化通过源自嗜热古细菌热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)的RNA连接酶1 (Mth RNA连接酶)实现，该酶在环化线性的、片段化ssDNA分子中具有高度模板-非依赖性连接酶活性。
在一些实施方案中，提供一种用于通过TS2126 RNA连接酶，提高环化ssDNA的效率的方法。为连接反应使用具有8.0的pH的HEPES缓冲液增加连接效率。当反应在TRIS缓冲液(如，对于CircLigaseTM II，EpiCenter建议的10x反应缓冲液包含0.33 M TRIS-乙酸盐(pH7.5)、0.66 M乙酸钾和5mM DTT)中进行时，模板-非依赖性ssDNA连接是无效的。此外，锰(一种用于连接反应的重要辅因子)在碱性条件下迅速氧化并在TRIS的存在下形成沉淀。Mn2+在空气中氧化为Mn3+可由与Mn3+离子强烈络合的阴离子促进。例如，当具有用HC1适当调节的pH的0.2 mol/升Tris和2 mmol/升MnC12等体积混合时，在pH 9.3 (单独的TRIS碱的pH)时，颜色立刻改变；在pH 8.5时有一个约3分钟的初始时间滞后；而在pH值低于8.3下1小时时未能检测到颜色改变。虽然反应在较低的pH下没有发生，在较高pH观察到的改变未被添加酸逆转。由于锰在TRIS缓冲液中迅速氧化，当分子内连接在TRIS缓冲液中进行时，较高浓度的锰对于连接反应是重要的(如，加入MnCl2至2.5 mM的最终浓度)。此外，当锰浓度随时间推移继续降低时，要精确地预测锰在反应中的工作浓度将变得困难。当连接和扩增在单一反应容器中进行时，较高浓度的锰可导致在扩增期间聚合酶的较高的错误率。在连接反应中，通过用HEPES缓冲液替换TRIS缓冲液，有效的分子内连接可用少于0.5 mM的锰离子浓度实现。除了HEPES，任何其它Good的缓冲液(见，例如，Good, Norman等Biochemistry, 5 (2):467–477, 1966；和Good, Norman等, Methods Enzymol., 24: 53–68, 1972.)可用于分子内连接反应。
在连接反应混合物中的ssDNA环可在等温条件下，通过滚环扩增(RCA)方法扩增。扩增试剂(包括DNA聚合酶、引物和dNTP)可被加入到相同的反应容器中，以产生扩增反应混合物并启动RCA反应。扩增反应混合物还可包括试剂例如单链DNA结合蛋白和/或合适的扩增反应缓冲剂。ssDNA环的扩增在其中进行连接的相同反应容器中进行。在扩增反应之前，ssDNA环的分离或纯化和/或连接酶的除去不是必须的。扩增的DNA可通过任何目前已知的用于DNA检测的方法检测。
RCA可通过使用本领域已知的任何DNA聚合酶如Phi29 DNA聚合酶进行。它可使用随机引物混合物或通过使用特异性引物进行。在一些实施方案中，随机引物被用于RCA反应。可使用包含一个或多个核苷酸类似物(如，LNA核苷酸、2-氨基-A，或2-硫代T修饰)的引物序列。在一些实施方案中，耐核酸酶引物(如，包含在适当位置的硫代磷酸酯基团的引物序列)被用于扩增反应(如，NNNN*N*N)。在一些实施方案中，RCA可通过使ssDNA环与包含随机引物混合物的引物溶液接触，以形成核酸模板-引物复合物；使核酸模板-引物复合物与DNA聚合酶和脱氧核糖核苷三磷酸接触；和扩增核酸模板来进行。在一些实施方案中，引物溶液包含部分约束的引物例如WWNNS。部分约束的引物可具有末端错配的引物-二聚体结构。在一些实施方案中，由核苷酸序列(W)x(N)y(S)z (其中x、y和z是彼此独立的整数值，和其中x的值是2或3，y的值是2、3或4，和z的值是1或2)组成的部分约束的引物被用于RCA反应。部分约束的引物可包含一个或多个核苷酸类似物。在一些实施方案中，包含修饰的核苷酸和具有末端错配引物二聚体结构的耐核酸酶的部分约束的引物被用于RCA反应。合适的引物序列包括，但不限于，+W+WNNS、W+W+NNS、+W+WNNNS、W+W+NNNS、W+W+NN*S、+W+WNN*S、W+W+NNN*S、+W+WNNN*S、W+W+N*N*S、+W+WN*N*S、W+W+NN*N*S，或+W+WNN*N*S。在一些实施方案中，RCA反应通过使ssDNA环与基本上由部分约束的引物混合物(包含末端错配引物二聚体结构)组成的引物溶液接触并扩增ssDNA环来进行。在一些其它实施方案中，RCA反应通过使ssDNA环与基本上由部分约束的引物混合物(包含核苷酸类似物)组成的引物溶液接触并扩增ssDNA环来进行。ssDNA环的RCA产生大量的具有减少的序列丢失和减少的扩增偏倚的DNA。ssDNA连接和扩增的整个过程可在单一管中进行，无需任何中间纯化或分离步骤。
