CN105378057A - 用于丁醇生产的甘油3-磷酸脱氢酶 - Google Patents

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Abstract

本文提供了对NADH具有增大的KM的甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)以及对NADH和NADPH具有基本上相同的亲和力和/或受到甘油-3-磷酸的反馈抑制的GPD酶。本文还提供了包含编码GPD的异源基因和编码GPD的内源基因中的缺失或破坏的重组微生物。还提供了包含编码GPD的异源基因和丁醇生物合成途径的重组微生物。还提供了生产丁醇的方法，所述方法包括提供本文所述的重组微生物以及使所述重组微生物与至少一种可发酵碳底物在其中产生丁醇的条件下接触。

Description

用于丁醇生产的甘油3-磷酸脱氢酶
相关申请的交叉引用
本专利申请要求2013年3月14日提交的美国临时申请61/782,651和2014年1月31日提交的美国临时申请61/934,096的优先权权益，所述临时申请特此以引用方式全文并入。
技术领域
本发明涉及工业微生物和丁醇及其异构体的发酵生产领域。更具体地，本发明涉及对NADH具有高KM、对NADH和NADPH具有基本上相同的亲和力的甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)和/或受到反馈抑制的GPD酶，包含此类酶的重组微生物，以及使用此类酶生产丁醇的方法。
以电子方式提交的序列表参考
与本专利申请一起提交的、以ASCII文本文件格式的电子方式提交的序列表内容(文件名：20140314_CL5707USNP_SequenceListing；大小：401,408字节，并且创建日期为：2014年3月12日)全文以引用方式并入本文。
背景技术
丁醇是一种重要的工业化学品，其可用作燃料添加剂、塑料工业中的化学原料以及食品和香料工业中的食品级萃取剂。每年，通过石油化学手段生产100至120亿磅的丁醇，并且对该日用化学品的需求未来可能还会增加。
用于化学合成异丁醇的方法是已知的，诸如羰基合成、一氧化碳的催化氢化(Ullmann′sEncyclopediaofIndustrialChemistry，第6版，Wiley-VCHVerlagGmbHandCo.，Weinheim，Germany，第5卷，第716-719页)和甲醇与正丙醇的格尔伯特缩合(Carlini等人，JMolec.CataI.A.Chem.220：215-220，2004)。这些工艺利用衍生自石油化学品的起始材料并通常昂贵，并且对环境不友好。用衍生自植物的原材料生产异丁醇将会使温室气体排放达到最低程度并将代表本领域的进步。
异丁醇作为酵母发酵的副产物或通过被修饰来表达用于生产丁醇的丁醇生物合成途径的重组工程化的微生物以生物方式产生。参见例如美国专利7,851,188，其全文以引用方式并入本文。作为“杂醇油”的一种组分，杂醇油由真菌对氨基酸的不完全代谢形成，由L-缬氨酸的分解代谢特异性地产生异丁醇。在L-缬氨酸的胺基团作为氮源被获得后，所得的α-酮酸被酶脱羧并还原成异丁醇，这就是所谓的Ehrlich途径(Dickinson等人，JBiol.Chem.273：25752-25756，1998)。
酵母丁醇生产中的关键收率损失机制之一是碳和还原等效物的损失，其因磷酸二羟丙酮至甘油的转化而偏离糖酵解。该转化中的第一步骤由被称为甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)的酶催化。先前已提出在生产丁醇的酵母中除去GPD和因此导致的甘油产生。然而，甘油是生长所需要的并且为渗透压保护剂。
因此，增加丁醇收率并降低甘油产生的方法代表本领域的进步。
发明内容
本文提供了GPD酶、重组微生物、以及用于生产丁醇的方法。
本文提供了包含以下的重组微生物：(a)包含至少一种对该重组微生物是异源的多肽的工程化丁醇生物合成途径；(b)异源甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)，其中与微生物的内源GPD的KM相比，异源GPD对NADH具有更高的KM；以及(c)编码GPD的内源基因中的缺失或破坏。在一些实施例中，与不含异源GPD的对照重组微生物相比，该重组微生物具有改善或提高的丁醇生产。在一些实施例中，与不含异源GPD的对照重组微生物相比，该重组微生物具有减小或降低的甘油产生。在一些实施例中，与不含异源GPD的对照重组微生物相比，该重组微生物丁醇与甘油摩尔比。在一些实施例中，与不含异源GPD的对照重组微生物相比，该重组微生物具有增大的有效收率。
本文还提供了包含以下的重组微生物：(a)包含至少一种对该重组微生物是异源的多肽的工程化丁醇生物合成途径；(b)异源甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)，其中异源GPD对NADH和NADPH具有基本上相同的亲和力和/或受到反馈抑制；以及(c)编码GPD的内源基因中的缺失或破坏。在一些实施例中，与不含异源GPD的对照重组微生物相比，该重组微生物具有改善的丁醇生产。任选地，异源GPD受甘油-3-磷酸的反馈抑制。在一些实施例中，与不含异源GPD的对照重组微生物相比，该重组微生物具有减小或降低的甘油产生。在一些实施例中，与不含异源GPD的对照重组微生物相比，该重组微生物具有增大的丁醇与甘油摩尔比。在一些实施例中，与不含异源GPD的对照重组微生物相比，该重组微生物具有增大的有效收率。
在某些实施例中，异源GPD是天然存在的GPD。在某些实施例中，天然存在的GPD选自EC编号1.1.1.8、1.1.5.3、或1.1.1.94。天然存在的GPD可为来自选自以下的生物体的GPD：墨西哥利什曼原虫(Leishmaniamexicana)、绿色杜氏藻(Dunaliellaviridis)、埃及跳鼠(Jaculusorientalis)、闪烁古生球菌(Archeoglobusfulgidus)、普氏立克次体(Rickettsiaprowazekii)、白色贝日阿托菌(Beggiatoaalba)、韩国康氏菌(Kangiellakoreenis)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、皱状假丝酵母(Candidaversatilis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、以及穴兔(Oryctolaguscuniculu)。
在某些实施例中，异源GPD是工程化GPD。工程化GPD可包含对应于SEQIDNO：195的位置42、44、45、71、73、75、95、124、126、129、151、152、183、184、185、246、310、336、337、或339的至少一个取代。在某些实施例中，工程化GPD包含位于对应于SEQIDNO：195的位置73的残基处的至少一个取代。在某些实施例中，工程化GPD包含位于对应于SEQIDNO：195的位置129的残基处的至少一个取代。在某些实施例中，工程化GPD包含位于对应于SEQIDNO：195的位置73的残基处的至少一个取代和位于对应于SEQIDNO：195的位置129的残基处的取代。
还提供了工程化甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)。在某些实施例中，工程化GPD酶与SEQIDNO：195具有至少85％的同一性。在某些实施例中，工程化GPD酶包含位于对应于SEQIDNO：195的位置42、44、45、71、73、75、95、124、126、129、151、152、183、184、185、246、310、336、337、或339的残基处的至少一个取代。在某些实施例中，工程化GPD酶包含对应于SEQIDNO：195的位置73的至少一个取代。在某些实施例中，工程化GPD酶包含对应于SEQIDNO：195的位置129的至少一个取代。在某些实施例中，工程化GPD酶包含对应于SEQIDNO：195的位置73的至少一个取代和对应于SEQIDNO：129的位置129的取代。在某些实施例中，工程化GPD酶对NADH的KM为约0.01mM至1mM。
还提供了包含本文公开的工程化GPD酶中的任一个的重组微生物。任选地，该重组微生物可包含工程化丁醇生物合成途径，该途径包含至少一个对该重组微生物是异源的基因。该重组微生物可例如包含编码GPD的内源基因的缺失或破坏。在某些实施例中，与不含工程化GPD酶的微生物相比，该重组微生物具有改善或提高的丁醇生产。在一些实施例中，与不含工程化GPD的对照重组微生物相比，该重组微生物具有减小或降低的甘油产生。在一些实施例中，与不含工程化GPD的对照重组微生物相比，该重组微生物具有增大的丁醇与甘油摩尔比。在一些实施例中，与不含工程化GPD的对照重组微生物相比，该重组微生物具有增大的有效收率。
还提供了用于生产丁醇的方法。该方法包括：提供重组微生物，该重组微生物包含(i)工程化丁醇生物合成途径，(ii)编码GPD的内源基因中的缺失或破坏，以及(iii)以下中的至少一种(a)工程化GPD酶；(b)异源甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)，其中与微生物的内源GPD的KM相比，异源GPD对NADH具有更高的KM，或(c)异源GPD，其中异源GPD对NADH和NADPH具有基本上相同的亲和力和/或受到反馈抑制；以及使该重组微生物与至少一种可发酵碳底物在其中产生丁醇的条件下接触。任选地，异源GPD受甘油-3-磷酸的反馈抑制。在某些实施例中，使重组微生物在厌氧条件下生长。
重组微生物可包含选自以下的工程化丁醇生物合成途径：(a)1-丁醇生物合成途径；(b)2-丁醇生物合成途径；以及(c)异丁醇生物合成途径。
任选地，1-丁醇生物合成途径包含执行以下底物至产物转化中的一个的至少一种多肽：(a)乙酰-CoA至乙酰乙酰-CoA，如由乙酰-CoA乙酰转移酶催化；(b)乙酰乙酰-CoA至3-羟丁酰-CoA，如由3-羟丁酰-CoA脱氢酶催化；(c)3-羟丁酰-CoA至巴豆酰-CoA，如由巴豆酸酶催化；(d)巴豆酰-CoA至丁酰-CoA，如由丁酰-CoA脱氢酶催化；(e)丁酰-CoA至丁醛，如由丁醛脱氢酶催化；以及(f)丁醛至1-丁醇，如由1-丁醇脱氢酶催化。
任选地，2-丁醇生物合成途径包含执行以下底物至产物转化中的一个的至少一种多肽：(a)丙酮酸至α-乙酰乳酸，如由乙酰乳酸合酶催化；(b)α-乙酰乳酸至乙偶姻，如由乙酰乳酸脱羧酶催化；(c)乙偶姻至2，3-丁二醇，如由丁二醇脱氢酶催化；(d)2，3-丁二醇至2-丁酮，如由丁二醇脱水酶催化；以及(e)2-丁酮至2-丁醇，如由2-丁醇脱氢酶催化。
任选地，异丁醇生物合成途径包含执行以下底物至产物转化中的一个的至少一种多肽：(a)丙酮酸至乙酰乳酸，如由乙酰乳酸合酶催化；(b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸，如由酮醇酸还原异构酶催化；(c)2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸，如由二羟酸脱水酶催化；(d)α-酮异戊酸至异丁醛，如由支链酮酸脱羧酶催化；以及(e)异丁醛至异丁醇，如由支链醇脱氢酶催化。
在某些实施例中，重组微生物来自选自以下的属：梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、志贺氏菌属(Shigella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、假丝酵母属(Candida)、酒香酵母属(Brettanomyces)、管囊酵母属(Pachysolen)、汉逊酵母属(Hansenula)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、丝孢酵母属(Trichosporon)、Yamadazyma、和酵母属(Saccharomyces)。
还提供了包括以下的重组微生物：(a)异源甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)，其中与微生物的内源GPD的KM相比，异源GPD对NADH具有更高的KM；以及(b)编码GPD的内源基因中的缺失或破坏。在一些实施例中，与不含异源GPD的对照重组微生物相比，该微生物具有降低的甘油产生。
还提供了包含以下的重组微生物：(a)异源甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)，其中异源GPD对NADH和NADPH具有基本上相同的亲和力和/或受到反馈抑制；以及(b)编码GPD的内源基因中的缺失或破坏。任选地，异源GPD受甘油-3-磷酸的反馈抑制。在一些实施例中，与不含异源GPD的对照重组微生物相比，该微生物具有降低的甘油产生。
还提供了包含异源GPD的重组微生物，其中异源GPD对NADH和NADPH具有基本上相同的亲和力和/或受到反馈抑制，并且其中与不含异源GPD的对照重组微生物相比，该重组微生物具有降低的甘油产生。任选地，异源GPD受甘油-3-磷酸的反馈抑制。
附图说明
图1示出用于在大肠杆菌中表达变体GPD蛋白的质粒的图谱。
图2示出人截短的(SEQIDNO：190)、酿酒酵母(GPD1)(SEQIDNO：191)、普氏立克次体(SEQIDNO：192)、白色贝日阿托菌(SEQIDNO：193)、以及韩国康氏菌(SEQIDNO：194)的GPD序列的部分比对星号(*)指示phe41和phe97在人截短序列中的位置。
图3示出展示所指示的GPD1变体和对照细胞培养物的20小时生产数据的图。每个变体的两个克隆一式两份进行测试。2145：具有WTGPD的异丁醇原(isobutanologen)对照菌株，其为用pLMH11-JM44转化的PNY2145；EC_1和EC_2：大肠杆菌优化的GPD；E3和E8：大肠杆菌优化的GPD1变体；N3和N8：酵母天然密码子使用GPD变体；M3和M8：酵母密码子优化的GPD变体。变体E3、N3和M3具有F73A取代并且变体E8、N8和M8具有F73G/F129G取代。
图4示出展示异丁醇(iBuOH)/甘油(Gly)比率与所测量的GPD活性(U/mg)的比较的图。iBuOH/Gly比率的回归方程等于2.93_234GPD(U/mg)(R-Sq＝60.1％；R-Sq(pred)＝25.04％)。
图5示出展示所测量的异丁醇滴度与通过线性回归方程(FIT_2)(S＝0.159277；R-Sq＝98.6％；R-Sq(adj)＝97.6％；PRESS＝0.415575；R-Sq(pred)＝94.32％)计算的值的比较的图。用于回归方程的常数和系数在表12中提供。
图6示出展示异丁醇收率(异丁醇克数/所消耗的葡萄糖克数)与通过线性回归方程(FIT_4)(S＝0.0101071；R-Sq＝93.9％；R-Sq(adj)＝91.4％；PRESS＝0.00197878；R-Sq(pred)＝76.30％)计算的值的比较的图。用于回归方程的常数和系数在表13中提供。图7示出CPN97和PNY2310异丁醇原菌株在28和42小时的异丁醇收率(所产生的异丁醇克数/所消耗的葡萄糖克数)的图。
图8示出CPN97和PNY2310异丁醇原菌株在28和42小时的异丁醇/甘油比率的图。
图9示出CPN97和PNY2310异丁醇原菌株的所消耗葡萄糖随时间变化的图。
具体实施方式
除非另外定义，本文所用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一样。如发生矛盾，包括定义的本专利申请将占支配地位。此外，除非上下文另外需求，单数术语将包括复数且复数术语将包括单数。本文提及的所有公布、专利和其它参考文献出于各种目的全文以引用方式并入本文，如同每一单独的公布或专利申请均特定且个别地以引用方式并入一样，除非仅专利或专利申请的特定部分被提及以引用方式并入本文。
为了进一步明确本发明，提供下列术语、缩写和定义。
应当理解，“来源于”在关于本文所公开的多肽时涵盖了基于所指示的生物中存在的GPD或其它酶的氨基酸序列合成的序列以及直接从所述生物体的遗传物质克隆的那些。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或它们的任何其他变型将被理解为是指包括指定的整数或整数组但不排除任何其它整数或整数组并且旨在是非排他性的或端值开放性的。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可以包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非明确指明相反，“或”是指包含性的“或”而非排他性的“或”。例如，条件A或B满足下列任一项：A为真实的(或存在的)且B为虚假的(或不存在的)，A为虚假的(或不存在的)且B为真实的(或存在的)，以及A和B均为真实的(或存在的)。
如本文所用，如整个说明书和权利要求中所使用的，术语“由...组成”或诸如“由...组成的”的变型指示包括任何列举的整数或整数组，但是没有另外的整数或整数组能够被加入到指定的方法、结构、或组合物中。
如本文所用，如整个说明书和权利要求中所使用的，术语“基本上由...组成”或诸如“基本上由...组成”的不同时态的变型表明包括任何列举的整数或整数组，并且任选地包括未显著改变指定的方法、结构或组合物的基本或新颖特性的任何列举的整数或整数组。参见M.P.E.P.§2111.03。
此外，涉及元素或组分例子(即出现)的数目在本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在为非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。
如本文所用，术语“发明”或“本发明”是非限制性术语，并且不旨在指本发明的任何单独实施例，而是涵盖如(所提出的或以后所修订的和补充的)权利要求中或本说明书中所述的所有可能的实施例。
如本文所用，修饰本发明的成分或反应物的量使用的术语“约”是指可以通过例如以下方式而发生的用数字表示的量的变化：在真实世界中用在产生浓缩物或溶液的一般测定和液体处理操作；在这些过程中的无意误差；
用于制备组合物或执行方法的成分的制造、来源或纯度中的差异；等等。术语“约”还包括由于相对于由特定起始混合物所得的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否由术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。在一个实施例中，术语“约”指在报告数值的10％范围内，或在报告数值的5％范围内。
如本文所用术语“丁醇生物合成途径”是指产生1-丁醇、2-丁醇或异丁醇的酶途径。
术语“1-丁醇生物合成途径”是指产生1-丁醇的酶途径。“1-丁醇生物合成途径”可指从乙酰-辅酶A(乙酰-CoA)产生1-丁醇的酶途径。例如，1-丁醇生物合成途径在美国专利申请公布2008/0182308和国际公布WO2007/041269中公开，它们全文以引用方式并入本文中。
术语“2-丁醇生物合成途径”是指产生2-丁醇的酶途径。“2-丁醇生物合成途径”可指从丙酮酸产生2-丁醇的酶途径。例如，2-丁醇生物合成途径在美国专利8,206,970、美国专利申请公布2007/0292927、国际公布WO2007/130518和WO2007/130521中公开，它们全文以引用方式并入本文中。
术语“异丁醇生物合成途径”是指产生异丁醇的酶途径。“异丁醇生物合成途径”可指从丙酮酸产生异丁醇的酶途径。例如，异丁醇生物合成途径在美国专利7,851,188、美国申请公布2007/0092957和国际公布WO2007/050671中公开，它们全文以引用方式并入本文中。有时“异丁醇生物合成途径”与“异丁醇生产途径”同义地被使用。
如本文所用，术语“丁醇”是指呈单独或其混合物形式的丁醇异构体1-丁醇(1-BuOH)、2-丁醇(2-BuOH)、叔丁醇(t-BuOH)和/或异丁醇(iBuOH或i-BuOH，也称为2-甲基-1-丙醇)。如本文所用，术语“生物丁醇”和“生物生产的丁醇”有时可与“丁醇”同义使用。
丁醇的用途可包括但不限于燃料(例如，生物燃料)、燃料添加剂、用于制备可被用作柴油或生物柴油燃料的酯的醇、塑料工业中的化学品、配制产品诸如化妆品中的成分和化学中间体。丁醇还可被用作油漆、涂料、清漆、树脂、树胶、染料、脂肪、蜡类、树脂、紫胶、橡胶和生物碱的溶剂。
如本文所用，术语“生物生产的”是指分子(例如，丁醇)由可再生来源生产(例如，分子可在发酵过程期间由可再生原料生产)。因此，例如，生物生产的异丁醇可为通过发酵过程由可再生原料生产的异丁醇。由可再生来源生产的分子还可通过14C/12C同位素比率定义。在1∶0至大于0∶1范围内的14C/12C同位素比率指示生物生产的分子，而0∶1的比率指示分子是来源于化石的。
包含“工程化的醇生产途径”(诸如工程化的丁醇或异丁醇生产途径)的重组宿主细胞是指包含经修饰的途径的宿主细胞，该经修饰的途径以与宿主细胞中通常存在的途径不同的方式生产醇。此类差异包括生产通常宿主细胞不生产的醇，或者提高产量或更有效地生产。
如本文所用，术语“异源的生物合成途径”是指用于生产产物的酶途径，其中酶中的至少一种对于包含该生物合成途径的宿主细胞而言不是内源性的。
如本文所用，术语“提取剂”是指能够用于从发酵液体培养基中提取醇(例如，丁醇)的一种或多种有机溶剂。
如本文所用，术语“有效异丁醇产量”是指每克细胞生产的异丁醇的总量(克)。
如本文所用，术语“有效滴度”是指每升发酵培养基通过发酵生产的特定醇(例如丁醇)的总量。丁醇的总量包括：(i)发酵培养基中丁醇的量；(ii)从有机萃取剂中回收的丁醇的量；以及(iii)如果采用汽提，从气相中回收的丁醇的量。
如本文所用，术语“有效速率”是指每升发酵培养基通过发酵每小时发酵产生的醇(例如，丁醇)的总量。
如本文所用，术语“有效收率”是指生物催化剂消耗每单位可发酵碳底物产生的醇(例如，丁醇)的量。
如本文所用，术语“分离”与“回收”同义，是指从初始混合物中除去化合物以获得纯度或浓度比初始混合物中的化合物纯度或浓度更高的化合物。
如本文所用，术语“水相”是指通过使发酵液体培养基接触与水不混溶的有机提取剂而获得的两相混合物中的水相。在本文所述包括发酵提取的方法的一个实施例中，术语“发酵液体培养基”具体地指在双相发酵提取中的水相。
如本文所用，术语“有机相”是指通过使发酵液体培养基接触与水不混溶的有机提取剂而获得的双相混合物中的非水相。
术语“碳底物”或“可发酵的碳底物”是指本发明的宿主生物体能够代谢的碳源，和尤其是选自单糖、低聚糖、多糖、和单碳底物或它们的混合物的碳源。本文提供了碳底物的非限制性例子，包括但不限于单糖、二糖、低聚糖、多糖、乙醇、乳酸盐、琥珀酸盐、甘油、二氧化碳、甲醇、葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、木糖、***糖、右旋糖、纤维素、甲烷、氨基酸、或它们的混合物。
如本文所用，“发酵液体培养基”是指水、糖(可发酵碳源)、溶解的固体(如果存在)、产生醇的微生物、产物醇及所有其他物质组分的混合物，其中产物醇通过在微生物存在的情况下使糖反应生成醇、水和二氧化碳(CO2)而制得。如本文所用，术语“发酵培养基”和“发酵混合物”有时可与“发酵液体培养基”同义使用。
如本文所用，“发酵罐”是指用于发酵底物的任何一个或多个容器、或设备。发酵罐可包含发酵培养基和能够发酵的微生物。术语“发酵容器”是指在其中进行发酵反应，由此制备醇诸如丁醇的容器。“发酵罐”在本文可与“发酵容器”互换使用。
术语“发酵产物”包括所关注的任何所需的产物，包括但不限于1-丁醇、2-丁醇、异丁醇等。
如本文所用的“生物质”是指包含可水解的淀粉的天然产物，其提供了可发酵的糖，包括任何纤维素或木质纤维素材料，以及包含纤维素的材料，并任选地还包括半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖、二糖、和/或单糖。生物质还可包含附加组分，诸如蛋白质和/或脂质。生物质可来源于单一来源，或生物质可包括来源于多于一种来源的混合物。例如，生物质可包括玉米芯和玉米秸秆的混合物，或草和叶片的混合物。生物质包括但不限于生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的例子包括但不限于：玉米粒、玉米芯、作物残余物诸如玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、裸麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、大豆、获取自谷物、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木及灌丛、蔬菜、水果、花和动物性杂肥、以及它们的混合物的研磨物的组分。
如本文所用，“原料”是指包含可发酵碳源的产物。合适的原料包括但不限于黑麦、小麦、玉米、玉米醪、甘蔗、甘蔗醪、甘蔗、大麦、纤维素材料、木质纤维素材料、以及它们的混合物。
如本文所用，在一些情况下，术语“生物质”是指培养物的质量，例如，重组微生物的量，通常以每升细胞干重(dcw)的克数(g/l)的单位提供。
如本文所用术语“有氧条件”是指氧气存在下的生长条件。
如本文所用，术语“微氧条件”是指具有低水平的氧气(即低于正常的大气氧气水平)的生长条件。
如本文所用术语“厌氧条件”是指不存在氧气时的生长条件。
术语“多核苷酸”旨在包括单数的核酸以及复数的核酸，并且是指核酸分子或构建体例如信使RNA(mRNA)或质粒DNA(PDNA)。多核苷酸可包含全长cDNA序列的核苷酸序列，或其片段，包括非翻译的5′和3′序列以及编码序列。所述多核苷酸可由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸构成，其可为非改性的RNA或DNA，或改性的RNA或DNA。例如，多核苷酸可由如下构成：单链和双链DNA(DNA即为单链和双链区域的混合物)；单链和双链RNA(RNA即为单链和双链区域的混合物)；包含DNA和RNA的杂合分子，其可为单链或，更典型地双链或单链和双链区域的混合物。“多核苷酸”包含了化学地、酶学地、或代谢地修饰的形式。
多核苷酸序列可意为“分离的”，其中它从其天然的环境中移除出来。例如，包含在载体中的编码具有ALS活性的多肽或多肽片段的异源性多核苷酸，出于本发明的目的可被认为是分离的。分离的多核苷酸的另外例子包括在异源宿主细胞中维持的重组多核苷酸或在溶液中的(部分或基本上)纯化的多核苷酸。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的此类分子。DNA聚合物形式的分离的多核苷酸片段可以由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构成。
如本文所用，“降低的活性”是指与导致该降低的活性的变化之前多肽的相同的生物活性相比，该多肽的已知的生物活性的任何可测量的下降。此类变化可包括多肽或编码多肽的多核苷酸的修饰，如本文所述。本文所公开的多肽的降低的活性可通过本领域熟知的和本文所公开的方法测定。酶的降低的活性是指与野生型酶的活性相比，酶活性的部分或总体下调。下调可在天然基因具有“破坏”或“修饰”时发生，“破坏”或“修饰”是指在该基因的部分中的***、缺失、或定向突变，所述破坏”或“修饰”导致例如整个基因敲除使得该基因从基因组中缺失并且不翻译出蛋白质，或导致翻译的亚单位蛋白质具有***、缺失、氨基酸取代或其他定向突变。蛋白质中的修饰位置可以是在例如蛋白质的N-末端部分中或在蛋白质的C-末端部分中。相对于未受破坏的蛋白质，修饰的蛋白质将具有削弱的活性，并且可能是无功能的。酶的降低的活性也可通过操纵上游调控结构域或通过使用有义、无义或RNAi技术等造成。降低酶活性的另一个机制是引入突变，突变改变了酶的动力学特性(例如，减小对底物的亲和力、降低kcat等)。
如本文所用，“消除的活性”是指与导致该消除的活性的变化之前多肽的相同的生物活性相比，该多肽的已知的生物活性的完全消失。此类变化可包括多肽或编码多肽的多核苷酸的修饰，如本文所述。
消除的活性包括与导致该消除的活性的变化之前多肽的相同的生物活性相比，该多肽的不能被测量到的生物活性。本文所公开的多肽的消除的活性可通过本领域熟知的和本文所公开的方法测定。
如本文所用，术语“PDC-”、“PDC敲除”、或“PDC-KO”是指具有灭活或降低编码丙酮酸脱羧酶(PDC)的基因的表达的基因修饰，从而使该细胞基本上或完全缺乏丙酮酸脱羧酶酶活性的细胞。如果所述细胞具有多于一种的表达的(活性的)PDC基因，则活性PDC基因中的每个可被灭活或具有最小的表达从而产生PDC-细胞。
如本文所用术语“比活性”定义为给定量的蛋白质的活性单位。因此，所述比活性不是直接测定的，而是通过1)酶样品的活性，以单位/ml表示，除以2)该样品中蛋白质的浓度计算得到的，因此比活性的单位表示为单位/mg，其中酶单位定义为所形成产物的摩尔/分钟。纯的、完全活性的酶样品的比活性是这个酶的性质。蛋白质混合物样品的比活性是由受关注的活性酶构成的样品中蛋白质的相对分数的量度。
术语“kcat”和“KM”是本领域的技术人员已知的并且在EnzymeStructureandMechanism，第2版(Ferst；W.H.FreemanPress，NY，1985；第98-120页)中有所描述。米氏常数KM是导致半-最大速度的底物浓度。术语“kcat”常称为“转换数”，定义为每个活性位点每单位时间底物分子转化为产物的最大数，或者每单位时间的酶转化次数。kcat＝Vmax/[E]，其中[E]是酶浓度(Ferst，同上)。术语“总转换”和“总转换数”本文用于指酶与底物反应形成的产物的量。
术语“催化效率”定义为酶的kcat/KM。“催化效率”用于定量酶对底物的特异性。
术语“分离的核酸分子”、“分离的核酸片段”和“基因构建体”互换使用，并指单链或双链的RNA或DNA聚合物，任选包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的核酸片段可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构成。
术语“氨基酸”是指蛋白质或多肽的基本化学结构单元。本文使用表1中的缩写来表示具体氨基酸。
表1：氨基酸及其缩写。
氨基酸 三字母缩写 单字母缩写
丙氨酸 Ala A
精氨酸 Arg R
天冬酰胺 Asn N
天冬氨酸 Asp D
半胱氨酸 Cys C
谷氨酰胺 Gln Q
谷氨酸 Glu E
甘氨酸 Gly G
组氨酸 His H
异亮氨酸 Ile I
亮氨酸 Leu L
赖氨酸 Lys K
甲硫氨酸 Met M
苯丙氨酸 Phe F
脯氨酸 Pro P
丝氨酸 Ser S
苏氨酸 Thr T
