CN104105789A - 降低酵母中甘露糖基转移酶活性的方法 - Google Patents

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Abstract

公开了用于降低低等真核生物宿主细胞中N-连接的和O-连接的寡糖的可检测的甘露糖基化的方法。具体而言，提供重组低等真核生物宿主细胞，其中由钒酸盐抗性糖基化4(VRG4)基因编码的GDP甘露糖转运蛋白的表达已被破坏。通常，VRG4基因对于细胞生存力是必需的；然而，本发明提供了当其中的VRG4基因的表达已被破坏时有活力的宿主细胞。所述宿主细胞能够产生具有降低的或无可检测的α-连接的甘露糖、β-连接的甘露糖或含有磷酸甘露糖的N-和/或O-聚糖的蛋白或糖蛋白。

Description

降低酵母中甘露糖基转移酶活性的方法
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发明背景
（1） 发明领域
本发明涉及降低酵母中N-连接和O-连接寡糖的可检测的甘露糖基化的方法。具体而言，本发明提供重组酵母宿主细胞，其中由钒酸盐抗性糖基化4(Vanadate Resistant Glycosylation 4 (VRG4))基因编码的GDP甘露糖转运蛋白的表达已被破坏。通常，VRG4基因对于细胞生存力是必需的；然而，本发明提供了当其中的VRG4基因的表达已被破坏时有活力的宿主细胞。
（2） 相关技术描述
产生重组人蛋白的能力已导致人健康护理中的较大进展并保持为药物开发的活跃领域。许多治疗性蛋白需要向蛋白的特定天冬酰胺残基翻译后添加聚糖（N-糖基化），以确保正常的结构-功能活性和随后在人血清中的稳定性。对于在人中的治疗性用途，糖蛋白需要人样N-糖基化。能够模拟人样糖蛋白加工的哺乳动物细胞系（例如CHO细胞、人视网膜细胞）具有几个缺点，包括低蛋白效价、长发酵时间、异源产物和持续的病毒抑制(viral containment)。因此期望使用不仅产生高蛋白效价以及具有短发酵时间，还能够产生人样糖蛋白的表达***。
真菌宿主诸如甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)具有治疗性蛋白表达的明显优点，例如，它们不分泌高量的内源性蛋白，可以获得用于产生异源蛋白的强诱导型启动子，它们可以在确定的化学培养基中生长，而无需使用动物血清，并且它们能够产生高效价的重组蛋白(Cregg等, FEMS Microbiol.Rev. 24:45-66 (2000))。然而，在巴斯德毕赤酵母中表达的糖基化的蛋白通常含有另外的甘露糖糖，产生“高甘露糖”聚糖，以及甘露糖基磷酸基，其给予糖蛋白负电荷。具有高甘露糖聚糖的或带电荷的甘露聚糖的糖蛋白存在在人中引起不期望的免疫应答的风险(Takeuchi, Trends in Glycosci.Glycotechnol.9:S29-S35 (1997); Rosenfeld和Ballou, J. Biol.Chem.249:2319-2321 (1974))。因此，期望在真菌宿主细胞中产生治疗性糖蛋白，其中所述糖蛋白上的糖基化的模式与在人中产生的糖蛋白上发生的相同或相似并且其不具有可检测的酵母糖基化。
发明简述
本发明提供降低在低等真核生物例如酵母和丝状真菌中N-连接和O-连接寡糖的可检测的甘露糖基化的方法。具体而言，提供重组低等真核生物宿主细胞，其中由钒酸盐抗性糖基化4(Vanadate Resistant Glycosylation 4 (VRG4))基因编码的GDP甘露糖跨膜转运蛋白或其同源物的表达已被破坏。科学文献中的多个出版物已暗示VRG4基因对于细胞生存力是必需的；然而，本发明人已发现能够构建其中已破坏VRG4基因的表达的低等真核生物宿主细胞例如巴斯德毕赤酵母。本发明人已发现缺少VRG4基因表达的宿主细胞是有活力的并且可以用于产生重组或异源蛋白或糖蛋白，其相比于表达VRG4基因的宿主细胞中产生的蛋白或糖蛋白具有对N-和/或O-聚糖降低的或无可检测的甘露糖基化，并产生完全有功能的GDP甘露糖跨膜转运蛋白。
因此，本发明提供低等真核生物宿主细胞，其包含（a）钒酸盐抗性糖基化(VRG4)基因或其同源物的表达的破坏；和（b）编码重组或异源、非内源蛋白或糖蛋白的核酸分子，其中所述宿主细胞是有活力的。VRG4基因或其同源物表达的破坏可以通过提供抑制剂来实现，所述抑制剂选自结合或拮抗编码的GDP甘露糖跨膜转运蛋白(Vrg4p)的功能的化合物、编码Vrg4p的mRNA的反义DNA、和编码Vrg4p的mRNA的siRNA。VRG4基因或其同源物表达的破坏可以通过缺失VRG4基因或编码Vrg4p的可读框(ORF)或通过缺失编码Vrg4p的基因或ORF内的一个或多个核苷酸或通过***异源核酸分子到编码Vrg4p的基因或ORF内来实现。在具体的实施方案中，VRG4基因表达的破坏可以通过引入一个或多个突变到编码vrg4p的ORF中（其突变产生Vrg4p活性的破坏、废除或降低）来实现。破坏基因表达的进一步的方法是通过将ORF置于异源启动子和/或终止子的调控下来改变表达水平。此类表达控制可以是天然的或突变的ORF或其部分的组成型的、诱导型的或可抑制的表达。因此，在具体的实施方案中，宿主细胞不产生有功能的GDP甘露糖跨膜转运蛋白（Vrg4p）或产生具有降低活性的GDP甘露糖跨膜转运蛋白（Vrg4p），或者根本不产生GDP甘露糖跨膜转运蛋白（Vrg4p）。如本文所用，术语Vrg4p指由VRG4基因或其同源物编码的蛋白。
本发明进一步提供在低等真核生物宿主细胞中产生重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白的方法，其包括在低等真核生物宿主细胞（其中编码GDP甘露糖跨膜转运蛋白的钒酸盐抗性糖基化(VRG4)基因或其同源物的表达已被破坏）中表达编码重组异源的、非内源蛋白糖蛋白的核酸分子。在具体的方面，编码异源的、非内源蛋白或糖蛋白的核酸分子可以整合入VRG4基因的区域内或替代VRG4基因或替代编码Vrg4p或其同源物的ORF。
本发明进一步提供降低低等真核生物宿主细胞中产生的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白上的N-和O-聚糖上的甘露糖基化的量的方法，其包括在低等真核生物宿主细胞（其中编码GDP甘露糖跨膜转运蛋白的钒酸盐抗性糖基化(VRG4)基因或其同源物的表达已被破坏）中表达编码重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白的核酸分子，其中N-和O-聚糖上的甘露糖基化的量低于在表达GDP甘露糖跨膜转运蛋白的低等真核生物宿主中产生的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白上的N-和O-聚糖上存在的甘露糖的量。例如，在OCH1野生型宿主菌株中，其中甘露糖残基的量降低至具有不多于九个或十个甘露糖残基。
本发明人还发现相比于产生有功能的GDP甘露糖跨膜转运蛋白的宿主细胞中产生的蛋白或糖蛋白上N-和O-聚糖的α-连接甘露糖的量，缺少VRG4基因表达的低等真核生物宿主细胞产生具有降低的对N-和O-聚糖的α-连接的甘露糖添加的蛋白或糖蛋白。因此，本发明进一步提供降低低等真核生物宿主细胞中产生的异源异源的、非内源重组蛋白或糖蛋白上的α-连接的甘露糖的量的方法，其包括在低等真核生物宿主细胞（其中编码GDP甘露糖跨膜转运蛋白的钒酸盐抗性糖基化(VRG4)基因或其同源物的表达已被破坏）中表达编码重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白的核酸分子，其中α-连接的甘露糖的量低于在表达GDP甘露糖跨膜转运蛋白的低等真核生物宿主中产生的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白上的α-连接的甘露糖的量。
本发明进一步提供降低低等真核生物宿主细胞中产生的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白的N-和/或O-聚糖的α-连接的甘露糖添加的量的方法，其包括在低等真核生物宿主细胞（其中编码GDP甘露糖跨膜转运蛋白的钒酸盐抗性糖基化(VRG4)基因或其同源物的表达已被破坏）中表达编码重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白的核酸分子，其中 α-连接的甘露糖添加的量低于在表达GDP甘露糖跨膜转运蛋白的低等真核生物宿主中产生的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白上的α-连接的甘露糖添加。
因此，在进一步的方面，本发明提供降低低等真核生物宿主细胞中产生的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白上的高甘露糖N-聚糖的量的方法，其包括在低等真核生物宿主细胞（其中编码GDP甘露糖跨膜转运蛋白的钒酸盐抗性糖基化(VRG4)基因或其同源物的表达已被破坏）中表达编码重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白的核酸分子，其中高甘露糖N-聚糖的量低于在表达GDP甘露糖跨膜转运蛋白的低等真核生物宿主中产生的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白上的高甘露糖N-聚糖的量。通常，宿主细胞能够产生这样的蛋白或糖蛋白，其中相比于表达有功能的GDP甘露糖跨膜转移酶的宿主细胞中的N-聚糖，N-聚糖上的甘露糖残基的数目不多于九个或十个甘露糖残基。