在一些实施方案中，提供一种用于经由多重置换扩增(MDA)来扩增有限量的线性片段化DNA的方法。MDA的常规方法，当在线性片段化DNA上尝试时，导致降低的扩增速度和高度的序列-偏倚扩增。而且，显著的序列丢失往往在特别接近片段化DNA的末端被观察到。为克服这些限制，首先将片段化dsDNA转化为ssDNA。然后经由模板-非依赖性分子内连接反应将ssDNA转化为单链环状DNA (即，DNA环)，从而消除了有问题的DNA末端。甚至短于500bp的ssDNA序列可使用ssDNA的模板-非依赖性分子内连接被环化。此外，当ssDNA的连接以模板-非依赖性方式进行时，不需要现有的目标序列的知识以创建DNA环。在环化前，片段化DNA可用PNK处理，以修复非-可连接的末端。在片段化ssDNA环化后，MDA在环化的DNA上进行。扩增反应可在等温条件下，通过采用滚环扩增(RCA)方法进行。RCA可使用可市售获得的RCA扩增试剂盒例如TempliPhiTM RCA试剂盒(GE Healthcare)进行。TempliPhiTM滚环扩增使用含有锁定核酸的随机引物，其提供较高的敏感性和扩增平衡。在一些实施方案中，耐核酸酶引物被用于RCA反应。本文公开的方法提高扩增敏感性、减少序列丢失，并允许更平衡的扩增。因为单链片段化DNA的模板-非依赖性环化即使在较低浓度下也可在较短序列上完成，因此当连接酶-辅助的全基因组扩增被用来扩增高度片段化的循环DNA (如，血浆中的循环DNA)时，具有更快的动力学和改进的序列覆盖率的更为平衡的DNA扩增可完成。例如，用于ssDNA的模板-非依赖性环化的ssDNA的持续长度可低至15个核苷酸。当CircLigaseTM在标准条件下用于连接反应时，几乎没有线性串联体或环状串联体产生。此外，环化和扩增反应均可在单一反应容器中进行，无需任何中间纯化或分离步骤，从而减少污染的机会并简化扩增工作流。连接酶-辅助的全基因组扩增方法可被用于，但不限于，分析循环血浆DNA、从***固定的石蜡包埋(FFPE)样本分离的片段化DNA、已暴露于环境条件的法医DNA样本或古老的DNA样本。扩增库可进一步用于经由qPCR扩增序列的目标检测或测序。
本文描述的包括预先将ssDNA片段连接成DNA环，接着滚环扩增的各种连接-辅助全基因组扩增方法，提供超过高分子量基因组DNA的优先的片段化DNA优先扩增。例如，包含循环DNA的血浆制剂往往可在纯化过程中被从血细胞释放的基因组DNA污染。通过MDA的全基因组扩增的常规方法扩增循环DNA和基因组DNA二者。相反，当片段化的循环DNA分子首先使用TS2126 RNA环化，接着使用Phi29 DNA聚合酶通过RCA扩增环化的DNA分子时，循环DNA超过高分子量基因组DNA而优先地扩增。片段化DNA超过基因组DNA的这样的优先扩增特别适合于诊断应用，因为诊断相关的DNA可优先扩增用于下游分析(见，实施例4)。此外，当与常规的基于MDA的全基因组扩增比较时，连接酶-辅助的全基因组扩增允许片段化DNA的更加稳健的扩增。
图1描述片段化dsDNA的连接酶-辅助全基因组扩增的实施方案的示意图。双链DNA的持续长度要高得多(~150 bp)，且其天然的刚度使得少于500 bp的片段的环化效率非常低。此外，使用约250 bp范围的小双链片段化DNA分子，环化是效率低的，除非末端处于正确的对齐位置(~10.5 bp/转角)。相反，当与双链片段化DNA比较时，单链片段化DNA的环化的持续长度非常小，约15个核苷酸。如在图1中所描述的，在连接酶-辅助的全基因组扩增中，片段化dsDNA首先转化为单链DNA环。这可通过于95℃孵育片段化双链DNA充分的时期，以使dsDNA变性为单链来完成。片段化ssDNA然后用DNA或RNA连接酶处理，所述酶能够模板-非依赖性的、分子内连接单链DNA底物，以生成单链DNA环。可用来分子内连接的连接酶的非-限制性实例包括CircLigaseTM、T3 DNA连接酶、T4 RNA连接酶、Mth RNA连接酶(MthRnl1)，或大肠杆菌连接酶。然后加入扩增试剂，包括DNA聚合酶、随机引物和dNTP，以启动在单链DNA环上的RCA反应。与常规全基因组扩增方法对比，这种采用RCA的连接酶-辅助的全基因组扩增产生大量的具有减少的序列丢失和扩增偏倚的DNA。因此，它可用来扩增和检测甚至高度片段化的DNA。生产单链DNA环及其随后的通过RCA的扩增的整个过程在单一管中进行，无需任何***的纯化步骤。