色氨酸 Trp W
酪氨酸 Tyr Y
缬氨酸 Val V
术语“基因”指能够被表达为特定蛋白质的核酸片段，其任选包括编码序列前的调控序列(5′非编码序列)和编码序列后的调控序列(3′非编码序列)。“天然基因”是指天然存在的具有其自己的调控序列的基因。“嵌合基因”指不是天然基因的任何基因，包含在天然情况下不是一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包括源于不同来源的调控序列和编码序列，或者包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。“内源基因”指在微生物基因组中处于其天然位置的天然基因。“外来”基因是指正常情况下不存在于宿主微生物体内，而是通过基因转移被导入宿主微生物体内的基因。外来基因可以包括***到非天然微生物体内的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法导入基因组中的基因。
如本文所用，“天然的”是指多核苷酸、基因或多肽的形式与天然存在的一样，带有其自身的调控序列(如果存在调控序列)。
如本文所用，术语“编码序列”或“编码区”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。
如本文所用，“内源”是指多核苷酸、基因或多肽在生物体内或在生物体的基因组中的其天然位置中的天然形式。“内源多核苷酸”包括在生物体的基因组中的其天然位置中的天然多核苷酸。“内源基因”包括在生物体的基因组中的其天然位置中的天然基因。“内源多肽”包括从在生物体的基因组中的其天然位置中的天然多核苷酸或基因转录并翻译的、在生物体内的其天然位置中的天然多肽。
术语“异源”在用于提及多核苷酸、基因、或多肽时是指通常不存在于宿主生物体中的多核苷酸、基因、或多肽。“异源”也包括天然编码区、或它们的部分，即以不同于对应的天然基因的形式重新导入源生物体内，例如，不在所述生物体的基因组中的其天然位置中。异源多核苷酸或基因可通过例如基因转移的方式被导入宿主生物体内。异源基因可包括具有被重新导入天然宿主中的非天然调控区的天然编码区。例如，异源基因可包括被重新导入天然宿主中的天然编码区，所述天然编码区为包括非天然的调控区的嵌合基因的一部分。“异源多肽”包括天然多肽，其以不同于对应的天然多肽的形式被重新导入源生物体内。“异源”多肽或多核苷酸也可包括工程化多肽或多核苷酸，其包含与“天然”多肽或多核苷酸的差异，例如，内源多核苷酸内的点突变可导致产生“异源”多肽。如本文所用，“嵌合基因”、“外来基因”和“转基因”可全部为“异源”基因的例子。
“转基因”是已通过转化方法被导入基因组中的基因。
如本文所用，术语“修饰”是指本文所公开的多核苷酸的改变，所述改变导致由所述多核苷酸编码的多肽活性降低或被消除，以及本文所公开的多肽的改变，所述改变导致该多肽活性降低或被消除。此类改变可通过本领域熟知的方法实现，包括但不限于缺失、突变(例如，自发诱变、随机诱变、由突变基因导致的诱变、或转座子诱变)、取代、***、下调、改变细胞定位、改变多核苷酸或多肽的状态(例如，甲基化、磷酸化或泛素化)、移除辅因子、反义RNA/DNA的导入、干扰RNA/DNA的导入、化学修饰、共价修饰、用UV或X-射线照射、同源重组、有丝***重组、启动子置换法、和/或它们的组合。通过将特定多核苷酸或多肽的序列与同源的多核苷酸或多肽(例如酵母或细菌的)的序列进行比较，并使高度同源区域(保守区域)或共有序列中进行的修饰的数量最大化，可发现用以确定哪些核苷酸或氨基酸残基可被修饰的指导。
术语“重组基因表达元件”是指表达一个或多个特异性蛋白质的核苷酸片段，其包括蛋白质编码序列前的调控序列(5′非编码序列)和蛋白质编码序列后的调控序列(3′终止序列)。嵌合基因是重组基因表达元件。操纵子的编码区可形成重组基因表达元件，一起的还有可操作地连接的启动子和终止区。
“调控序列”指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译的核苷酸序列。调控序列可包括启动子、增强子、操纵子、抑制子、转录终止信号、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。
术语“启动子”是指能够控制编码序列或功能RNA表达的核酸序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可全部来源于天然基因、或由来源于天然存在的不同启动子的不同元件构成、或甚至包含合成的核酸片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件或生理条件而指导基因的表达。通常将在大多数细胞类型中、在大多数情况下引起基因表达的启动子称为“组成型启动子”。另一方面，“诱导型启动子”在所述启动子被启动子特异的信号或分子诱导或打开时导致基因表达。还应认识到因为在大多数情况下还不能完全限定调控序列的确切范围，不同长度的DNA片段可具有相同的启动子活性。例如，应当理解，“FBA1启动子”可被用于指来源于FBA1基因的启动子区的片段。
如本文所用，术语“终止子”是指位于编码序列下游的DNA序列。这包括多腺苷酸化识别序列和编码能够影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其它序列。多腺苷酸化信号的特征通常在于影响多腺苷酸片至mRNA前体的3′末端的添加。3′区可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。已经认识到，因为在大多数情况下还不能完全限定调控序列的确切范围，不同长度的DNA片段可具有相同的终止子活性。例如，应当理解，“CYC1终止子”可用于指来源于CYC1基因终止子区的片段。
术语“可操作地连接”指核酸序列在单个核酸片段上的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以按有义或反义的取向可操作地连接到调控序列。
如本文所用，术语“表达”指源于本发明核酸片段的有义RNA(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。
如本文所用，术语“过表达”是指比相同的或相关的基因的内源性表达更高的表达。如果异源基因的表达比可比较的内源基因的表达更高，则所述异源基因是过表达的。
术语过表达是指在宿主细胞中核酸或蛋白质水平的增加。因此，可通过增加宿主细胞中内源性的序列的转录或翻译水平、或将异源性序列导入宿主细胞中导致过表达。也可通过增加核酸或蛋白质序列的稳定性导致过表达。
如本文所用，术语“转化”是指将核酸片段转移到宿主微生物的基因组中，导致基因稳定遗传。包含转化的核酸片段的宿主微生物被称为“转基因”或“重组”或“转化的”微生物。
术语“质粒”、“载体”和“盒”指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA片段的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状)，其中多个核苷酸序列已连接或重组到独特构建体中，该独特构建体能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列连同适当的3′端非翻译序列一起导入细胞中。“转化盒”指含有外来基因并且除了该外来基因外还具有有利于特定宿主细胞转化的元件的特定载体。“表达盒”指包含外来基因并且除了该外来基因以外还具有使得该基因在外来宿主中的表达增强的元件的特定载体。
如本文所用，术语“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。技术人员将充分意识到：特定宿主细胞在使用核苷酸密码子以确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏好性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，希望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。
术语“密码子优化的”在其涉及用于转化不同宿主的核酸分子的基因或编码区时，是指在不改变由DNA编码的多肽的情况下，改变核酸分子的基因或编码区中的密码子以反映宿主生物体通常的密码子使用。此类优化包括用一种或多种在该生物的基因中更经常被使用的密码子，替代至少一种、或多于一种、或显著数量的密码子。
在包含编码任何多肽链的氨基酸的密码子的核苷酸序列中的差异使得在编码所述基因的序列中发生突变。因为每个密码子由三个核苷酸组成，并且包含DNA的核苷酸限于四个特定碱基，有64个可能的核苷酸组合，它们中的61个编码氨基酸(剩余的三个密码子编码翻译终止信号)。示出哪个密码子编码哪个氨基酸的“遗传密码”在本文重制为表2A。因此，许多氨基酸被分配了多于一种的密码子。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由四个核苷酸三联体编码，丝氨酸和精氨酸由六个核苷酸三联体编码，而色氨酸和甲硫氨酸仅由一个核苷酸三联体编码。这种简并性允许DNA碱基组合发生广泛范围的改变，并且不改变由该DNA编码的蛋白质的氨基酸序列。
表2A：标准遗传密码
对于使用特定密码子来编码特定氨基酸在延伸中的肽链中的***，许多生物表现出偏倚。密码子偏爱、或密码子偏好性，生物之间密码子使用的差异是由遗传密码的简并性提供的，并且在许多生物中已被很好地描述。密码子偏好性经常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关联，所述翻译效率反过来据信依赖于，特别是，被翻译的密码子的特性和特定转运RNA(tRNA)分子的可用性。细胞中选择的优势tRNA一般是在肽合成中最频繁使用的密码子的反映。相应地，能够基于密码子优化对基因进行加工，以使在给定生物中的基因表达最优化。
如果大量基因序列可用于广泛的动物、植物和微生物物种，计算密码子使用的相关频率是可能的。密码子使用表是容易获得的，例如，从可以在http：//www.kazusa.or.jp/codon/获得(2008年3月20日访问)的“密码子使用数据库”，并且这些表可以多种方式被改编。参见Nakamura，Y.等人，Nucl.AcidsRes.28：292(2000)。从GenBankRelease128.0[2002年2月15日]计算的酵母的密码子使用表被重制为下文的表2B。这个表使用mRNA命名，并且因此取代了存在于DNA中的胸腺嘧啶(T)，所述表使用存在于RNA中的尿嘧啶(U)。表2B经过了调整，因此计算了每个氨基酸的频率，而非全部64个密码子。
表2B：酿酒酵母的密码子使用表
通过利用这个表或相似的表，本领域的普通技术人员可将所述频率应用于任何给定的多肽序列，并且产生密码子优化的编码区的核酸片段，其编码所述多肽，但是使用给定物种的最优密码子。
以最优频率随机分配以编码给定多肽序列的密码子可通过计算每个氨基酸的密码子频率人工完成，然后将所述密码子随机分配到多肽序列。此外，多个算法和计算机软件程序是本领域的普通技术人员易得的。例如，可得自DNAstar，Inc.，Madison，WI的Lasergene软件包中的“EditSeq”功能，可得自InforMax，Inc.，Bethesda，MD的VectorNTI套件中的backtranslation功能，和可得自Accelrys，Inc.，SanDiego，CA的GCG-Wisconsin软件包中的“backtranslate”功能。此外，各种资源可公开获得，用于密码子优化编码区序列，例如，http：//www.entelechon.comlbioinformatics/backtranslation.php？lang＝eng(2008年4月15日访问)上的“backtranslation”功能和在http：//biolnfo.pbi.nrc.ca：8090/EMBOSS/index.html(2002年7月9日访问)上获得的“backtranseq”功能。构建用于基于给定频率分配密码子的基本算法也可由本领域的普通技术人员利用基本的数学函数容易地完成。
密码子优化的编码区可通过本领域的技术人员已知的多个方法进行设计，包括诸如“syntheticgenedesigner”(userpages.umbc.edu/～wug1/codon/sgd/，2012年3月19日访问)的软件包。
当在合适的温度和溶液离子强度的条件下单链形式的核酸片段可以退火至另一核酸片段时，多核苷酸或核酸片段“可杂交”至另一核酸片段，诸如cDNA、基因组DNA或RNA分子。杂交和洗涤条件为人们所熟知，并且示例于Sambrook，1.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.MolecularCloning：ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarborLaboratory：ColdSpringHarbor，NY(1989)，尤其是在该文献第11章和表11.1(全文以引用方式并入本文)中进行例示。温度和离子强度的条件确定了杂交的“严格度”。可调节严格性条件以筛选中度相似的片段(诸如来自远缘生物的同源序列)到筛选高度相似的片段(诸如从近缘生物复制功能性酶的基因)。杂交后的洗涤确定严格性条件。一组条件使用一系列洗涤，以6XSSC，0.5％SDS在室温下开始15min，接着以2XSSC，0.5％SDS在45℃下重复30min，然后以0.22XSSC，0.5％SDS在50℃下重复两次进行30min。另一组严格条件使用更高的温度，其中洗涤与以上的那些相同，除了最后两次以0.22XSSC，0.5％SDS的30min洗涤的温度增加至60℃。另一组高度严格条件使用在65℃下以0.1XSSC，0.1％SDS的两次最终洗涤。另外的一组严格条件包括以0.1XSSC，0.1％SDS在65℃下杂交并且例如以2XSSC，0.1％SDS，接着是0.1XSSC，0.1％SDS洗涤。
杂交需要包含互补序列的两种核酸，但是取决于杂交的严格度，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适的严格度取决于核酸的长度和互补的程度，它们是本领域熟知的变量。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应较高的Tm)按以下顺序依次降低：RNA：RNA、DNA：RNA、DNA：DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言，已经获得了计算Tm的公式(参见Sambrook等人，同上，9.509.51)。对于与较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更重要，而且寡核苷酸的长度确定了其特异性(参见Sambrook等人，同上，11.711.8)。在一个实施例中，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。在一个实施例中，可杂交核酸的最小长度为至少约15个核苷酸、至少约20个核苷酸；或长度为至少约30个核苷酸。此外，技术人员将认识到，必要时可根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液的盐浓度。
如本文所用，术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并指由通过酰胺键(也被称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指任何两个或更多个氨基酸的一条链或多条链，并且不涉及产物的具体长度。因此，“肽”、“二肽”、“三肽”、“寡肽”、“蛋白质”、“氨基酸链”、或其它任何用于指两个或更多个氨基酸的一条链或多条链的术语，都包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可代替或与这些术语中任一项互换使用。多肽可来源于天然生物源或由重组技术产生，但不一定是由指定的核酸序列翻译的。它可由任何方式生成，包括通过化学合成方式。
“分离的”多肽或其片段、变体、或其衍生物，是指不在其天然环境下的多肽。不要求特定的纯化水平。例如，分离的多肽可被从其天然的或自然的环境中移出。出于本发明的目的，在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质被认为是分离的，如同已通过任何适合的技术被分离的、分馏的、或部分或基本上纯化的天然或重组的多肽被认为是分离的。
如本文所用，术语“变体”和“突变体”是同义的，是指通过利用例如重组DNA技术(诸如诱变)产生的一个或多个氨基酸***、缺失、突变、和取代，而不同于具体地列出的多肽的多肽。通过将特定多肽的序列与同源的多肽(例如酵母或细菌的)的序列进行比较，并使高度同源区域(保守区域)中进行的氨基酸序列改变的数量最小化，或通过用共有序列替代氨基酸，可发现用以确定哪些氨基酸残基可以被替代、添加、或缺失而不会破坏所关注的活性的指导。
如本文所用，“工程化的多肽”是指合成的，即以某些方式不同于天然存在的多肽的多肽。
另选地，编码这些相同或相似的多肽的重组多核苷酸变体可以被合成，或通过利用遗传密码中的“冗余”进行选择。各种密码子替换，诸如产生各种限制性位点的沉默变化，可被导入以优化克隆到用于表达的质粒载体或病毒载体中。多核苷酸序列的突变可以体现在被添加至多肽以修饰所述多肽的任何部分的特性的多肽或其他肽的结构域之中。例如，突变可用于降低或消除靶蛋白质的表达，并且包括但不限于整个基因或部分基因的缺失、基因中DNA片段的***(在启动子区或编码区)，因此所述蛋白质不表达或低水平表达；在编码区引入突变即增加终止密码子或移框使得有功能的蛋白质不表达；以及在编码区中引入一个或多个突变以改变氨基酸，因此表达无功能的或较少酶活性的蛋白质。
氨基酸“取代”可为将一个氨基酸替换为另一个具有相似结构和/或化学性质的氨基酸的结果，即保守的氨基酸替换，或其可为一个氨基酸替换为一个具有不同结构和/或化学性质的氨基酸的结果，即非保守的氨基酸替换。“保守的”氨基酸取代可以基于所涉及的残基在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、或两亲性性质方面的相似性实现。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、以及甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、以及谷氨酰胺；带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、以及组氨酸；并且带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。另选地，“非保守的”氨基酸取代可以通过选择任何这些氨基酸在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、或两亲性性质方面的差异实现。“***”或“缺失”可在重组蛋白质结构上或功能上耐受的变型范围之内。通过利用重组DNA技术***地产生多肽分子中的氨基酸的***、缺失、或取代，并检测所得重组变体的活性，可以以实验方法确定所允许的变型。
氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”是指这样的部分，该部分包括的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以通过推定而鉴定所述多肽或基因，所述鉴定或者由本领域技术人员通过人工评价序列来完成，或者利用诸如BLAST(Altschul，S.F.等人，JMol.Biol.，215：403-410(1993))的算法通过计算机自动化的序列比较和鉴定来完成。一般来讲，为了通过推定而鉴定多肽或核酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源，需要有十个或更多个邻接氨基酸或者三十个或更多个核苷酸的序列。此外，对于核苷酸序列，包含20-30个邻接核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定(例如Southern杂交)和分离(例如细菌菌落或噬菌斑的原位杂交)的方法中。此外，12-15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物，以便获得包含该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“基本部分”包含的序列足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。本说明书讲授了编码特定蛋白质的完整的氨基酸和核苷酸序列。利用本文所报道的序列的有益效果，技术人员现在可以利用本发明所公开序列的全部或基本部分，以用于本领域技术人员已知的目的。因此，本发明包括如随附的序列表中所报道的完整序列，以及如上文定义的这些序列的基本部分。
术语“互补的”用于描述能够彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，针对DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补并且胞嘧啶与鸟嘌呤互补，并且针对RNA，腺嘌呤与尿嘧啶互补并且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。
如本领域所熟知的，术语“百分比同一性”是两条或更多条多肽序列之间或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较而确定。在本领域中，“同一性”还表示多肽或多核苷酸序列之间序列关联的程度，根据具体情况，它由这些序列的序列串之间的匹配程度确定。“同一性”和“相似性”可通过已知方法容易地计算出来，包括但不限于描述于下列中的那些：1.)ComputationalMolecularBiology(Lesk，A.M.编辑)OxfordUniversity：USA1988；2.)Biocomputing：Informaticsand GenomeProjects(Smith，D.W.编辑)Academic：USA1993；3.)Computer AnalysisofSequenceData，部分I(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)Humania：USA1994；4.)SequenceAnalysisinMolecularBiology(vonHeinje，G.Ed.)Academic(1987)；和5.)SequenceAnalysisPrimer(Gribskov，M.和Devereux，J.编辑)Stockton：NY(1991)。
设计确定同一性的方法来给出待测试序列之间的最佳匹配。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中被编成了代码。序列比对和百分比同一性计算可以用LASERGENE生物信息学计算软件包(LASERGENEbioinformaticscomputingsuite(DNASTARInc.，Madison，WI))中的MegAlignTM程序进行。序列的多重比对使用“Clustal比对方法”进行，该方法涵盖若干个不同的算法，包括对应于称为ClustalV的比对方法的“ClustalV比对方法”(描述于Higgins和Sharp，CABIOS.5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.，8：189-191(1992)中)，和可以在LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTARInc.)中的MegAlignTM程序中找到的比对方法。对于多重比对，默认值对应于GAPPENALTY＝10和GAPLENGTHPENALTY＝10。用于成对比对和用Clustal方法计算蛋白质序列的百分比同一性的默认参数为KTUPLE＝1、GAPPENALTY＝3、WINDOW＝5、以及DIAGONALSSAVED＝5。对于核酸，这些参数为KTUPLE＝2，空位罚分＝5，窗＝4，以及DIAGONALSSAVED＝4。在用ClustalV程序进行序列比对后，有可能通过观察相同程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。另外所述“ClustalW比对方法”是可用的并对应于称为ClustalW的比对方法(描述见Higgins和Sharp，CABIOS.5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.8：189-191(1992)中)，并且可以在LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTARInc.)中的MegAlignTMv6.1程序中找到的比对方法。用于多重比对的默认参数(GAPPENALTY＝10、GAPLENGTHPENALTY＝0.2、DelayDivergenSeqs(％)＝30、DNATransitionWeight＝0.5、ProteinWeightMatrix＝Gonnet系列、以及DNAWeightMatrix＝IUB)。在使用ClustalW程序对序列进行比对之后，可通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。
本领域的技术人员非常清楚，多种程度的序列同一性可用于鉴定多肽，诸如从其它物种，其中此类多肽具有相同或相似的功能或活性，或者可用于描述对应的多核苷酸。百分比同一性的有用的例子包括但不限于：55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％、或从55％至100％的任何整数百分比在描述本发明时可为有用的，诸如55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。适宜的多核苷酸片段不仅具有上述同源性，而且典型地包含具有至少50个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸、或至少250个核苷酸的多核苷酸。此外，适宜的具有上述同源性的多核苷酸片段编码具有至少50个氨基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基酸、至少200个氨基酸、或至少250个氨基酸的多肽。
术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件包括但不限于：1.)GCG程序包(WisconsinPackageVersion9.0，GeneticsComputerGroup(GCG)，Madison，WI)；2.)BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990))；3.)DNASTAR(DNASTAR，Inc.Madison，WI)；4.)Sequencher(GeneCodesCorporation，AnnArbor，MI)；以及5.)整合了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.MethodsGenomeRes.，[Proc.Int.Symp.](1994)，开会日期1992，111-20。编辑：Suhai、Sandor.Plenum：NewYork，NY)。在本专利申请的上下文中应当理解，使用序列分析软件进行分析时，除非另外指明，否则分析结果将基于所参考程序的“默认值”。如本文所用的“默认值”是指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。
标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的，并且在如下文献中有所描述：Sambrook，J.、Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY(1989)(下文称为“Maniatis”)；以及Silhavy，T.J.、Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，ExperimentswithGeneFusions，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience出版(1987)。此处所用的另外的方法参见MethodsinEnzymology，第194卷，GuidetoYeastGeneticsandMolecularandCellBiology(部分A，2004，ChristineGuthrie和GeraldR.Fink(编辑)，ElsevierAcademicPress，SanDiego，CA)。其他分子工具和技术是本领域中已知的，并且包括通过重叠延伸聚合酶链反应(PCR)进行的拼接(Yu，等人(2004)FungalGenet.Biol.41：973-981)、针对位于酿酒酵母的URA3基因座处的突变的正向选择(Boeke，J.D.等人(1984)Mol.Gen.Genet.197：345-346；MARomanos等人NucleicAcidsRes.1991年1月11日；19(1)：187)，ere-lox位点特异性重组***以及突变lox位点和FLP底物突变(Sauer，B.(1987)MolCellBiol7：2087-2096；Senecoff等人(1988)JournalofMolecularBiology，第201卷，第2期，第405-421页；Albert等人(1995)ThePlantJournal.第7卷，第4期，第649-659页)、“无缝”基因缺失(Akada等人(2006)Yeast；23(5)：399-405)、和缺口修复技术(Ma等人，Genetics58：201-216；1981)。
具有GPD活性的多肽