本发明人还发现缺少VRG4基因表达的低等真核生物宿主细胞产生这样的蛋白或糖蛋白，其具有其中甘露糖残基的数目相比于产生有功能的GDP甘露糖跨膜转运蛋白的宿主细胞中产生的蛋白或糖蛋白上的包含O-聚糖的甘露糖残基的数目降低的O-聚糖。这些甘露糖残基以α1,2-键连接。因此，本发明进一步提供降低低等真核生物宿主细胞中产生的重组异源的、非内源重组蛋白或糖蛋白的O-聚糖链长度的量的方法，其包括在低等真核生物宿主细胞（其中编码GDP甘露糖跨膜转运蛋白的钒酸盐抗性糖基化(VRG4)基因或其同源物的表达已被破坏）中表达编码重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白的核酸分子，其中O-聚糖链长度低于在表达GDP甘露糖跨膜转运蛋白的低等真核生物宿主中产生的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白上的p O-聚糖链长度。因此，这些宿主细胞能够产生具有其上具有降低的α-连接的甘露糖残基的量的O-聚糖的蛋白和糖蛋白。
本发明人还发现相比于产生有功能的GDP甘露糖跨膜转运蛋白的宿主细胞中产生的蛋白或糖蛋白上N-和/或O-聚糖的β-连接甘露糖的量，缺少VRG4基因表达的低等真核生物宿主细胞产生具有降低的对N-和/或O-聚糖的 β-连接的甘露糖添加的蛋白或糖蛋白。因此，本发明进一步提供降低低等真核生物宿主细胞中产生的异源异源的、非内源重组蛋白或糖蛋白上的β-连接的甘露糖的量的方法，其包括在低等真核生物宿主细胞（其中编码GDP甘露糖跨膜转运蛋白的钒酸盐抗性糖基化(VRG4)基因或其同源物的表达已被破坏）中表达编码重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白的核酸分子，其中β-连接的甘露糖的量低于在表达GDP甘露糖跨膜转运蛋白的低等真核生物宿主中产生的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白上的β-连接的甘露糖的量。
本发明进一步提供降低低等真核生物宿主细胞中产生的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白的N-和/或O-聚糖的β-连接的甘露糖添加的量的方法，其包括在低等真核生物宿主细胞（其中编码GDP甘露糖跨膜转运蛋白的钒酸盐抗性糖基化(VRG4)基因或其同源物的表达已被破坏）中表达编码重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白的核酸分子，其中β-连接的甘露糖添加的量低于在表达GDP甘露糖跨膜转运蛋白的低等真核生物宿主中产生的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白上的β-连接的甘露糖添加。
本发明人还发现相比于产生有功能的GDP甘露糖跨膜转运蛋白的宿主细胞中产生的蛋白或糖蛋白上N-和/或O-聚糖的磷酸甘露糖基化(phosphomannosylation)的量，缺少VRG4基因表达的低等真核生物宿主细胞产生具有降低的N-和/或O-聚糖的磷酸甘露糖基化的蛋白或糖蛋白。因此，本发明进一步提供降低低等真核生物宿主细胞中产生的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白的N-和/或O-聚糖的磷酸甘露糖基化的量的方法，其包括在低等真核生物宿主细胞（其中编码GDP甘露糖跨膜转运蛋白的钒酸盐抗性糖基化(VRG4)基因或其同源物的表达已被破坏）中表达编码重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白的核酸分子，其中磷酸甘露糖基化的量低于在表达GDP甘露糖跨膜转运蛋白的低等真核生物宿主中产生的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白上的磷酸甘露糖基化。
本发明人还发现缺少VRG4基因表达的低等真核生物宿主细胞产生这样的蛋白或糖蛋白，其具有相比于产生有功能的GDP甘露糖跨膜转运蛋白的宿主细胞中产生的蛋白或糖蛋白上的杂合N-聚糖(hybrid N-glycan)的量降低量的杂合N-聚糖。因此，本发明进一步提供降低低等真核生物宿主细胞中产生的异源的、非内源重组蛋白或糖蛋白上的杂合N-聚糖的量的方法，其包括在低等真核生物宿主细胞（其中编码GDP甘露糖跨膜转运蛋白的钒酸盐抗性糖基化(VRG4)基因或其同源物的表达已被破坏）中表达编码重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白的核酸分子，其中杂合N-聚糖的量低于在表达GDP甘露糖跨膜转运蛋白的低等真核生物宿主中产生的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白上的杂合N-聚糖的量。
在上述的低等真核生物宿主细胞的进一步的方面，选自BMT1、BMT2、BMT3和BMT4的至少一种β-甘露糖基转移酶(BMT)基因或其同源物的表达被破坏。在具体的实施方案中，β-甘露糖基转移酶基因或其同源物表达的破坏可以通过提供抑制剂来实现，所述抑制剂选自结合或拮抗β-甘露糖基转移酶的化合物、编码β-甘露糖基转移酶的mRNA的反义DNA、和一种或多种编码β-甘露糖基转移酶的mRNA的siRNA。β-甘露糖基转移酶基因表达的破坏可以通过破坏或缺失β-甘露糖基转移酶基因或向BMT基因***突变（其降低或取消所编码的β-甘露糖基转移酶的活性）来实现。
在具体的方面中，低等真核生物宿主细胞具有外链（Outer Chain (OCH1)）基因或其同源物、获得性热耐受性1（Acquired Thermo-Tolerance 1 (ATT1)）基因或其同源物、或两者的表达的破坏。表达的破坏包括但不限于编码Och1p的OCH1基因或ORF的缺失或破坏和/或编码Att1p的ATT1基因或ORF的缺失或破坏。
在具体的方面，低等真核生物宿主细胞是酵母或丝状真菌宿主细胞。在进一步的方面，酵母或丝状真菌宿主细胞选自巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）、芬兰毕赤酵母（Pichia finlandica）、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、膜醭毕赤酵母（Pichia membranaefaciens）、微小毕赤酵母（Pichia minuta）（Ogataea minuta, Pichia lindneri）、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、柳毕赤酵母（Pichia salictaria）、Pichia guercuum、Pichia pijperi、树干毕赤酵母（Pichia stiptis）、嗜甲毕赤酵母（Pichia methanolica）、毕赤酵母属物种（Pichia sp.）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、酵母菌属物种（Saccharomyces sp.）、多形汉森酵母（Hansenula polymorpha）、克鲁维酵母属物种（Kluyveromyces sp.）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）、白色念珠菌（Candida albicans）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、里氏木霉（Trichoderma reesei）、Chrysosporium lucknowense、镰孢属物种（Fusarium sp.）、禾谷镰孢菌（Fusarium gramineum）、Fusarium venenatum、小立碗藓（Physcomitrella patens）和粗糙链孢霉（Neurospora crassa）。在进一步的方面，低等真核生物宿主细胞是酵母宿主细胞，其选自巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）、芬兰毕赤酵母（Pichia finlandica）、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、膜醭毕赤酵母（Pichia membranaefaciens）、微小毕赤酵母（Pichia minuta）（Ogataea minuta, Pichia lindneri）、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、柳毕赤酵母（Pichia salictaria）、Pichia guercuum、Pichia pijperi、树干毕赤酵母（Pichia stiptis）、嗜甲毕赤酵母（Pichia methanolica）和毕赤酵母属物种（Pichia sp.）。在进一步的方面，低等真核生物宿主细胞是巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）。
在进一步的方面，低等真核生物宿主细胞已遗传工程化以产生人样N-聚糖。
在上述任一项的进一步的实施方案中，将低等真核生物宿主细胞遗传工程化以产生包含一种或多种选自G0、G1、G2、A1或A2的哺乳动物样或人样复合N-聚糖的糖蛋白。在进一步的实施方案中，将宿主细胞遗传工程化以产生包含一种或多种具有二等分的N-聚糖(bisected N-glycans)或具有多触角N-聚糖(multiantennary N-glycans)的哺乳动物样或人样复合N-聚糖的糖蛋白。在其他的实施方案中，将宿主细胞遗传工程化以产生包含一种或多种选自G-1结构 ；G-2结构、或具有6个、7个、8个、9个或10个甘露糖残基的高甘露糖N-聚糖的哺乳动物样或人样N-聚糖的糖蛋白。N-聚糖可以是岩藻糖基化的（即包括一个或多个岩藻糖残基）或可以是非岩藻糖基化的或无岩藻糖并且缺乏任何岩藻糖残基。