在一些实施方案中，提供用于片段化DNA的连接酶-辅助全基因组扩增的单管工作流程，其包括处理片段化DNA以修复非-可连接的DNA末端。例如，如果片段化单链DNA不含有5＇磷酰基和3＇羟基，则它在分子内连接反应中可不得到连接。这样的非-可连接的DNA序列的存在可在连接酶-辅助的全基因组扩增中引起扩增偏倚。例如，如在图8中所图示的，在细胞死亡期间通过DNase II消化生成的DNA片段可含有5＇羟基、3＇磷酰基。源自含有5＇羟基、3＇磷酰基的这样双链DNA片段的单链DNA片段在分子内连接反应中将不环化。因此DNAse II型断裂可能在全基因组扩增中被忽视。在一些实施方案中，片段化DNA用激酶(如，T4多核苷酸激酶，TPK)处理，以使片段化DNA的5＇羟基磷酸化和/或3＇磷酰基去磷酸化。在该反应中包括激酶使得在不含5＇磷酸的池中的片段有效环化。用激酶使片段化DNA的5＇末端磷酸化，接着扩增片段化DNA创建一个更具代表性的库。
在一些实施方案中，片段化dsDNA的磷酸化修复可使用T4 PNK激酶进行。磷酸化修复可在片段化dsDNA上或者在变性片段化ssDNA上进行。如果磷酸化修复在dsDNA上进行，则修复的dsDNA可被变性为线性ssDNA，其随后可使用CircLigaseIITM (缩写为CLII)环化。CircLigaseIITM包含基本腺苷酸化形式的TS2126 RNA连接酶。通过CircLigaseIITM的模板-非依赖性分子内连接ssDNA被较高浓度的ATP或dATP抑制。然而，通过激酶的磷酸化修复往往需要ATP的存在。此外，从反应混合物除去ATP而不损害DNA可能不是容易的。例如，磷酸酶处理反应混合物以除去ATP也将是DNA去磷酸化的结果(除非DNA例如，通过预腺苷酸化来保护)，因此使得DNA链为未可连接的。结果，在单一管中进行片段化DNA的磷酸化修复并生成ssDNA环，而无需任何***的纯化或分离步骤往往是困难的。本文提供的方法在激酶反应期间采用GTP、CTP、UTP或dTTP代替ATP。因为CircLigaseIITM对GTP或备选的磷酸供体(如，CTP或UTP)是更加耐受的，激酶修复步骤和连接步骤可在单一反应容器中进行，而无需任何***的纯化和/或分离步骤。激酶反应混合物还可包含另外的试剂例如锰盐和甜菜碱(两性离子性三甲基甘氨酸)。一旦连接，ssDNA环可被扩增。通过在相对低浓度的GTP下进行连接和扩增反应，本文描述的单管工作流程避免了酶处理之间的间歇清理步骤并最大限度地减少了DNA模板损失(见图9，涉及激酶修复、连接和扩增的单一管工作流程的示意图)。
在一些实施方案中，提供一种从线性DNA生成单链DNA环的替代方法，其中该方法在分子内连接步骤之前采用DNA预腺苷酸化步骤。首先，线性DNA可在ATP的存在下用多核苷酸激酶孵育，生成包含在5＇末端的磷酸基团和在3＇末端的羟基的可连接的DNA序列。然后在腺苷三磷酸的存在下，可连接的DNA序列用腺苷酸化酶孵育，生成5´腺苷酸化DNA序列。5´腺苷酸化DNA序列具有游离3＇羟基。选择在连接反应中的ATP浓度，以使在可连接的DNA序列的3＇端不发生腺苷酸化。然后5＇腺苷酸化DNA序列用非-腺苷酸化连接酶孵育，该酶能够模板-非依赖性分子内连接5＇腺苷酸化DNA序列，以生成单链DNA环。如果ATP-依赖性非-腺苷酸化连接酶用于分子内连接反应，在分子内连接反应之前，可必须通过用磷酸酶处理反应混合物，从反应混合物除去ATP。在DNA的末端核苷酸的5＇磷酸，其通常通过磷酸酶除去，由于预腺苷酸化而不受磷酸酶处理。如果DNA呈现为双链形式，它在分子内连接反应之前需要变性。该方法的所有步骤在单一反应容器中进行，而无需任何***的分离或纯化步骤。
在一些实施方案中，在ATP的存在下，使用RNA连接酶，例如源自嗜热古细菌热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)的RNA连接酶I (Mth RNA连接酶1)，以生成线性DNA的腺苷酸化形式。突变体或适当地工程改造的ATP-非依赖性连接酶(其在自-腺苷酸化、脱腺苷酸化和腺苷酸转移中是有缺陷的)可用于腺苷酸化线性DNA的分子内连接反应，以生成单链DNA环。例如，可使用Mth RNA连接酶的基序V赖氨酸突变体(K246A)。这种突变体具有与预腺苷酸化底物的完全连接活性。也可使用在基序I 中具有取代催化的赖氨酸的丙氨酸(K97A)的Mth RNA连接酶突变体。K97A突变体的活性与作为供体底物的预腺苷酸化RNA或者单链DNA (ssDNA)相似，但与具有相同序列的ssDNA比较，具有对作为受体底物的RNA的两倍优先。如果ATP-依赖性连接酶例如TS2126 RNA连接酶用于5＇腺苷酸化DNA序列的分子内连接反应，在该反应中的ATP可必须在连接反应之前除去。