内源性NAD-依赖性“甘油-3-磷酸脱氢酶”或“GPD”是甘油合成中的关键酶，其将磷酸二羟丙酮(DHAP)转化为甘油-3-磷酸。术语“甘油-3-磷酸脱氢酶”和“GPD”是指具有GPD的生物学功能的任一个多肽(或多个多肽)。此类多肽包括具有催化磷酸二羟丙酮转化为甘油-3-磷酸的酶活性的多肽。GPD在自然界中广泛分布并且可分为三类。在第一类EC1.1.1.8中，GPD为可溶性胞质酶，其中氧化还原辅因子为NADINADH对，EC1.1.1.8类中的GPD描述为NADH特异性的，但是这并不排除一些GPD可具有对NADPH的可测量的活性。酿酒酵母GPD1是这种类型的GPD的例子(Albertyn等人，1992，FEBSLett308：130-132；Valadi等人，2004，J.BiolChem279：39677-39685)。另一个例子为人GPD1，对于人GPD1，存在多个3维结构研究(Ou等人，2005，1.Mol.Biol.357：858-869)。此类别的酶的测定可利用在DHAP和GPD酶存在下NADH氧化的分光光度测量(Niesel等人，1982MethodsEnzymol89：296-301)。第二类EC1.1.5.3的GPD酶为线粒体内膜的内在性膜蛋白，并且包含黄素辅因子，还原等效物在线粒体中转移到醌/醌醇对。存在第三小类的GPD，EC1.1.1.94，其以基本上相同的亲和力利用NADH或NADPH。第三小类的GPD还可受到甘油-3-磷酸的反馈抑制。
诸如酵母的重组微生物可具有一个或多个编码甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)的内源基因。在一些酵母诸如酿酒酵母、裂殖酵母(S.pombe)和树干毕赤酵母(P.stipitis)中，GPD1和GPD2是功能性同源物。酵母的编码GPD酶的基因中的任一个可被破坏以降低酵母细胞中的GPD活性。
酵母丁醇生产中的关键收率损失机制之一是碳和还原等效物的损失，其因磷酸二羟丙酮至甘油的转化而偏离糖酵解。由于GPD催化磷酸二羟丙酮至甘油的该转化的第一步骤，GPD的活性可促进甘油的产生和丁醇收率的损失。因此，已考虑在生产丁醇的酵母中消除GPD的功能(例如，通过敲除编码GPD蛋白的基因)。然而，甘油是生长所需要的并且为重要的渗透压保护剂。因此，保持制备一些甘油的能力提供某些优点。
保持制备甘油的能力，但是还改善产物醇的生产的一种方式是改变GPD的辅因子特异性。酿酒酵母GPD1在酵母细胞中催化磷酸二羟丙酮至甘油的转化的第一步骤时通常偏爱辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(“NADH”)。然而，如本文所展示，GPD酶也可使用辅因子磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(“NADPH”)。
当与偏好NADH的酶相比时，相比于偏好NADH而偏好NADPH的GPD酶的使用可允许宿主细胞保持在不同代谢条件下生产甘油的能力。然而，这种甘油产生可有利地在厌氧条件下在NADPH产生受限时而受到限制。
同时，降低GPD对NADH的偏好可增加NADH在宿主细胞中的可用性。NADH也被产物醇生产途径，例如，异丁醇生产途径中的其它酶使用，可用的NADH可被KARI和醇脱氢酶利用。因此，降低GPD对NADH的亲和力可增加产物醇(例如，异丁醇)生产。因此，在一些实施例中，在重组微生物中表达异源和/或工程化GPD，该重组微生物还表达利用NADH的酶，例如，在异丁醇生产途径中起作用的利用NADH的酶，诸如KARI和醇脱氢酶。
改善产物醇(例如，丁醇)的生产的另一种方式是改变GPD以降低对NADPH的KM。通过改变GPD来降低对NADPH的KM可增大由GPD催化的NADPH氧化的速率，因此允许NADH在宿主细胞中的可用性的增大。可用的NADH可被产物醇生产途径，例如，异丁醇生产途径中的其它酶使用，可用的NADH可被KARI和醇脱氢酶利用。因此，增加GPD对NADPH的亲和力可增加产物醇(例如，异丁醇)生产。因此，在一些实施例中，在重组微生物中表达异源和/或工程化GPD，该重组微生物还表达其它利用NADH的酶，例如，在异丁醇生产途径中起作用的利用NADH的酶，诸如KARI和醇脱氢酶。
保持制备一些甘油的能力并且还改善产物醇的生产的另一种方式是使用异源GPD酶，与由内源性GPD酶产生的量相比，该异源GPD酶可减小所产生的甘油的量。示例性异源性酶为大肠杆菌gpsA。大肠杆菌gpsA的可促进其产生较少甘油的能力的两个机制特征包括(1)gpsA受到甘油-3-磷酸的产物抑制，以及(2)gpsA以基本上相同的亲和力利用辅因子NADH和NADPH(Edgar和Bell，JBC255：3492-7(1980))，并且在某些条件下，这还可允许使用NADPH生产甘油，因此允许NADH在宿主细胞中的可用性。在酵母属中受到甘油-3-磷酸的产物抑制可导致降低的甘油产生，尤其是在甘油-3-磷酸磷酸酶酶促反应慢于GPD酶促反应时。酵母属磷酸酶GPP1和GPP2的所公布的米氏常数分别为3.1和3.9(Norbeck，JBC271：13875-81(1996)，它们比大肠杆菌gpsA的甘油-3-磷酸的抑制常数(Ki)高接近1000倍(Edgar和Bell，JBC253：6345-63(1978))。大多数条件有利于通过甘油-3-磷酸进行的产物抑制。
可利用NADH或NADPH和/或受到甘油-3-磷酸的反馈抑制的GPD酶可包括天然存在的蛋白和工程化蛋白。例如，利用NADH或利用NADPH的GPD酶通过EC1.1.1.94描述并且已在米曲霉、皱状假丝酵母、大肠杆菌和穴兔中发现。
在一些实施例中，本文所用的异源性GPD为墨西哥利什曼原虫、绿色杜氏藻、埃及跳鼠、闪烁古生球菌、普氏立克次体、白色贝日阿托菌、韩国康氏菌、米曲霉、皱状假丝酵母、大肠杆菌、或穴兔GPD。
在某些实施例中，可利用NADH或NADPH和/或受到甘油-3-磷酸的反馈抑制的其它GPD酶的序列能够在文献中被鉴定，并且利用本文所公开的和本领域中可获得的序列可在技术人员熟知的生物信息学数据库中鉴定候选。例如，通过用已知的GPD编码多核苷酸或多肽序列对可公开获得的数据库的BLAST检索可鉴定此类序列。在此类方法中，同一性可基于ClustalW比对方法，采用GAPPENALTY＝10，GAPLENGTHPENALTY＝0.1的默认参数和Gonnet250系列的蛋白质权重矩阵。
另外，本文所公开或本领域中已知的GPD多核苷酸或多肽序列可用于鉴定自然界中的其它候选GPD同源物。例如，本文所公开或本领域已知的GPD编码核酸序列可用于分离编码同源蛋白的基因。使用序列依赖性方案分离同源基因包括但不限于(1)核酸杂交方法；(2)DNA和RNA扩增的方法，如通过核酸扩增技术的多种用途所例示(例如，聚合酶链反应(PCR)，Mullis等人，美国专利4,683,202；连接酶链反应(LCR)，Tabor，S.等人，PNASUSA82：1074(1985)；或链置换扩增技术(SDA)，Walker等人，PNASUSA89：392(1992)]；以及(3)文库构建和互补筛选法。
改善产物醇的生产的另一种方式是改变GPD以增加对NADH的KM。通过改变GPD来增大对NADH的KM可降低由GPD催化的NADH氧化的速率，因此允许NADH在宿主细胞中的可用性的增大。可用的NADH可被产物醇生产途径，例如，异丁醇生产途径中的其它酶使用，可用的NADH可被KARI和醇脱氢酶利用。因此，降低GPD对NADH的亲和力可增加产物醇(例如，异丁醇)生产。因此，在一些实施例中，在重组微生物中表达异源和/或工程化GPD，该重组微生物还表达其它利用NADH的酶，例如，在异丁醇生产途径中起作用的利用NADH的酶，诸如KARI和醇脱氢酶。
对NADH具有增大的KM的GPD酶还可通过蛋白质工程化的手段产生。在一些实施例中，该GPD与酿酒酵母GPD1(SEQIDNO：195)具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，但是与SEQIDNO：195并非100％相同。在一些实施例中，该GPD包含位于对应于酿酒酵母GPD1(SEQIDNO：195)的位置42、44、45、71、73、75、95、124、126、129、151、152、183、184、185、246、310、336、337、或339的残基处的至少一个取代。
例如，在一些实施例中，该GPD包含对应于SEQIDNO：195的位置44(SEQIDNO：195中的Asn)的残基取代，取代为选自A、C、G、I、L、M、S、以及V的氨基酸。
在一些实施例中，该GPD包含对应于SEQIDNO：195的位置45(SEQIDNO：195中的Trp)的残基取代，取代为选自A、C、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、以及V的氨基酸。
在一些实施例中，该GPD包含对应于SEQIDNO：195的位置73(SEQIDNO：195中的Phe)的残基取代，取代为选自G、A、R、以及K的氨基酸。
在一些实施例中，该GPD包含对应于SEQIDNO：195的位置129(SEQIDNO：195中的Phe)的残基取代，取代为选自G、A、R、以及K的氨基酸。
在一些实施例中，该GPD包含对应于SEQIDNO：195的位置337(SEQIDNO：195中的Ser)的残基取代，取代为选自A、C、D、E、G、I、L、M、N、Q、以及V的氨基酸。
在一些实施例中，该GPD包含对应于SEQIDNO：195的位置339的残基(SEQIDNO：195中的Gln)的取代，取代为选自A、C、G、I、L、M、S、以及V的氨基酸。
在一些实施例中，该GPD包含对应于SEQIDNO：195的位置42、71、75、95、124、126、151、152、183、184、185、246、310、和/或336(分别为SEQIDNO：195的Ser、Trp、Glu、Tyr、Gln、Pro、Leu、Lys、Asn、He、Ala、Asn、Arg、Gln)的残基取代，取代为选自19种天然存在的氨基酸的任何其它氨基酸。
在一些实施例中，该GPD对NADH的KM为约0.01mM至约1mM。在一些实施例中，该GPD对NADH的KM为约0.05mM至约1mM。在一些实施例中，该GPD对NADH的KM为约0.10mM至约1mM。在一些实施例中，该GPD对NADH的KM为约0.15mM至约1mM。在一些实施例中，该GPD对NADH的KM为约0.20mM至约1mM。在一些实施例中，该GPD对NADH的KM为约0.30mM至约1mM。在一些实施例中，该GPD对NADH的KM为约0.40mM至约1mM。在一些实施例中，该GPD对NADH的KM为约0.50mM至约1mM。用于测量GPD对NADH的KM的测定公开于以下实例1中并且在本领域中是已知的，参见，例如，Niesel等人，MethodsEnzymol.89：296-301(1982)。某些测定可称为“NADH消耗测定法”，是指用于确定GPD酶的特异性活性的酶测定法，包括从酶反应测量GPD辅因子，NADH的消失。
在一些实施例中，该GPD对NADPH的KM为约0.01mM至约1mM。在一些实施例中，该GPD对NADPH的KM为约0.05mM至约1mM。在一些实施例中，该GPD对NADPH的KM为约0.10mM至约1mM。在一些实施例中，该GPD对NADPH的KM为约0.15mM至约1mM。在一些实施例中，该GPD对NADPH的KM为约0.20mM至约1mM。在一些实施例中，该GPD对NADPH的KM为约0.30mM至约1mM。在一些实施例中，该GPD对NADPH的KM为约0.40mM至约1mM。在一些实施例中，该GPD对NADPH的KM为约0.50mM至约1mM。在实例1中以下公开的NADH测定可适于通过用NADPH替代NADH来测量GPD对NADPH的KM。用于测量GPD对NADPH的KM的另外的测定在本领域中是已知的，参见，例如，Niesel等人，MethodsEnzymol.89：296-301(1982)。某些测定可称为“NADPH消耗测定法”，是指用于确定GPD酶的特异性活性的酶测定法，包括从酶反应测量GPD辅因子，NADH的消失。
在一些实施例中，与不包含异源性和/或工程化GPD的重组微生物相比，异源性和/或工程化GPD可增加包含异源性和/或工程化GPD的重组微生物的生长。
在一些实施例中，与不包含异源性和/或工程化GPD的重组微生物相比，异源性和/或工程化GPD可增加包含异源性和/或工程化GPD的重组微生物的产物醇(例如，异丁醇)生产。
在一些实施例中，与不包含异源性和/或工程化GPD的重组微生物相比，异源性和/或工程化GPD可降低包含该GPD的重组微生物的甘油产生。在一些实施例中，与不包含异源性和/或工程化GPD的重组微生物相比，异源性和/或工程化GPD可增大由包含异源性和/或工程化GPD的重组微生物的产生的产物醇(例如，异丁醇)与甘油的比率。
在一些实施例中，与不包含异源性和/或工程化GPD的重组微生物相比，异源性和/或工程化GPD可增加包含异源性和/或工程化GPD的重组微生物的收率(例如，所生产异丁醇的克数/所消耗底物的克数)。
因此，在重组微生物中，所述重组微生物包含丁醇生物合成途径、对NADH的KM高于微生物的内源性GPD的异源性和/或工程化GPD、以及编码GPD的内源基因的缺失或破坏，“改善的丁醇生产”可以指与不含异源性和/或工程化GPD的微生物相比增大的丁醇生产、降低的甘油产生、或两者。
在重组微生物中，所述重组微生物包含对NADH的KM高于微生物的内源性GPD的异源性和/或工程化GPD和编码GPD的内源基因中的缺失或破坏，“改善的醇生产”可以指与不含异源性和/或工程化GPD的微生物相比增大的丁醇生产、降低的甘油产生、或两者。
因此，在重组微生物中，所述重组微生物包含丁醇生物合成途径、对NADH和NADPH具有基本上相同的亲和力和/或受到甘油-3-磷酸的反馈抑制的异源性GPD、以及编码GPD的内源基因的缺失或破坏，“改善的丁醇生产”可以指与不含异源性GPD的微生物相比增大的丁醇生产、降低的甘油产生、或两者。
因此，在重组微生物中，所述重组微生物包含对NADH和NAPDH具有基本上相同的亲和力和/或受到甘油-3-磷酸的反馈抑制的异源性GPD和编码GPD的内源基因中的缺失或破坏，“改善的醇生产”可以指与不含异源性GPD的微生物相比增大的醇生产、降低的甘油产生、或两者。
重组微生物
不受理论的束缚，据信本文所述方法可与生产任何醇的微生物、尤其是生产醇的重组微生物结合使用。
生产醇的重组微生物也是本领域已知的(例如，Ohta等人，Appl.Environ.Microbiol.57：893-900(1991)；Underwood等人，Appl.Envrion.Microbiol.68：1071-81(2002)；Shen和Liao，Metab.Eng.10：312-20(2008)；Hahnai等人，Appl.Environ.73：7814-8(2007)；美国专利5,514,583；美国专利5,712,133；国际公布WO1995/028476；Feldmann等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.38：354-61(1992)；Zhang等人，Science267：240-3(1995)；美国专利公布2007/0031918A1；美国专利7,223,575；美国专利7,741,119；美国专利公布2009/0203099A1；美国专利公布2009/0246846A1；以及国际公布WO2010/075241，它们以引用方式并入本文)。
例如，微生物的代谢途径可经基因修饰以产生丁醇。这些途径也可经修饰以减少或消除非期望的代谢物，从而改善产物醇的收率。通过微生物生产丁醇公开于例如，美国专利7,851,188；7,993,889；8,178,328、8,206,970；美国专利申请公布2007/0292927；2008/0182308；2008/0274525；2009/0305363；2009/0305370；2011/0250610；2011/0313206；2011/0111472；2012/0258873；以及201310071898，它们各自的全部内容以引用方式并入本文。在某些实施例中，微生物经基因修饰以包含丁醇生物合成途径或丁醇异构体诸如1-丁醇、2-丁醇或异丁醇的生物合成途径。在某些实施例中，微生物中的异源性多核苷酸编码至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、或至少五个多肽，它们催化丁醇生物合成途径中底物至产物的转化。在某些实施例中，微生物中的异源性多核苷酸编码所有多肽，它们催化丁醇生物合成途径中底物至产物的转化。应认识到，包括丁醇生物合成途径的微生物还可包括如美国专利申请公布2013/0071898中公开的一个或多个另外的基因修饰，所述公布全文以引用方式并入本文。
在一些实施例中，所述微生物可为细菌、蓝细菌、丝状真菌、或酵母。能够经由生物合成途径生产产物醇(例如，丁醇)的合适的微生物包括下列中的一个成员：梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、志贺氏菌属(Shigella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、假丝酵母属(Candida)、酒香酵母属(Brettanomyces)、管囊酵母属(Pachysolen)、汉逊酵母属(Hansenula)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、丝孢酵母属(Trichosporon)、Yamadazyma或酵母属(Saccharomyces)。在一个实施例中，重组微生物可选自大肠杆菌(Escherichiacoli)、真养产碱杆菌(Alcaligeneseutrophus)、地衣芽孢杆菌属(Bacilluslichenifonnis)、浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillusmacerans)、红平红球菌(Rhodocuccuserythropolis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarium)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、萨纳瑞西斯假丝酵母(Candidasonorensis)、methanosorbosa假丝酵母(Candidamethanosorbosa)、乳酸克鲁维酵母(Kluveromyceslactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、耐热克鲁维酵母(Kluyveromycesthermotolerans)、东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。在一个实施例中，经基因修饰的微生物是酵母。在一个实施例中，经基因修饰的微生物为克拉布特里阳性酵母，其选自酵母属、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、裂殖酵母属、德克酵母属(Dekkera)、球拟酵母属(Torulopsis)、酒香酵母属(Brettanomyces)、以及假丝酵母属的一些菌种。克拉布特里阳性酵母的菌种包括但不限于，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、克鲁维酵母(Saccharomyceskluyveri)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、贝酵母(Saccharomycesbayanus)、mikitae酵母(Saccharomycesmikitae)、奇异酵母(Saccharomycesparadoxus)、葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)、芽殖酵母(Saccharomycescastelli)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)、拜耳接合酵母(Zygosaccharomycesbailli)和光滑假丝酵母(Candidaglabrata)。
在一些实施例中，宿主细胞是酿酒酵母。酿酒酵母为本领域所已知并可购自多种来源，包括但不限于美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)、CentraalbureauvoorSchimmelcultures(CBS)真菌生物多样性中心、LeSaffre、GertStrandAB、FermSolutions、NorthAmericanBioproducts、Martrex和Lallemand。酿酒酵母包括但不限于BY4741、CEN.PK113-7D、Ethanol酵母、FermProTM酵母、XR酵母、GertStrandPrestigeBatchTurboalcohol酵母、GertStrandPotDistillers酵母、GertStrandDistillersTurbo酵母、FerMaxTMGreen酵母、FerMaxTMGold酵母、酵母、BG-1、PE-2、CAT-1、CBS7959、CBS7960和CBS7961。
在一些实施例中，微生物可被固定或包封。例如，微生物可使用藻酸酯、藻酸钙或聚丙烯酰胺凝胶固定或包封，或通过在多种高表面积载体矩阵诸如硅藻土(diatomite)、硅藻土(celite)、硅藻土(diatomaceousearth)、硅胶、塑料或树脂上诱导生物膜形成来固定或包封。在一些实施例中，ISPR可与固定的或包封的微生物组合使用。该组合可改善生产能力诸如比体积生产能力、代谢速率、产物醇收率、产物醇耐受性。此外，固定和包封可使工艺条件诸如剪切对微生物的影响最小化。
用于生产可使用的异丁醇的生物合成途径包括如Donaldson等人在美国专利7,851,188；美国专利7,993,388；以及国际公布WO2007/050671中描述的那些，所述专利以引用方式并入本文。在一个实施例中，异丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化：
a)丙酮酸至乙酰乳酸，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；
b)来自步骤a)的乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸，其可被例如酮醇酸还原异构酶催化；
c)来自步骤b)的2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸，其可被例如二羟酸脱水酶催化；
d)来自步骤c)的α-酮异戊酸至异丁醛，其可被例如支链α-酮酸脱羧酶催化；以及
e)来自步骤d)的异丁醛至异丁醇，其可被例如支链醇脱氢酶催化。
在另一个实施例中，异丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化：
a)丙酮酸至乙酰乳酸，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；
b)来自步骤a)的乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸，其可被例如酮醇酸还原异构酶催化；
c)来自步骤b)的2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸，其可被例如二羟酸脱水酶催化；
d)来自步骤c)的α-酮异戊酸至缬氨酸，其可被例如转氨酶或缬氨酸脱氢酶催化；
e)来自步骤d)的缬氨酸至异丁胺，其可被例如缬氨酸脱羧酶催化；
f)来自步骤e)的异丁胺至异丁醛，其可被例如ω转氨酶催化；以及
g)来自步骤f)的异丁醛至异丁醇，其可被例如支链醇脱氢酶催化。
在另一个实施例中，异丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化：
a)丙酮酸至乙酰乳酸，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；
b)来自步骤a)的乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸，其可被例如酮醇酸还原异构酶催化；
c)来自步骤b)的2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸，其可被例如二羟酸脱水酶催化；
d)来自步骤c)的α-酮异戊酸至异丁酰-CoA，其可被例如支链酮酸脱氢酶催化；
e)来自步骤d)的异丁酰-CoA至异丁醛，其可被例如酰化乙醛脱氢酶催化；以及
f)来自步骤e)的异丁醛至异丁醇，其可被例如支链醇脱氢酶催化。
用于生产可使用的1-丁醇的生物合成途径包括在美国专利申请公布2008/0182308和WO2007/041269中描述的那些，所述专利以引用的方式并入本文。在一个实施例中，1-丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化：
a)乙酰-CoA至乙酰乙酰-CoA，其可被，例如，乙酰-CoA乙酰转移酶催化；
b)来自步骤a)的乙酰乙酰-CoA至3-羟丁酰-CoA，其可被例如3-羟丁酰-CoA脱氢酶催化；
c)来自步骤b)的3-羟丁酰-CoA至巴豆酰-CoA，其可被例如巴豆酸酶催化；
d)来自步骤c)的巴豆酰-CoA至丁酰-CoA，其可被例如丁酰-CoA脱氢酶催化；
e)来自步骤d)的丁酰-CoA至丁醛，其可被例如丁醛脱氢酶催化；以及
f)来自步骤e)的丁醛至1-丁醇，其可被例如丁醇脱氢酶催化。
用于生产可使用的2-丁醇的生物合成途径包括由Donaldson等人在美国专利8,206,970；美国专利申请公布2007/0292927和2009/0155870；国际公布WO2007/130518和WO2007/130521中描述的那些，所述专利全部以引用方式并入本文。在一个实施例中，2-丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化：
a)丙酮酸至α-乙酰乳酸的转化，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；
b)来自步骤a)的α-乙酰乳酸至乙偶姻，其可被例如乙酰乳酸脱羧酶催化；
c)来自步骤b)的乙偶姻至3-氨基-2-丁醇，其可被例如乙偶姻胺化酶催化；
d)来自步骤c)的3-氨基-2-丁醇至3-氨基-2-丁醇磷酸，其可被例如氨基丁醇激酶催化；
e)来自步骤d)的3-氨基-2-丁醇磷酸至2-丁酮，其可被例如磷酸氨基丁醇磷酸化酶催化；以及
f)来自步骤e)的2-丁酮至2-丁醇，其可被例如丁醇脱氢酶催化。
在另一个实施例中，2-丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化：
a)丙酮酸至α-乙酰乳酸的转化，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；
b)来自步骤a)的α-乙酰乳酸至乙偶姻，其可被例如乙酰乳酸脱羧酶催化；
c)来自步骤b)的乙偶姻至2，3-丁二醇，其可被例如丁二醇脱氢酶催化；
d)来自步骤c)的2，3-丁二醇至2-丁酮，其可被例如二醇脱水酶催化；以及
e)来自步骤d)的2-丁酮至2-丁醇，其可被例如丁醇脱氢酶催化。
用于生产可使用的2-丁醇的生物合成途径包括在美国专利8,206,970以及美国专利申请公布2007/0292927和2009/0155870中描述的那些，所述专利以引用方式并入本文。在一个实施例中，2-丁酮生物合成途径包括下列底物至产物的转化：
a)丙酮酸至α-乙酰乳酸的转化，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；
b)来自步骤a)的α-乙酰乳酸至乙偶姻，其可被例如乙酰乳酸脱羧酶催化；
c)来自步骤b)的乙偶姻至3-氨基-2-丁醇，其可被例如乙偶姻胺化酶催化；
d)来自步骤c)的3-氨基-2-丁醇至3-氨基-2-丁醇磷酸，其可被例如氨基丁醇激酶催化；以及
e)来自步骤d)的3-氨基-2-丁醇磷酸至2-丁酮，其可被例如磷酸氨基丁醇磷酸化酶催化。
在另一个实施例中，2-丁酮生物合成途径包括下列底物至产物的转化：
a)丙酮酸至α-乙酰乳酸的转化，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；
b)来自步骤a)的α-乙酰乳酸至乙偶姻，其可被例如乙酰乳酸脱羧酶催化；
c)来自步骤b)的乙偶姻至2，3-丁二醇，其可被例如丁二醇脱氢酶催化；
d)来自步骤c)的2，3-丁二醇至2-丁酮，其可被例如二醇脱水酶催化。
术语“乙酰羟酸合酶”、“乙酰乳酸合酶”和“乙酰乳酸合成酶”(缩写为“ALS”)本文互换使用，指催化丙酮酸转化为乙酰乳酸和CO2的酶。已知乙酰乳酸合酶的例子为EC编号2.2.1.6(EnzymeNomenclature1992，AcademicPress，SanDiego)。这些酶可得自多种来源，包括但不限于：枯草芽孢杆菌(基因库编号：CAB07802.1、Z99122，分别是NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)氨基酸序列、NCBI核苷酸序列)、CAB15618、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)(基因库编号：AAA25079、M73842)以及乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)(基因库编号：AAA25161、L16975)。
术语“酮醇酸还原异构酶”(“KARI”)、“乙酰羟酸异构还原酶”、和“乙酰羟酸还原异构酶”将互换使用并且是指能够催化(S)-乙酰乳酸转化为2，3-二羟基异戊酸的反应的酶。KARI酶的例子可归类为EC编号EC1.1.1.86(EnzymeNomenclature1992，AcademicPress，SanDiego)，并且得自多种微生物，包括但不限于大肠杆菌(基因库编号：NP_418222、NC_000913)、酿酒酵母(基因库编号：NP_013459、NC_001144)、海沼甲烷球菌(Methanococcusmaripaludis)(基因库编号：CAF30210、BX957220)、以及枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(基因库编号：CAB14789、Z99118)。KARI包括粪厌氧棒状菌(Anaerostipescaccae)KARI变体“K9G9”(SEQIDNO：85)、“K9D3”(SEQIDNO：86)、以及“K9JB4P”(SEQIDNO：87)。酮醇酸还原异构酶(KARI)在美国专利7,910,342和8,129,162；美国专利申请公布2008/0261230、2009/0163376、2010/0197519、PCT申请公布WO/2011/041415、PCT申请公布WO/2012/129555；以及2013年9月26日提交的美国专利申请14/038,455中有所描述，所述专利全部以引用方式并入本文。本文所公开的KARI的例子是来自乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、霍乱弧菌(Vibriocholera)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PAO1和荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)PF5突变体的那些。在一些实施例中，KARI利用NADH。在一些实施例中，KARI利用NADPH。在一些实施例中，KARI利用NADH或NADPH。