在上述任一项的具体方面中，低等真核生物宿主细胞包括一个或多个编码一个或多个糖苷酶、甘露糖苷酶或糖基转移酶活性（其来源于由UDP-GlcNAc转移酶(GnT) I、GnT II、GnT III、GnT IV、GnT V、GnT VI、GnT IX、UDP-半乳糖基转移酶(GalT)、岩藻糖基转移酶和唾液酸转移酶组成的组的成员）的催化结构域的核酸分子。在具体的实施方案中，甘露糖苷酶选自线虫（C. elegans）甘露糖苷酶IA、线虫甘露糖苷酶IB、黑腹果蝇（D. melanogaster）甘露糖苷酶IA、智人（H. sapiens）甘露糖苷酶IB、桔青霉（P. citrinum）甘露糖苷酶I、小鼠甘露糖苷酶IA、小鼠甘露糖苷酶IB、构巢曲霉（A. nidulans）甘露糖苷酶IA、构巢曲霉甘露糖苷酶IB、构巢曲霉甘露糖苷酶IC、小鼠甘露糖苷酶II、线虫甘露糖苷酶II、智人甘露糖苷酶II和甘露糖苷酶III。
在上述任一项的某些方面，至少一个催化结构域通过形成包含催化结构域和细胞导向信号肽的融合蛋白来定位。融合蛋白可以由至少一个遗传构建体来编码，所述遗传构建体通过将编码细胞导向信号肽的DNA片段与编码具有催化活性的催化结构域的DNA片段框内连接来形成。导向信号肽的实例包括但不限于ER或高尔基体的膜结合蛋白、滞留信号(retrieval signals)、II型膜蛋白、I型膜蛋白、跨膜核苷酸糖转运蛋白、甘露糖苷酶、唾液酸转移酶、葡萄糖苷酶、甘露糖基转移酶和磷酸-甘露糖基转移酶。
在上述任一项的具体方面中，低等真核生物宿主细胞进一步包括一个或多个编码一种或多种酶的核酸分子，所述酶选自UDP-GlcNAc转运蛋白、UDP-半乳糖转运蛋白、GDP-岩藻糖转运蛋白、CMP-唾液酸转运蛋白和核苷酸二磷酸酶。
在上述任一项的进一步的方面中，低等真核生物宿主细胞包括一个或多个核酸分子，其编码α1,2-甘露糖苷酶活性、UDP-GlcNAc转移酶(GnT) I活性、甘露糖苷酶II活性和GnT II活性。
在上述任一项的仍进一步的方面中，低等真核生物宿主细胞包括一个或多个核酸分子，其编码α1,2-甘露糖苷酶活性、UDP-GlcNAc转移酶(GnT) I活性、甘露糖苷酶II活性、GnT II活性和UDP-半乳糖基转移酶(GalT)活性。
在上述任一项的仍进一步的方面中，低等真核生物宿主细胞包括一个或多个核酸分子，其编码α1,2-甘露糖苷酶活性、UDP-GlcNAc转移酶(GnT) I活性、甘露糖苷酶II活性、GnT II活性、UDP-半乳糖基转移酶(GalT)活性和唾液酸转移酶(silayltransferase)活性。
在上述任一项的仍进一步的方面中，低等真核生物宿主细胞缺乏一种或多种选自甘露糖基转移酶和磷酸甘露糖基转移酶的酶的活性。在仍进一步的方面中，宿主细胞不表达选自1,6甘露糖基转移酶、1,3甘露糖基转移酶、和1,2甘露糖基转移酶的酶。
本发明提供这样的蛋白糖蛋白组合物，其中所述组合物缺少可检测的量的添加多于一个甘露糖残基（通常其特征在于内质网后加工），其中N-聚糖的检测通过MALDI-TOF或HPLC。此类甘露糖添加可以是α-连接的甘露糖、β-连接的甘露糖或磷酸甘露糖构型。
本发明提供来蛋白或糖蛋白组合物，其中所述组合物缺少可检测量的甘露四糖(mannotetraose)O-聚糖，其中通过MALDI-TOF或HPLC检测O-聚糖。
在进一步的方面，组合物包含治疗性蛋白或糖蛋白。治疗性糖蛋白的实例包括但不限于上文描述的治疗性蛋白糖蛋白。
本发明提供质粒载体，其包含编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3的至少25、50、75或100个邻接的核苷酸的核酸分子。在进一步的实施方案中，质粒载体进一步包括编码选择标志物的核酸分子。在具体的实施方案中，选择标志物是编码潮霉素抗性、Ura5p、Ura3p、Zeocin抗性、亚砷酸盐抗性或诺尔丝菌素抗性的核酸分子。
本发明进一步提供产生其中VRG4基因或其同源物的表达被破坏的低等真核生物宿主细胞的方法，其包括（a）提供质粒载体，所述质粒载体包含编码选择标志物的第一核酸分子，所述第一核酸分子在一侧侧接包含VRG4基因或其同源物的5'区的第二核酸分子，并且在另一侧侧接包含VRG4基因或其同源物的3'区的第三核酸分子；（b）用所述质粒载体转化低等真核生物宿主细胞，其中通过双交换同源重组将选择标志物整合入VRG4基因或其同源物中，以产生这样的低等真核生物宿主细胞，其中编码所述选择标志物的第一核酸分子在VRG4基因或其同源物（其分别与第二和第三核酸分子同源或具有同一性）的5'区和3'区之间被整合入VRG4基因或其同源物中，和（c）选择包含编码整合入VRG4基因或其同源物中的选择标志物的核酸分子的低等真核生物宿主细胞，以产生其中VRG4基因或其同源物的表达被破坏的低等真核生物宿主细胞。
在具体的方面中，包含VRG4基因或其同源物的5'区的第二核酸分子和包含VRG4基因或其同源物的3'区的第三核酸分子是不邻接的，并且编码选择标志物的第一核酸当整合入VRG4基因或其同源物中时，替代宿主细胞中的VRG4基因或其同源物的5'和3'区之间的区域，以产生其中VRG4基因或其同源物的表达被破坏的宿主细胞。在进一步的方面，编码选择标志物的第一核酸分子替代编码Vrg4p的VRG4基因或其同源物中的可读框（ORF）。进一步提供来由上述方法产生的低等真核生物宿主细胞。
在具体的方面，低等真核生物宿主细胞是酵母或丝状真菌宿主细胞。在进一步的方面，酵母或丝状真菌宿主细胞选自巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）、芬兰毕赤酵母（Pichia finlandica）、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、膜醭毕赤酵母（Pichia membranaefaciens）、微小毕赤酵母（Pichia minuta）（Ogataea minuta, Pichia lindneri）、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、柳毕赤酵母（Pichia salictaria）、Pichia guercuum、Pichia pijperi、树干毕赤酵母（Pichia stiptis）、嗜甲毕赤酵母（Pichia methanolica）、毕赤酵母属物种（Pichia sp.）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、酵母菌属物种（Saccharomyces sp.）、多形汉森酵母（Hansenula polymorpha）、克鲁维酵母属物种（Kluyveromyces sp.）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）、白色念珠菌（Candida albicans）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、里氏木霉（Trichoderma reesei）、Chrysosporium lucknowense、镰孢属物种（Fusarium sp.）、禾谷镰孢菌（Fusarium gramineum）、Fusarium venenatum、小立碗藓（Physcomitrella patens）和粗糙链孢霉（Neurospora crassa）。在进一步的方面，低等真核生物宿主细胞是酵母宿主细胞，其选自巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）、芬兰毕赤酵母（Pichia finlandica）、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、膜醭毕赤酵母（Pichia membranaefaciens）、微小毕赤酵母（Pichia minuta）（Ogataea minuta, Pichia lindneri）、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、柳毕赤酵母（Pichia salictaria）、Pichia guercuum、Pichia pijperi、树干毕赤酵母（Pichia stiptis）、嗜甲毕赤酵母（Pichia methanolica）和毕赤酵母属物种（Pichia sp.）。在进一步的方面，低等真核生物宿主细胞是巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）。
在具体的方面中，低等真核生物宿主细胞具有外链（Outer Chain (OCH1)）基因或其同源物、获得性热耐受性1（Acquired Thermo-Tolerance 1 (ATT1)）基因或其同源物、或两者的表达的破坏。
在本发明的上述实施方案或方面任一项的具体实施方案中，异源的、非内源蛋白或糖蛋白可以是治疗性蛋白或糖蛋白。治疗性蛋白和糖蛋白包括在用于向哺乳动物或人施用以治疗疾病或病况的组合物中。治疗性蛋白或糖蛋白的实例，人或哺乳动物，包括但不限于***（EPO）；细胞因子诸如干扰素α、干扰素β、干扰素γ、和干扰素ω；和粒细胞集落刺激因子（GCSF）；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）；凝血因子诸如因子VIII、因子IX、和人蛋白C；抗凝血酶III；凝血酶；可溶性IgE受体α链；免疫球蛋白诸如IgG、IgG片段、IgG融合体和IgM；免疫黏附和其他Fc融合蛋白诸如可溶性TNF受体-Fc融合蛋白；RAGE-Fc融合蛋白；白细胞介素；尿激酶；糜蛋白酶；尿素胰蛋白酶抑制剂；IGF结合蛋白；表皮生长因子；生长激素释放因子；锚定蛋白V融合蛋白；血管他丁；血管内皮生长因子-2；骨髓祖细胞抑制因子-1；骨保护素；α-1-抗胰蛋白酶；α-胎蛋白；DNase II；人纤溶酶原的三环3（kringle 3）；葡萄糖脑苷脂酶；TNF结合蛋白1；促卵泡激素；细胞毒素T淋巴细胞相关抗原4-Ig；跨膜激活剂和钙调节剂和亲环蛋白配体；胰高血糖素样蛋白1；胰岛素及其类似物、GLP1受体激动剂诸如GLP1及其类似物、胃泌酸调节素及其类似物、胰高血糖素样肽的抑制剂-4(exendin-4)及其类似物、等等；胰高血糖素受体激动剂或拮抗剂；成纤维细胞生长因子诸如FGF-21及其类似物、FGF-19及其类似物，等等；瘦蛋白及其类似物；胰淀素及其类似物；IL-2受体激动剂、或类似物或其突变蛋白。
