CN105388222A - 一种高效液相色谱同时测定龙脑、樟脑、异龙脑含量的方法 - Google Patents

Abstract

一种高效液相色谱法测定样品中龙脑、樟脑、异龙脑含量的方法，该方法是利用高效液相色谱法的色谱峰面积测定样品中龙脑、樟脑、异龙脑含量，包括：(1)确定色谱条件；(2)对照品溶液制备；(3)供试品溶液的制备；(4)测定；(5)结果计算：按照计算公式C_x＝C_R×A_X×W_R/A_R×W_X×100％计算龙脑、樟脑、异龙脑含量。本发明检测速度快、检测数据准确、重现性好、灵敏度高、专属性强、操作方法简便、检测试剂和仪器应用广泛，经过精密度试验、重复性试验、线性关系考察和加样回收试验等试验对方法进行验证，结果表明本方法准确可靠，方便快捷，成本低廉；检测范围大；灵敏度、精确性高；将广泛应用于化学分析领域。

Description

一种高效液相色谱同时测定龙脑、樟脑、异龙脑含量的方法

技术领域

本发明本发明涉及龙脑，尤其涉及高效液相色谱测定艾片及冰片等样品中龙脑、樟脑、异龙脑含量方法。

背景技术

众所周知，龙脑有d、l、dl三种旋光异构体。《中国药典》2010年版一部收载有天然冰片(右旋龙脑)、冰片(合成龙脑)与艾片(左旋龙脑)，其中的艾片为菊科植物艾纳香的新鲜叶经提取加工制成的结晶，其主要活性成分为左旋龙脑；冰片为龙脑香科植物龙脑香的树脂和挥发油加工品提取获得的半透明似梅花瓣块状、片状的结晶体，是近乎于纯粹的右旋龙脑，亦也用化学方法合成；天然冰片为天然樟科植物樟的新鲜枝、叶经提取加工制成，为白色结晶性粉末或片状结晶，主要成分为右旋龙脑。《中国药典》记载艾片、冰片、天然冰片：“辛、苦，微寒。归心、脾、肺经。其功效主治：开窍醒神，清热止痛。用于热病神昏、痉厥，中风痰厥，气郁暴厥，中恶昏迷，目赤，口疮，咽喉肿痛，耳流脓疮”。艾片、冰片临床应用极为广泛，尤其在心脑血管疾病的预防和治疗中，是开窍醒神的常用中药。

天然冰片、冰片与艾片中的标志性活性成分为龙脑，其含量通常被作为上述三种药材主要质量控制指标，目前龙脑含量测定的主要方法包括气相色谱法、衍生化高效液相色谱法、薄层色谱法、红外光谱法、紫外-可见分光光度法等。由于其具有挥发性，且没有较强的紫外吸收，其含量测定方法大多采用GC法或GC-MS法。目前，《中国药典》2010版收录天然冰片、冰片与艾片中龙脑、樟脑、异龙脑含量测定方法为气相色谱法(GC)，用于其质量控制。但GC分析成本比较高，对样品稳定性要求高，而目前报道的液相测定的柱前衍生化又增加了样品的前处理时间，而示差检测器是根据物质的折射率进行检测的，是一种通用型的检测器，可以检测紫外吸收不能响应的组分，适用范围广泛，并且其对样品的要求较低、分析成本低，可用于工业化生产的检测。中国专利数据库中也无涉及高效液相测定龙脑、樟脑、异龙脑的含量的专利，因此建立高效液相色谱示差法准确测定龙脑、樟脑、异龙脑含量的方法具有非常重要的意义。

发明内容

本发明旨在提供简便、分离效果好、精密度和准确性高的一种高效液相色谱测定龙脑、樟脑、异龙脑含量的方法，为达到上述目的，本方法采用了如下技术方案：

(1)确定色谱条件

色谱柱：C18柱；

检测器：示差检测器；

柱温：30℃～40℃；

流动相：甲醇-0.4％磷酸溶液或乙腈-磷酸水溶液

流速：0.6～1mL·min^-1；

进样量：10～20μL。

(2)对照品溶液的制备

称取龙脑、樟脑、异龙脑的对照品适量，精密称定，加甲醇制成1mg·mL^-1，作为对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备

精密称取适量供试品10mg，加甲醇溶解制备1mg·mL^-1，即得供试品溶液；

(4)测定

将对照品溶液与供试品溶液分别进行高效液相色谱检测，其中供试品溶液中待检测峰之间的分离度大于1.5，分别得到对照品溶液色谱峰与供试品溶液色谱峰，根据对照品与供试品的出峰时间来进行供试品组分的定性，通过外标法进行计算来得到待检测组分的含量；