术语“乙酰羟酸脱水酶”和“二羟基酸脱水酶”(“DHAD”)是指催化2，3-二羟基异戊酸转化为a-酮异戊酸的酶。乙酰羟酸脱水酶的例子已知其EC编号为EC4.2.1.9。此类酶可得自多种微生物，包括但不限于大肠杆菌(基因库编号：YP026248、NC000913)、酿酒酵母(基因库编号：NP012550、NC001142)、海沼甲烷球菌(M.maripaludis)(基因库编号：CAF29874、BX957219)、枯草芽孢杆菌(基因库编号：CAB14105、Z99115)、乳酸乳球菌(SEQIDNO：88)、以及粗糙链孢霉(Ncrassa)。美国专利申请公布2010/0081154、美国专利7,851,188和美国专利8,241,878(全文以引用方式并入本文)描述了二羟酸脱水酶(DHAD)，包括来自变异链球菌(Streptococcusmutans)(SEQIDNO：89)及其变体的DHAD。
术语“支链α-酮酸脱羧酶、”“α-酮酸脱羧酶、”“α-酮异戊酸脱羧酶、”或“2-酮异戊酸脱羧酶”(“KIVD”)是指催化α-酮异戊酸转化为异丁醛和CO2的酶。已知支链α-酮酸脱羧酶的例子为EC编号4.1.1.72，并且得自许多来源，包括但不限于乳酸乳球菌(基因库编号：AAS49166、AY548760；CAG34226、AJ746364)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)(基因库编号：NP_461346、NC_003197)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)(基因库编号：NP_149189、NC_001988)、溶酪大球菌(M.caseolyticus)、以及格雷氏李斯特菌(L.grayis)。合适的支链α-酮酸脱羧酶可包括来自乳酸乳球菌的SEQIDNO：90和来自格雷氏李斯特菌的SEQIDNO：91。
术语“支链醇脱氢酶”(“ADH”)是指催化异丁醛转化为异丁醇的酶。支链醇脱氢酶的例子已知EC编号为1.1.1.265，但是所述酶也可被归类为其它醇脱氢酶(具体地讲，EC1.1.1.1或1.1.1.2)。醇脱氢酶可为NADPH依赖性或NADH依赖性的。这些酶可得自多种来源，包括但不限于酿酒酵母(基因库编号：NP_010656、NC_001136、NP_014051、NC_001145)、大肠杆菌(基因库编号：NP_417484、NC_000913)、丙酮丁醇梭菌(基因库编号：NP_349892、NC_003030；NP_349891、NC_003030)。美国专利申请公布2009/0269823描述了来自木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)的醇脱氢酶(ADH)SadB(SEQIDNO：92)。醇脱氢酶还包括马肝脏ADH(SEQIDNO：93)和印度拜耶林克氏菌(Beijerinkiaindica)ADH(SEQIDNO：94)(如美国专利申请公布201110269199所述，其以引用方式并入本文)。
术语“丁醇脱氢酶”是指多肽(或多个多肽)，其具有催化异丁醛转化为异丁醇或催化2-丁酮和2-丁醇的转化的酶活性。丁醇脱氢酶是醇脱氢酶大家族中的一个子集。丁醇脱氢酶可为NAD-或NADP-依赖性的。NAD-依赖性酶已知为EC1.1.1.1并且可得自例如赤红球菌(Rhodococcusruber)(基因库编号：CAD36475、AJ491307)。NADP依赖性酶已知为EC1.1.1.2并且可得自例如强烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)(基因库编号：AAC25556、AF013169)。另外，丁醇脱氢酶得自大肠杆菌(基因库编号：NP417484、NC_000913)，环己醇脱氢酶可得自不动杆菌属(Acinetobactersp.)(基因库编号：AAG10026、AF282240)。术语“丁醇脱氢酶”也指催化丁醛转化为1-丁醇的酶，其使用NADH或NADPH作为辅因子。丁醇脱氢酶可得自例如丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(基因库编号：NP_149325、NC_001988；注意：这个酶同时具有醛和醇脱氢酶活性)；NP_349891、NC_003030；以及NP_349892、NC_003030)以及大肠杆菌(基因库编号：NP_417-484、NC_000913)。
术语“支链酮酸脱氢酶”是指催化α-酮异戊酸转化为异丁酰-CoA(异丁酰-辅酶A)的酶，通常使用NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)作为电子受体。支链酮酸脱氢酶的例子已知其编号为EC1.2.4.4。此类支链酮酸脱氢酶由四个亚基构成，并且来自所有亚基的序列可得自多种微生物，包括但不限于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(基因库编号：CAB14336、Z99116；CAB14335、Z99116；CAB14334、Z99116；以及CAB14337、Z99116)以及恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)(基因库编号：AAA65614、M57613；AAA65615、M57613；AAA65617、M57613；以及AAA65618、M57613)。
术语“酰化醛脱氢酶”指催化异丁酰-CoA转化为异丁醛的酶，其通常使用NADH或NADPH作为电子供体。已知乙酰化醛脱氢酶的例子为EC编号1.2.1.10和1.2.1.57。此类酶得自多种来源，包括但不限于拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)(基因库编号：AAD31841、AF157306)、丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(基因库编号：NP_149325、NC_001988；NP_149199、NC_001988)、恶臭假单胞菌(P.putida)(基因库编号：AAA89106、U13232)、以及嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)(基因库编号：YP_145486、NC_006461)。
术语“转氨酶”指催化α-酮异戊酸转化为L-缬氨酸的酶，其使用丙氨酸或谷氨酸作为胺供体。转氨酶的例子已知为EC编号2.6.1.42和2.6.1.66。这些酶可得自多个来源。丙氨酸依赖性酶的来源的例子包括但不限于大肠杆菌(基因库编号：YP_026231、NC_000913)以及地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)(基因库编号：YP_093743、NC_006322)。谷氨酸依赖性酶的来源的例子包括但不限于大肠杆菌(基因库编号：YP_026247、NC_000913)、酿酒酵母(基因库编号：NP_012682、NC_001142)以及嗜热自养甲烷杆菌(基因库编号：NP_276546、NC_000916)。
术语“缬氨酸脱氢酶”指催化α-酮异戊酸转化为L-缬氨酸的酶，其通常使用NAD(P)H作为电子供体并用氨作为胺供体。缬氨酸脱氢酶的例子已知为EC编号1.4.1.8和1.4.1.9，并且此类酶可得自多个来源，包括但不限于天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)(基因库编号：NP_628270、NC_003888)和枯草芽孢杆菌(基因库编号：CAB14339、Z99116)。
术语“缬氨酸脱羧酶”指催化L-缬氨酸转化为异丁胺和CO2的酶。缬氨酸脱羧酶的例子已知为EC编号4.1.1.14。此类酶存在于链霉菌属(Streptomyces)中，诸如例如生绿链霉菌(Streptomycesviridifaciens)(基因库编号：AAN10242、AY116644)。
术语“ω转氨酶”催化异丁胺转化为异丁醛的酶，其使用合适的氨基酸作为胺供体。已知ω转氨酶的例子为EC编号2.6.1.18，并且得自许多来源，包括但不限于反硝化产碱菌(Alcaligenesdenitrificans)(AAP92672、AY330220)、富养罗尔斯通氏菌(Ralstoniaeutropha)(基因库编号：YP_294474、NC_007347)、沙雷菌(Shewanellaoneidensis)(基因库编号：NP_719046、NC_004347)以及恶臭假单胞菌(基因库编号：AAN66223、AE016776)。
术语“乙酰-CoA乙酰转移酶”是指催化两分子乙酰-CoA转化为酰乙酰-CoA和辅酶A(CoA)的酶。乙酰-CoA乙酰转移酶的例子是具有对短链酰基-CoA和乙酰-CoA的底物偏好(在正向上反应)的乙酰-CoA乙酰转移酶，并且该酶被归类为E.C.2.3.1.9[EnzymeNomenclature1992，AcademicPress，SanDiego]；但是具有更广泛的底物范围的酶(E.C.2.3.1.16)也将具有功能。乙酰-CoA乙酰转移酶可得自多种来源，例如，大肠杆菌(基因库编号：NP_416728、NC_000913；NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)氨基酸序列，NCBI核苷酸序列)、丙酮丁醇梭菌(基因库编号：NP_349476.1、NC_003030；NP_149242，NC_001988、枯草芽孢杆菌(基因库编号：NP_390297、NC_000964)、以及酿酒酵母(基因库编号：NP_015297、NC_001148)。
术语“3-羟丁酰-CoA脱氢酶”是指催化乙酰乙酰-CoA转化为3-羟丁酰-CoA的酶。3-羟丁酰-CoA脱氢酶的例子可为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)-依赖性的，具有对(S)-3-羟丁酰-CoA或(R)-3-羟丁酰-CoA的底物偏好。例子可分别归类为E.C.1.1.1.35和E.C.1.1.1.30。另外，3-羟丁酰-CoA脱氢酶可为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)-依赖性的、具有对(S)-3-羟丁酰-CoA或(R)-3-羟丁酰-CoA的底物偏好，并且其可分别归类为E.C.1.1.1.157和E.C.1.1.1.36。3-羟丁酰-CoA脱氢酶得自多种来源，例如丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(基因库编号：NP_349314、NC_003030)、枯草芽孢杆菌(基因库编号：AAB09614、U29084)、富养罗尔斯通氏菌(基因库编号：YP_294481、NC_007347)、以及真养产碱杆菌(Alcaligeneseutrophus)(基因库编号：AAA21973、104987)。
术语“巴豆酸酶”是指催化3-羟丁酰-CoA转化为巴豆酰-CoA和H2O的酶。示例性巴豆酰酶可具有对(S)-3-羟丁酰-CoA或(R)-3-羟丁酰-CoA的底物偏好性，并且可分别被分类为E.C.4.2.1.17和E.C.4.2.1.55。巴豆酸酶得自多种来源，例如，大肠杆菌(基因库编号：NP_415911、NC_000913)、丙酮丁醇梭菌(基因库编号：NP_349318、NC_003030)、枯草芽孢杆菌(基因库编号：CAB13705、Z99113)、以及豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae)(基因库编号：BAA21816、D88825)。
术语“丁酰-CoA脱氢酶”指催化巴豆酰-CoA转化为丁酰-CoA的酶。丁酰-CoA脱氢酶的例子可为NADH-依赖性的、NADPH-依赖性的、或黄素-依赖性的，并且可分别归类为E.C.1.3.1.44、E.C.1.3.1.38、以及E.C.1.3.99.2。丁酰-CoA脱氢酶得自多种来源，例如丙酮丁醇梭菌(基因库编号：NP_347102、NC_003030)、小眼虫(Euglenagracilis)(基因库编号：Q5EU90、AY741582)、山丘链霉菌(Streptomycescollinus)(基因库编号：AAA92890、U37135)、以及天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)(基因库编号：CAA22721、AL939127)。
术语“丁醛脱氢酶”是指催化丁酰-CoA转化为丁醛的酶，该酶使用NADH或NADPH作为辅因子。丁醛脱氢酶具有对NADH的偏好性，该酶已知为E.C.1.2.1.57并且得自例如拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)(基因库编号：AAD31841、AF157306)以及丙酮丁醇梭菌(基因库编号：NP_149325、NC_001988)。
术语“异丁酰-CoA变位酶”指催化丁酰-CoA转化为异丁酰-CoA的酶。这种酶使用辅酶B12作为辅因子。异丁酰-CoA变位酶的例子已知为EC编号5.4.99.13。这些酶存在于多种链霉菌属中，包括但不限于肉桂地链霉菌(Streptomycescinnamonensis)(基因库编号：AAC08713、U67612；CAB59633、AJ246005)、天蓝色链霉菌(基因库编号：CAB70645、AL939123；CAB92663、AL939121)、以及阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)(基因库编号：NP_824008、NC_003155；NP_824637、NC_003155)。
术语“乙酰乳酸脱羧酶”指具有催化α-乙酰乳酸转化为乙偶姻的酶活性的多肽(或多个多肽)。示例性乙酰乳酸脱羧酶已知编号为EC4.1.1.5并且可例如得自枯草芽孢杆菌(基因库编号：AAA22223、L04470)、土生克雷伯氏菌(klebsiellaterrigena)(基因库编号：AAA25054、L04507)以及肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)(基因库编号：AAU43774、AY722056)。
术语“乙偶姻胺化酶”或“乙偶姻转氨酶”指具有催化乙偶姻转化为3-氨基-2-丁醇的酶活性的多肽(或多个多肽)。乙偶姻胺化酶可利用辅因子5′-磷酸吡哆醛或NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)或NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)。所得产物可在3-位置处具有(R)或(S)立体化学构型。依赖磷酸吡哆醛的酶可使用氨基酸诸如丙氨酸或谷氨酸作为氨基供体。NADH-和NADPH-依赖性酶可使用氨作为第二底物。NADH依赖的乙偶姻胺化酶的合适例子也称为氨基醇脱氢酶，由Ito等人(美国专利6,432,688)进行了描述。依赖吡哆醛的乙偶姻胺化酶的例子是胺：丙酮酸氨基转移酶(也称为胺：丙酮酸转氨酶)，如Shin和Kim所述(J.Org.Chem.67：2848-2853，2002)。
术语“乙偶姻激酶”指具有催化乙偶姻转化为磷酸乙偶姻的酶活性的多肽(或多个多肽)。乙偶姻激酶可利用ATP(三磷酸腺苷)或磷酸烯醇式丙酮酸作为反应中的磷酸供体。对类似底物二羟基丙酮催化类似反应的酶包括例如已知为EC2.7.1.29的酶(Garcia-Alles等人，Biochemistry43：13037-13046，2004)。
术语“乙偶姻磷酸胺化酶”指具有催化磷酸乙偶姻转化为3-氨基-2-丁醇邻位磷酸的酶活性的多肽(或多个多肽)。磷酸乙偶姻胺化酶可利用辅因子5′-磷酸吡哆醛、NADH、或NADPH。所得产物可在3-位置处具有(R)或(S)立体化学构型。依赖磷酸吡哆醛的酶可使用氨基酸诸如丙氨酸或谷氨酸。NADH和NADPH依赖性酶可使用氨作为第二底物。虽然没有对催化这种磷酸乙偶姻反应的酶的报道，但是有一种吡哆醛磷酸-依赖性的酶，提出其对相似的底物丝氨醇磷酸进行相似的反应(Yasuta等人，Appl.Environ.Microbial.67：4999-5009，2001)。
术语“磷酸氨基丁醇磷酸化酶”，也称为“邻磷酸氨基醇裂解酶”，是指具有催化邻磷酸-3-氨基-2-丁醇转化为2-丁酮的酶活性的多肽(或多种多肽)。磷酸氨基丁醇磷酸裂解酶可利用辅因子5′-磷酸吡哆醛。有对催化相似底物1-氨基-2-丙醇磷酸的类似反应的酶的报道(Jones等人，BiochemJ134：167-182，1973)。美国专利申请公布2007/0259410描述了来自生物胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora)的磷酸氨基丁醇磷酸裂解酶。
术语“氨基丁醇激酶”是指具有催化3-氨基-2-丁醇转化为邻磷酸-3-氨基-2-丁醇的酶活性的多肽(或多种多肽)。氨基丁醇激酶可利用ATP作为磷酸供体。虽然没有对催化这种3-氨基-2-丁醇反应的酶的报道，但是报道了催化相似底物乙醇胺和1-氨基-2-丙醇的类似反应的酶(Jones等人，同上)。美国专利申请公布2009/0155870在实例14中描述了胡萝卜软腐欧文氏菌黑胫亚种(Erwiniacarotovorasubsp.Atroseptica)的氨基醇激酶。
术语“丁二醇脱氢酶”也称为“乙偶姻还原酶”，指具有催化乙偶姻转化为2，3-丁二醇的酶活性的多肽(或多个多肽)。丁二醇脱氢酶是醇脱氢酶大家族中的一个子集。丁二醇脱氢酶对于在醇类产物中的(R)-或(S)-立体化学生产可具有特异性。(S)-特异性丁二醇脱氢酶已知为EC1.1.1.76并且可例如来自肺炎克雷伯氏菌(基因库编号：BBA13085、D86412)。(R)-特异性丁二醇脱氢酶已知为EC1.1.1.4并且可例如得自蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)(基因库编号：NP830481、NC_004722；AAP07682、AE017000)、以及乳酸乳球菌(基因库编号AAK04995、AE006323)。
术语“丁二醇脱水酶”，也称为“二醇脱水酶”或“丙二醇脱水酶”，是指具有催化2，3-丁二醇转化为2-丁酮的酶活性的多肽(或多种多肽)。丁二醇脱水酶可利用辅因子腺苷钴胺素(也称为辅酶Bw或维生素B12；但是维生素B12也可指并非辅酶B12的其它形式的钴胺素)。腺苷钴胺素-依赖性酶已知为EC4.2.1.28并且可得自例如产酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)(基因库编号：AA08099(α亚基)，D45071；BAA08100(β亚基)，D45071；BBA08101(γ亚基)，D45071(注意：所有三个亚基都是活性所需的)、以及肺炎克雷伯氏菌(基因库编号：AAC98384(α亚基)，AF102064；基因库编号：AAC98385(β亚基)，AF102064，基因库编号：AAC98386(γ亚基)，AF102064)。其它合适的二醇脱水酶包括但不限于B12-依赖性二醇脱水酶，其得自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)(基因库编号：AAB84102(大亚基)，AF026270；基因库编号：AAB84103(中等亚基)，AF026270；基因库编号：AAB84104(小亚基)，AF026270)；以及嗜酸乳杆菌(Lactobacilluscollinoides)(基因库编号：CAC82541(大亚基)，AJ297723；基因库编号：CAC82542(中等亚基)，AJ297723；基因库编号：CAD01091(小亚基)，AJ297723)；以及来自短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)(尤其是菌株CNRZ734和CNRZ735，Speranza等人，J.Agric.FoodChem.45：3476-3480，1997)，以及编码对应酶的核苷酸序列。二醇脱水酶基因分离的方法是本领域为人们所熟知的(例如美国专利5,686,276)。
术语“丙酮酸脱羧酶”是指催化丙酮酸脱羧成乙醛和二氧化碳的酶。丙酮酸脱羧酶已知为EC编号4.1.1.1。这些酶存在于多种酵母中，包括酿酒酵母(基因库编号：CAA97575、CAA97705、CAA97091)。
应当理解，包含如本文所提供的异丁醇生物合成途径的宿主细胞可进一步包含一个或多个附加的修饰。美国专利申请公布2009/0305363(以引用方式并入)公开了通过工程化酵母以表达定位于胞质的乙酰乳酸合酶和基本除去丙酮酸脱羧酶活性而提高丙酮酸至乙酰乳酸的转化。在一些实施例中，宿主细胞包含如美国专利申请公布2009/0305363(以引用的方式并入本文)所述的修饰以降低甘油-3-磷酸脱氢酶活性和/或破坏至少一个编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的基因或破坏至少一个编码控制丙酮酸脱羧酶基因表达的调控元件的基因，包含如美国专利申请公布2010/0120105(以引用的方式并入本文)所述对宿主细胞的修饰以提供通过恩特纳-道德洛夫途径的提高碳流量或降低的等效平衡。其它的修饰包括整合至少一种多核苷酸，所述多核苷酸编码催化利用丙酮酸的生物合成途径中一个步骤的多肽。
其它的修饰包括编码具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽的内源性多核苷酸中的至少一个缺失、突变、和/或替换。如本文所用，“乙酰乳酸还原酶活性”是指具有催化乙酰乳酸转化为DHMB的能力的任何多肽的活性。此类多肽能够通过本领域熟知的和本文所公开的方法被确定。如本文所用，“DHM”是指2，3-二羟基-2-甲基丁酸酯。DHM包括具有2S，3S构型的“快DHMB”，和具有2S，3R构型的“慢DHMB”。参见Kaneko等人，Phytochemistry39：115-120(1995)，该文献全文以引用方式并入本文，并将快DHMB称为angliceric酸，将慢DHMB称为tigliceric酸。在实施例中，具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽为酿酒酵母的YMR226C或其同源物。
附加的修饰包括编码具有醛脱氢酶和/或醛氧化酶活性的多肽的内源性多核苷酸中的缺失、突变、和/或替换。如本文所用，“醛脱氢酶活性”是指任何具有醛脱氢酶的生物学功能的多肽。此类多肽包括催化醛的氧化(脱氢)的多肽。此类多肽包括催化异丁醛转化为异丁酸的多肽。此类多肽也包括对应于酶学委员会编号EC1.2.1.3、EC1.2.1.4或EC1.2.1.5的多肽。此类多肽可通过本领域熟知的和本文所公开的方法被确定。如本文所用，“醛氧化酶活性”是指任何具有醛氧化酶的生物学功能的多肽。此类多肽包括催化由醛产生羧酸的多肽。此类多肽包括催化异丁醛转化为异丁酸的多肽。此类多肽还包括对应于酶学委员会编号EC1.2.3.1的多肽。此类多肽可通过本领域熟知的和本文所公开的方法被确定。在一些实施例中，具有醛脱氢酶活性的多肽是来自酿酒酵母的ALD6或其同源物。
其中酵母生产宿主细胞是pdc-的具有减少葡萄糖阻遏效应的基因修饰在美国专利申请公布2011/0124060中有所描述，该文献以引用的方式并入本文。在一些实施例中，缺失或下调的丙酮酸脱羧酶选自：PDC1、PDC5、PDC6、以及它们的组合。在一些实施例中，丙酮酸脱羧酶选自：来自酿酒酵母的PDC1丙酮酸脱羧酶、来自酿酒酵母的PDC5丙酮酸脱羧酶、来自酿酒酵母的PDC6丙酮酸脱羧酶、来自光滑假丝酵母(Candidaglabrata)的丙酮酸脱羧酶、来自树干毕赤酵母的PDC1丙酮酸脱羧酶、来自树干毕赤酵母的PDC2丙酮酸脱羧酶、来自乳酸克鲁维酵母的丙酮酸脱羧酶、来自解脂耶氏酵母的丙酮酸脱羧酶、来自粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的丙酮酸脱羧酶、以及来自鲁氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)的丙酮酸脱羧酶。在一些实施例中，宿主细胞含有缺失或下调的多核苷酸，其编码催化3-磷酸甘油醛转化为1，3-二磷酸甘油酸的多肽。在一些实施例中，催化这种反应的酶是3-磷酸甘油醛脱氢酶。
WIPO公布号WO2011/103300公开了包含以下的重组宿主细胞：(a)编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸；以及(b)(i)编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的内源基因中的至少一个缺失、突变、和/或替换；和/或(ii)编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的至少一种异源性多核苷酸。在实施例中，影响Fe-S簇生物合成的多肽是由AFT1、AFT2、FRA2、GRX3或CCC1编码的。在实施例中，影响Fe-S簇生物合成的多肽为组成型突变体AFT1L99A、AFT1L102A、AFT1C291F、或AFT1C293F。
此外，宿主细胞可包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸和/或编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸，如美国专利申请2012/0156735中所描述，所述专利申请以引用方式并入本文。
在一些实施例中，任何特定核酸分子或多肽可与本文所述的核苷酸序列或多肽序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。如本领域所已知的，术语“百分比同一性”是两条或更多条多肽序列之间或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较而确定。在本领域中，“同一性”还表示多肽或多核苷酸序列之间序列关联的程度，根据具体情况，它由这些序列的序列串之间的匹配程度确定。“同一性”和“相似性”可容易地通过已知方法计算出来，所述的方法包括但不限于下列文献中所公开的那些：1.)ComputationalMolecularBiology(Lesk，A.M.编辑)OxfordUniversity：USA1988；2.)Biocomputing：InformaticsandGenomeProjects(Smith，D.W.编辑)Academic：USA1993；3.)ComputerAnalysisofSequenceData，部分I(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)Humania：USA1994；4.)SequenceAnalysisinMolecularBiology(vonHeinje，G.编辑)Academic(1987)；和5.)SequenceAnalysisPrimer(Gribskov，M.和Devereux，1.编辑)Stockton：NY(1991)。
标准重组DNA和分子克隆技术为本领域所熟知，并且描述于Sambrook等人(Sambrook，J.、Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(MolecularCloning：ALaboratoryManual；ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，1989，本文称为Maniatis)以及Ausubel等人(Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology，由GreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience出版1987)。构建包含丁醇生物合成途径的微生物的方法的例子公开于例如，美国专利7,851,188、以及美国专利申请公布2007/0092957；2007/0259410；2007/0292927；2008/0182308；2008/0274525；2009/0155870；2009/0305363；以及2009/0305370，所述专利各自的全部内容以引用方式并入本文。
丁醇生物合成途径在酿酒酵母中的表达
用于酿酒酵母中基因表达的方法是本领域已知的(例如，Methodsin Enzymology，第194卷，GuidetoYeastGeneticsandMolecularandCell Biology，部分A，2004，ChristineGuthrie和GeraldR.Fink，编辑，ElsevierAcademicPress，SanDiego，CA)。酵母中的基因表达通常需要在受关注的基因前的启动子和转录终止子。多种酵母启动子，包括本文的实例中所使用的那些，可被用于构建用于编码异丁醇生物合成途径的基因的表达盒，包括但不限于组成型启动子FBA、GPD、ADH1、和GPM，以及诱导型启动子GAL1、GAL10、和CUP1。合适的转录终止子包括但不限于FBAt、GPDt、GPMt、ERG10t、GAL1t、CYC1、和ADH1。例如，合适的启动子、转录终止子、和异丁醇生物合成途径的基因可被克隆到大肠杆菌-酵母穿梭载体中，并转化到酵母细胞中，如美国专利申请公布2010/0129886中所述。这些载体允许菌株在大肠杆菌和酵母菌株两者中繁殖。载体通常包含选择性标记和在目标宿主中允许自主复制或染色体整合的序列。在酵母中通常使用的质粒是穿梭载体pRS423、pRS424、pRS425和pRS426(美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)，它们包含大肠杆菌复制起点(例如，pMB1)、酵母2μ复制起点，以及用于营养选择的标记。这四种载体的选择标记物是His3(载体pRS423)、Trp1(载体pRS424)、Leu2(载体pRS425)和Ura3(载体pRS426)。具有编码所关注的多肽的基因的表达载体的构建，可通过标准分子克隆技术在大肠杆菌中或者通过缺口修复重组方法在酵母中进行。