在上述任一项的进一步的实施方案中，治疗性糖蛋白是抗体，其实例包括但不限于抗Her2抗体、抗RSV（呼吸道合胞病毒）抗体、抗TNFα抗体、抗VEGF抗体、抗CD3受体抗体、抗CD41 7E3受体、抗CD25抗体、抗CD52抗体、抗CD33抗体、抗IgE抗体、抗CD11a抗体、抗EGF受体抗体、或抗CD20抗体。
本发明进一步提供本文公开的低等真核生物宿主细胞的任一种用于生产用于治疗疾病或病症的药物的用途。例如，本发明提供包含VRG4基因或其同源物表达破坏的低等真核生物宿主细胞用于生产用于治疗疾病或病症的药物的用途。
定义
如本文所用，术语“糖蛋白”指任何具有与其连接的一个或多个N-聚糖或O-聚糖的蛋白。术语既指本领域中通常公认为糖蛋白的蛋白，也指本领域中通常不被公认为糖蛋白但已被修饰或遗传工程化以含有一个或多个N-连接和/或O-连接的糖基化位点的蛋白。该术语还指这样的蛋白，其在本领域中通常不被公认为具有N-聚糖和/或O-聚糖，但当在特定宿主细胞中表达为重组异源、非内源蛋白时，其被糖基化。例如，胰岛素通常不被公认为糖蛋白；然而，已发现在某些情况下当编码人胰岛素的核酸分子在酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母中表达时，产生的胰岛素分子的一部分被糖基化(例如参见，公开的国际申请号WO2009/104199和美国专利号6,180,757)。
如本文所用，“N-连接的糖基化位点”指三肽氨基酸序列NX(S/T)或AsnXaa(Ser/Thr)，其中“N”代表天冬酰胺（Asn）残基，“X”代表除脯氨酸（Pro）之外的任何氨基酸（Xaa），“S”代表丝氨酸（Ser）残基，并且“T”代表苏氨酸（Thr）残基。
如本文所用，术语“N-聚糖”和“糖形”可以互换使用，并指通过天冬酰胺-N-乙酰葡糖胺键连接至包含N-连接的糖基化位点的连接基团的寡糖基团本身。N-聚糖寡糖基团可以体外连接至除天冬酰胺之外的任何氨基酸残基或体内连接至包含N-连接的糖基化位点的天冬酰胺残基。
术语“N-连接的聚糖”指这样的N-聚糖，其中在还原端的N-乙酰葡糖胺残基以β1键连接至蛋白中连接基团的天冬酰胺残基的酰胺氮。
如本文所用，术语“N-连接的糖基化的”和“N-糖基化的”可互换使用，并且指连接至包含天冬酰胺残基的连接基团或N-连接的糖基化位点或基序的N-聚糖。
如本文所用，术语“体内糖基化”或“体内N-糖基化”或“体内N-连接糖基化”指寡糖或聚糖部分与体内存在的N-连接糖基化位点的天冬酰胺残基的连接，即，在糖基化细胞中在翻译后加工过程中表达经N-连接的糖基化的多肽。正确的寡糖结构很大程度上依赖于所用的宿主细胞来产生糖基化蛋白或多肽。
术语“连接基团”旨在说明多肽（尤其是其氨基酸残基）的官能团，其能够共价连接至大分子物质诸如寡糖或聚糖、聚合物分子、亲脂分子、或有机衍生化试剂。
对于体内N-糖基化，术语“连接基团”以非常规方式使用来说明构成包含N-X-S/T的“N-连接的糖基化位点”或“N-糖基化位点”的氨基酸残基，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。尽管N-糖基化位点的天冬酰胺（N）残基是其中寡糖或聚糖部分在糖基化过程中连接，但此类连接无法实现，除非N-糖基化位点的其他氨基酸残基存在。尽管N-连接糖基化的胰岛素类似物前体将包括包含“连接基团”的所有三种氨基酸以能够体内N-糖基化，但N-连接的糖基化胰岛素类似物可以随后加工为缺少X和/或S/T。因此，当缀合通过N-糖基化实现时，如与多肽的氨基酸序列的改变相关使用的术语“包含用于寡糖或聚糖的连接基团的氨基酸残基”应理解为表示构成N-糖基化位点的一个或多个氨基酸残基将以这样的方式被改变，所述方式使得有功能的N-糖基化位点引入氨基酸序列中。连接基团可以存在于胰岛素类似物前体中，但在异源二聚体胰岛素类似物中，可以去除包含连接位点的一个或两个氨基酸残基（但不是连接至寡糖或聚糖的天冬酰胺（N）残基）。例如，胰岛素类似物前体可以包含分别由NKT在位置B28、29和30处组成的连接基团，但类似物的成熟异源二聚体可以是desB30胰岛素类似物，其中在位置30的T已被移除。
如本文所用，“N-聚糖”具有的普通五糖核心（“Man”指甘露糖；“Glc”指葡萄糖；并且“NAc”指N-乙酰基；GlcNAc指N-乙酰葡糖胺）。通常，存在非还原端在左侧且还原端在右侧的N-聚糖结构。N-聚糖的还原端是连接至包含蛋白上的糖基化位点的Asn残基的末端。N-聚糖区别在于包含外周糖（例如，GlcNAc、半乳糖、岩藻糖和唾液酸）的分支（触角）的数目，所述外周糖加入到(“Man3”)核心结构（其也称为“三甘露糖核心”、“五糖核心”或“寡甘露糖(paucimannose)核心”）中。根据其分支构成将N-聚糖分类（例如，高甘露糖、复合的或杂合的）。“高甘露糖”型N-聚糖具有五个或更多个甘露糖残基。“复合”型N-聚糖通常具有至少一个连接至1,3甘露糖臂的GlcNAc和至少一个连接至“三甘露糖”核心的1,6甘露糖臂的GlcNAc。复合N-聚糖还可以具有任选用唾液酸("Sia")或衍生物(例如，“NANA”或“NeuAc”其中“Neu”指神经氨酸并且“Ac”指乙酰基，或衍生的NGNA，其指N-羟乙酰基神经氨酸)修饰的半乳糖(“Gal”)或N-乙酰半乳糖胺(“GalNAc”)残基。复合N-聚糖还可以具有包含“二等分的”GlcNAc和核心岩藻糖(“Fuc”)的链内取代。复合N-聚糖还可以具有“三甘露糖核心”上的多个触角，通常称为“多触角聚糖”。“杂合”N-聚糖具有在三甘露糖核心的1,3甘露糖臂的末端的至少一个GlcNAc和在三甘露糖核心的1,6甘露糖上的零个或多个甘露糖。由结构组成的N-聚糖也称为寡甘露糖(paucimannose)。多种N-聚糖也称为“糖形”。
关于复合N-聚糖，术语"G-2"、"G-1"、"G0"、"G1"、"G2"、"A1"、和"A2"表示如下。"G-2"指可以表征为的N-聚糖结构；术语"G-1"指可以表征为的N-聚糖结构；术语"G0"指可以表征为的N-聚糖结构；术语"G1"指可以表征为的N-聚糖结构；术语"G2"指可以表征为的N-聚糖结构；术语"A1"指可以表征为的N-聚糖结构；并且，术语"A2"指可以表征为的N-聚糖结构。除非另有所指，术语"G-2"、"G-1"、"G0"、"G1"、"G2"、"A1"和"A2"指缺少连接至N-聚糖的还原端的GlcNAc残基的岩藻糖的N-聚糖种类。当术语包括“F”时，“F”表示N-聚糖种类含有在N-聚糖还原端处的GlcNAc残基上的岩藻糖残基。例如G0F、G1F、G2F、A1F和A2F均表示N-聚糖进一步包括连接至N-聚糖还原端处的GlcNAc残基上的岩藻糖残基。低等真核生物诸如酵母和丝状真菌通常不产生产生岩藻糖的N-聚糖。
关于多触角N-聚糖，术语“多触角N-聚糖”指这样的N-聚糖，其进一步包含在甘露糖残基（其包含N-聚糖的1,6臂或1,3臂的非还原端）上的GlcNAc残基或在每一甘露糖残基（其包含N-聚糖的1,6臂和1,3臂的非还原端）上的GlcNAc残基。因此，多触角N-聚糖可以表征为式、、或。术语“1-4”指1、2、3或4个残基。
关于二等分的N-聚糖，术语“二等分的N-聚糖”指其中GlcNAc残基连接至N-聚糖的三甘露糖核心的最内部的、β-连接的甘露糖的N-聚糖。二等分的N-聚糖可以表征为式，其中每一甘露糖残基在其非还原端连接至GlcNAc残基。相反，当多触角N-聚糖表征为时，该式表示两个GlcNAc残基在N-聚糖的两个臂之一的非还原端连接至甘露糖残基，并且一个GlcNAc残基在N-聚糖的另一个臂的非还原端连接至甘露糖残基。
本文所用的缩写是本领域中常用用法，参见例如，上文糖的缩写。其他常用缩写包括“PNGase”或“聚糖酶”，其均指糖肽N-糖苷酶；糖肽酶；N-寡糖糖肽酶；N-聚糖酶；糖肽酶；Jack-bean糖肽酶；PNGase A；PNGase F；糖肽N-糖苷酶(EC 3.5.1.52，之前的EC 3.2.2.18)。
如本文所用，术语“重组宿主细胞”（“表达宿主细胞”、“表达宿主***”、“表达***”或简单地“宿主细胞”）旨在指重组载体已引入其中的细胞。应理解此类术语旨在不仅指具体的本发明的细胞还指此类细胞的后代。因为由于突变或环境影响，某些修饰可以在继代中发生，此类后代实际上可能与母细胞不相同，但仍包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞可以是分离的细胞或在培养物中生长的细胞系，或可以是位于活组织或器官中的细胞。宿主细胞可以是酵母、真菌、哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞和原核生物和古菌，其已遗传工程化以产生糖蛋白。
当指存在于糖蛋白制备物中的聚糖的“摩尔百分比”或“摩尔％”时，该术语表示当用PNGase处理蛋白制备物并随后用不受糖形组成影响的方法定量时，（例如，用荧光标签诸如2-氨基苯甲酰胺标记PNGase释放的聚糖库并随后通过高效液相层析或毛细管电泳分开及随后通过荧光强度定量聚糖），在释放的N-连接的寡糖的库中存在的具体聚糖的摩尔百分比。例如，50摩尔百分比的表示释放的聚糖的50％是并且剩余的50％由其他N-连接的寡糖构成。在实施方案中，糖蛋白制备物中具体聚糖的摩尔百分比将在20%-100%之间，优选高于25％、30％、35％、40％或45％，更优选高于50％、55％、60％、65％或70％，并且最优选高于75％、80％、85％、90％或95％。
术语“可操作地连接的”表达控制序列指其中表达控制序列与目的基因邻接以控制目的基因的连接，以及以反式或以一定距离作用来控制目的基因的表达控制序列。
术语“表达控制序列”或“调节序列”可互换使用，并如本文所用指对于影响它们与其可操作地连接的编码序列的表达是必需的多核苷酸序列。表达控制序列是控制核酸序列的转录、转录后事件和翻译的序列。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA处理信号诸如剪接和多腺苷酸信号；稳定胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列（例如核糖体结合位点）；增强蛋白稳定性的序列；和当需要时，增强蛋白分泌的序列。此类控制序列的性质依赖于宿主生物而不同；在原核生物中，此类控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。术语“控制序列”旨在在最小程度上包括其存在对表达是必需的所有组分，并且还能够包括其存在是有利的另外组分，例如前导序列和融合配偶体序列。