(5)计算公式

按照以下外标法计算公式计算龙脑、樟脑、异龙脑含量：

C_x＝C_R×A_X×W_R/A_R×W_X×100％

式中：C_X为供试品的含量，

C_R为对照品的含量，

A_X为供试品的峰面积，

A_R为对照品的峰面积，

W_R为对照品的称样量，单位：mg，

W_x为供试品的称样量，单位：mg。

上述方法的流动相中为甲醇或乙腈；磷酸的分数为0.4％。

本发明采用高效液相色谱法同时检测龙脑、樟脑、异龙脑含量，不同于已有的气相色谱方法，与现有技术相比，具有检测速度快、检测数据准确、重现性好、灵敏度高、专属性强、操作方法简便、检测试剂和仪器应用广泛等特点，经过精密度试验、重复性试验、线性关系考察和加样回收试验等试验对方法进行验证，结果表明该方法准确可靠，方便快捷，成本低廉；检测范围大；灵敏度、精确性高；将广泛应用于化学分析领域中。

附图说明

图1为龙脑、樟脑、异龙脑混标高效液相色谱图；图2艾粉供试品高效液相色谱图；图3龙脑、樟脑、异龙脑混标高效液相色谱图；图4艾片高效液相色谱图；图5对照品高效液相色谱图；图6冰片(合成龙脑)高效液相色谱图。

具体实施方式

以下实施案例将有助于本发明的了解，但这些实施案例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。

实施例1

艾粉中龙脑、樟脑、异龙脑含量检测

(1)色谱条件：色谱柱：依利特C18柱；检测器：示差检测器；柱温：40℃；流动相：甲醇：磷酸水溶液为65：35，流速：1mL·min^-1。

(2)标准品溶液的制备：对照品溶液的制备：称取龙脑、樟脑、异龙脑的对照品适量，精密称定，加甲醇制成1mg·mL^-1，作为对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备：精密称取适量供试品10mg，加甲醇溶解制备1mg·mL^-1，即得供试品溶液；

(4)记录色谱图并测定：将对照品溶液与供试品溶液分别进行高效液相色谱检测，其中供试品溶液中待检测峰之间的分离度大于1.5，分别得到对照品溶液色谱峰与供试品溶液色谱峰，根据对照品与供试品的出峰时间来进行供试品组分的定性，通过外标法进行计算来得到待检测组分的含量。根据计算公式计算出的含量见表1，对照品高效液相色谱图见附图1，供试品高效液相色谱图见附图2。

表1艾粉中龙脑、樟脑、异龙脑含量测定结果

通过上述实例表明本发明稳定性好，精密度高，适用于龙脑、樟脑、异龙脑的高效液相色谱法的含量测定。

本发明方法学的建立

1.1专属性

该方法专属性强。

1.2线性范围

精密量取混合对照品溶液1、2、3、4、5、8mL分别置于10mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，配制成对照品溶液。在HPLC上进样分析并记录色谱图。分别以樟脑、龙脑、异龙脑的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行回归分析。樟脑、龙脑、异龙脑的回归方程分别为：

Y＝77727X+2635.7(R²＝0.9990)；

Y＝79415X+2756.0(R²＝0.9991)；

Y＝79284X+4796.6(R²＝0.9993)。

线性范围分别为0.205～1.535、0.207～1.554、0.214～1.607mg·mL^-1。

1.3精密度试验

精密量取混合对照品溶液1.0mL，置10mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得对照品溶液。重复进样分析6次，记录色谱图。测得樟脑、龙脑、异龙脑的峰面积的RSD分别为0.90％、1.07％和0.68％，表明进样精密度很好。

1.4重复性试验

分别精密称取艾粉样6份10mg样品，10mL色谱甲醇溶解，于上述色谱条件下测定，结果表明该样中未检出异龙脑，樟脑、龙脑平均含量为27.37％、61.83％，RSD为1.67％、1.81％。表明方法重复性良好，结果见表2。

表2样品中龙脑、樟脑、异龙脑含量重复性试验(n＝6)

1.5样品溶液稳定性考察

精密称取艾粉样10.46mg，用甲醇溶解并定容至10mL，分别于0、2、4、8、12、24h进行测定，樟脑、龙脑平均含量29.55％、61.43％，RSD为0.98％、0.95％，异龙脑含量为0。表明溶液在24h内稳定，结果见表3。