缺口修复克隆方法利用了酵母中高效的同源重组。典型地，酵母载体DNA被消化(例如，在其多克隆位点中)，以在其序列中产生“缺口”。生成了许多受关注的***DNA，所述***DNA在5′和3′端两处包含≥21bp的序列，这些序列彼此依次重叠，并且与载体DNA的5′和3′末端重叠。例如，为构建“基因X”的酵母表达载体，选择了用于表达盒的酵母启动子和酵母终止子。所述启动子和终止子扩增自酵母基因组DNA，而基因X通过PCR扩增自其源生物体，或从包含基因X序列的克隆载体中获得。至少21bp的重叠序列存在于线性载体和启动子序列的5′之间、启动子和基因X之间、基因X和终止子序列之间、以及在终止子和线性载体3′端之间。然后将“带缺口”的载体和***DNA共转化到酵母菌株中，并铺板于包含适当的化合物混合物的培养基上，所述混合物允许质粒上营养选择标记的互补作用。通过利用从选择的细胞制备的质粒DNA进行聚合酶链反应作图可验证正确的***组合的存在。然后可将从酵母分离的质粒DNA(通常浓度较低)转化到大肠杆菌菌株中，例如TOP10，然后通过小量抽提和限制性作图进一步验证所述质粒构建体。最后，所述构建体可通过序列分析进行验证。
与缺口修复技术类似，整合到酵母基因组中也利用了酵母中的同源重组***。典型地，利用高保真度DNA聚合酶和引物，包含编码区加上控制元件(启动子和终止子)和营养缺陷型标记的盒被PCR扩增，其中所述引物与所述盒杂交，并且包含与期望***发生的基因组区域的5′和3′区同源的40-70碱基对的序列。然后将PCR产物转化到酵母中，并铺板于包含适当的化合物混合物的培养基上，所述混合物允许对所整合的营养缺陷型标记的选择。例如，为了将“基因X”整合到染色***置“Y”中，从质粒DNA构建体PCR扩增了启动子-编码区X-终止子构建体，并通过重叠延伸PCR(SOEPCR)或常规的限制性酶切和克隆与营养缺陷型标记(诸如URA3)连接。所述全长盒，包含启动子-编码区X-终止子-URA3区，是使用引物序列进行PCR扩增得到的，所述引物序列包含40-70个碱基对，与酵母染色体上的位置“Y”的5′和3′区同源。所述PCR产物被转化到酵母中，并在缺乏尿嘧啶的生长培养基上进行选择。转化体可通过菌落PCR或通过对染色体DNA的直接测序得到验证。
用于生产的生长
使本文公开的重组宿主细胞与合适的碳底物接触，通常在发酵培养基中。附加的碳底物可包括但不限于：单糖，诸如果糖；低聚糖，诸如乳糖、麦芽糖、半乳糖或蔗糖；多糖，诸如淀粉或纤维素或它们的混合物；以及来自可再生原料的未纯化混合物，诸如干酪乳清渗透物、玉米浆、糖用甜菜糖蜜和大麦麦芽。其它碳底物可包括乙醇、乳酸盐、琥珀酸盐或甘油。
另外，碳底物也可以是已被证明可以被代谢转化为关键生化中间产物的诸如二氧化碳的一碳底物或甲醇。除了一碳和二碳底物之外，甲基营养生物体也已知利用多种其它含碳化合物，诸如甲胺、葡糖胺和用于代谢活动的多种氨基酸。例如，甲基营养酵母已知利用来自甲胺的碳来形成海藻糖或甘油(Bellion等人，Microb.GrowthC1Compd.，[Int.Symp.]，7th(1993)，415-32，编辑：Murrell、J.Collin、Kelly、DonP.；出版社：Intercept，Andover，UK)。类似地，假丝酵母属的多种菌种将会代谢丙氨酸或油酸(Sulter等人Arch.Microbiol.153：485-489(1990))。因此，预期本发明中所利用的碳源可涵盖各种含碳底物并且将仅受限于生物体的选择。
尽管预期以上提及的所有碳底物以及它们的混合物均适用于本发明，但是在一些实施例中，对于经过修饰以利用C5糖的酵母细胞，碳底物是葡萄糖、果糖和蔗糖，或者是它们与C5糖诸如木糖和/或***糖的混合物。蔗糖可衍生自可再生的糖源诸如甘蔗、甜菜、木薯、甜高粱、以及它们的混合物。葡萄糖和右旋糖可通过淀粉基原料包括谷物诸如玉米、小麦、裸麦、大麦、燕麦、以及它们的混合物的糖化来源于可再生的谷物来源。此外，可发酵的糖类可通过预处理和糖化过程来源于可再生的纤维素的或木质纤维素的生物质，例如，如美国专利申请公布2007/0031918A1中所述，该专利以引用方式并入本文。在参考碳底物使用时，生物质指任何纤维素或木质纤维素材料，并包括包含纤维素的材料、以及任选地还包含半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖和/或单糖的材料。生物质还可包含附加组分诸如蛋白质和/或脂质。生物质可来源于单一来源，或者生物质可包括来源于一种以上来源的混合物；例如，生物质可包括玉米芯和玉米秸秆的混合物，或草和叶片的混合物。生物质包括但不限于：生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的例子包括但不限于：玉米粒、玉米芯、作物残余物诸如玉米壳、玉米秸秆、玉米纤维、草、小麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、蔗渣、高粱、大豆、获取自谷物、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木及矮树丛、蔬菜、水果、花和动物粪肥、以及它们的混合物的研磨物的组分。
除了适合的碳源之外，发酵液体培养基还必须包含本领域的技术人员已知的适合培养物的生长并促进本文所述的酶途径的适合的矿物、盐、辅因子、缓冲液和其他组分。
培养条件
通常，使细胞在约20℃至约40℃范围内的温度下在合适的培养基中生长。本发明中的合适的生长培养基是普通的商业制备的培养基，诸如LuriaBertani(LB)液体培养基、沙氏葡糖(SD)液体培养基或酵母培养基(YM)液体培养基、或包含酵母氮源、硫酸铵和右旋糖(作为碳/能源)的液体培养基，或YPD培养基——蛋白胨、酵母提取物和右旋糖以大多数酿酒酵母菌株生长的最适比例混合的共混物。其他确定的或合成的生长培养基也可被使用，微生物学或发酵科学领域的技术人员将知道用于具体微生物生长的合适培养基。已知用于直接或间接调节分解代谢物阻遏的试剂，例如环腺苷2′，3′-单磷酸(cAMP)，也可以掺入发酵培养基中。
适于发酵的pH范围在pH5.0到pH9.0之间，其中pH6.0至pH8.0优选作为起始条件。对于酵母的发酵，适合的pH范围通常是介于约pH3.0至约pH9.0之间。在一个实施例中，初始条件采用了约pH5.0至约pH8.0。对于其他微生物的发酵，适合的pH范围介于约pH3.0至约pH7.5之间。在一个实施例中，初始条件采用了约pH4.5至约pH6.5。
发酵可在有氧或厌氧条件下进行。在一个实施例中，厌氧或微氧条件被用于发酵。
工业分批发酵和连续发酵
丁醇，或其它产物，可使用分批的发酵方法生产。经典的分批发酵是封闭***，其中培养基的组成在发酵开始时设定并且在发酵过程中不进行人工改变。标准分批式***的一种变型是补料分批***。补料分批发酵工艺也适用于本发明，并且包括典型的分批式***，不同的是随着发酵进程递增地添加底物。在分解代谢物阻遏往往抑制细胞的代谢作用以及在期望培养基中具有有限量的底物的情况下，补料分批式***是有用的。分批发酵和补料-分批发酵在本领域中是常用的且是本领域所熟知的，并且例子可见于如下文献：ThomasD.Brock，Biotechnology：ATextbookofIndustrialMicrobiology，第二版，1989，SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA.)中，或者Deshpande，MukundV.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36：227，(1992)，它们以引用方式并入本文。
丁醇，或其它产物，也可用连续发酵方法生产。连续发酵是一种开放式***，其中将设定好的发酵培养基连续加入生物反应器中，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续发酵一般使培养物维持在恒定的高密度下，其中细胞主要处于对数生长期。连续发酵允许调节一种因素或任意数目的因素，这些因素影响细胞生长或终产物浓度。调节连续发酵工艺的营养物质和生长因子的方法以及使产物形成的速率保持最高水平的技术是工业微生物领域众所周知的，并且多种方法已由Brock(同上)详细描述。
预期采用分批、补料分批或连续过程进行的丁醇或其它产物的生产可以实行，并且任何已知的发酵模式将是合适的。另外，预期可以将细胞固定在底物上而作为完整的细胞催化剂并让其经受发酵条件以生产丁醇。
用于从发酵培养基中分离丁醇的方法
对于ABE发酵使用本领域已知方法，生物生产的丁醇可从发酵培养基中分离出来(参见例如，Durre，Appl.Microbiol.Biotechnol.49：639-648(1998)，Groot等人(1992)Process.Biochem.27：61-75(1992)，以及其中的参考文献)。例如，可通过离心、过滤、滗析等方法从发酵培养基中除去固体。可使用诸如蒸馏、共沸蒸馏、液液萃取、吸附、汽提、膜蒸发、或全蒸发的方法从发酵培养基中分离丁醇。
因为丁醇与水形成低沸点的共沸混合物，蒸馏可被用于分离混合物直至其共沸组成。蒸馏可与本文描述的方法组合使用以便分离共沸物。可与蒸馏组合使用以便分离并纯化丁醇的方法包括但不限于滗析、液-液萃取、吸附和基于膜的技术。此外，可使用共沸蒸馏用夹带剂(参见例如Doherty和Malone，ConceptualDesignofDistillationSystems，McGrawHill，NewYork，2001)分离丁醇。
丁醇-水混合物形成非均相共沸物，从而可组合使用蒸馏和滗析以分离并纯化异丁醇。在这种方法中，包含丁醇的发酵液被蒸馏至接近共沸组成。然后，冷凝共沸混合物，通过滗析从发酵培养基分离丁醇。滗析后的水相可作为回流物返回到第一蒸馏塔或返回到独立的汽提塔。富含丁醇的滗析有机相可通过在第二蒸馏塔中蒸馏进一步被纯化。
也可组合使用液-液萃取和蒸馏从发酵培养基中分离丁醇。在这种方法中，使用液-液提取用合适溶剂从发酵液中提取丁醇。然后蒸馏包含丁醇的有机相以从溶剂中分离丁醇。
蒸馏与吸附组合也可用于从发酵培养基中分离丁醇。在这种方法中，蒸馏包含丁醇的发酵液使其接近共沸组成，然后使用吸附剂诸如分子筛移除剩余的水(Aden等人，LignocellulosicBiomasstoEthanolProcessDesignandEconomicsUtilizingCo-CurrentDiluteAcidPrehydrolysisandEnzymaticHydrolysisforCornStover，ReportNREL/TP-510-32438，NationalRenewableEnergyLaboratory，2002年6月)。
此外，可组合使用蒸馏和全蒸发以从发酵培养基中分离和纯化丁醇。在这种方法中，蒸馏包含丁醇的发酵液使其接近共沸组合物，然后用全蒸发通过亲水性膜移除剩余的水(Guo等人，J.Membr.Sci.245，199-210(2004))。
当生产丁醇时可使用原位产物移除(ISPR)(也称为提取发酵)从发酵容器中移除丁醇(或其他发酵性醇)，从而使得微生物以高收率生产丁醇。本领域已经描述过的一种用于移除发酵性醇的ISPR方法是液-液萃取。一般来讲，就丁醇发酵而言，例如，使包含微生物的发酵培养基在丁醇浓度达到毒性水平之前的时间与有机提取剂接触。所述有机提取剂和所述发酵培养基形成两相混合物。所述丁醇分配至有机提取剂相，降低了包含微生物的水相中的浓度，从而限制了微生物在抑制性的丁醇中的暴露。
可进行液-液萃取，例如根据美国专利申请公布2009/0305370和2011/0097773中描述的方法，其公开内容特此全文并入。美国专利申请公布2009/0305370和2011/0097773描述了用于生产丁醇和采用液-液萃取从发酵液体培养基中回收丁醇的方法，所述方法包括以下步骤：使发酵液体培养基与水不混溶的提取剂接触，以形成包含水相和有机相的两相混合物。通常，提取剂可以为有机提取剂，其选自饱和的、单不饱和的、多不饱和的(以及它们的混合物)C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、以及它们的混合物。用于ISPR的一种或多种提取剂可以为非醇提取剂。ISPR提取剂可以为外源有机提取剂诸如油醇、二十二醇、鲸蜡醇、月桂醇、肉豆蔻醇、硬脂醇、1-十一烷醇、油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、肉豆蔻酸甲酯、油酸甲酯、十一烷醛、月桂醛、20-甲基十一烷醛、以及它们的混合物。
在一些实施例中，通过使发酵液体培养基中的醇与有机酸(例如，脂肪酸)和能够使所述醇与所述有机酸酯化的催化剂接触可形成醇酯。在此类实施例中，所述有机酸可作为所述醇酯被分配至其中的ISPR提取剂。有机酸可被补充至发酵容器和/或来源于被进料至发酵容器的供应可发酵碳的生物质。原料中存在的脂质可被催化水解为有机酸，并且相同的催化剂(例如，酶)可使有机酸与醇酯化。在某些实施例中，可利用上述催化剂(例如，酶)将原料中存在的脂质转化为脂肪酸和甘油。甘油可例如被提供至发酵容器，以补充本文所述的具有减少的甘油产生的微生物。补充微生物可例如改善生物质生产和微生物细胞健康状态。将以超过酵母在发酵条件下所产生的足够的量提供甘油。在发酵期间产生的羧酸可另外用由相同或不同催化剂产生的醇酯化。催化剂可在发酵之前被供应至原料，或者可在原料的供应之前或与其同时地被供应至发酵容器。当催化剂被提供至发酵容器时，通过脂质水解为有机酸和有机酸与发酵容器中存在的丁醇基本上同时的酯化作用，可获得醇酯。并非来源于原料的有机酸和/或天然油也可被进料至发酵容器，其中天然油被水解为有机酸。任何不与所述醇酯化的有机酸可作为ISPR提取剂的部分。包含醇酯的提取剂可被从发酵液体培养基中分离，并且可从所述提取剂中回收醇。提取剂可被再循环至发酵容器。如此，就丁醇生产的情况而言，例如，丁醇至酯的转化降低了发酵培养基中的游离丁醇浓度，保护了微生物免受增大的丁醇浓度的毒性影响。此外，未分级的谷物可被用作原料而没有分离其中的脂质，因为脂质可被催化水解为有机酸，从而降低了脂质在ISPR提取剂中积累的速率。
原位产物移除可在分批模式或连续模式中进行。在连续模式的原位产物移除中，产物被连续地从反应器中移出。在分批模式的原位产物移除中，一定体积的有机提取剂被添加至发酵容器，并且提取剂在过程期间不被移出。对于原位产物移除，有机提取剂可在发酵开始时与发酵培养基接触，形成两相的发酵培养基。作为另外一种选择，有机提取剂可在微生物达到期望的生长量之后接触发酵培养基，其中期望的生长量可通过测定培养物的光密度确定。此外，有机提取剂可在发酵培养基中的产物醇含量达到预选含量时接触发酵培养基。就根据本发明的一些实施例的丁醇生产的情况而言，有机酸提取剂可在丁醇浓度达到毒性水平之前的时间接触发酵培养基，使得丁醇与有机酸酯化以产生丁醇酯，并从而降低发酵容器中的丁醇浓度。然后，包含酯的有机相可在达到所期望的丁醇酯的有效滴度之后被从发酵容器中移出(并从构成水相的发酵液体培养基中分离)。在一些实施例中，包含酯的有机相在发酵容器中的可用的可发酵糖的发酵基本上完成之后被从水相中分离。
异丁醇生产的确认
异丁醇在培养基中的存在和/或浓度可通过本领域中已知的多种方法(参见，例如，美国专利7,851,188，该专利以引用方式并入本文)测定。例如，一种特异性的使用ShodexSH-1011柱和ShodexSHG保护柱(二者均可购自WatersCorporation(Milford，Mass.))并配有折射率(RI)检测的高效液相色谱(HPLC)方法。用0.01MH2SO4作为流动相，以0.5mL/分钟的流速和50℃的柱温实现色谱分离。异丁醇在所使用的条件下具有46.6min的保留时间。
另选地，气相色谱法(GC)是可用的。例如，特异性的GC方法利用HP-INNOWax柱(30m×0.53mm内径，1μm膜厚度，AgilentTechnologies(Wilmington，DE))，配有火焰离子化检测器(FID)。载气为氦气，流速为4.5mL/min，在150℃和恒定头部压力下测得；注入器分流为200℃下1∶25；烘箱温度为45℃持续1min，以10℃/min从45至220℃，以及220℃持续5min；并且在240℃和26mL/min的氦气补充气体下采用FID检测。异丁醇的保留时间为4.5分钟。
尽管本发明的多个实施例已如本文所述，但是应当理解它们仅仅以举例的方式存在，并且不受限制。对相关领域的技术人员将显而易见的是能够在不脱离本发明的实质和范围下对其进行形式和细节的多种改变。因此，本发明的广度和范围应不受任何上述示例性实施例的限制，但应仅仅根据以下权利要求及其等同物限定。
在本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请均指示本发明所属领域的技术人员的技术水平，并且以引用方式并入本文至如同每个单独的公布、专利或专利申请被具体且单独地指明为以引用方式并入的相同程度。
实例
本发明将在以下的实例中进一步阐述。应该理解，尽管这些实例说明了本发明的实施例，但仅是以例证的方式给出的。通过上述论述和这些实例，本领域的技术人员可确定本发明的必要特征，并且在不脱离本发明的实质和范围内的前提下，可对本发明进行各种变化和修改以适应多种用途和条件。
一般方法
实例中所用的标准重组DNA、分子克隆技术和转化方案在本领域内是众所周知的，并且在下列文献中有所描述：Sambrook等人(MolecularCloning：(Sambrook，J.、Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(MolecularCloning：ALaboratoryManual；ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，1989，本文称为Maniatis)以及Ausubel等人(Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience出版，1987)以及Amberg等人(Amberg，D.C.、Burke，D.J.和Strathem，J.N.(MethodsinYeastGenetics：AColdSpringHarborLaboratoryCourseManual，ColdSpringHarborPress，2005)。适于细菌培养物维持及生长的材料和方法在领域所熟知的。下列实例中适用的技术描述可在下列文献中查到：ManualofMethodsforGeneralBacteriology(Phillipp等人编辑，AmericanSocietyforMicrobiology，Washington，DC.，1994)或ThomasD.Brock((Brock，Biotechnology：ATextbookofIndustrialMicrobiology，第二版，SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA(1989)。所有试剂、限制性酶和用于细菌细胞的生长和维持的材料可购自SigmaAldrichChemicals(St.Louis，MO)、BDDiagnosticSystems(Sparks，MD)、Invitrogen(Carlsbad，CA)、HiMedia(Mumbai，India)、SDFinechemicals(India)、或TakaraBioInc.(Shiga，Japan)，除非另外指明。
缩写的含义如下：“sec”指秒，“min”指分钟，“h”指小时，“nm”指纳米，“uL”指微升，“mL”指毫升，“mg/mL”指毫克每毫升，“L”指升，“nm”指纳米，“mM”指毫摩尔，“M”指摩尔，“mmol”指毫摩尔，“μmole”指微摩尔，“kg”指千克，“g”指克，“μg”指微克，“ng”指纳克，“PCR”指聚合酶链反应，“OD”指光密度，“OD600”指在600nm波长下测量的光密度，“kDa”指千道尔顿，“g”也可指引力常数，“bp”指碱基对，“kbp”指千碱基对，“kb”指千碱基，“％”指百分比，“％w/v”指重量/体积百分比，“％v/v”指体积/体积百分比，“HPLC”指高效液相色谱，“g/L”指克每升，“μg/L”指微克每升，“ng/μL”指纳克每微升，“pmol/μL”指皮摩尔每微升，“RPM”指每分钟转数，“μmol/min/mg”指微摩尔每分钟每毫克，“w/v”指每单位体积重量，“v/v”指每单位体积体积。
菌株构建
菌株PNY2115的构建
酿酒酵母菌株PNY0827被用作PNY2115的进一步基因操作的宿主细胞。PNY0827是指来源于酿酒酵母的一种菌株，其根据2011年9月22日的布达佩斯条约被保藏于ATCC，美国典型培养物保藏中心，PatentDepository10801UniversityBoulevard，Manassas，VA20110-2209，并且具有专利保藏命名PTA-12105。
URA3的缺失和产孢成单倍体
为删除内源URA3编码区，缺失盒通过PCR扩增自pLA54(SEQIDNO：95)，其包含PTEF1-kanMX4-TEF1t盒，盒侧接loxP位点以允许体内同源重组以及后续移除KANMX4标记。使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix(NewEnglandBioLabs；Ipswich，MA)和引物BK505(SEQIDNO：96)和BK506(SEQIDNO：97)进行PCR。每种引物的URA3部分来源于URA3ATG上游的5′区180bp和编码区下游的3′区78bp，使得kanMX4盒整合导致URA3编码区的替换。使用标准基因技术将所述PCR产物转化到PNY0827中(MethodsinYeastGenetics，2005，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，第201-202页)并且在30℃补充了2％葡萄糖和100μg/mL遗传霉素的YEP培养基上选择转化子。通过菌落PCR筛选转化子以验证所述整合盒的存在，所用引物为LA468(SEQIDNO：98)和LA492(SEQIDNO：99)。获得了杂合二倍体：NYLA98，其具有基因型MATa/αURA3/ura3：：loxP-kanMX4-loxP。为获得单倍体，使用标准方法形成NYLA98孢子(CodónAC，Gasent-RamírezJM，BenítezT.Factorswhichaffectthefrequencyofsporulation和tetradformationinSaccharomycescerevisiaebaker′syeast.ApplEnvironMicrobiol.1995PMID：7574601)。四分体用微操作器解剖并在补充了2％葡萄糖的丰富YPE培养基上生长。将含有四个活孢子的四分体接种至不含尿嘧啶补充了2％葡萄糖的合成完全培养基上，并且通过多重菌落PCR验证交配型，所用引物为AK109-1(SEQIDNO：100)、AK109-2(SEQIDNO：101)、以及AK109-3(SEQIDNO：102)。所得的经鉴定的单倍体菌株被称为NYLA103(其具有基因型：MATaura3Δ：：loxP-kanMX4-loxP)和NYLA106(其具有基因型：MATaura3Δ：：loxP-kanMX4-loxP)。
His3的缺失
为删除内源HIS3编码区，使用了无痕缺失盒。用于无痕HIS3缺失的PCR盒的四个片段的扩增使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix(NewEnglandBioLabs；Ipswich，MA)并以CEN.PK113-7D基因组DNA为模板，用GentraPuregeneYeast/Bact试剂盒(Qiagen；Valencia，CA)制备。HIS3片段A使用以下引物进行扩增：引物oBP452(SEQIDNO：103)，和引物oBP453(SEQIDNO：104)，其包含与HIS3片段B的5′端同源的5′尾。HIS3片段B使用以下引物进行扩增：引物oBP454(SEQIDNO：105)，其包含与HIS3片段A的3′端同源的5′尾，和引物oBP455(SEQIDNO：106)，其包含与HIS3片段U的5′端同源的5′尾。HIS3片段U使用以下引物进行扩增：引物oBP456(SEQIDNO：107)，其包含与HIS3片段B的3′端同源的5′尾，和引物oBP457(SEQIDNO：108)，其包含与HIS3片段C的5′端同源的5′尾。HIS3片段C使用以下引物进行扩增：引物oBP458(SEQIDNO：109)，其包含与HIS3片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP459(SEQIDNO：110)。用PCRPurification试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物。HIS3片段AB通过重叠PCR产生，通过混合HIS3片段A和HIS3片段B并用引物oBP452(SEQIDNO：103)和oBP455(SEQIDNO：106)进行扩增。HIS3片段UC通过重叠PCR产生，通过混合HIS3片段U和HIS3片段C并用引物oBP456(SEQIDNO：107)和oBP459(SEQIDNO：110)进行扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过GelExtraction试剂盒(Qiagen)纯化。HIS3ABUC盒通过重叠PCR产生，通过混合HIS3片段AB和HIS3片段UC并用引物oBP452(SEQIDNO：103)和oBP459(SEQIDNO：110)进行扩增。用PCRPurification试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物。用HIS3ABUCPCR盒转化NYLA106的感受态细胞并且将其涂布在30℃的不含尿嘧啶并补充2％葡萄糖的合成完全培养基上。通过影印涂布到30℃不含组氨酸并补充2％葡萄糖的合成完全培养基上来筛选转化子，以验证正确整合。制备基因组DNA以通过PCR验证整合，对于5′端，所用引物为oBP460(SEQIDNO：111)和LA135(SEQIDNO：112)，对于3′端，所用引物为oBP461(SEQIDNO：113)和LA92(SEQIDNO：114)。URA3标记的回收是通过按照标准规程涂布于30℃补充2％葡萄糖和5-FOA的合成完全培养基上。通过将来自所述5-FOA平板的菌落接种至SD-URA培养基上以验证生长的抑制来确认标记的移除。所得的经过鉴定的称为PNY2003的菌株具有下列基因型：MATaura3Δ：：loxP-kanMX4-loxPhis3Δ。
PDC1的缺失
为删除内源性PDC1编码区，缺失盒通过PCR扩增自pLA59(SEQIDNO：115)，其包含URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点，以允许体内同源重组以及后续移除URA3标记。使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix(NewEnglandBioLabs；Ipswich，MA)和引物LA678(SEQIDNO：116)和LA679(SEQIDNO：117)进行PCR。每种引物的PDC1部分来源于PDC1起始密码子的上游5′区50bp和终止密码子的下游3′区50bp，使得URA3盒的整合导致PDC1编码区被替换，但保留了所述编码区的最初50bp和最后50bp。使用标准基因技术将PCR产物转化到PNY2003中，在30℃不含尿嘧啶并且补充了2％葡萄糖的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR筛选转化子以验证正确整合，所用引物为LA337(SEQIDNO：118)，其位于5′编码区的外部，和LA135(SEQIDNO：112)，其为URA3内部引物。然后通过菌落PCR筛选阳性转化子，所用引物为LA692(SEQIDNO：119)和LA693(SEQIDNO：120)，其位于PDC1编码区的内部。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34(SEQIDNO：121)转化，并且涂布在30℃不含组氨酸并补充了2％葡萄糖的合成完全培养基上。将转化子接种在补充了0.5％半乳糖的丰富培养基上以诱导重组酶。通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了2％葡萄糖的合成完全培养基以验证生长的抑制来确认标记的移除。所得的经过鉴定的被称为PNY2008的菌株，具有下列基因型：MATaura3Δ：：loxP-kanMX4-loxPhis3Δpdc1Δ：：loxP71/66。
PDC5的缺失
为删除内源性PDC5编码区，缺失盒通过PCR扩增自pLA59(SEQIDNO：115)，其包含URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点，以允许体内同源重组以及后续移除URA3标记。使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix(NewEnglandBioLabs；Ipswich，MA)和引物LA722(SEQIDNO：122)和LA733(SEQIDNO：123)进行PCR。每种引物的PDC5部分来源于PDC5起始密码子上游的5′区50bp和终止密码子下游的3′区50bp，使得URA3盒的整合导致整个PDC5编码区的替换。使用标准基因技术将所述PCR产物转化到PNY2008中，在30℃不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR筛选转化子以验证正确整合，所用引物为LA453(SEQIDNO：124)，其位于5′编码区的外部，和LA135(SEQIDNO：112)，其为URA3内部引物。然后通过菌落PCR筛选阳性转化子，所用引物为LA694(SEQIDNO：125)和LA695(SEQIDNO：126)，其位于PDC5编码区的内部。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34(SEQIDNO：121)进行转化，并且涂布在30℃不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。将转化子涂布在补充了1％乙醇和0.5％半乳糖的丰富YEP培养基上以诱导重组酶。通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基以验证生长的抑制来确认标记的移除。所得的经过鉴定的被称为PNY2009的菌株，具有下列基因型：MATaura3Δ：：loxP-kanMX4-loxPhis3Δpdc1Δ：：loxP71/66pdc5Δ：：loxP71/66。