术语“转染(transfect)”、“转染(transfection)”、“转染(transfecting)”等指将异源核酸引入真核生物细胞，包括高等和低等真核生物细胞。历史上，术语“转化”已用于描述将核酸引入原核生物、酵母或真菌细胞；然而，术语“转染”也用于指将核酸引入任何原核生物或真核生物细胞，包括酵母和真菌细胞。此外，将异源核酸引入原核生物或真核生物细胞还可以通过病毒或细菌感染或弹道DNA转移来发生，并且术语“转染”也用于指在合适宿主细胞中的这些方法。
术语“真核生物的”指有核的细胞或生物，并包括昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、动物细胞和低等真核生物细胞。
术语“低等真核生物细胞”包括酵母和丝状真菌。酵母和丝状真菌包括但不限于巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）、芬兰毕赤酵母（Pichia finlandica）、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、膜醭毕赤酵母（Pichia membranaefaciens）、微小毕赤酵母（Pichia minuta）（Ogataea minuta, Pichia lindneri）、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、柳毕赤酵母（Pichia salictaria）、Pichia guercuum、Pichia pijperi、树干毕赤酵母（Pichia stiptis）、嗜甲毕赤酵母（Pichia methanolica）、毕赤酵母属物种（Pichia sp.）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、酵母菌属物种（Saccharomyces sp.）、多形汉森酵母（Hansenula polymorpha）、克鲁维酵母属物种（Kluyveromyces sp.）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）、白色念珠菌（Candida albicans）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、里氏木霉（Trichoderma reesei）、Chrysosporium lucknowense、镰孢属物种（Fusarium sp.）、禾谷镰孢菌（Fusarium gramineum）、Fusarium venenatum、小立碗藓（Physcomitrella patens）和粗糙链孢霉（Neurospora crassa）。毕赤酵母属物种、任何酵母菌属物种、多形汉森酵母、任何克鲁维酵母属物种、白色念珠菌、任何曲霉物种（Aspergillus sp.）、里氏木霉、Chrysosporium lucknowense、任何镰孢属物种（Fusarium sp.）、解脂耶罗维亚酵母（Yarrowia lipolytica）和粗糙链孢霉。
如本文所用，术语“基本上由……组成”将理解为意指包括陈述的整体或整体的组；同时排除将实质上影响或改变所陈述的整体的修改或其他整体。例如，关于连接到胰岛素或胰岛素类似物的N-聚糖的种类，术语“基本上由陈述的N-聚糖组成”将理解为包括N-聚糖，无论该N-聚糖是否在直接连接至糖蛋白的天冬酰胺残基的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)处被岩藻糖化，只要对于特定的N-聚糖种类，相比于其中N-聚糖缺少岩藻糖的糖基化的胰岛素或胰岛素类似物，岩藻糖不会实质上影响糖基化的胰岛素或胰岛素类似物。
如本文所用，术语“主要地”或其变体诸如“主要的”或“其是主要的”将理解为表示这样的聚糖种类，其在糖蛋白已用PNGase处理并通过质谱例如MALDI-TOF MS或HPLC分析释放的聚糖后，具有最高的摩尔百分比（％）的总N-聚糖。换言之，短语“主要地”定义为单独的实体诸如特定的糖形以大于其他任何单独实体的摩尔百分比存在。例如，如果组合物由以40摩尔百分比的种类A、以35摩尔百分比的种类B和以25摩尔百分比的种类C组成，则该组合物主要包含种类A，并且种类B将是其次最主要的种类。一些宿主细胞可以产生包含中性N-聚糖和带电荷的N-聚糖诸如磷酸甘露糖(mannosylphosphate)或唾液酸的组合物。因此，糖蛋白的组合物可以包括许多带电荷的和不带电荷的或中性的N-聚糖。在本发明中，它在其中主要N-聚糖确定的组合物中的全部多种N-聚糖的上下文中。因此，如本文所用，“主要的N-聚糖”表示在组合物中的全部多种中性N-聚糖中，主要的N-聚糖是特定结构。
如本文所用，术语“基本上无”特定糖残基诸如岩藻糖或半乳糖等，用于表示糖蛋白组合物基本上缺乏含有此类残基的N-聚糖。以纯度方式表示的，基本上无意指含有此类糖残基的N-聚糖结构的量不超过10％，并且优选低于5％，更优选低于1％，最优选低于0.5％，其中该百分比以重量计或以摩尔百分比计。
如本文所用，当在任何时在N-聚糖结构中不存在可检测量的此类糖残基时，糖蛋白组合物“缺乏(lacks)”或“缺乏(is lacking)”特定糖残基，诸如岩藻糖或半乳糖。例如，在本发明优选的实施方案中，糖蛋白组合物由低等真核生物来产生，所述真核生物如上定义，包括酵母（例如毕赤酵母属物种；酵母菌属物种；克鲁维酵母属物种；曲霉属物种），并将“缺乏岩藻糖”，这是因为这些生物的细胞不具有产生岩藻糖化的N-聚糖结构所需的酶。因此，术语“基本上无岩藻糖”包括术语“缺乏岩藻糖”。然而，组合物可以是“基本上无岩藻糖”的，即使组合物同时含有岩藻糖化的N-聚糖结构或含有有限的但可检测量的如上所述的岩藻糖化的N-聚糖结构。
如本文所用，术语“前导肽”指包含前肽原(pre-peptide)（信号肽）和前肽的多肽。
如本文所用，术语“信号肽”指作为蛋白的前体形式上的N-末端肽存在的前肽原。信号肽的功能是实现或促进与其连接的表达的多肽向内质网的易位。信号肽通常在该加工过程中被切掉。信号肽对于用于产生多肽的生物可以是异源的或同源的。可以使用的大量信号肽包括酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信号肽或任何有功能的类似物(Egel-Mitani等YEAST 6:127 137 (1990)和美国专利号5,726,038)和酿酒酵母交配因子α1基因(ScMF α 1)基因的信号肽(Thorner (1981) in The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae, Strathern等, 编辑, pp 143 180, Cold Spring Harbor Laboratory, NY和美国专利号4,870,008。
如本文所用，术语“前肽”指这样的肽，其功能为允许其连接的表达的多肽被从内质网导向至高尔基体并进一步至分泌小泡以分泌入培养基中（即，多肽跨过细胞壁的输出或至少经过细胞膜进入酵母细胞的周质间隙）。前肽可以是ScMF α1 (参见美国专利号4,546,082和4,870,008)。或者，前肽可以是合成的前肽，其可以说是自然界中未发现的前肽，包括但不限于在美国专利号5,395,922; 5,795,746; 和5,162,498及在WO 9832867中公开的那些。前肽将优选含有在C末端的内肽酶加工位点，诸如Lys-Arg序列或其任何有功能的类似物。
如本文所用，氨基酸“修饰”指氨基酸的取代，或通过向氨基酸添加化学基团和/或从氨基酸去除化学基团的氨基酸的衍生，并包括用任何在人蛋白中通常发现的20种氨基酸、以及非典型的或非天然存在的氨基酸的取代。非典型氨基酸的商业来源包括Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI)、ChemPep Inc. (Miami, FL)、和Genzyme Pharmaceuticals (Cambridge, MA)。非典型氨基酸可以是购自商业供应商，重新合成，或化学修饰或衍生自天然存在的氨基酸。
附图简述
图1显示质粒载体pGLY8655的图谱，所述载体用于通过同源重组破坏VRG4基因座，导致编码Vrg4p的可读框的缺失。所述载体进一步包括编码可选择标志物潮霉素（HygR）抗性的表达盒。
图2-1和2-2图示显示在多种糖工程化的巴斯德毕赤酵母细胞中几个vrg4缺失突变体的构建，获得的vrg4缺失(vrg4 Δ)克隆的数目，和已通过同源重组整合入宿主细胞基因组中的糖转运蛋白。
图3-1和3-2显示从来自VRG4和vrg4 Δ GFI 1.0糖工程化菌株的总细胞团块(cell mass)提取的N-聚糖的MALDI-TOF (基质辅助激光解析/离子化-飞行时间质谱)分析。
图4-1和4-2显示从来自VRG4和vrg4 Δ GFI 3.5和5.0糖工程化菌株的总细胞团块(cell mass)提取的N-聚糖的MALDI-TOF分析。
图5显示质粒pGLY8594的图谱，所述质粒是靶向THR1基因座并包含编码与巴斯德毕赤酵母AOX1启动子可操作地连接的TNFRII-Fc融合蛋白的两个表达盒的整合载体。所述载体进一步包括编码可选择标志物Zeocin (Sh bl)抗性的表达盒。
图6-1和6-2显示从获自VRG4和vrg4 Δ GFI 1.0和5.0糖工程化菌株（其进一步表达TNFRII-Fc）的总细胞团块提取的N-聚糖的MALDI-TOF分析。
图7显示来自YGLY2-3背景的VRG4和vrg4 Δ糖工程化菌株（其进一步表达TNFRII-Fc）的总细胞团块的N-聚糖的比较。
图8显示来自YGLY6-3背景的VRG4和vrg4 Δ糖工程化菌株（其进一步表达TNFRII-Fc）的总细胞团块的N-聚糖的比较。