表3样品溶液稳定性考察

1.6加样回收率试验

精密称取艾粉样20.20mg，10mL甲醇溶解，摇匀，吸取5mL于100mL容量瓶，甲醇定容至刻度，分别吸取5mL于6个试管内，两份分别加入混合对照品溶液1mL(含龙脑0.100mg、樟脑0.069mg、异龙脑0.071mg)；两份分别加入混合对照品溶液1mL(含龙脑0.200mg、樟脑0.138mg、异龙脑0.143mg)；两份分别加入混合对照品溶液1mL(含龙脑0.310mg、樟脑0.207mg、异龙脑0.218mg)。进样测定，计算求得龙脑、樟脑、异龙脑的平均回收率和RSD值，结果见表4。

表4样品中龙脑、樟脑、异龙脑加样回收率试验(n＝6)

实施例2

艾片中龙脑、樟脑、异龙脑含量检测

(1)色谱条件：色谱柱：依利特C18柱，检测器：示差检测器，柱温：35℃；流动相：乙腈：0.4％磷酸溶液为55:45；流速：0.8mL·min^-1。

(2)标准品溶液的制备：对照品溶液的制备：称取龙脑、樟脑、异龙脑的对照品适量，精密称定，加甲醇制成1mg·mL^-1，作为对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备：精密称取适量供试品10mg，加甲醇溶解制备1mg·mL^-1，即得供试品溶液；

(4)记录色谱图并测定：将对照品溶液与供试品溶液分别进行高效液相色谱检测，其中供试品溶液中待检测峰之间的分离度大于1.5，分别得到对照品溶液色谱峰与供试品溶液色谱峰，根据对照品与供试品的出峰时间来进行供试品组分的定性，通过外标法进行计算来得到待检测组分的含量。结果见表5,其中艾片中龙脑含量高达95.47％，樟脑、异龙脑含量基本为0，对照品高效液相色谱图见附图3，该供试品高效液相色谱图见附图4。

表5艾片中龙脑含量测定(n＝5)

实施例3

冰片(合成龙脑)中龙脑、樟脑、异龙脑含量检测

(1)色谱条件：色谱柱：依利特C18柱；检测器：示差检测器；柱温：40℃；流动相：乙腈：0.4％磷酸溶液为55:45；流速：1mL·min^-1。

(2)标准品溶液的制备：对照品溶液的制备：称取龙脑、樟脑、异龙脑的对照品适量，精密称定，加甲醇制成1mg·mL^-1，作为对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备：精密称取适量供试品5mg，加甲醇溶解并定容至50mL，制备得0.1mg·mL^-1，即得供试品溶液；

(4)测定：将对照品溶液与供试品溶液分别进行高效液相色谱检测，其中供试品溶液中待检测峰之间的分离度大于1.5，分别得到对照品溶液色谱峰与供试品溶液色谱峰，根据对照品与供试品的出峰时间来进行供试品组分的定性，通过外标法进行计算来得到待检测组分的含量。结果见表6，对照品高效液相色谱图见附图5，该供试品高效液相色谱图见附图6。

表6冰片(合成龙脑)中龙脑、樟脑、异龙脑含量

Claims (2)

1.一种测定利用高效液相色谱法测定艾片及冰片等样品中龙脑、樟脑、异龙脑含量方法。包括：

(1)确定色谱条件

色谱柱：C18柱；

检测器：示差检测器；

柱温：30℃～40℃；

流动相：甲醇-0.4％磷酸溶液或乙腈-磷酸水溶液

流速：0.6～1mL·min^-1；

进样量：10～20μL。

(2)对照品溶液的制备

称取龙脑、樟脑、异龙脑的对照品适量，精密称定，加甲醇制成1mg·mL^-1，作为对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备

精密称取适量供试品10mg，加甲醇溶解制备1mg·mL^-1，即得供试品溶液；

(4)测定

将对照品溶液与供试品溶液分别进行高效液相色谱检测，其中供试品溶液中待检测峰之间的分离度大于1.5，分别得到对照品溶液色谱峰与供试品溶液色谱峰，根据对照品与供试品的出峰时间来进行供试品组分的定性，通过外标法进行计算来得到待检测组分的含量；

(5)计算公式

按照以下外标法计算公式计算龙脑、樟脑、异龙脑含量：

C_x＝C_R×A_X×W_R/A_R×W_X×100％

式中：C_X为供试品的含量，

C_R为对照品的含量，

A_X为供试品的峰面积，

A_R为对照品的峰面积，

W_R为对照品的称样量，单位：mg，

W_x为供试品的称样量，单位：mg。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述流动相中有机相为甲醇或乙腈，磷酸的分数为0.4％；流动相中甲醇与0.4％磷酸质量比为65∶35，乙腈—0.4％磷酸溶液为55∶45。