FRA2的缺失
FRA2缺失被设计为从编码序列的3′端删除250个核苷酸，保留FRA2编码序列的最初113个核苷酸完整。一个同框终止密码子出现在缺失的下游7个核苷酸的位置。用于无痕FRA2缺失的PCR盒的四个片段的扩增使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix(NewEnglandBioLabs；Ipswich，MA)并以CEN.PK113-7D基因组DNA为模板，用GentraPuregeneYeast/Bact试剂盒(Qiagen；Valencia，CA)制备。FRA2片段A使用以下引物进行扩增：引物oBP594(SEQIDNO：127)和引物oBP595(SEQIDNO：128)，其包含与FRA2片段B的5′端同源的5′尾。FRA2片段B使用以下引物进行扩增：引物oBP596(SEQIDNO：129)，其包含与FRA2片段A的3′端同源的5′尾，和引物oBP597(SEQIDNO：130)，其包含与FRA2片段U的5′端同源的5′尾。FRA2片段U使用以下引物进行扩增：引物oBP598(SEQIDNO：131)，其包含与FRA2片段B的3′端同源的5′尾，和引物oBP599(SEQIDNO：132)，其包含与FRA2片段C的5′端同源的5′尾。FRA2片段C使用以下引物进行扩增：引物oBP600(SEQIDNO：133)，其包含与FRA2片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP601(SEQIDNO：134)。用PCRPurification试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物。FRA2片段AB通过重叠PCR产生，通过混合FRA2片段A和FRA2片段B并用引物oBP594(SEQIDNO：127)和oBP597(SEQIDNO：130)进行扩增。FRA2片段UC通过重叠PCR产生，通过混合FRA2片段U和FRA2片段C并用引物oBP598(SEQIDNO：131)和oBP601(SEQIDNO：134)进行扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过GelExtraction试剂盒(Qiagen)纯化。FRA2ABUC通过重叠PCR产生，通过混合FRA2片段AB和FRA2片段UC并用引物oBP594(SEQIDNO：127)和oBP601(SEQIDNO：134)进行扩增。用PCRPurification试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物。
为删除内源性FRA2编码区，使用标准技术将上述获得的无缝缺失盒转化到PNY2009中并涂布于不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。制备基因组DNA以通过PCR验证整合，对于5′端使用引物oBP602(SEQIDNO：135)和LA135(SEQIDNO：112)，并且使用引物oBP602(SEQIDNO：135)和oBP603(SEQIDNO：136)以扩增整个基因座。URA3标记的回收是通过按照标准规程涂布于30℃补充了1％乙醇和5-FOA(5-氟乳清酸)的合成完全培养基上。通过将来自5-FOA平板的菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上以验证生长的抑制来确认标记的移除。所得的经鉴定的菌株PNY2037具有下列基因型：MATaura3Δ：：loxP-kanMX4-loxPhis3ΔpdclΔ：：loxP71/66pdc5Δ：：loxP71/66fra2Δ。
加入天然2微米质粒
使用来自pLA59(SEQIDNO：115)的PhusionDNA聚合酶(NewEnglandBioLabs；Ipswich，MA)PCR扩增loxP71-URA3-loxP66标记，并且在30℃下于SE-URA平板上与LA811×817(SEQIDNO：137、138)和LA812×818(SEQIDNO：139、140)2微米质粒片段(由来自CEN.PK113-7D的天然2微米质粒扩增；CentraalbureauvoorSchimmelcultures(CBS)真菌生物多样性中心)一起转化到菌株PNY2037中。用pLA34(pRS423：：cre)(也称为pLA34)(SEQIDNO：121)转化所得的菌株PNY20372μ：：loxP71-URA3-loxP66并且在30℃SE-HIS-URA平板上进行选择。将转化子接种至YP-1％半乳糖平板上，使其在30℃下生长48小时以诱导Cre重组酶表达。然后将单个菌落接种至SE-URA、SE-HIS和YPE平板上以确认URA3标记移除。所得的经鉴定的菌株PNY2050具有下列基因型：MATaura3Δ：：loxP-kanMX4-loxP，his3Δpdc1Δ：：loxP71/66pdc5Δ：：loxP71/66fra2Δ2-μ。
从PNY2050构建PNY2115
如下从PNY2050构建PNY2115[MATaura3Δ：：loxPhis3Δpdc5Δ：：loxP66/71fra2Δ2-微米质粒(CEN.PK2)pdc1Δ：：P[PDC1]-ALS□alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66pdc6Δ：：(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD□Lg(y)-TDH3t-loxP71/66adh1Δ：：P[ADH1]-ADH□Bi(y)ADHt-loxP71/66fra2Δ：：P[ILV5]-ADH□Bi(y)-ADHt-loxP71/66gpd2Δ：：loxP71/66]。
Pdc1Δ：：P[PDC1]-ALS□alsSBs-CYC1t-loxP71/66
为将alsS整合到PNY2050的pdc1Δ：：loxP66/71基因座中(使用内源性PDC1启动子)，整合盒通过PCR扩增自pLA71(SEQIDNO：146)，其包含来自菌种枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合酶基因，所述基因带有FBA1启动子和CYC1终止子以及URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点以允许体内同源重组以及后续的URA3标记移除。通过使用KAPAHiFi以及引物895(SEQIDNO：149)和679(SEQIDNO：150)进行PCR。每种引物的PDC1部分来源于所述编码序列的上游的60bp和位于终止密码子的上游53bp的50bp。使用标准基因技术将所述PCR产物转化到PNY2050中，在30℃不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR筛选转化子以验证正确整合，所用引物为681(SEQIDNO：151)，其位于3′编码区的外部，和92(SEQIDNO：152)，其位于URA3基因内部。然后制备阳性转化子以用于基因组DNA，并且通过PCR进行筛选，所用引物为N245(SEQIDNO：153)和N246(SEQIDNO：154)。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34(SEQIDNO：121)进行转化，并且涂布在30℃不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。将转化子涂布在补充了1％乙醇和0.5％半乳糖的丰富培养基上以诱导重组酶。通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基以验证生长的抑制来确认标记的移除。所得的经鉴定的被称为PNY2090的菌株，具有基因型：MATaura3Δ：：loxP，his3Δ，pdc1Δ：：loxP71/66，pdc5Δ：：loxP71/66fra2Δ2-μpdc1Δ：：P[PDC1]-ALS□alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66。
Pdc6Δ：：(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD□Lg(y)-TDH3t-loxP71/66
为了删除内源性PDC6编码区，整合盒通过PCR扩增自pLA78(SEQIDNO：147)，其包含来自菌种格氏李斯特菌的kivD基因，所述基因带有杂合的FBA1启动子和TDH3终止子以及URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点以允许体内同源重组以及后续的URA3标记移除。通过使用KAPAHiFi以及引物896(SEQIDNO：155)和897(SEQIDNO：156)进行PCR。每种引物的PDC6部分来源于所述编码序列上游的60bp和所述编码区下游的59bp。使用标准基因技术将所述PCR产物转化到PNY2090中，在30℃不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR筛选转化子来验证正确整合，所用引物为365(SEQIDNO：157)和366(SEQIDNO：158)，其为PDC6基因的内部引物。然后通过菌落PCR筛选产物不存在的转化子，N638(SEQIDNO：159)，其位于所述基因的5’端，和740(SEQIDNO：160)，其位于FBA1启动子内部。然后制备阳性转化子以用于基因组DNA并使用PDC6编码序列的两个外部引物通过PCR进行筛选。阳性整合子会产生4720bp的产物，而PDC6野生型转化子会产生2130bp的产物。通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34转化，并且涂布在30℃不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上来对URA3标记进行回收利用。将转化子涂布在补充了1％乙醇和0.5％半乳糖的丰富培养基上以诱导重组酶。通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基以验证生长的抑制来确认标记的移除。所得的经鉴定的被称为PNY2093的菌株，具有基因型：MATaura3Δ：：loxPhis3Δpdc5Δ：：loxP71/66fra2Δ2-μpdc1Δ：：P[PDC1]-ALS□alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66pdc6Δ：：(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD□Lg(y)-TDH3t-loxP71/66。
Adh1Δ：：P[ADH1]-ADH□Bi(y)-ADHt-loxP71/66
为了删除内源性ADH1编码区并且使用内源ADH1启动子整合BiADH，整合盒通过PCR扩增自pLA65(SEQIDNO：148)，其包含来自菌种印度拜叶林克氏菌(Beijerinckii)的醇脱氢酶，所述醇脱氢酶带有ILV5启动子和ADH1终止子以及URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点以允许体内同源重组以及后续的URA3标记移除。通过使用KAPAHiFi以及引物856(SEQIDNO：161)和857(SEQIDNO：162)进行PCR。每种引物的ADH1部分来源于ADH1起始密码子上游的5’区50bp和所述编码区的最后50bp。使用标准基因技术将所述PCR产物转化到PNY2093中，在30℃不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR筛选转化子以验证正确整合，所用引物为BK415(SEQIDNO：163)，其位于5′编码区的外部，和N1092(SEQIDNO：164)，其位于BiADH基因内部。然后通过菌落PCR筛选阳性转化子，所用引物为413(SEQIDNO：169)，其位于3′编码区的外部，和92(SEQIDNO：152)，其位于URA3标记内部。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34(SEQIDNO：121)进行转化，并且涂布在30℃不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。将转化子涂布在补充了1％乙醇和0.5％半乳糖的丰富培养基上以诱导重组酶。通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基以验证生长的抑制老确认标记的移除。所得的经鉴定的被称为PNY2101的菌株，具有基因型：MATaura3Δ：：loxPhis3Δpdc5Δ：：loxP71/66fra2Δ2-μpdc1Δ：：P[PDC1]-ALS□alsS_Bs-CYCIt-loxP71/66pdc6Δ：：(UAS)PGK1-P[FBAI]-KIVD□Lg(y)-TDH3t-loxP71/66adh1Δ：：P[ADH1]-ADH□Bi(y)-ADHt-loxP71/66
Fra2Δ：：P[ILV5]-ADH□Bi(y)-ADHt-loxP71/66
为将BiADH整合至PNY2101的fra2Δ基因座中，整合盒通过PCR扩增自pLA65(SEQIDNO：148)，其包含来自菌种印度拜叶林克氏菌的醇脱氢酶，所述醇脱氢酶带有ILV5启动子和ADH1终止子以及URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点以允许体内同源重组以及后续的URA3标记移除。通过使用KAPAHiFi以及引物906(SEQIDNO：165)和907(SEQIDNO：166)进行PCR。每种引物的FRA2部分来源于起始于ATG处的编码序列的最初60bp和终止密码子下游的56bp。使用标准基因技术将所述PCR产物转化到PNY2101中，在30℃不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR筛选转化子以验证正确整合，所用引物为667(SEQIDNO：167)，其位于5′编码区的外部，和749(SEQIDNO：168)，其位于ILV5启动子内部。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34(SEQIDNO：121)进行转化，并且涂布在30℃不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。将转化子涂布在补充了1％乙醇和0.5％半乳糖的丰富培养基上以诱导重组酶。通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基以验证生长的抑制来确认标记的移除。所得的经鉴定的被称为PNY2110的菌株，具有基因型：MATaura3Δ：：loxPhis3Δpdc5Δ：：loxP66/712-μpdc1Δ：：P[PDC1]-ALS□alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66pdc6Δ：(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD□Lg(y)-TDH3t-loxP71/66adh1Δ：：P[ADH1]-ADH□Bi(y)-ADHt-loxP71/66fra2Δ：：P[ILV5]-ADH□Bi(y)-ADHt-loxP71/66。
GPD2缺失
为删除内源GPD2编码区，缺失盒通过PCR扩增自pLA59(SEQIDNO：115)，其包含URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点，以允许体内同源重组以及后续移除URA3标记。通过使用KAPAHiFi以及引物LA512(SEQIDNO：141)和LA513(SEQIDNO：142)进行PCR。每种引物的GPD2部分来源于GPD2起始密码子上游的5’区50bp和终止密码子下游的3′区50bp，使得URA3盒的整合导致整个GPD2编码区的替换。使用标准基因技术将所述PCR产物转化到PNY2110中，在30℃不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR筛选转化子以验证正确整合，所用引物为LA516(SEQIDNO：143)，其位于5′编码区的外部，和LA135(SEQIDNO：112)，其位于URA3内部。然后通过菌落PCR筛选阳性转化子，所用引物为LA514(SEQIDNO：144)和LA515(SEQIDNO：145)，其位于GPD2编码区的内部。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34(SEQIDNO：121)进行转化，并且涂布在30℃不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。将转化子涂布在补充了1％乙醇和0.5％半乳糖的丰富培养基上以诱导重组酶。通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基以验证生长的抑制来确认标记的移除。所得的经鉴定的被称为PNY2115的菌株，具有基因型：MATaura3Δ：：loxPhis3Δpdc5Δ：：loxP66/71fra2Δ2-μpdc1Δ：：P[PDC1]-ALS□alsS_Bs-CYClt-loxP71/66pdc6Δ：：(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD□Lg(y)-TDH3t-loxP71/66adhΔ：：P[ADH1]-ADH□Bi(y)-ADHt-loxP71/66fra2Δ：：P[ILV5]-ADH□Bi(y)-ADHt-loxP71/66gpd2Δ：：loxP71/66。
由PNY2115产生PNY2145
通过在pdc5Δ基因座处另外整合磷酸转酮酶基因盒，并且通过用来自CEN.PK的经过密码子优化的直向同源物型式替换天然AMN1基因，从PNY2115构建PNY2145。下面进一步描述整合构建体。
pdc5Δ：：FBA(L8)-xpk1-CYC1t-loxP71/66
来自pRS423：：TEF(M4)-xpk1+ENO1-eutD(SEQIDNO：170)的TEF(M4)-xpk1-CYC1t基因使用引物N1341和N1338(SEQIDNO：171和172)进行PCR扩增，产生3.1kb产物。来自pLA59(SEQIDNO：115)的侧接loxP的URA3基因盒使用引物NI033c和N1342(SEQIDNO：173和174)进行扩增，产生1.6kb产物。xpk1和URA3PCR产物的融合是通过将两者混合、不加引物、使用PhusionDNA聚合酶进行额外10个循环的PCR来实现的。然后将所得反应混合物用作模板，用KAPAHiFi和引物N1342和N1364(SEQIDNO：174和175)进行PCR反应。通过从电泳琼脂糖凝胶(Zymo试剂盒)纯化来回收4.2kb的PCR产物。FBA启动子变体L8(SEQIDNO：176)使用引物N1366和N1368(SEQIDNO：177和178)进行扩增。通过额外轮次的PCR将xpk1：：URA3PCR产物与FBA启动子组合。用多核苷酸激酶磷酸化所得的产物，并且连接到经过EcoRV消化和小牛肠磷酸酶处理的pBR322中。将连接反应转化到大肠杆菌(E.coli)细胞中(来自Invitrogen的Stbl3感受态细胞)。通过测序确认所述整合盒。为制备用于整合的DNA，所述质粒被用作PCR反应的模板，使用了KapaHiFi和引物N1371和N1372(SEQIDNO：179和180)。通过苯酚-氯仿萃取和乙醇沉淀来分离所述PCR产物(使用标准方法；egoManiatas等人)。使用5微克DNA转化菌株PNY2115。在不含尿嘧啶的培养基(无尿嘧啶、带有1％乙醇作为碳源的合成完全培养基)上选择转化子。用PCR筛选菌落的整合事件(JumpStart)，所用引物为BK93和N1114(SEQIDNO：181和182)。选取了两个克隆体继续操作。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pJT254(SEQIDNO：183)进行转化，并且涂布在30℃不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。使转化子在补充了1％乙醇的丰富培养基上生长以去阻遏重组酶。对于分离的单个菌落，通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基以验证生长的抑制来确认标记的移除。通过将所述菌落接种至不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基来确认重组酶质粒pJT254的缺失。通过PCR确认正确的标记移除(引物N160SeqF5(SEQIDNO：184)和BK380。一个所得的克隆体被命名为PNY2293。
amn1Δ：：AMN1(y)-loxP71/66
为将内源的AMN1拷贝替换为来自CEN.PK2的经过密码子优化的AMN1基因型式，通过SOEPCR组装包含CEN.PKAMNI启动子、AMN1(y)基因(核酸SEQIDNO：185、氨基酸SEQIDNO：186)、以及CEN.PKAMN1终止子的整合盒，并且亚克隆到穿梭载体pLA59中。AMNI(y)基因定制于DNA2.0，针对酿酒酵母进行了密码子优化。完整的pLA67质粒(SEQIDNO：187)包含：包含大肠杆菌复制起点和氨苄青霉素抗性基因的pUC19载体骨架序列；侧接loxP71和loxP66位点的URA3选择标记；以及3)PAMN1(CEN.PK)-AMN1(y)-termAMN1(CEN.PK)表达盒。AMN1(y)-loxP71-URA3-loxP66盒的PCR扩增是通过使用来自KapaBiosystems，Woburn，MA的KAPAHiFi以及引物LA712(SEQIDNO：188)和LA746(SEQIDNO：189)进行的。使用标准基因技术将所述PCR产物转化到PNY2293中，在30℃不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上选择转化子。相对于对照(PNY2293)，对于无结块表型，在放大镜下观察转化子。使用如上所述的pJT254Cre重组酶质粒回收URA3标记。在标记回收后，在放大镜下再次观察克隆体以确认无结块的表型。所得的经鉴定的菌株PNY2145具有下列基因型：MATaura3Δ：：loxPhis3Δpdc5Δ：：P[FBA(L8)]-XPK□xpk1_Lp-CYCt-loxP66/71fra2Δ2微米质粒(CEN.PK2)pdc1Δ：：P[PDC1]-ALS□alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66pdc6Δ：：(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD□Lg(y)-TDH3t-loxP71/66adh1Δ：：P[ADH1]-ADH□Bi(y)-ADHt-loxP71/66fra2Δ：：P[ILV5]-ADH□Bi(y)-ADHt-loxP71/66gpd2Δ：：loxP71/66amn1Δ：：AMN1(y)。
由PNY2145产生PNY2310
通过用质粒pLH804-L2V4和pRS413：：BiADH-kivD转化菌株PNY2145来产生PNY2310。质粒pLH804-L2V4(SEQIDNO：12)是基于pHR81(ATCC#87541)的酵母-大肠杆菌穿梭载体。其包含用于KARI变体K9JB4P和DHAD变体L2V4的表达的基因。质粒pRS413：：BiADH-kivD(SEQIDNO：13)是基于pRS413(ATCC#87518)的酵母-大肠杆菌穿梭载体。其包含用于BiADH和kivD的表达的基因。相关基因特征在两种质粒中的位置在表3和4中列出。通过涂布在不含尿嘧啶和组氨酸、具有1％(v/v)乙醇作为碳源的合成完全培养基上来选择质粒转化子。通过接种将菌落转移到新鲜平板。两天后，将来自接种的细胞转移到包含具有2％(w/v)葡萄糖作为碳源的合成完全培养基(不含尿嘧啶和组氨酸)的平板。将所得菌株命名为PNY2310。
表3：途径基因特征在质粒pLH804-L2V4中的核苷酸位置
元件 描述 起始 结束 链
启动子 ILV5p 427 1620 T
CDS JB4P 1628 2659 T
终止子 ILV5t 2685 3307 T
终止子 FBAt 3320 3632 B
CDS ILVD-L2V4 3641 5356 B
启动子 TEF1(M7)p 5366 5766 B
表4：途径基因特征在质粒pRS413：：BiADH-kivD中的核苷酸位置
元件 描述 起始 结束 链
启动子 FBA1p 2293 2893 T
CDS kivD_Lg(y) 2902 4548 T
终止子 TDH3t 4560 5139 T
启动子 PDC1p 5983 6852 T
CDS adhBiy 6853 7896 T
终止子 ADH1t 7905 8220 T
由PNY2145产生CPN97
为将酿酒酵母的内源性GPD1替换为大肠杆菌gpsA，设计引物以扩增大肠杆菌gpsA开放阅读框，以***内源性GPD1染色***置中，从而维持ATG起始密码子和内源性酿酒酵母GPD1终止密码子上游的区域。使用重叠PCR来获得包含位于用于重组的酿酒酵母GPD1上游的50个碱基对、大肠杆菌gpsA基因、loxP-URA3-loxP盒、以及位于用于在PNY2145中重组的酿酒酵母GPD1下游的50个碱基对的PCR产物。利用大肠杆菌BL21染色体DNA作为模板，用引物F1(SEQIDNO：234)和R1(SEQIDNO：235)扩增大肠杆菌gpsAORF(PCR产物1)。利用pLA59(SEQIDNO：27)作为模板，用引物F2(SEQIDNO：236)和R2(SEQIDNO：237)扩增loxP-URA3-loxP盒(PCR产物2)。包含位于酿酒酵母GPD1上游的50个碱基对、大肠杆菌gpsA基因、loxP-URA3-loxP盒、以及位于酿酒酵母GPD1下游的50个碱基对的PCR产物(PCR产物3)利用PCR产物1和2作为模板并且利用引物F1(SEQIDNO：234)和R2(SEQIDNO：237)进行扩增。所有PCR反应使用酶Herculase(Agilent；SantaClara，CA)根据制造商的条件进行。
通过纯化回收PCR产物3并且使用酵母转化试剂盒(Sigma-Aldrich；St.Louis，MO)将其转化到PNY2145中。在包含1％乙醇但是不含尿嘧啶的酵母合成培养基上选择菌落。酵母合成培养基：6.7g/L无氨基酸的酵母氮源(BectonDickinson；EastRutherford，NJ)、1.85g/LKaiser缺陷型His-Ura(Formedium；Norfolk，UK)。在需要时，以76mg/L添加组氨酸或尿嘧啶。
为回收URA3标记，选择一个菌落并且用包含在GAL1启动子的控制下的CRE重组酶的质粒pJT254(SEQIDNO：183)转化并且将其涂布在包含1％乙醇且不含组氨酸的酵母合成培养基上。选择一个菌落并且使其在YPE培养基(20g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物、10g/L乙醇)中生长过夜，并且在YPE平板(20g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物、10g/L乙醇、15g/L琼脂)上重新划线。选择菌落并且将其接种在包含1％乙醇且不含尿嘧啶、1％乙醇且不含组氨酸的酵母合成培养基的平板、以及YPE平板上。选择不能在不含尿嘧啶和组氨酸的平板上生长的菌落，并且通过PCR针对标记移除和大肠杆菌gpsA的***进行筛选。将该菌落命名为CPN82。
为产生具有异丁醇生产途径的菌株，用上述pLH804：：L2V4(SEQIDNO：12)和pRS413：：BiADH-kivD(SEQIDNO：13)转化CPN82。将转化涂布在不含尿嘧啶和组氨酸且具有1％乙醇的酵母合成培养基上，选择三个菌落并且将其在不含组氨酸和尿嘧啶且具有3g/L葡萄糖、3g/L乙醇的酵母合成培养基上重新划线。针对异丁醇生产测试所述菌落，选择一个菌落并且将其命名为CPN97。由酵母密码子优化的GPD1变体的PNY2145整合产生酵母密码子优化的GPD1M、M3、以及M8变体菌株
为了测试宿主酿酒酵母菌株中的GPD1突变体，用使用酿酒酵母密码子用法通过DNA2.0合成的GPD1的密码子优化型式交换天然GPD1。
整合盒的制备
通过将2个片段(上游GPD1上游同源区和密码子优化的酵母GPD1片段)克隆在载体pBP3518(SEQIDNO：9)中制备基因交换盒(geneswapcassette)，所述载体包含URA3标记基因，连同启动子和终止子以及克隆在URA3标记基因下游的GPD下游同源区。
用于整合盒的片段1使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix(NewEnglandBiolabsInc.；Ipswich，MA)、引物oBP1329(SEQIDNO：1)和oBP1333(SEQIDNO：2)以及使用YeaStarTMGenomicDNA试剂盒(ZymoResearch)制备的作为模板的PNY2145基因组DNA进行扩增。片段2使用引物oBP1334(SEQIDNO：3)和oBP1335(SEQIDNO：4)以及作为模板的合成密码子优化的酵母GPD1或适当的GPD1变体进行扩增。引物oBP1333(SEQIDNO：2)具有与片段2(合成的密码子优化的GPD1)的5′区同源的5′尾，并且引物oBP1334(SEQIDNO：3)具有与片段1(GPD上游区域)的3′端同源的5′尾。使用重叠PCR，使用引物oBP1329(SEQIDNO：1)和oBP1335(SEQIDNO：4)将两个片段合并。将该合并的片段克隆在载体pBP3518(SEQIDNO：9)中的AscI和PmeI位点中并且将被称为pBP3518GPD*(SEQIDNO：10)的所得载体转化到AgilentXL1Blue感受态细胞(AgilentTechnologies，USA)中。