图9显示来自YGLY4754背景的VRG4和vrg4 Δ糖工程化菌株（其进一步表达TNFRII-Fc）的总细胞团块的N-聚糖的比较。
图10显示pGLY4510的质粒图谱，所述质粒是靶向巴斯德毕赤酵母TRP2基因座并包含编码与巴斯德毕赤酵母AOX1启动子可操作地连接的大鼠***(rEPO或ratEPO)的两个表达盒的整合载体。所述载体进一步包括编码可选择标志物（其编码Zeocin (Sh bl)抗性）的表达盒。
图11-1和11-2显示从获自VRG4细胞和vrg4 Δ GFI 1.0糖工程化菌株（其进一步表达rEPO）的总细胞团块提取的细胞N-聚糖的MALDI-TOF分析。
图12-1和12-2显示从获自VRG4细胞和vrg4 Δ GFI 1.0糖工程化菌株的rEPO组合物的rEPO N-聚糖组合物的MALDI-TOF分析。
图13显示从获自VRG4和vrg4 Δ GFI 5.0糖工程化菌株的rEPO组合物的rEPO N-聚糖组合物的MALDI-TOF分析。
图14显示pGLY7430的质粒图谱，所述质粒是靶向TRP1基因座并且携带巴斯德毕赤酵母OCH1基因的KINKO整合载体。所述载体进一步包括编码可选择标志物（其编码诺尔丝菌素(NATR)抗性）的表达盒。
图15图示显示在多种糖工程化巴斯德毕赤酵母细胞（其中OCH1基因已被再引入菌株内并且表达为报道蛋白TNFRII-Fc或不表达）中几个VRG4和vrg4 Δ菌株的构建。
图16-1和16-2显示从获自VRG4细胞和vrg4 Δ GFI 1.0糖工程化菌株（其中OCH1基因已被再引入并因此相比于och1 Δ的菌株，为OCH1）的总细胞团块中提取的细胞N-聚糖的MALDI-TOF分析。
图17-1和17-2显示从获自VRG4细胞和vrg4 Δ GFI 1.0糖工程化菌株（其中OCH1基因已被再引入并因此相比于och1 Δ的菌株，为OCH1）的总细胞团块中提取的细胞N-聚糖的MALDI-TOF分析。菌株进一步表达TNFRII-Fc为报道蛋白。
图18-1和18-2显示从获自VRG4细胞和vrg4 Δ GFI 1.0糖工程化菌株（其中OCH1基因已被再引入并因此相比于och1 Δ的菌株，为OCH1）的TNFRII-Fc组合物中提取的N-聚糖的MALDI-TOF分析。菌株表达TNFRII-Fc为报道蛋白。
图19显示可以与基序Asn-Xaa-Ser/Thr中的天冬酰胺残基连接的N-聚糖结构的实例，其中Xaa是除糖蛋白的脯氨酸之外的任何氨基酸。
图20显示相比于菌株YGLY14-3和亲株YGLY28269（菌株YGLY14-3的重新制作），从来自菌株YGLY29175 (vrg4 Δ)的总细胞团块提取的N-聚糖的MALDI-TOF分析。
图21显示相比于菌株YGLY14-3和亲株YGLY28269（菌株YGLY14-3的重新制作），从来自菌株YGLY29175、YGLY29176和YGLY29177 (均vrg4 Δ)的总细胞团块提取的N-聚糖的HPLC分析。
图22-1和22-2图示显示在OCH1和och1Δ菌株中工程化的VRG4和vrg4Δ菌株的构建。在OCH1菌株谱系的实例中，ATT1的敲除在VRG4敲除前合并。
图23-1和23-2显示相比于在摇瓶中生长的菌株YGLY25241 (och1 Δ /vrg4 Δ)，从来自在摇瓶中生长的菌株YGLY29170 (och1 Δ /vrg4 Δ)的总细胞团块提取的N-聚糖的MALDI-TOF分析。还显示的是来自YGLY27836 (OCH1/att1Δ)和YGLY29170 (OCH1/att1Δ/vrg4Δ)的聚糖的比较，其表明在野生型OCH1背景中VRG4敲除上，甘露糖基化程度大大降低。
发明详述
本发明提供降低或消除低等真核生物宿主细胞（包括但不限于酵母和丝状真菌宿主细胞）中产生的重组异源的、非内源蛋白和糖蛋白的N-连接和/或O-连接的寡糖的可检测的甘露糖基化的方法。具体而言，本发明提供重组低等真核生物宿主细胞，其中由钒酸盐抗性糖基化4(VRG4)基因编码的GDP甘露糖转运蛋白或其同源物的表达已被破坏。当这些宿主细胞用于产生重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白时，相比于在表达内源VRG4基因并产生有功能的GDP甘露糖转运蛋白的宿主细胞中产生的对应蛋白或糖蛋白上的杂合和高甘露糖N-聚糖的量，其上的杂合和高甘露糖N-聚糖的量降低。通常，如本文公开的缺乏VRG4基因表达的宿主细胞中N-和/或O-聚糖具有明显更低的向聚糖上的内质网后甘露糖添加(post-endoplasmic reticulum mannose addition)，而表达VRG4基因的宿主细胞产生其中发生显著甘露糖基化（包括α-连接的甘露糖、β-连接的甘露糖和/或磷酸甘露糖的掺入）的N-和/或O-聚糖。此外，当宿主细胞用于产生重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白时，相比于在表达内源VRG4基因和有功能的GDP甘露糖转运蛋白的宿主细胞中产生的对应蛋白或糖蛋白上的N-聚糖和O-聚糖的甘露糖基化的量，在其上N-聚糖和/或O-聚糖上的甘露糖基化（包括α-连接的甘露糖、β-连接的甘露糖和/或磷酸甘露糖掺入）的量降低。如此，相比于在表达内源VRG4基因和有功能的GDP甘露糖转运蛋白的宿主细胞中产生的O-聚糖甘露糖基化，其上O-聚糖甘露糖基化（即，O-聚糖中甘露糖残基的数目）降低。通常，相对于在本发明的宿主细胞中产生的蛋白或糖蛋白上的甘露糖和甘露二糖O-聚糖的量或比例，甘露三糖和甘露四糖O-聚糖的量或比例降低或减少，从而使甘露糖和甘露二糖O-聚糖是蛋白或糖蛋白上的主要O-聚糖种类。在本发明具体的实施方案中，在本发明的宿主细胞中产生的蛋白或糖蛋白具有主要的甘露糖和甘露二糖O-聚糖，而无可检测的甘露三糖或甘露四糖O-聚糖。此外，本发明证实VRG4基因的破坏可以显著降低来自几种背景的菌株中甘露二糖O-聚糖为具有主要单一甘露糖的O-聚糖。
VRG4基因或其同源物编码GDP甘露糖转运蛋白，其促进GDP甘露糖从细胞质转运至高尔基体中，其中使得GDP甘露糖对高尔基体驻留的甘露糖基转移酶是可用的。高尔基体驻留的甘露糖基转移酶完成甘露糖从GDP甘露糖转移至糖蛋白的N-聚糖或O-聚糖，或转移至含磷酸肌醇的鞘脂。转移的甘露糖可以以α1,2; α1,3; α1,6; 或β1,2连接掺入聚糖或鞘脂内。或者，甘露糖可以转移至N-聚糖或O-聚糖作为磷酸甘露糖，其随后向糖蛋白或鞘脂引入电荷。
VRG4基因在酿酒酵母中由Poster和Dean鉴定 (J. Biol.Chem.271:3837-3845 (1996))，其还显示vrg4突变体缺乏糖蛋白的N-聚糖的外链糖基化，其一般在糖蛋白穿过高尔基体过程中延展。Dean等(J. Biol.Chem.272:31908-31914 (1997)显示Vrg4p蛋白是GDP甘露糖跨膜转运蛋白，并且其存在对于细胞生长是必需的。Abe等(FEBS Letts.458:309-312 (1999)显示Vrg4p或GDP甘露糖跨膜转运蛋白具有多个跨膜结构域，并且对于GDP甘露糖穿过高尔基体膜转运是必需的。
巴斯德毕赤酵母VRG4基因包含显示在SEQ ID NO:3中的核苷酸序列或至少编码具有SEQ ID NO:77中显示的氨基酸序列的巴斯德毕赤酵母GDP甘露糖跨膜转运蛋白（Vrg4p）的可读框（ORF），其由SEQ ID NO:3的核苷酸1001-1987编码，具有包括核苷酸1988-1990的终止密码子。编码Vrg4p的核酸序列显示在SEQ ID NO:76。本发明进一步提供包含与SEQ ID NO:1、2、3或76中显示的核苷酸序列70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或更高同一性的核酸分子。本发明进一步提供编码GDP甘露糖跨膜转运蛋白的核酸分子，所述转运蛋白具有与SEQ ID NO:77中显示的多肽序列70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或更高的同一性。本发明进一步提供质粒载体，其包含含有与SEQ ID NO:1中显示的核苷酸序列70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或更高的同一性的核酸分子。本发明进一步提供质粒载体，其包含含有与SEQ ID NO:2中显示的核苷酸序列70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或更高的同一性的核酸分子。本发明进一步提供质粒载体，其包含含有与SEQ ID NO:1中显示的核苷酸序列70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或更高的同一性的核酸分子，和含有与SEQ ID NO:2中显示的核苷酸序列70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或更高的同一性的核酸分子。本发明进一步提供质粒载体，其包含含有与SEQ ID NO:76中显示的核苷酸序列70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或更高的同一性的核酸分子。本发明进一步提供编码包含核酸分子的质粒载体，所述核酸分子编码含有与SEQ ID NO:77中显示的多肽序列70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或更高的同一性的GDP甘露糖跨膜转运蛋白。
真菌诸如酵母是产生蛋白有吸引力的宿主，因为它们能够以高产量产生高质量的蛋白。然而，酵母的糖基化途径产生具有与由哺乳动物和人宿主细胞产生的糖基化模式非常不同的糖基化模式的糖蛋白。酵母产生具有高甘露糖基化或高甘露糖N-聚糖的糖蛋白。低等真核生物诸如酵母缺乏合成具有半乳糖、岩藻糖、和末端唾液酸：通常在哺乳动物和人N-聚糖中发现的糖的N-聚糖的能力。因此，为了使用酵母宿主细胞产生具有人样N-聚糖糖蛋白，宿主细胞通常工程化以缺乏使宿主细胞产生具有高甘露糖或高甘露糖基化的N-聚糖的糖蛋白的甘露糖基转移酶活性，并随后修饰以包括一个或多个编码来自哺乳动物或人来源的糖转运蛋白和糖基转移酶活性的核酸分子，其已修饰以包括将糖基转移酶活性靶向内质网或高尔基体中的位置的定位肽，这实现糖基转移酶活性来修饰糖蛋白上的N-聚糖，因为它改变(traverses)分泌途径为具有哺乳动物样或人样糖基化模式。美国专利号7,029,872公开了产生重组低等真核生物宿主细胞的方法，所述宿主细胞产生具有哺乳动物样或人样N-聚糖的糖蛋白。