在一些实施方案中，提供采用备选工作流程的连接酶-辅助的全基因组扩增。这个工作流程的示意图在图11中提供。该方法包括在连接和扩增前，在ATP的存在下，用激酶修复片段化DNA并用RNA连接酶或DNA连接酶在5＇端使片段化DNA预腺苷酸化。包含具有非-可连接的末端的序列(如，包含5＇羟基和/或3＇磷酰基的序列)的片段化DNA通过用激酶处理在5＇末端被磷酸化和在3＇末端被去磷酸化，生成可连接的DNA序列。然后在ATP的存在下，可连接的DNA序列可使用RNA连接酶如Mth RNA连接酶(MthRnl 1)进行腺苷酸化，以生成片段化DNA的腺苷酸化形式。随后通过用磷酸酶(如，虾碱性磷酸酶(SAP))处理反应混合物，从反应混合物除去ATP。本领域可获得的用于DNA的5＇腺苷酸化的任何方法均可采用(如，RNA连接酶、DNA连接酶或合成方法)。预腺苷酸化单链线性DNA然后用具有低度腺苷酸化的RNA连接酶例如CircLigase ITM处理，经由分子内连接生成DNA环。然后使用RCA扩增DNA环。在其中CircLigase ITM经由分子内连接生成DNA环的实施方案中，分子内DNA连接和后续的扩增反应在ATP的不存在下进行。在激酶处理和预腺苷酸化反应后，从反应混合物除去ATP是重要的，因为预腺苷酸化ssDNA通过CircLigase I的环化受ATP的抑制。在一些实施方案中，ATP通过用磷酸酶处理而转化为腺苷和磷酸盐。即使腺苷不抑制环化反应，生成的磷酸盐可抑制分子内连接反应。生成的磷酸盐可通过用磷酸-螯合酶或用沉淀或除去磷酸盐的试剂(如，磷酸盐结合树脂例如LayneRT树脂)处理反应混合物，从溶液中进一步除去。磷酸盐除去也可通过用酶例如麦芽糖磷酸化酶(其催化麦芽糖转化为葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸)处理反应混合物实现，从而从溶液中除去磷酸盐。在该反应中包含激酶使得不含有5＇磷酸和/或3＇羟基的池中的DNA片段环化和扩增，由此经由连接酶-辅助的扩增，创建一个更具代表性的库。目标DNA的预腺苷酸化促进具有低度腺苷酸化的连接酶(如，CircLigase ITM，其约30%被腺苷酸化)对分子内连接反应的应用。这可具有重要意义，因为具有高度腺苷酸化的连接酶(如，CircLigase IITM)只有一次连接未-腺苷酸化DNA。因此，化学计量的量的连接酶往往需要驱动分子内连接反应至完全。相反，具有低度腺苷酸化的连接酶(如CircLigase ITM)具有高的周转性，并能可逆地和催化地或反复地作用于多个预腺苷酸化DNA分子。这增加连接动力学，减少所需连接酶的数量，和潜在地允许增加更困难或复杂的DNA模板的环化。
在一些实施方案中，连接酶-辅助的全基因组扩增的方法被用于在生物学样本例如全血或尿中扩增和后续检测循环核酸(如，来自生物学样本的非-细胞部分的循环DNA)。循环核酸可源自凋亡或坏死细胞，或可从细胞主动释放。因为细胞核酸酶将高分子量基因组DNA分解成小的、核小体-大小的片段，循环核酸天然地是高度片段化的。高度片段化循环核酸往往不适合常规核酸扩增方法。此外，循环核酸以极低的量存在于血流中。双链循环线性核酸的标准滚环扩增(RCA)是效率低且高度偏倚的。将循环核酸分离为单链并在滚环扩增前用连接酶环化改进了效率并导致较少的偏倚。为使得这样稀释的DNA模板具有好的RCA动力学和高的灵敏性，采用使用包含LNA的引物的RCA方法。这种改进的RCA已对微量DNA和单细胞扩增进行了优化。
在一些实施方案中，提供一种从全血扩增循环DNA的方法。循环DNA从全血的非-细胞部分(如，血浆或血清)扩增。这种方法包括收集全血的非-细胞部分，从非-细胞部分收集循环DNA (主要以其天然双链形式存在)，使双链DNA变性以生成线性单链DNA，使循环单链DNA分子环化以生成单链DNA环，和通过滚环扩增来扩增单链DNA环的步骤。由于持续长度，它通常不可能环化具有小于150 bp的序列长度的dsDNA，且环化dsDNA是极其困难的，除非DNA长于200 bp。相反，具有15个或更多个核苷酸(nt)的序列长度的线性ssDNA分子是非常有效地被合适的连接酶环化，只要5＇端被磷酸化和3＇端被羟基化。环化单链DNA以生成单链DNA环通过采用能够模板-非依赖性分子内连接单链DNA的连接酶实现。在一些实施方案中，单链DNA分子的环化通过用RNA连接酶如CircLigase IITM处理单链线性DNA进行。