整合盒在PNY2145中的转化
使用QIAprepSpinminiprepKit(Qiagen，GmbH)分离质粒oBP3518GPD*(SEQIDNO：10)并且使用SacI和PacI限制性酶(NewEnglandBiolabsInc.Ipswich，MA)限制。使用FrozenEZYeastTransformationIIKit(ZymoResearch)将所得的4.2kb片段(包含整个整合盒、GPD上游同源区、密码子OptGPD、URA3标记基因以及下游GPD区域)转化到PNY2145中。将转化混合物涂布在30℃不含尿嘧啶且具有0.5％乙醇的合成完全培养基上，持续48小时。对于整合位点的确认，使用两组引物oBP1342(SEQIDNO：6)和oBP1344(SEQIDNO：7)以及oBP1341(SEQIDNO：5)和oBP1345(SEQIDNO：8)筛选转化子，以用于两个末端处整合的确认。由盒外部的区域设计引物oBP1342(SEQIDNO：6)和oBP1345(SEQIDNO：8)，以确认整合在正确位点。
URA3标记的移除
使用Frozen-EZYeastTransformationIITM试剂盒(ZymoResearchCorporation，Irvine，CA)用pRS423：：PGAL1-cre转化确认的转化子(菌株PNY2145GPD1Δ：：COGPD1URA3)并且涂布在不含组氨酸和尿嘧啶且补充了0.5％乙醇的合成完全培养基上并且在30℃下温育48小时。使转化子在不含组氨酸的具有0.5％乙醇的合成完全培养基中生长过夜并且针对URA3标记，将其涂布在具有0.5％乙醇和0.1％5FOA的合成完全培养基上。使用引物oBP1341(SEQIDNO：5)和oBP1345(SEQIDNO：8)，通过菌落PCR确认标记移除。
途径质粒的转化
然后使用Frozen-EZYeastTransformationIITM试剂盒(ZymoResearchCorporation，Irvine，CA)用质粒pLMH11-JM44(SEQIDNO：240)转化菌株PNY2145GPD1Δ：：COGPD1，并且将其涂布在不含尿嘧啶且具有0.5％乙醇的合成完全培养基上。将所得菌株命名为M、M3(F73A)和M8(F73G/F129G)。
由大肠杆菌的酵母GPD1密码子优化的PNY2145整合产生大肠杆菌密 码子优化的酵母GPD1EC1、E3、以及E8菌株
为了测试宿主酿酒酵母菌株中的GPD1突变体，用使用大肠杆菌密码子用法通过DNA2.0合成的GPD1的大肠杆菌密码子优化型式交换天然GPD1。
整合盒的制备
通过将2个片段(上游GPD1上游同源区和密码子优化的酵母GPD1片段)克隆在载体pBP3518(SEQIDNO：9)中制备基因交换盒，所述载体包含URA3标记基因，连同启动子和终止子以及克隆在URA3标记基因下游的GPD下游同源区。
用于整合盒的片段1使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix(NewEnglandBiolabsInc.；Ipswich，MA)、引物oBP1329(SEQIDNO：1)和oBP1350(SEQIDNO：241)以及使用YeaStarTMGenomicDNA试剂盒(ZymoResearch)制备的作为模板的PNY2145基因组DNA进行扩增。片段2使用引物oBP1351(SEQIDNO：242)和oBP1352(SEQIDNO：243)以及作为模板的合成大肠杆菌密码子酵母优化的GPD1基因以及E3和E8变体进行扩增。引物oBP1350(SEQIDNO：241)具有与片段2(合成的密码子优化的GPD1)的5′区同源的5′尾，并且引物oBP1351(SEQIDNO：242)具有与片段1(GPD上游区域)的3′端同源的5′尾。使用重叠PCR，使用引物oBP1329(SEQIDNO：1)和oBP1352(SEQIDNO：243)将两个片段合并。将该合并片段克隆在载体pBP3518(SEQIDNO：9)中的AscI和PmeI位点中，并且将被称为pBP3518GPD1_EcOpt(SEQIDNO：249)的所得载体转化到AgilentXL1Blue感受态细胞(AgilentTechnologies，USA)中。
整合盒在PNY2145中的转化
使用QIAprepSpinminiprepKit(Qiagen，GmbH)分离质粒pBP3518GPD1_EcOpt(SEQIDNO：249)，并且使用SacI和PacI限制性酶(NewEnglandBiolabsInc.Ipswich，MA)限制。使用FrozenEZYeastTransformationIIKit(ZymoResearch)将所得的4.2kb片段(包含整个整合盒、GPD上游同源区、大肠杆菌密码子优化的GPD1、URA3标记基因以及下游GPD区域)转化到PNY2145中。将转化混合物涂布在30℃不含尿嘧啶且具有0.5％乙醇的合成完全培养基上，持续48小时。对于整合位点的确认，使用两组引物oBP1342(SEQIDNO：6)和oBP1352(SEQIDNO：243)以及oBP1357(SEQIDNO：248)和oBP1345(SEQIDNO：8)筛选转化子，以用于在两个末端处的整合的确认。由盒外部的区域设计引物oBP1342(SEQIDNO：6)和oBP1345(SEQIDNO：8)，以确认整合在正确位点。
UR43标记的移除
使用Frozen-EZYeastTransformationIITM试剂盒(ZymoResearchCorporation，Irvine，CA)用pRS423：：PGAL1-cre转化确认的转化子(菌株PNY2145GPD1Δ：：ECCOGPD1URA3)，并且涂布在不含组氨酸和尿嘧啶且补充了0.5％乙醇的合成完全培养基上并且在30℃下温育48小时。使转化子在不含组氨酸的具有0.5％乙醇的合成完全培养基中生长过夜，并且针对URA3标记，将其涂布在具有0.5％乙醇和0.1％5FOA的合成完全培养基上。使用引物oBP1357(SEQIDNO：248)和oBP1345(SEQIDNO：8)，通过菌落PCR确认标记移除。
途径质粒的转化
然后使用Frozen-EZYeastTransformationIITM试剂盒(ZymoResearchCorporation，Irvine，CA)用质粒pLMH11-JM44(SEQIDNO：240)转化菌株PNY2145GPD1Δ：：ECCOGPD1，并且将其涂布在不含尿嘧啶且具有0.5％乙醇的合成完全培养基上。将所得菌株命名为EC1、E3(F73A)和E8(F73G/F129G)。
由酵母天然GPD1变体的PNY2145整合产生天然酵母GPD1N、N3、 以及N8菌株
为了测试宿主酿酒酵母菌株中的酵母天然GPD1突变体，用菌株PNY2145GPD1Δ：：COGPD1中的GPD1的酵母天然型式交换酵母密码子优化的GPD1。
整合盒的制备
通过将2个片段(上游GPD1上游同源区和酵母天然GPD1片段)克隆在载体pBP3518(SEQIDNO：9)中制备基因交换盒，所述载体包含URA3标记基因，连同启动子和终止子以及克隆在URA3标记基因下游的GPD下游同源区。
用于整合盒的片段1使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix(NewEnglandBiolabsInc.；Ipswich，MA)、引物oBP1329(SEQIDNO：1)和oBP1353(SEQIDNO：244)以及使用YeaStarTMGenomicDNA试剂盒(ZymoResearch)制备的作为模板的PNY2145基因组DNA进行扩增。片段2使用引物oBP1354(SEQIDNO：245)和oBP1355(SEQIDNO：246)以及作为模板的PNY2145基因组DNA和适当变体进行扩增。引物oBP1353(SEQIDNO：244)具有与片段2(酵母天然GPD1)的5′区同源的5′尾，并且引物oBP1354(SEQIDNO：245)具有与片段1(GPD上游区域)的3′端同源的5′尾。使用重叠PCR，使用引物oBP1329(SEQIDNO：1)和oBP1355(SEQIDNO：246)将两个片段合并。将该合并片段克隆在载体pBP3518(SEQIDNO：9)中的AscI和PmeI位点中，并且将被称为pBP3518GPD1_天然(SEQIDNO：250)的所得载体转化到AgilentXL1Blue感受态细胞(AgilentTechnologies，USA)中。
整合盒在PNY2145中的转化
使用QIAprepSpinminiprepKit(Qiagen，GmbH)分离质粒pBP3518GPD1_天然(SEQIDNO：250)并且使用SacI和PacI限制性酶(NewEnglandBiolabsInc.Ipswich，MA)限制。使用FrozenEZYeastTransformationIIKit(ZymoResearch)将所得的4.2kb片段(包含整个整合盒、GPD上游同源区、酵母天然GPD1、URA3标记基因以及下游GPD区域)转化到PNY2145GPD1Δ：：COGPD1中。将转化混合物涂布在30℃不含尿嘧啶且具有0.5％乙醇的合成完全培养基上，持续48小时。对于整合位点的确认，使用两组引物oBP1342(SEQIDNO：6)和oBP1355(SEQIDNO：246)以及oBP1356(SEQIDNO：247)和oBP1345(SEQIDNO：8)筛选转化子，以用于在两个末端处的整合的确认。
URA3标记的移除
使用Frozen-EZYeastTransformationIITM试剂盒(ZymoResearchCorporation，Irvine，CA)用pRS423：：PGAL1-cre转化确认的转化子(菌株PNY2145COGPD1Δ：：天然GPD1URA3)并且涂布在不含组氨酸和尿嘧啶且补充了0.5％乙醇的合成完全培养基上并且在30℃下温育48小时。使转化子在不含组氨酸的具有0.5％乙醇的合成完全培养基中生长过夜并且针对URA3标记，将其涂布在具有0.5％乙醇和0.1％5FOA的合成完全培养基上。使用引物oBP1356(SEQIDNO：247)和oBP1345(SEQIDNO：8)，通过菌落PCR确认标记移除。
途径质粒的转化
然后使用Frozen-EZYeastTransformationIITM试剂盒(ZymoResearchCorporation，Irvine，CA)用质粒pLMH11-JM44(SEQIDNO：240)转化菌株PNY2145COGPD1Δ：：天然GPD1并且将其涂布在不含尿嘧啶且具有0.5％乙醇的合成完全培养基上。将所得菌株命名为N、N3(F73A)和N8(F73G/F129G)。
GPD1变体的整合
以与以上针对密码子优化的GPD1交换所述的相同的方式制备GPD1变体的整合盒，不同的是，用于扩增每个GPD1变体的片段2的模板为具有表5中列出的突变的对应编码序列。
表5：具有对应突变的GPD变体
GPD变体 突变 菌株
GPD2 F129G
GPD3 F73A E3、M3、N3
GPD4 F73G
GPD7 F73A129G
GPD8 F73G129G E8、M8、N8
E3和E8为使用大肠杆菌密码子优化的GPD1的变体；M3和M8为使用酿酒酵母密码子优化的GPD1的变体；并且N3和N8为使用天然酿酒酵母密码子用法的GPD1的变体。
异源性GPD的整合
异源性GPD的整合盒可以与以上针对密码子优化的GPD1所述的相同的方式制备，不同的是，本领域技术人员将基于待***的异源性GPD1重新设计引物，以达到整合盒的恰当组装。
实例1：变体GPD1酶
在该实例中，产生酵母属GPD1的变体型式并且通过在大肠杆菌中表达，接着在粗制细胞提取物上酶促测定来进行测试。
GPD1诱变
根据需要引导酵母GPD1的诱变，以增加对NADH的KM，而不影响酶的其它动力学参数。诱变方法基于人GPD1的高分辨率晶体结构(Ou等人，2005，J.Mol.Biol.357：858-869)，其允许确定辅因子结合口袋中的NAD的接触距离内的氨基酸。通过分析氨基酸残基和进行接触的类型，可以限制氨基酸变化的数量，以导致NADHKM值的增大。表6示出该分析的结果，其中列举了结合NAD的5埃内的氨基酸残基，并且解释了在NAD结合中的作用。由于它们在结合NAD的π-堆叠稳定性中的作用，将初始焦点放在与截短的人GPD1(SEQIDNO：84)的phe41和phe97(酵母GPD1的phe73和phe129)同源的位置的诱变上。
表6：人晶体结构中结合NAD的5埃 内的氨基酸残基，以及目标 在于增大NADHK M 值的可能诱变。
菌株和培养基
大肠杆菌TOPI0可购自LifeTechnologiesCorp.(Cat.#C404003，GrandIsland，NY)。表达质粒pBAD是先前所描述的(美国专利7,910,342)。针对酵母表达优化的合成酵母GPD1基因可得自DNA2.0(MenloPark，CA)。使细胞在37℃下在具有0.02％L-(+)-***糖(Cat.#A3256，Sigma-Aldrich，Inc.，St.Louis，MO)和100μg/ml氨苄青霉素(Cat.#AI066，Sigma-Aldrich，Inc.，St.Louis，MO)的Miller′sLB液体培养基(Cat.#46-050-CM，Mediatech，Inc.，Herndon，VA)中生长。将细胞涂布在具有100μg/mL氨苄青霉素(Cat.#LI004，Teknova，Inc.，Hollister，CA)的LB琼脂平板上。
GPD1变体的构建
根据表7，在4个不同的氨基酸位置处引入突变。使用QuikChangeLightningKit(Cat.#210519，AgilentTechnologies，LaJolla，CA)，根据制造商的指导执行诱变。诱变引物可购自Sigma-AldrichCo.LLC，St.LouisMO。反应液在GeneAmp9700(PerkinElmerAppliedBiosystems，Norwalk，CT)中热循环。根据制造商的指导，用1μl的QuikChange反应产物转化大肠杆菌TOP10，并且在具有100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择转化子。获得来自各转化的多个分离物的DNA序列，以便鉴定具有期望突变的那些。
以相同方式构建双突变体，不同的是诱变反应中的模板已经包含突变之一，并且使用适当的引物引入第二突变。
表7：GPD1变体及其构建中所用的引物
位置 SEQ IDNO： 正向引物SEQ ID NO： 反向引物SEQ ID NO：
Asn44 20
N44A 212 21 54
N44C 213 22 55
N44G 214 23 56
N44I 215 24 57
N44L 216 25 58
N44M 217 26 59
N44S 218 27 60
N44V 219 28 61
Trp45 29
W45A 220 30 62
W45C 221 31 63
W45G 222 32 64
W45H 223 33 65
W45I 224 34 66
W45K 225 35 67
W45L 226 36 68
W45M 227 37 69
W45N 228 38 70
W45Q 229 39 71
W45R 230 40 72
W45S 231 41 73
W45T 232 42 74
W45V 233 43 75
Phe73 44
F73G 196 45 76
F73A 197 46 77
F73R 198 47 78
F73K 199 48 79
Phe129 49
F129G 200 50 80
F129A 201 51 81
F129R 202 52 82
F129K 203 53 83
GPD1测定
通过在Mini-Bead-搅拌器(Cat.#3110BX，BiospecProducts，Bartlesville，OK)中在100mMMOPSpH6.8、10mMMgCl2、1mMEDTA中珠搅拌2×10秒来由5ml培养物制备可溶性级份细胞提取物。细胞提取物蛋白质浓度通过PierceBCA测定(Cat.#23224and23228，ThermoFisherScientific，Inc.，Rockford，IL)进行测定。
测定在包含100mMMOPSpH6.8、1mMEDTA、1mM葡萄糖-6-磷酸、3mU/μL葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Cat.#G8404，Sigma-Aldrich，Inc.，St.Louis，MO)、1mM磷酸二羟丙酮(Cat.#D7137，Sigma-Aldrich，Inc.，St.Louis，MO)、不同浓度的NADH、以及不同浓度的细胞提取物的100μL体积中进行。通过4倍稀释到0.1％甲酸(Suprapur，#1167-1，EMDChemicals，Gibbstown，NJ)的水溶液(Omnisolv，#WX0001-1，EMDChemicals，Gibbstown，NJ)中来终止反应。通过LC/MS测量甘油-3-磷酸产生。
LC/MS法
在30℃的温度下，将2μL的各样品注入使用HSST3柱(2.1×100mm，1.8μm，#186003539，Waters，Milford，MA)的WatersAcuityUPLC/SQD***上。UPLC移动相由具有0.3mL/min的恒定流速的0.1％甲酸的水溶液(移动A)和乙腈中的0.1％甲酸(Omnisolv，#AX0156-1，EMDChemicals，Gibbstown，NJ)(移动B)组成。梯度由以下组成：初始1分钟时间段，99％A；接着0.5分钟线性梯度，以75％B终止；然后0.5分钟线性梯度，回到99％A，之后注入下一样品。MS分析通过电喷雾负离子化在30V的锥电压下进行并且m/z＝171。保留时间和峰强度使用MassLynx4.1软件(Waters，Milford，MA)确定。以相同方式分析外部标准(甘油-3-磷酸，Cat.#G7886，Sigma-Aldrich，Inc.，St.Louis，MO)以用于定量。
GPD1变体的分析
通过测量在两种NADH浓度(30和300μM)下甘油3磷酸(G3P)的初始形成速率来初始筛选GPD1变体的活性。这用作指示变体对NADH的KM的测量结果：对于远低于30μM的KM，比率将为1.0；对于远高于300μM的KM，比率将为10。单独的单一突变体的结果在表8中示出。
表8：通过初始G3P形成速率测量的GPD1变体的活性
变体 活性比率
129R 78.0
129K 73.1
129G 67.8
129A 65.9
44G 2.4
44M 2.4
44S 2.3
45G 2.2
44V 2.2
73A 2.0
44A 1.8
73G 1.8
44C 1.8
44L 1.8
441 1.7
45C 1.7
73R 1.5
45M 1.4
45A 1.4
45H 1.3
73K 1.2
451 1.0
45S 1.0
45V 1.0
45T 0.9
45K 0.8
45L 0.7
45N 0.6
45Q 0.6
45R 0.6
GPD1wt 1.3+/-0.3
此数据可解释为表明，具有大于1.6(三个对照测量的平均值加上标准偏差)的比率的任何变体具有高于野生型GPD1的NADHKM。如上所述形成具有单独高Ku单一突变的双突变体。用于双突变体和单突变体的选择的NADHKM值的全尺度分析在表9中示出。
表9：GPD1变体对NADH的米氏常数(K M )
变体 Vmax(U/ml) KM(μM)
GPD1WT_y 9 13
F129A 14 234
F129G 21 200
F129K 14 136
F129R 11 76
F73A 11 101
F73G 9 42
N44A 6 14
N44C 3 5
N44G 29 26
N44L 1 8
N44M 9 8
N44S 6 51
N44V 3 3
F129A 33 199
F129R 32 70
F73A129G(SEQ ID NO：204) 30 605
F73A129A(SEQ ID NO：205) 12 595
F73A129R(SEQ ID NO：206) 14 734
F73A129K(SEQ ID NO：207) 9 2989
F73G129G(SEQ ID NO：208) 29 515
F73G129A(SEQ ID NO：209) 15 554
F73G129R(SEQ ID NO：210) 7 1364
F73G129K(SEQ ID NO：211) 6 1671
这些数据表明，对应于酿酒酵母GPD的残基44、45、73和129(单独或组合)的氨基酸的突变可增大GPD对NADH的KM。如图2中所示，酿酒酵母GPD的氨基酸73和129分别对应于人GPD的氨基酸41和97。
实例2：对NADH的KM高于酿酒酵母GPD的异源GPD酶
在该实例中，鉴定对NADH的米氏常数(KM)高于酵母GPD1的另选的甘油-3-磷酸脱氢酶。
鉴定更高NADHKM酶的一种策略是使用先前已鉴定的那些酶的文献中公布的值。表10列举了其中NADHKM高于针对酵母GPD1所报道的NADHKM的出版物。
表10：GPD的公布的NADHK M
以上引用的黑腹果蝇参考文献中的鉴定为“GPDH1”的酶来自果蝇飞行肌。然而，该参考文献在日期上早于关于编码该酶的基因的序列信息。随后，该酶的序列被鉴定(gi：22945708)为来自果蝇基因组序列的甘油3磷酸脱氢酶，同种型C(Carmon&MacIntyre，2010，JournalofHeredity101：225-234)。使用实例1中概述的技术，将该酶在大肠杆菌中表达，在用于测量大肠杆菌表达的酵母GPD1的相同条件下同时测量KM值。在一个实验中，两种酶的NADHKM测量为5μM，即，不明显不同。
鉴定对NADH具有高KM的天然存在的GPD的另选策略是如由酶学委员会命名EC1.1.1.94所定义的，评价GPD的成员。虽然这些酶中的一些同样地使用NADH和NADPH(例如，Edgar&Bell，1980，JBiolChem255：3492-34-97)，但是其它酶已被表征为具有NADPH偏好(Frohlich等人，2010，JBacteriol192：4281-4288；Watanabe等人，2008，Yeast25：107-116；Sakasegawa等人，2004，ProteinScience13：1361-1371；Ruijter等人，2004，Microbiology150：1095-1101)。可能的是，这种偏好可表现为对NADH的高KM(与同一个酶对NADPH的KM相比)。使用实例1中概述的技术，制备以下GPD酶的在pBad表达载体中的合成基因：(a)闪烁古生球菌(Archaeoglobusfulgidus)DSM4304(gi|11497621：c775889-774882)(SEQIDNO：14)；(b)用于甘油-3-磷酸脱氢酶的皱状假丝酵母CvGPD1基因(gil157060214|dbj|AB296385.1)(SEQIDNO：15)；以及(c)普氏立克次体菌株BuV67-CWPP染色体(gi|383499256：539930-540880)(SEQIDNO：16)。
如在实例1中，在大肠杆菌中表达这些蛋白质，并且使用粗制细胞提取物测量NADHKM值。皱状假丝酵母GPD不产生显著可测量的活性。闪烁古生球菌酶具有可测量的活性，对于NADPH，KM＝7μM，并且对于NADH为5μM，并且普氏立克次体酶具有可测量的活性，对于NADPH，KM＝4μM，并且对于NADH为664μM。
普氏立克次体酶对NADH的KM高于酵母的KM。为了进一步评价酶的哪方面可能促进对NADH的这种降低的亲和力，将立克次体酶的序列与在结合位点具有NAD+的人酶的晶体结构相比较。人酶：NAD复合物的明显特征是夹在NAD+的腺嘌呤环周围的phe41和phe97的π-堆叠(pdb：1X0X；Ou等人，2006JMolBiol357：858-869)。π-堆叠是非常稳定的结构，并且序列比对揭示，同源位置在酵母GPD1序列(phe73、phe129)中是保守的。然而，在立克次体中，比对中的同源位置为arg35和ala85(参见图2)。这些氨基酸将预期使NADH结合去稳定，因此导致增大的NADHKM。这通过在实例中在这些位置处的诱变来证实。
作为这些氨基酸位置在增大NADHKM中的作用的进一步确认，通过NCBI数据库的BLAST搜索鉴定立克次体属之外的两个最紧密相关的GPD序列。两个最紧密相关的序列来自白色贝日阿托菌(BLASTE值＝2e-51，37％序列同一性；SEQIDNO：17)和韩国康氏菌(BLASTE值＝2e-50，37％序列同一性；SEQIDNO：18)。合成这些蛋白质并且如先前所述进行测试。
虽然这些酶在大肠杆菌中的表达水平低，但是使用贝日阿托菌酶测得的值为对于NADPH，KM＝6μM并且对于NADH为101μM，而康氏菌值为对于NADPH，KM＝1μM并且对于NADH为2018μM。处于与在人酶中形成π-堆叠的两个苯丙氨酸同源的位置处的氨基酸在贝日阿托菌酶中为lys85和gly86并且在康氏菌酶中为arg35和ala86(参见图2)。
这些结果证实，来自其它生物体的某些GPD对NADH具有较高KM，并且还进一步支持，对NADH的KM可通过将GPD酶工程化来提高，例如，通过π-堆叠苯丙氨酸对中涉及的氨基酸的修饰。
实例3：包含GPD1酶变体的酵母菌株的异丁醇和甘油产生。
在该实例中，针对异丁醇和甘油产生对具有所产生且以上所述的变体GPD1酶的酵母菌株进行测试。
将PNY2145GPD和具有异丁醇途径质粒的GPD变体菌株涂布在合成完全琼脂平板[1X无氨基酸的酵母氮源(Difnitrogenbaseco)，1X无尿嘧啶的氨基酸缺陷型(Clone-tech)，包含2％琼脂(Difco)、0.2％乙醇]上并且在300C温育器(NewBrunswick)中温育72小时。
将细胞接种在合成完全培养基[1X无氨基酸的酵母氮源(Difco)，1X无尿嘧啶的氨基酸缺陷型(Clonetech)，包含2％琼脂(Difco)、1％葡萄糖(sigma)、0.2％乙醇]上并且在30℃温育器(NewBrunswick)中温育72小时。通过持续30天每三天重复涂布在相同培养基上使细胞适应。
将适应的细胞的接种物接种于在125ml烧瓶(BD)中的10ml的合成完全液体培养基[1X无氨基酸的酵母氮源(Difco)，1X无尿嘧啶的氨基酸缺陷型(Clonetech)，包含2％琼脂(Difco)、1％葡萄糖(sigma)、0.2％乙醇]中作为原代培养物并且在30℃下在250rpm的温育摇床(NewBrunswick)中温育24小时。将来自原代培养物的次代培养物接种在具有0.5的初始OD的相同培养基中并且使其再生长24小时。在24小时后，将来自次代培养物的三代培养物接种在具有0.5的初始OD的相同培养基中并且使其再生长24小时。然后使用这些细胞进行GPD变体的评价研究。
通过在离心机(Eppendorf)中在室温下以3600rpm离心5分钟来获得细胞并且将其悬浮于15mlfalcon管中的生产培养基(1X无氨基酸的酵母氮源(Difco)，1X无尿嘧啶的氨基酸缺陷型(Clonetech)、35g/L葡萄糖(Sigma)、2g/L乙醇、110mMMES(Sigma)1X蛋白胨(Difco)、1X酵母提取物(Difco)、1MHCL(Sigma)，pH5.2)中并且初始OD为2。接着将培养物在30℃下在225rpm的温育摇床(NewBrunswick)温育20小时。在20小时时收集样品并且通过HPLC(AgilentLifeSciences)进行分析(图3)。
样品制备
在20小时，在生产结束时获得培养物并且将各细胞沉淀物重新悬浮于包含1X蛋白酶抑制剂的pH6.8的100mM的MOPS(Roche)中。通过使细胞经受5个循环的珠搅拌(Mini-Beadbeater-16，Biospec)来实现裂解，其中每个循环30秒，各循环之间间隔2min。使裂解样品经受在40℃下在离心机中以13,000rpm离心30min。将上清液小心转移到另一个管。使用Bradford试剂(Cat.#500-0205，Bio-Rad)进行蛋白质估计。在新鲜样品上立即进行GPD测定，而不进行任何冻融步骤。
测定条件
甘油-3-磷酸(GPD)测定使用Cary100UV-Vis分光光度计在包含100mMMOPS(Sigma)pH6.8、1mMEDTA、1mM葡萄糖-6-磷酸、3mU/μL葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Cat.#GS404，Sigma-Aldrich，Inc.，St.Louis，MO)、1mM磷酸二羟丙酮(Cat.#D51269，Sigma-Aldrich，Inc.，St.Louis，MO)、0.3mMNADH、以及不同浓度的细胞提取物的1ml体积中进行。通过取在340nm下NADH浓度降低的第一个1min的斜率来计算反应速率。NADH的消光系数取为6.22mM-1cm-1。对于变体N8_1、E8_1和M8_1(即，具有双突变体F73G/FI29G的那些)，NADH浓度增大至0.45mM。这是这些变体的NADH的非饱和水平。
结果的回归分析
这部分中使用的数据提供于表11中，并且包括代谢产物的测量结果和如上所述的GPD的体外测量结果。为了说明由次饱和量的NADH下的测量结果产生的测得GPD活性的差异，对于如表9中确定的速率和KM值，在Vmax下的总活性通过使用GPD(U/mg)求解Vmax的单一底物Michaelis-Menton方程来计算。
表11：在异源/天然GPD序列中携带不同取代的各种对照和变体异丁 醇原菌株中GPD的代谢产物和特异性活性的体外测量。
最初，据观察，根据上述方法整合未改变的GPD和变体GPD导致不同的GPD活性量，如根据异丁醇生产在酵母细胞提取物中所分析的。GPD的特异性活性可变化多达10倍。异丁醇/甘油比率也表现出与GPD活性水平的逆相关性，如图4中所示。如图所示，此关系的线性回归的R2值为60.1％，但是指示GPD活性数据预测未知的异丁醇/甘油比率值的能力的交叉证实R-Sq(pred)值仅为25.04％。这个结果表明，虽然存在相关性，但是单独GPD活性不是该比率的良好预测因子。
这种因素使得难以检测高KMGPD变体对甘油和异丁醇生产的贡献的变化，因为增大的NADHKM的有益效应被不可预测的活性水平遮蔽。为了进一步理解这些效应，向表11的数据应用多个线性回归分析，以确定变体特性的贡献是否可更清楚地定量。使用Minitab(MinitabV16.2.1，MinitabInc.；StateCollege，PA)使模型化参数经受多轮线性回归，手动移除具有最大P值的贡献参数(contributingparameter)，直到剩余系数的P值均低于0.05。这产生具有最大R-sq(pred)值的回归方程，其表明该模型预测新观察的值的能力。表11中的代谢测量中的两个产生具有可在生理学上解释的独立贡献参数的模型。