例如，为了降低巴斯德毕赤酵母和酿酒酵母中N-聚糖的外链糖基化，编码α1,6-甘露糖基转移酶(Och1p)的OCH1基因的表达被破坏（参见美国专利号7,029,872）。尽管破坏OCH1基因的表达显著降低外链糖基化和因此高甘露糖基化，但酵母宿主细胞表达其他可以作用于高尔基体中以完成甘露糖残基向N-聚糖转移的甘露糖基转移酶。例如，图4-1、6-1和11-1每一显示遗传工程化以缺乏OCH1的表达并进一步修饰以产生哺乳动物样或人样N-聚糖的巴斯德毕赤酵母宿主细胞可能仍产生可检测的高甘露糖N-聚糖，即，含有多于九个甘露糖残基的N-聚糖。这些甘露糖基转移酶驻留在高尔基体内并且依赖于Vrg4p或GDP甘露糖跨膜转运蛋白来转运足够的GDP甘露糖至高尔基体内来转移至N-聚糖。
为了进一步降低具有酵母N-聚糖结构的蛋白或糖蛋白的发生，酵母宿主细胞进一步修饰以缺乏β-甘露糖基转移酶活性和磷酸甘露糖基转移酶活性。为了降低具有β-连接的甘露糖残基的N-聚糖和O-聚糖的发生，破坏一个或多个β-甘露糖基转移酶基因（例如BMT1、BMT2 、 BMT3和BMT4）的表达（参见美国专利号7,465,577、美国专利号7,713,719、和公开的国际申请号WO2011046855）。为了使细胞产生具有哺乳动物样或人样N-聚糖的蛋白或糖蛋白，宿主细胞随后修饰以包括一个或多个编码来自哺乳动物样或人来源的糖基化酶活性（其修饰以包括将糖基化活性靶向内质网或高尔基体内的位置的定位肽）的核酸分子，这实现糖基化酶活性来修饰糖蛋白上的N-聚糖。为了降低具有磷酸化的甘露糖残基的N-聚糖和O-聚糖的发生，破坏PNO1和MNN4基因的表达（美国专利号7,198,921和7,259,007）。在酿酒酵母中，破坏MNN4基因(Chiba等J. Biol.Chem.273:26298-26304 (1998))。
然而，已发现在某些情况下，这些宿主细胞可以持续展示残余的甘露糖基化活性。因此，这些宿主细胞中产生的蛋白或糖蛋白的组合物在某些情况下可以包括具有可检测量的高甘露糖、磷酸甘露糖或β-甘露糖结构的糖蛋白的群体或亚群。对于治疗性蛋白或糖蛋白的产生，这些结构的存在（即使以非常低的量）是不期望的，因为当包含即使非常低量的具有此类结构的糖蛋白的蛋白或糖蛋白组合物施用于一些患者时，所述组合物可能仍引起不想要的免疫应答。此外，这些不想要的或不合适的糖基化结构可能修饰蛋白或糖蛋白的活性至干扰(inters with)所述蛋白或糖蛋白的活性的程度。例如，不想要的或不合适的糖基化可以使蛋白或糖蛋白有活性。
本发明人已发现其中内源VRG4基因的表达已被破坏的巴斯德毕赤酵母宿主细胞不仅是有活力的，而且还能够产生这样的糖蛋白，其中相比于在表达内源VRG4基因并产生有功能的GDP甘露糖跨膜转运蛋白的宿主细胞中产生的杂合和高甘露糖N-聚糖的量，杂合和高甘露糖N-聚糖的量降低；相比于在表达内源VRG4基因并产生有功能的GDP甘露糖跨膜转运蛋白的宿主细胞中产生的磷酸甘露糖N-聚糖和O-聚糖的量，磷酸甘露糖N-聚糖和O-聚糖的量降低；和相比于在表达内源VRG4基因并产生有功能的GDP甘露糖跨膜转运蛋白的宿主细胞中所产生的，O-聚糖甘露糖基化（即，O-聚糖中的甘露糖残基的数目）降低。例如，图4-2、6-2和11-2每一显示遗传工程化以缺乏OCH1和VRG4的表达并进一步修饰以产生哺乳动物样或人样N-聚糖的巴斯德毕赤酵母宿主细胞不产生可检测的高甘露糖N-聚糖，即，含有多于九个甘露糖残基的N-聚糖。如实施例中所示，磷酸甘露糖基化中的降低可以甚至在表达PNO1 、 MNN4和MNN4L1基因（已知参与N-聚糖和O-聚糖的磷酸甘露糖基化的基因）的宿主细胞中实现。
本发明人已发现其中已破坏外链(OCH1)基因或同源物、获得性热耐受性1(ATT1)基因或同源物、或两者的表达的巴斯德毕赤酵母菌株可以耐受VRG4基因表达的破坏。缺乏VRG4基因表达的有活力的重组宿主细胞还可以如下构建：通过随机诱变，随后用指定为破坏VRG4基因表达的质粒载体或编码siRNA以已知VRG4基因表达的质粒载体转化诱变的宿主细胞，和对经转化的宿主细胞筛选有活力的重组宿主细胞。有活力的重组宿主细胞可以用作本文公开的来产生重组糖蛋白。
通过破坏VRG4基因或其同源物的表达，提供缺乏分泌途径GDP甘露糖库的vrg4宿主细胞。由于分泌途径中的甘露糖基转移酶使用GDP甘露糖作为糖供体来转移甘露糖至N-或O-聚糖，vrg4宿主细胞中缺乏分泌途径GDP甘露糖库导致糖蛋白上的N-和/或O-聚糖延伸的抑制或消除，这是因为它们改变了分泌。此外，VRG4基因或其同源物的破坏表达也抑制磷酸化的或具有一个或多个以β1,2-连接连接的甘露糖残基的N-聚糖的合成。
如上所讨论的，抑制或降低不期望的糖形（例如，高甘露糖和磷酸化的N-聚糖和具有β1,2-连接的甘露糖残基的N-聚糖）发生的现有技术方法涉及构建其中编码甘露糖基转移酶的大量基因表达被破坏的重组宿主细胞。例如，为了产生其中抑制或消除高甘露糖和磷酸化的N-聚糖和含有β1,2-连接的甘露糖残基的N-聚糖的合成的重组巴斯德毕赤酵母宿主细胞，抑制高至七个编码不同甘露糖基转移酶的宿主基因的表达。在宿主中通过破坏仅一个基因（VRG4基因）表达的来实现相似效果的能力相对于现有技术方法是显著改进，所述现有技术方法用于抑制或消除可能在表达具体的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白的具体宿主细胞中发生的许多不期望的糖形。当期望进一步宿主细胞的遗传工程来产生能够产生具有哺乳动物样或人样糖形的蛋白或糖蛋白的宿主细胞时，这是尤其值得关注的。例如，在产生可以主要产生图19中显示的糖形的任一种的宿主细胞中，可以发生竞争性甘露糖基化，其经常是生长或培养条件相关的，并且其影响产生的糖蛋白的总体质量。一种此类不期望的甘露糖基化活性是以α1,2连接向N-聚糖加入甘露糖残基。负责转移这些甘露糖残基至N-或O-聚糖的基因家族具有几个成员。因此，消除该不期望的活性可能潜在地需要破坏每一个家族成员的表达。破坏VRG4基因的表达实现来这一最终目标，而不需鉴定该基因家族的所有成员并随后破坏所有家族成员的表达。
因此，在具体的实施方案中，提供这样的低等真核生物宿主细胞，其包含（a）钒酸盐抗性糖基化(VRG4)基因或其同源物表达的破坏；和（b）编码重组异源的、非内源糖蛋白的核酸分子，其中所述宿主细胞不产生有功能的GDP甘露糖跨膜转运蛋白（Vrg4p）并且其中所述宿主细胞是有活力的。VRG4基因或其同源物表达的破坏可以通过提供抑制剂来实现，所述抑制剂选自结合或拮抗编码的GDP甘露糖跨膜转运蛋白(Vrg4p)的功能的化合物、编码Vrg4p的mRNA的反义DNA、和编码Vrg4p的mRNA的siRNA。VRG4基因或其同源物表达的破坏可以通过缺失VRG4基因或编码Vrg4p的可读框(ORF)或通过缺失编码Vrg4p的ORF内的一个或多个核苷酸或通过***异源核酸分子到编码Vrg4p的ORF内来实现。在具体的实施方案中，VRG4基因表达的破坏可以通过引入一个或多个突变到编码vrg4p的ORF中（其突变产生Vrg4p活性的破坏、废除或降低）来实现。破坏基因表达的进一步的方法是通过将ORF置于异源启动子和/或终止子的调控下来改变表达水平。此类表达控制可以是天然的或突变的ORF或其部分的组成型的、诱导型的或可抑制的表达。因此，在具体的实施方案中，宿主细胞不产生有功能的GDP甘露糖跨膜转运蛋白（Vrg4p）或产生具有降低活性的GDP甘露糖跨膜转运蛋白（Vrg4p），或者根本不产生GDP甘露糖跨膜转运蛋白（Vrg4p）。如本文所用，术语Vrg4p指由VRG4基因或其同源物编码的蛋白。
低等真核生物宿主细胞可以进一步包括其中破坏至少一个选自BMT1、BMT2、BMT3和BMT4的β-甘露糖基转移酶(BMT)基因的表达的实施方案，其可以包括其中缺失或破坏编码Bmt蛋白的BMT基因或ORF的实施方案。
在具体的方面中，低等真核生物宿主细胞具有外链（Outer Chain (OCH1)）基因或其同源物、获得性热耐受性1（Acquired Thermo-Tolerance 1 (ATT1)）基因或其同源物、或两者的表达的破坏。表达的破坏包括但不限于编码Och1p的OCH1基因或ORF的缺失或破坏和/或编码Att1p的ATT1基因或ORF的缺失或破坏。