在一些实施方案中，循环DNA检测的灵敏性通过在ssDNA连接步骤和RCA之前，用多核苷酸激酶(PNK)使循环核酸磷酸化而进一步增加。一旦在工作流程中加入PNK步骤，本文提出的连接酶-辅助的全基因组扩增方法，当以1%水平掺入时，可在雌性全血中检测雄性循环DNA (3份重复)。除非ssDNA模板具有5＇磷酸基团和3＇羟基，否则模板-非依赖性分子内连接不能完成。多种条件在DNA中产生5＇羟基(包括DNase II酶促裂解，和血中磷酸酶活性)。PNK处理消除了这个问题并改进了滚环扩增CNA库的多样性。
在一些实施方案中，提供用于从线性DNA生成单链DNA环的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包含包装在一起的多核苷酸激酶、磷酸供体和能够模板-非依赖性的、分子内连接ssDNA序列的预腺苷酸化连接酶。多核苷酸激酶可以是T4 PNK。磷酸供体可选自GTP、UTP、CTP或dTTP。在一个实施方案中，试剂盒可包括TS2126连接酶。超过60%的TS2126连接酶可被预腺苷酸化。试剂盒还可包含缓冲液(如，HEPES)、DNA扩增试剂(如，DNA聚合酶、引物、dNTP)和通过提供的方法用于单链DNA环的生成的其它试剂(如，MnCl2、甜菜碱)。在一些实施方案中，试剂盒可包括Phi29 DNA聚合酶和随机/部分约束的引物。在另一个实施方案中，试剂盒包含包装在一起的腺苷酸化酶、磷酸酶和非-腺苷酸化连接酶。试剂盒还可包含多核苷酸激酶和/或磷酸供体。腺苷酸化酶可以是源自热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotropicum)的RNA连接酶I (Mth RNA连接酶)。非-腺苷酸化连接酶可以是TS2126连接酶的组合物，其中超过60%的连接酶呈现为非-腺苷酸化形式。试剂盒还可包括从线性DNA生成单链DNA环的用法说明书。
本发明的实践从以下实施例将更加充分地理解，本文提出的实施例仅仅是为了举例说明，而不应视为限制由所附权利要求书限定的本发明的范围。用于实施例部分的一些缩写详述如下：“mg”：毫克；“ng”：毫微克；“pg”：皮克；“fg”：毫微微克；“mL”：毫升；“mg/mL”：毫克/毫升；“mM”：毫摩尔量；“mmol”：毫摩尔；“pM”：皮摩尔量；“pmol”：皮摩尔；“μL”：微升；“min.”：分钟和“h.”：小时。
实施例：
实施例1：来自血浆的循环核酸的全基因组扩增：
使用Wako DNA提取仪SP试剂盒(Wako Pure Chemical Industries)，从表观健康个体的柠檬酸盐-磷酸盐-右旋糖(CPD)-稳定的血浆分离循环DNA。通过2%琼脂糖凝胶电泳，使用TBE缓冲液分析约1.3 ng，用SYBR Gold染色和使用Typhoon成像仪显现。如在图2中所述，大多数循环DNA的长度为约180 bp，伴有长度为约370 bp的另外较少量的序列，和显著更少量的较高分子量序列。
将得自血浆的350 pg循环DNA于95℃加热以使模板变性。然后用RNA或DNA连接酶处理变性的单链DNA模板，生成单链DNA环。ATP-依赖性T4 DNA连接酶、细胞-编码的NAD-依赖性大肠杆菌DNA连接酶或热稳定的RNA连接酶(CircLigase II)被用于这些连接反应。然后使用GenomiPhi试剂盒(GE Healthcare)，使用Phi29 DNA聚合酶使100 pg DNA连接的单链DNA环经受全基因组扩增。扩增使用引物混合物+N+N(at N)(at N)(at N)*N进行，其中“at N”表示含有2-氨基dA、2-硫代-dT、正常的G和正常的C的随机混合物。实时扩增通过加入小量的SYBR green I至扩增混合物中并在Tecan读板仪(Tecan SNiPer, Amersham-Pharmecia Biotech)中监测荧光信号随时间推移的增加而进行。为了比较，包括等量浓度的未经处理的基因组DNA、未经处理的血浆DNA和无DNA模板的样本(无模板扩增)。
如在图3中描述的，当与等量的高分子量基因组DNA比较时，未经处理的、片段化的血浆DNA的扩增动力学要低得多，指示扩增缺乏。然而，当片段化血浆DNA经预处理并使用CircLigase IITM转化为单链DNA环时，实现快速的扩增动力学(图3A)。连接酶，包括ATP-依赖性T4 DNA连接酶(图3B)和细胞-编码的NAD-依赖性大肠杆菌DNA连接酶(图3C)在恢复片段化血浆DNA的扩增动力学中也是有效的，但效率较低。在这些实施例中，扩增动力学的相对增加指示各种连接酶在促进单链DNA模板的分子内连接中的有效性。