使用来自表11的以下参数将异丁醇滴度模型化：所消耗的葡萄糖、乙醇、甘油、收率、GPDKM和GPDVmax。消除最小显著参数(leastsignificantparameter)得到具有3个参数(预测因子)的回归模型：所消耗的葡萄糖、GPDKM和GPDVmax(在图5和表12中示出)。该模型的R-Sq值为98.6％。该模型的R-Sq(pred)值为94.32％，表明该回归方程提供高度预测的值。在生理学上解释回归模型，表明通过来自所消耗的葡萄糖和GPDKM值的正贡献和来自GPDVmax值的负贡献来预测异丁醇滴度。因此，在任何所消耗的葡萄糖的量下，较高的GPDKM将导致异丁醇滴度增大。类似地，GPD酶的测量活性水平(作为Vmax值)增加将导致异丁醇滴度降低。
表12：用于异丁醇滴度(g/L)的回归模型。
预测因子 系数 SE系数 T P VIF
常数 0.3316 0.3499 0.95 0.397
所消耗的葡萄糖(g/L) 0.17741 0.01382 12.83 0.000 1.804
GPD KM(μM) 0.0013789 0.0003309 4.17 0.014 1.977
GPD Vmax(U/mg) -75.81 10.10 -7.50 0.002 1.146
该回归模型允许估计这些效应的量值。在30g/L的葡萄糖消耗水平和0.0026U/mg的GPDVmax下，将KM从11μM(野生型)增加至550μM导致异丁醇滴度增加14％。然而，在30g/L的葡萄糖消耗水平、11μM的KM下，GPD水平从0.0015U/mg增加至0.019U/mg(来自表11的活性的最大变化)导致异丁醇滴度降低25％。该回归模型因此展示了，降低GPD对NADH的亲和力(增大KM)使此处所示的样品中的异丁醇滴度增大。
使用来自表12的以下参数将异丁醇收率(异丁醇克数/所消耗的葡萄糖克数)类似地模型化：所消耗的葡萄糖、乙醇、甘油、异丁醇、GPDKM和GPDVmax。消除最小显著参数得到使用2个参数的回归模型：GPDKM和GPDVmax(参见图6和表13)。该回归模型具有93.9％的R-Sq值。该回归模型以76.3％的R-Sq(pred)值预测收率并且值得注意的是仅依赖于GPD酶的活性水平和KM。类似于用于异丁醇滴度的回归模型，GPDVmax对收率具有负贡献。在该回归模型中，在0.0015U/mg的所观察到的最低GPD活性水平下，GPD的KM从11μM(野生型)增大至550μM导致28％的收率改善。在此处所观察到的最高GPD活性水平(0.019U/mg)下，收率改善为78％。
表13：用于收率(g/g)的回归模型。
预测因子 系数 SE系数 T P VIF
常数 0.199176 0.005908 33.71 0.000
GPD KM(μM) 0.00009410 0.00001597 5.89 0.002 1.144
GPD Vmax(U/mg) -5.2197 0.6404 -8.15 0.000 1.144
实例4：假想例
在该实例中，针对异丁醇和甘油产生对上述异源GPD1酵母整合体进行测试。
生长培养基和过程
在酵母菌株的生长过程期间使用两种类型的培养基：需氧预培养培养基和厌氧培养基。除非另有说明，否则所有化学品可购自Sigma(St.Louis，MO)
需氧预培养培养基(SE-Ura-His)：6.7g/L无氨基酸的酵母氮源(Difco，291940，Sparks，MD)，1.4g/L无组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶的酵母合成缺陷型培养基补充剂、0.2％乙醇、0.2％葡萄糖、0.01％w/v亮氨酸和0.002％w/v色氨酸。
厌氧培养基(SEG-Ura-His)：50mMMES(pH5.5，6.7g/L无氨基酸的酵母氮源(Difco，291940，Sparks，MD)、1.4g/L无组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶的酵母合成缺陷型培养基补充剂、0.1％乙醇、3％葡萄糖、0.01％亮氨酸、0.002％色氨酸、30mg/L烟酸、30mg/L硫胺素和10mg/L麦角固醇，在50/50v/vTween/乙醇溶液中补足。
将接种细胞接种至25mL具有0.2％葡萄糖和0.2％乙醇的SEG-Ura，His培养基中并且使其在盖子关闭的情况下在氧气逐渐受限条件下在30℃和振摇下生长大约48小时，直到实现大约1.5至2的目标OD600值。记录OD600值。通过离心将细胞沉淀并且弃去上清液。将细胞沉淀物转移到CoyAnaerobicBag(GrassLake，MI)中，沉淀物在其中重新悬浮于1.0mL的厌氧生长培养基(SEG-Ura-His)中。使用重新悬浮的细胞沉淀物接种在50mL血清瓶(Wheaton，223748，Millville，NJ)中的30mLSEG-Ura-His培养基至目标初始OD600值为0.2。允许所有厌氧培养基、血清小瓶、塞子和夹具在接种之前在厌氧袋中脱气至少24小时。将血清瓶塞上、夹住并且转移出厌氧袋并且在240rpm的振摇下在30℃下生长。使厌氧培养物生长24至72小时，其中目标OD600值为至少1.2。另外的厌氧生长步骤使用来自先前厌氧培养步骤的细胞作为接种物。针对每个变体，评价三个转化子。
变体和异源酵母GPD1菌株的HPLC分析
获取样品进行HPLC分析并且在厌氧生长期结束时获得OD600值。使用Waters2695分离单元、2996光电二极管阵列检测器、以及2414折射率检测器(Waters，Milford，MA)，利用ShodexSugarSH-G前置柱和ShodexSugarSHI011分离柱(Shodex，JMScience，GrandIsland，NY)进行HPLC分析。在0.01N硫酸下，以0.5mL/min的流速，通过等度洗脱分离化合物。使用WatersEmpowerPro软件分析色谱图。
确定甘油、异丁醇的摩尔收率以及异丁醇/甘油比率。由每个变体和异源GPD的一式三份分析计算平均和标准偏差。采用学生t检验确定与密码子优化的GPD1对照值比较的值的差异是否是统计学上显著的。
实例5：gpsA在异丁醇生产上的作用
使菌株CPN97和PNY2310在包含100mMMES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)、3g/L葡萄糖和3g/L乙醇且不含组氨酸和尿嘧啶的酵母合成培养基上生长。选择来自每个菌株的菌落并且接种于包含10g/L葡萄糖和100mM无组氨酸和尿嘧啶的MES的10ml酵母合成培养基中并且在30℃、200rpm下温育过夜。在温育过夜之后，将细胞在包含20g/L葡萄糖和100mM无组氨酸和尿嘧啶的MES的10ml酵母合成培养基中重悬至OD600＝0.4并且在30℃、200rpm下温育4小时。然后获得细胞并且在20ml血清小瓶(Wheaton；Millville，NJ)中的包含20g/L葡萄糖和100mM无组氨酸和尿嘧啶的MES的10ml酵母合成培养基中重悬至OD600＝0.2，用丁基橡胶塞加盖并密封。将小瓶放置在30℃孵育器中、在200rpm下旋转并且温育28和42.5小时。对于所测试的每个菌株，制备两个小瓶。
在28和42.5小时之后，打开一个小瓶的盖子，测量OD600并且通过HPLC分析液体培养基。在Agilent1100seriesHPLC***上进行HPLC分析，该***包含反射率检测器，使用在50℃下温育且配备有BioRad-MicroguardCationHrefill30mm×4.6mm的300mm×7.8mmBioRad-AminexHPX-87H排阻柱(BioRad；Hercules，CA)。样品在0.6ml/min的流速下在0.01N硫酸运行缓冲液中运行。由HPLC分析，据观察，与PNY2310相比，CPN97中的异丁醇收率(图7)和异丁醇/甘油比率(图8)增加，并且与PNY2310相比，CPN97中的葡萄糖消耗降低(图9)。在有氧条件下生长时，随时间变化的光密度(OD)是类似的。
实例6：抵抗反馈的gpsA的产生的假想例
使用大肠杆菌MG1655染色体DNA以及引物Ptrc-gpsANcoIF(SEQIDNO：238)和Ptrc-gpsAPstIR(SEQIDNO：239)扩增gpsA等位基因。使用GeneArt无缝克隆和组装试剂盒(LifeTechnologies，Carlsbad，CA)将gpsA等位基因克隆到NcoI/PstI-消化的pTrcHis2B(Invitrogen；Carlsbad，CA)中以形成pCPNI24。
使用来自Agilent(SantaClara，CA)的GeneMorphIIRandomMutagenesis试剂盒使pCPN124经受易错诱变。将所获得的质粒转化到菌株BB26-36中(Bell，J.Bact.117：1065-1076(1974))。菌株BB26-36在plsB基因中包含突变。另外，由于果糖-1，6-二磷酸(fru-1，6-diP)对甘油激酶(GlpK)的抑制的丧失，该菌株不具有亲代菌株BB26的甘油-3-磷酸营养缺陷型，因此BB26-36可产生甘油-3-磷酸并且在加上甘油3g/L和葡萄糖3g/L的基本培养基M9上生长(M9每升包含12.8g七水磷酸钠、3g磷酸二氢钾、0.5g氯化钠、1g氯化铵、0.24g硫酸镁、以及11.1mg氯化钙)。
将转化反应液涂布在包含5g/L葡萄糖和50mg/L羧苄青霉素的M9培养基上。从在这些平板上生长的菌落中提取质粒并且对gpsA基因测序。测定突变蛋白的GpsA活性并且测量对于甘油-3-磷酸的K。然后使用与野生型蛋白质相比具有增大的K的蛋白质来代替酵母染色体中的GPD1并且测量异丁醇和甘油产生。

Claims (63)

1.一种重组微生物，包含：
(a)丁醇生物合成途径，其包含至少一种对所述重组微生物是异源的多肽；
(b)异源甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)，其中与所述微生物的内源GPD的KM相比，所述异源GPD对NADH具有更高的KM；以及
(c)编码GPD的内源基因中的缺失或破坏；
其中与不含所述异源GPD的对照重组微生物相比，所述重组微生物具有改善的丁醇生产。
2.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述丁醇生物合成途径选自：
(a)1-丁醇生物合成途径；
(b)2-丁醇生物合成途径；以及
(c)异丁醇生物合成途径。
3.根据权利要求2所述的重组微生物，其中所述1-丁醇生物合成途径包含至少一种编码执行以下底物至产物转化中的至少一个的多肽的基因：
(a)乙酰-CoA至乙酰乙酰-CoA，如由乙酰-CoA乙酰转移酶催化；
(b)乙酰乙酰-CoA至3-羟丁酰-CoA，如由3-羟丁酰-CoA脱氢酶催化；
(c)3-羟丁酰-CoA至巴豆酰-CoA，如由巴豆酸酶催化；
(d)巴豆酰-CoA至丁酰-CoA，如由丁酰-CoA脱氢酶催化；
(e)丁酰-CoA至丁醛，如由丁醛脱氢酶催化；以及
(f)丁醛至1-丁醇，如由1-丁醇脱氢酶催化。
4.根据权利要求2所述的重组微生物，其中所述2-丁醇生物合成途径包含至少一种编码执行以下底物至产物转化中的至少一个的多肽的基因：
(a)丙酮酸至α-乙酰乳酸，如由乙酰乳酸合酶催化；
(b)α-乙酰乳酸至乙偶姻，如由乙酰乳酸脱羧酶催化；
(c)乙偶姻至2，3-丁二醇，如由丁二醇脱氢酶催化；
(d)2，3-丁二醇至2-丁酮，如由丁二醇脱水酶催化；以及
(e)2-丁酮至2-丁醇，如由2-丁醇脱氢酶催化。
5.根据权利要求2所述的重组微生物，其中所述异丁醇生物合成途径包含至少一种编码执行以下底物至产物转化中的至少一个的多肽的基因：
(a)丙酮酸至乙酰乳酸，如由乙酰乳酸合酶催化；
(b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸，如由乙酰羟酸异构还原酶催化；
(c)2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸，如由二羟酸脱水酶催化；
(d)α-酮异戊酸至异丁醛，如由支链酮酸脱羧酶催化；以及
(e)异丁醛至异丁醇，如由支链醇脱氢酶催化。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组微生物，其中所述微生物来自选自以下的属：梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、志贺氏菌属(Shigella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、假丝酵母属(Candida)、酒香酵母属(Brettanomyces)、管囊酵母属(Pachysolen)、汉逊酵母属(Hansenula)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、丝孢酵母属(Trichosporon)、Yamadazyma、和酵母属(Saccharomyces)。
7.根据权利要求6所述的重组微生物，其中所述微生物来自酵母属。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的重组微生物，其中所述异源GPD为天然存在的GPD。
9.根据权利要求8所述的重组微生物，其中所述异源GPD包括来自选自以下的生物体的GPD的序列：墨西哥利什曼原虫(Leishmaniamexicana)、绿色杜氏藻(Dunaliellaviridis)、埃及跳鼠(Jaculusorientalis)、闪烁古生球菌(Archeoglobusfulgidus)、普氏立克次体(Rickettsiaprowazekii)、白色贝日阿托菌(Beggiatoaalba)、韩国康氏菌(Kangiellakoreenis)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、皱状假丝酵母(Candidaversatilis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、以及穴兔(Oryctolaguscuniculu)。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的重组微生物，其中所述异源GPD为工程化GPD。
11.根据权利要求10所述的重组微生物，其中所述工程化GPD包含位于对应于SEQIDNO：195的位置42、44、45、71、73、75、95、124、126、129、151、152、183、184、185、246、310、336、337、或339的残基处的至少一个取代。
12.根据权利要求11所述的重组微生物，其中所述工程化GPD包含位于对应于SEQIDNO：195的位置73的残基处的至少一个取代。
13.根据权利要求11所述的重组微生物，其中所述工程化GPD包含位于对应于SEQIDNO：195的位置129的残基处的至少一个取代。
14.根据权利要求11所述的重组微生物，其中所述工程化GPD包含位于对应于SEQIDNO：195的位置73的残基处的取代和位于对应于SEQIDNO：195的位置129的残基处的取代。
15.根据权利要求5-14中任一项所述的重组微生物，其中所述微生物包含利用NADH的酮醇酸还原异构酶(KARI)。
16.一种工程化甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)，其与SEQIDNO：195具有至少85％的同一性。
17.根据权利要求15所述的工程化GPD酶，其中所述酶包含位于对应于SEQIDNO：195的位置42、44、45、71、73、75、95、124、126、129、151、152、183、184、185、246、310、336、337、或339的残基处的至少一个取代。
18.根据权利要求17所述的工程化GPD酶，其中所述酶包含对应于SEQIDNO：195的位置73的至少一个取代。
19.根据权利要求17所述的工程化GPD酶，其中所述酶包含对应于SEQIDNO：195的位置129的至少一个取代。
20.根据权利要求17所述的工程化GPD酶，其中所述酶包含对应于SEQIDNO：195的位置73的取代和对应于SEQIDNO：195的位置129的取代。
21.根据权利要求16-20中任一项所述的工程化GPD酶，其中对NADH的KM为约0.01mM至约1mM。
22.一种重组微生物，包含根据权利要求16-21中任一项所述的工程化GPD酶。
23.根据权利要求22所述的重组微生物，其中所述微生物包含丁醇生物合成途径，所述丁醇生物合成途径包含至少一种对所述重组微生物是异源的基因；其中所述微生物包含编码GPD的内源基因的缺失或破坏；并且其中与不含所述工程化GPD酶的微生物相比，所述重组微生物具有改善的丁醇生产。
24.根据权利要求23所述的重组微生物，其中所述丁醇生物合成途径选自：
(a)1-丁醇生物合成途径；
(b)2-丁醇生物合成途径；和
(c)异丁醇生物合成途径。
25.根据权利要求24所述的重组微生物，其中所述1-丁醇生物合成途径包含至少一种编码执行以下底物至产物转化中的至少一个的多肽的基因：
(a)乙酰-CoA至乙酰乙酰-CoA，如由乙酰-CoA乙酰转移酶催化；
(b)乙酰乙酰-CoA至3-羟丁酰-CoA，如由3-羟丁酰-CoA脱氢酶催化；
(c)3-羟丁酰-CoA至巴豆酰-CoA，如由巴豆酸酶催化；
(d)巴豆酰-CoA至丁酰-CoA，如由丁酰-CoA脱氢酶催化；
(e)丁酰-CoA至丁醛，如由丁醛脱氢酶催化；以及
(f)丁醛至1-丁醇，如由1-丁醇脱氢酶催化。
26.根据权利要求24所述的重组微生物，其中所述2-丁醇生物合成途径包含至少一种编码执行以下底物至产物转化中的至少一个的多肽的基因：
(a)丙酮酸至α-乙酰乳酸，如由乙酰乳酸合酶催化；
(b)α-乙酰乳酸至乙偶姻，如由乙酰乳酸脱羧酶催化；
(c)乙偶姻至2，3-丁二醇，如由丁二醇脱氢酶催化；
(d)2，3-丁二醇至2-丁酮，如由丁二醇脱水酶催化；以及
(e)2-丁酮至2-丁醇，如由2-丁醇脱氢酶催化。
27.根据权利要求24所述的重组微生物，其中所述异丁醇生物合成途径包含至少一种编码执行以下底物至产物转化中的至少一个的多肽的基因：
(a)丙酮酸至乙酰乳酸，如由乙酰乳酸合酶催化；
(b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸，如由乙酰羟酸异构还原酶催化；
(c)2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸，如由二羟酸脱水酶催化；
(d)α-酮异戊酸至异丁醛，如由支链酮酸脱羧酶催化；以及
(e)异丁醛至异丁醇，如由支链醇脱氢酶催化。
28.根据权利要求22-27中任一项所述的重组微生物，其中所述微生物来自选自以下的属：梭菌属、发酵单胞菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、志贺氏菌属、红球菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、产碱杆菌属、类芽孢杆菌、节杆菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、毕赤酵母属、接合酵母属、德巴利氏酵母属、假丝酵母属、酒香酵母属、管囊酵母属、汉逊酵母属、伊萨酵母属、丝孢酵母属、Yamadazyma、和酵母属。
29.根据权利要求28所述的重组微生物，其中所述微生物来自酵母属。
30.根据权利要求27-29中任一项所述的重组微生物，其中所述微生物包含利用NADH的酮醇酸还原异构酶(KARI)。
31.一种用于生产异丁醇的方法，所述方法包括：
(a)提供重组微生物，所述重组微生物包含
i.工程化异丁醇生物合成途径，
ii编码GPD1的内源基因中的缺失或破坏；和
iii.以下中的至少一个
a.根据权利要求16-22中任一项所述的工程化GPD酶；或
b.异源甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)，其中与所述微生物的内源GPD的KM相比，所述异源GPD对NADH具有更高的KM；以及
(b)使所述重组微生物与至少一种可发酵碳底物在其中产生异丁醇的条件下接触。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述重组微生物在厌氧条件下生长。
33.根据权利要求31-32中任一项所述的方法，其中所述工程化GPD包含位于对应于SEQIDNO：195的位置42、44、45、71、73、75、95、124、126、129、151、152、183、184、185、246、310、336、337、或339的残基处的至少一个取代。
34.根据权利要求31-33中任一项所述的方法，其中所述GPD对NADH的KM为约0.01mM至约1mM。
35.一种重组微生物，包含：
(a)丁醇生物合成途径，其包含至少一种对所述重组微生物是异源的多肽；
(b)异源甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)，其中与所述微生物的内源GPD的KM相比，所述异源GPD对NADH具有更高的KM；以及
(c)编码GPD的内源基因中的缺失或破坏；
其中与不含所述异源GPD的对照重组微生物相比，所述重组微生物具有降低的甘油产生。
36.一种重组微生物，包含：
(a)丁醇生物合成途径，其包含至少一种对所述重组微生物是异源的多肽；
(b)异源甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)，其中与所述微生物的内源GPD的KM相比，所述异源GPD对NADH具有更高的KM；以及
(c)编码GPD的内源基因中的缺失或破坏；
其中与不含所述异源GPD的对照重组微生物相比，所述重组微生物具有增大的丁醇与甘油摩尔比。
37.一种重组微生物，包含：
(a)异源甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)，其中与所述微生物的内源GPD的KM相比，所述异源GPD对NADH具有更高的KM；以及
(b)编码GPD的内源基因中的缺失或破坏；
其中与不含所述异源GPD的对照重组微生物相比，所述重组微生物具有降低的甘油产生。
38.一种重组微生物，包含：
(a)工程化丁醇生物合成途径，其包含至少一种对所述重组微生物是异源的多肽；
(b)异源甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)，其中所述异源GPD对NADH和NADPH具有基本上相同的亲和力；以及
(c)编码GPD的内源基因中的缺失或破坏；
其中与不含所述异源GPD的对照重组微生物相比，所述重组微生物具有改善的丁醇生产。
39.一种重组微生物，包含：
(a)工程化丁醇生物合成途径，其包含至少一种对所述重组微生物是异源的多肽；
(b)异源甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)，其中所述异源GPD对NADH和NADPH具有基本上相同的亲和力；以及
(c)编码GPD的内源基因中的缺失或破坏；
其中与不含所述异源GPD的对照重组微生物相比，所述重组微生物具有降低的甘油产生。
40.一种重组微生物，包含：
(a)工程化丁醇生物合成途径，其包含至少一种对所述重组微生物是异源的多肽；
(b)异源甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)，其中所述异源GPD对NADH和NADPH具有基本上相同的亲和力；以及
(c)编码GPD的内源基因中的缺失或破坏；
其中与不含所述异源GPD的对照重组微生物相比，所述重组微生物具有增大的丁醇与甘油摩尔比。
41.根据权利要求38-40中任一项所述的重组微生物，其中所述工程化丁醇生物合成途径选自：
(a)1-丁醇生物合成途径；
(b)2-丁醇生物合成途径；以及
(c)异丁醇生物合成途径。
42.根据权利要求38-41中任一项所述的重组微生物，其中所述微生物来自选自以下的属：梭菌属、发酵单胞菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、志贺氏菌属、红球菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、产碱杆菌属、类芽孢杆菌属、节杆菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、毕赤酵母属、接合酵母属、德巴利氏酵母属、假丝酵母属、酒香酵母属、管囊酵母属、汉逊酵母属、伊萨酵母属、丝孢酵母属、Yamadazyma、和酵母属。
43.根据权利要求42所述的重组微生物，其中所述微生物来自酵母属。
44.根据权利要求38-43中任一项所述的重组微生物，其中所述异源GPD为具有EC编号1.1.1.94的GPD。
45.根据权利要求44所述的重组微生物，其中所述异源GPD选自大肠杆菌GPD、皱状假丝酵母GPD、和米曲霉GPD。
46.一种用于生产丁醇的方法，所述方法包括：
(a)提供根据权利要求38-40中任一项所述的重组微生物；以及
(b)使所述重组微生物与至少一种可发酵碳底物在其中产生丁醇的条件下接触。
47.根据权利要求9所述的方法，其中所述工程化丁醇生物合成途径选自：
(a)1-丁醇生物合成途径；
(b)2-丁醇生物合成途径；以及
(c)异丁醇生物合成途径。
48.根据权利要求46或47所述的方法，其中所述微生物来自选自以下的属：梭菌属、发酵单胞菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、志贺氏菌属、红球菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、产碱杆菌属、类芽孢杆菌属、节杆菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、毕赤酵母属、接合酵母属、德巴利氏酵母属、假丝酵母属、酒香酵母属、管囊酵母属、汉逊酵母属、伊萨酵母属、丝孢酵母属、Yamadazyma、和酵母属。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述微生物来自酵母属。
50.根据权利要求46-49中任一项所述的方法，其中所述异源GPD为具有EC编号1.1.1.94的GPD。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述异源GPD选自大肠杆菌GPD、皱状假丝酵母GPD、和米曲霉GPD。
52.一种重组微生物，包含：
(a)异源甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)，其中所述异源GPD对NADH和NADPH具有基本上相同的亲和力；以及
(b)编码GPD的内源基因中的缺失或破坏；
其中与不含所述异源GPD的对照重组微生物相比，所述重组微生物具有降低的甘油产生。
53.一种包含异源甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)的重组微生物，其中所述异源GPD对NADH或NADPH具有基本上相同的亲和力；并且其中与不含所述异源GPD的对照重组微生物相比，所述重组微生物具有降低的甘油产生。
54.一种重组微生物，包含：
(a)工程化丁醇生物合成途径，其包含至少一种对所述重组微生物是异源的多肽；
(b)异源甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)，其中所述异源GPD受到甘油-3-磷酸的抑制；以及
(c)编码GPD的内源基因中的缺失或破坏；
其中与不含所述异源GPD的对照重组微生物相比，所述重组微生物具有改善的丁醇生产。
55.一种重组微生物，包含：
(a)工程化丁醇生物合成途径，其包含至少一种对所述重组微生物是异源的多肽；
(b)异源甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)，其中所述异源GPD受到甘油-3-磷酸的抑制；以及
(c)编码GPD的内源基因中的缺失或破坏；
其中与不含所述异源GPD的对照重组微生物相比，所述重组微生物具有降低的甘油产生。
56.一种重组微生物，包含：
(a)工程化丁醇生物合成途径，其包含至少一种对所述重组微生物是异源的多肽；
(b)异源甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)，其中所述异源GPD受到甘油-3-磷酸的抑制；以及
(c)编码GPD的内源基因中的缺失或破坏；
其中与不含所述异源GPD的对照重组微生物相比，所述重组微生物具有增大的丁醇与甘油摩尔比。
57.根据权利要求54-56中任一项所述的重组微生物，其中所述工程化丁醇生物合成途径选自：
(a)1-丁醇生物合成途径；
(b)2-丁醇生物合成途径；以及
(c)异丁醇生物合成途径。
58.根据权利要求54-57中任一项所述的重组微生物，其中所述微生物来自选自以下的属：梭菌属、发酵单胞菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、志贺氏菌属、红球菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、产碱杆菌属、类芽孢杆菌属、节杆菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、毕赤酵母属、接合酵母属、德巴利氏酵母属、假丝酵母属、酒香酵母属、管囊酵母属、汉逊酵母属、伊萨酵母属、丝孢酵母属、Yamadazyma、和酵母属。
59.根据权利要求54-58中任一项所述的重组微生物，其中所述异源GPD为具有EC编号1.1.1.94的GPD。
60.根据权利要求59所述的重组微生物，其中所述异源GPD选自大肠杆菌GPD、皱状假丝酵母GPD、和米曲霉GPD。
61.一种用于生产丁醇的方法，所述方法包括：
(a)提供根据权利要求54-60中任一项所述的重组微生物；以及
(b)使所述重组微生物与至少一种可发酵碳底物在其中产生丁醇的条件下接触。
62.一种重组微生物，包含：
(a)异源甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)，其中所述异源GPD受到甘油-3-磷酸的抑制；以及
(b)编码GPD的内源基因中的缺失或破坏；
其中与不含所述异源GPD的对照重组微生物相比，所述重组微生物具有降低的甘油产生。
63.一种包含异源甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)的重组微生物，其中所述异源GPD受到甘油-3-磷酸的抑制；并且其中与不含所述异源GPD的对照重组微生物相比，所述重组微生物具有降低的甘油产生。
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