实施例2：通过连接酶-辅助的全基因组扩增从血浆扩增的循环核酸的分析。
为了测试用于促进灵敏的和平衡的DNA扩增的连接酶-辅助全基因组扩增方法的样本有效性，通过定量PCR，使用靶向4个不同的CODIS位点(vWA、TPOX、D8S1129和D13S317)的引物，进一步分析在实施例1中生成的扩增的DNA。将这些DNA水平与得自未扩增的DNA的值相比较，以在扩增后确定相对表示水平。如在图4中说明的，在两个实施例中，未经处理的血浆DNA的扩增导致序列丢失或产生在测试的位点有高度没有代表性的DNA。相反，在该方法中包括CircLigase IITM或者T4 DNA连接酶防止4个位点的序列丢失并产生在表现度方面与扩增的高分子量基因组DNA更类似的DNA。在使用CircLigase IITM作为单链DNA连接酶的实施例中，在使用靶向12个不同的CODIS位点的引物通过定量PCR (qPCR)测试的12个不同的CODIS位点中，有11个在扩增后被覆盖，而在扩增的未经处理的血浆DNA中仅有4个存在(图5)。在图5中，报告的Ct值是两份重复的平均值。其中Ct值未确定的PCR反应用“X”标记。
实施例3：连接酶-辅助全基因组扩增的反应条件的优化。
连接酶-辅助的DNA扩增反应通过优化经过TS2126 RNA连接酶的单链DNA分子的连接反应的效率而得到进一步的优化。金属离子的存在对于连接反应是必不可少的，因为从标准的生产商推荐的缓冲液中除去锰减少扩增速率至背景水平。使用改进缓冲条件，将未经处理的基因组DNA和未经处理的血浆DNA与CircLigase IITM-处理的血浆DNA样本比较(图6)。所有缓冲条件含有33 mM KOAc、0.5 mM DTT和1M甜菜碱。如所指明的，缓冲液含有33 mMTris-乙酸盐(pH 7.5)或33 mM HEPES-KOH (pH 8.0)并且另外含有2.5 mM MgCl2或2.5 mMMnCl2。实时扩增通过加入小量的SYBR green I至扩增混合物中并在Tecan读板仪上监测荧光随时间推移的增加而进行。扩增阈值是荧光升高至背景水平(2000 RFU)以上的时间。
连接酶-辅助全基因组扩增反应(100 pg样本)的扩增动力学比较描述于图6中。镁和锰二者在标准TRIS缓冲液的存在下产生类似的效果，但观察到锰和镁的组合在HEPES缓冲液(pH 8.0)的存在下，在促进更高的扩增速率方面是最有效的。在这种反应条件下增加血浆DNA的环化效率的HEPES缓冲液可预期降低HEPES缓冲液中的锰阳离子的氧化。
实施例4：在连接酶-辅助的全基因组扩增中高分子量基因组DNA扩增的抑制。
将未经处理的基因组DNA的全基因组扩增反应的扩增动力学与CircLigase ITM和CircLigase IITM-处理的基因组DNA样本(100 pg样本)比较。结果说明于图7中。如在图7中描述的，CircLigase处理的基因组DNA产生对高分子量基因组DNA的扩增速率的抑制效果(不像对血浆DNA的积极影响)。抑制作用对CircLigase I和CircLigase IITM二者均是明显的。
为研究是否基于Phi29的扩增被连接酶抑制，在活性连接酶的存在下扩增未经处理的基因组DNA。实时扩增通过加入小量的SYBR green I至扩增混合物中并在Tecan读板仪上监测荧光随时间推移的增加而进行。扩增阈值是荧光升高至背景水平(2000 RFU)以上的时间。已观察到基因组DNA扩增抑制作用不是在扩增期间存在的活性连接酶的效果。
用于扩增循环超过高分子量基因组DNA的优先选择可能是某些应用的优势，因为来自血细胞的基因组DNA往往污染循环核酸的制备，因而具有较低的诊断价值。
实施例5：使用连接酶-辅助全基因组扩增的片段化DNA的单管扩增 - 在分子内连接前，使用激酶的循环DNA片段的磷酸化效果。
使用激酶的循环DNA片段的磷酸化允许更灵敏的检测血浆中的循环DNA。进行雄性-雌性血浆/血混合实验，以建立从用激酶处理的输入DAN创立的更有代表性的库，使得更敏感检测DYS14雄性-特异性标记物(图10，3/3复制，而如果未进行磷酸化，则仅有1/3被检出)。如下制备100 µL血/血浆混合物：100A：100%雄性血浆；5A-C：雄性血浆以5% v/v掺入雌性全血；1A-C：雄性血浆以1% v/v掺入雌性全血；和0A：100%雌性血。通过侧向流动穿过MF1膜(Whatman)，使血浆与血细胞分离，接着收集到经过夜干燥和贮存的纤维素垫上。然后通过改进的Wako提取仪SP试剂盒(Wako Pure Chemical Industries)，一种基于标准碘化钠/去垢剂的方法，从纤维素垫分离循环DNA。然后在GTP、锰和甜菜碱的存在下，用或不用T4多核苷酸激酶处理约1.8 ng DNA，然后用CircLigase IITM处理以环化单链DNA片段。然后使DNA经受GenomiPhi全基因组扩增(GE Healthcare)和产物通过定量PCR分析以评价两个标记物的检测：Dys14 (其是位于Y-染色体的多拷贝基因并应为可仅从雄性部分检测的)，和D16S539 (其是位于染色体16的STR位点并应为可从雄性和雌性两部分检测)。反应在单一反应容器中进行，在工作流程中无需任何中间纯化或分离步骤。这通过以相对低浓度的GTP进行磷酸化反应而完成。
图10说明，在反应中包含激酶允许环化和扩增不含有5'磷酸的池中的DNA片段，从而创立一个更具代表性的库。这将包括含有5'羟基的DNA片段，其在细胞死亡期间通过DNase II消化特异性地生成。使用雄性-雌性血浆/血混合实验，显示从用激酶处理的输入DNA创立的库是更具代表性的，允许更敏感检测DYS14雄性-特异性标记物(3/3复制，而如果未进行磷酸化，则仅有1/3被检出)。
实施例6：在环化反应前，片段化DNA的预腺苷酸化的效果。
被磷酸化或者预腺苷酸化40分钟的小的DNA片段的环化效率用不同量的CircLigase酶评价。于60℃，用增加量的CircLigase ITM或CircLigase IITM将2.5 pmol的在5'位置上含有磷酸基团或腺苷酸化的64-mer寡核苷酸处理40分钟。百分比环化通过扫描线性和环状位置谱带的强度测定。如在图12中描述，片段化DNA的预腺苷酸化改进连接和扩增动力学。在图12中，P-64mer表示5′-磷酸化的64-nt寡核苷酸；和ad-64表示预腺苷酸化64-nt寡核苷酸。预腺苷酸化DNA的环化比标准磷酸化的DNA更快。此外，连接酶(其具有低度的腺苷酸化)催化摩尔过量的底物的连接，指示连接酶具有连接预腺苷酸化DNA分子的多个机会，这增加连接动力学并潜在地允许增加更困难的模板的环化。
实施例7：使用预腺苷酸化工作流程环化含有5′-磷酸和5′-羟基的寡核苷酸。
如所指示的，于37℃，用1.25 U的T4多核苷酸激酶处理含有5 pmol的在5′位携带磷酸基团或者羟基的64-mer的寡核苷酸的反应物。用25 pmol Mth RNA连接酶于65℃孵育后，用0.25单位的虾碱性磷酸酶处理反应物。因为Mth RNA连接酶对ATP浓度是极其敏感的，在标准100 µM ATP浓度时，Mth RNA连接酶几乎排他性地腺苷酸化DNA末端。在该ATP浓度不发生经Mth RNA连接酶的分子内连接。在每次孵育后热灭活酶。最后，如所指示的用50单位的CircLigase I处理反应物并于60℃孵育60分钟。百分比环化通过扫描在线性和环状位置的谱带强度测定(图13)。P-64mer表示5＇-磷酸化64-nt寡核苷酸，而ad-64mer表示预腺苷酸化64-nt寡核苷酸。
图11显示“单管”预腺苷酸化工作流程，其中含有5′-磷酸或5′-羟基的线性寡核苷酸被转化为环状形式。在这个“单管”过程中，底物用多核苷酸激酶、Mth RNA连接酶、虾碱性磷酸酶和CircLigase ITM连续处理，而无需任何中间纯化步骤。
要求保护的发明可以其它特定形式体现，而不背离其精神或本质特征。前述实施方案是从多种形式的所有可能的实施方案或实施例选择的实施方案或实施例。因此，前述实施方案在所有的方面被认为是对本文所述的发明进行说明而非限制。虽然要求保护的发明的仅仅某些特征已经在本文图示说明并描述，要理解本领域技术人员，鉴于本公开内容的利益，将能够根据本发明的原理使用适合于这些和其它类型的应用的方法，鉴定、选择、优化或修饰合适的条件/参数。准确的用途、试剂的选择、变量如浓度、体积、孵育时间、孵育温度等的选择可很大程度取决于其预定的具体应用。因此，要理解所附权利要求书意欲覆盖落入本发明的真正精神范围内的所有修饰和变化。此外，落入权利要求书的等价物的意义和范围内的所有变化均意欲包括在其中。

Claims (32)

1.一种从线性DNA生成单链DNA环的方法，所述方法包括：
(a) 提供线性DNA；
(b) 在磷酸供体的存在下，用多核苷酸激酶孵育线性DNA，以生成具有在5´末端的磷酸基团和在3´末端的羟基的可连接的DNA序列；和
(c) 用能够进行模板-非依赖性的、分子内连接单链DNA序列的连接酶孵育所述可连接的DNA序列，以生成单链DNA环，
其中该方法的所有步骤在单一反应容器中进行，而无需任何***的分离或纯化步骤，
其中步骤(b)使用除了腺苷三磷酸或脱氧腺苷三磷酸的磷酸供体进行。
2.权利要求1的方法，其中磷酸供体选自鸟苷三磷酸、胞苷三磷酸、尿苷三磷酸、脱氧胸苷三磷酸及其组合。
3.权利要求2的方法，其中磷酸供体是鸟苷三磷酸。
4.权利要求3的方法，其中线性DNA在少于200 µM的鸟苷三磷酸的存在下用多核苷酸激酶孵育。
5.权利要求4的方法，其中线性DNA在至多30 µM的鸟苷三磷酸和至多2.5 mM的锰离子的存在下用多核苷酸激酶孵育。
6.权利要求3的方法，其还包括如果可连接的DNA序列呈现为双链形式，则在步骤(c)之前使可连接的DNA序列变性。
7.权利要求6的方法，其中所述连接酶是预腺苷酸化连接酶。
8.权利要求7的方法，其中所述预腺苷酸化连接酶是预腺苷酸化TS2126 RNA连接酶。
9.权利要求8的方法，其中步骤(a)-(c)以连续的方式在单一反应容器中进行。
10.权利要求9的方法，其中所述方法的所有步骤在腺苷三磷酸或脱氧腺苷三磷酸的不存在下进行。
11.权利要求10的方法，其中所述方法的所有步骤在HEPES缓冲液中进行。
12.权利要求1的方法，其中所述线性DNA是循环DNA、从***固定的石蜡包埋的样本分离的DNA、已暴露于环境条件的法医DNA样本或古老的DNA样本。
13.权利要求1的方法，其还包括在等温条件下扩增单链DNA环。
14.权利要求13的方法，其中单链DNA环经由滚环扩增来扩增。
15.权利要求14的方法，其中所述滚环扩增使用耐核酸酶引物进行。
16.权利要求15的方法，其中所述耐核酸酶引物包含至少一个修饰的核苷酸。
17.权利要求14的方法，其中单链DNA环使用随机引物混合物扩增。
18.权利要求14的方法，其中单链DNA环使用基本上由部分约束的引物混合物组成的引物溶液扩增，所述引物混合物包含末端错配引物-二聚体结构。
19.一种从线性DNA生成单链DNA环的方法，所述方法包括：
(a) 提供线性DNA；
(b) 任选地在腺苷三磷酸的存在下，用多核苷酸激酶孵育线性DNA，以生成具有在5＇末端的磷酸基团和在3＇末端的羟基的可连接的DNA序列；
(c) 在腺苷三磷酸的存在下，用腺苷酸化酶孵育线性DNA序列或可连接的DNA序列，以生成5＇腺苷酸化DNA序列；用磷酸酶孵育步骤(c)的包含5＇腺苷酸化DNA序列的反应混合物，以从反应混合物除去腺苷三磷酸，和
(d) 用非-腺苷酸化连接酶孵育5＇腺苷酸化DNA序列，所述连接酶能够进行模板-非依赖性分子内连接5＇腺苷酸化单链DNA序列，以生成单链DNA环，
其中所述方法的所有步骤在单一反应容器中进行，而无需任何***的分离或纯化步骤。
20.权利要求19的方法，其还包括如果5＇腺苷酸化DNA序列呈现为双链形式，则在步骤(d)之前使5＇腺苷酸化DNA序列变性。
21.权利要求20的方法，其中腺苷酸化酶是源自嗜热古细菌热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)的RNA连接酶1。
22.权利要求21的方法，其中非-腺苷酸化连接酶是突变体或工程改造的连接酶，其是腺苷三磷酸-非依赖性的且在自-腺苷酸化、脱腺苷酸化和腺苷酸转移中是有缺陷的。
23.权利要求22的方法，其中所述突变体连接酶是源自嗜热古细菌热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)的RNA连接酶1的突变体。
24.权利要求19的方法，其中非-腺苷酸化连接酶是源自栖热菌属噬菌体TS2126的TS2126 RNA连接酶。
25.权利要求24的方法，其中步骤(a)-(d)以连续的方式在单一反应容器中进行。
26.权利要求19的方法，其中所述线性DNA是循环DNA、从***固定的石蜡包埋的样本分离的DNA、已暴露于环境条件的法医DNA样本或古老的DNA样本。
27.权利要求19的方法，其还包括在等温条件下扩增单链DNA环。
28.权利要求27的方法，其中单链DNA环经由滚环扩增来扩增。
29.权利要求28的方法，其中单链DNA环使用耐核酸酶引物扩增。
30.权利要求29的方法，其中所述耐核酸酶引物包含至少一个修饰的核苷酸。
31.权利要求28的方法，其中单链DNA环使用随机引物混合物扩增。
32.权利要求28的方法，其中单链DNA环使用基本上由部分约束的引物混合物组成的引物溶液扩增，所述引物混合物包含末端错配引物-二聚体结构。
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