低等真核生物宿主细胞可以是酵母或丝状真菌宿主细胞。酵母或丝状真菌宿主细胞可以选自巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）、芬兰毕赤酵母（Pichia finlandica）、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、膜醭毕赤酵母（Pichia membranaefaciens）、微小毕赤酵母（Pichia minuta）（Ogataea minuta, Pichia lindneri）、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、柳毕赤酵母（Pichia salictaria）、Pichia guercuum、Pichia pijperi、树干毕赤酵母（Pichia stiptis）、嗜甲毕赤酵母（Pichia methanolica）、毕赤酵母属物种（Pichia sp.）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、酵母菌属物种（Saccharomyces sp.）、多形汉森酵母（Hansenula polymorpha）、克鲁维酵母属物种（Kluyveromyces sp.）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）、白色念珠菌（Candida albicans）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、里氏木霉（Trichoderma reesei）、Chrysosporium lucknowense、镰孢属物种（Fusarium sp.）、禾谷镰孢菌（Fusarium gramineum）、Fusarium venenatum、小立碗藓（Physcomitrella patens）和粗糙链孢霉（Neurospora crassa）。在具体的方面，宿主细胞是酵母宿主细胞，其选自巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）、芬兰毕赤酵母（Pichia finlandica）、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、膜醭毕赤酵母（Pichia membranaefaciens）、微小毕赤酵母（Pichia minuta）（Ogataea minuta, Pichia lindneri）、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、柳毕赤酵母（Pichia salictaria）、Pichia guercuum、Pichia pijperi、树干毕赤酵母（Pichia stiptis）、嗜甲毕赤酵母（Pichia methanolica）和毕赤酵母属物种（Pichia sp.）。在具体的方面，低等真核生物宿主细胞是巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）。
进一步提供在低等真核生物宿主细胞中产生重组糖蛋白的方法，其包括在低等真核生物宿主细胞（其中编码GDP甘露糖跨膜转运蛋白的钒酸盐抗性糖基化(VRG4)基因或其同源物的表达已被破坏）中表达编码重组糖蛋白的核酸分子。在进一步的实施方案中，VRG4基因表达的破坏包括缺失或破坏编码GDP甘露糖跨膜转运蛋白（Vrg4p）的VRG4基因或ORF。
进一步提供降低低等真核生物宿主细胞中产生的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白的N-和/或O-聚糖的磷酸甘露糖基化的量的方法，其包括在低等真核生物宿主细胞（其中编码GDP甘露糖跨膜转运蛋白的钒酸盐抗性糖基化(VRG4)基因或其类似物的表达已被破坏）中表达编码重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白的核酸分子，其中磷酸甘露糖基化的量低于在表达GDP甘露糖跨膜转运蛋白的低等真核生物宿主中产生的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白上的磷酸甘露糖基化。在进一步的实施方案中，VRG4基因表达的破坏包括缺失或破坏编码GDP甘露糖跨膜转运蛋白（Vrg4p）的VRG4基因或ORF。
进一步提供降低低等真核生物宿主细胞中产生的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白的N-和/或O-聚糖的α-连接的甘露糖掺入的量的方法，其包括在低等真核生物宿主细胞（其中编码GDP甘露糖跨膜转运蛋白的钒酸盐抗性糖基化(VRG4)基因或其类似物的表达已被破坏）中表达编码重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白的核酸分子，其中α-连接的甘露糖掺入的量低于在表达GDP甘露糖跨膜转运蛋白的低等真核生物宿主中产生的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白上的α-连接的甘露糖掺入。在进一步的实施方案中，VRG4基因表达的破坏包括缺失或破坏编码GDP甘露糖跨膜转运蛋白（Vrg4p）的VRG4基因或ORF。
进一步提供降低低等真核生物宿主细胞中产生的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白的N-和/或O-聚糖的β-连接的甘露糖掺入的量的方法，其包括在低等真核生物宿主细胞（其中编码GDP甘露糖跨膜转运蛋白的钒酸盐抗性糖基化(VRG4)基因或其类似物的表达已被破坏）中表达编码重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白的核酸分子，其中β-连接的甘露糖掺入的量低于在表达GDP甘露糖跨膜转运蛋白的低等真核生物宿主中产生的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白上的β-连接的甘露糖掺入。在进一步的实施方案中，VRG4基因表达的破坏包括缺失或破坏编码GDP甘露糖跨膜转运蛋白（Vrg4p）的VRG4基因或ORF。
进一步提供降低低等真核生物宿主细胞中产生的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白上的高甘露糖N-聚糖的量的方法，其包括在低等真核生物宿主细胞（其中编码GDP甘露糖跨膜转运蛋白的钒酸盐抗性糖基化(VRG4)基因的表达已被破坏）中表达编码重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白的核酸分子，其中高甘露糖N-聚糖的量低于在表达GDP甘露糖跨膜转运蛋白的低等真核生物宿主中产生的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白上的高甘露糖N-聚糖的量。在进一步的实施方案中，VRG4基因表达的破坏包括缺失或破坏编码GDP甘露糖跨膜转运蛋白（Vrg4p）的VRG4基因或编码ORF或ORF。
进一步提供降低酵母宿主细胞中产生的重组糖蛋白上的杂合N-聚糖的甘露糖基化量的方法，其包括在低等真核生物宿主细胞（其中编码GDP甘露糖跨膜转运蛋白的钒酸盐抗性糖基化(VRG4)基因的表达已被破坏）中表达编码重组糖蛋白的核酸分子，其中杂合N-聚糖的甘露糖基化的程度（或量）低于在表达GDP甘露糖跨膜转运蛋白的低等真核生物宿主中产生的重组糖蛋白上的杂合N-聚糖的甘露糖基化的量。在进一步的实施方案中，VRG4基因表达的破坏包括缺失或破坏编码GDP甘露糖跨膜转运蛋白（Vrg4p）的VRG4基因或编码ORF或ORF。
任一种上述方法可以进一步包括其中破坏至少一个选自BMT1、BMT2、BMT3和BMT4的β-甘露糖基转移酶(BMT)基因的表达的实施方案，其可以包括其中缺失或破坏编码Bmtp蛋白的BMT基因或ORF的实施方案。
任一种上述方法进一步包括其中低等真核生物宿主细胞具有外链(OCH1)基因或其同源物、获得性热耐受性1(ATT1)基因或其同源物、或两者表达的破坏的实施方案。表达的破坏包括但不限于编码Och1p的OCH1基因或ORF的缺失或破坏和/或编码Att1p的ATT1基因或ORF的缺失或破坏。
任一种上述方法可以进一步包括其中低等真核生物宿主细胞是酵母或丝状真菌宿主细胞的实施方案。在进一步的方面，宿主细胞选自巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）、芬兰毕赤酵母（Pichia finlandica）、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、膜醭毕赤酵母（Pichia membranaefaciens）、微小毕赤酵母（Pichia minuta）（Ogataea minuta, Pichia lindneri）、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、柳毕赤酵母（Pichia salictaria）、Pichia guercuum、Pichia pijperi、树干毕赤酵母（Pichia stiptis）、嗜甲毕赤酵母（Pichia methanolica）、毕赤酵母属物种（Pichia sp.）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、酵母菌属物种（Saccharomyces sp.）、多形汉森酵母（Hansenula polymorpha）、克鲁维酵母属物种（Kluyveromyces sp.）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）、白色念珠菌（Candida albicans）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、里氏木霉（Trichoderma reesei）、Chrysosporium lucknowense、镰孢属物种（Fusarium sp.）、禾谷镰孢菌（Fusarium gramineum）、Fusarium venenatum、小立碗藓（Physcomitrella patens）和粗糙链孢霉（Neurospora crassa）。在进一步的方面，宿主细胞是酵母宿主细胞，其选自巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）、芬兰毕赤酵母（Pichia finlandica）、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、膜醭毕赤酵母（Pichia membranaefaciens）、微小毕赤酵母（Pichia minuta）（Ogataea minuta, Pichia lindneri）、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、柳毕赤酵母（Pichia salictaria）、Pichia guercuum、Pichia pijperi、树干毕赤酵母（Pichia stiptis）、嗜甲毕赤酵母（Pichia methanolica）和毕赤酵母属物种（Pichia sp.）。在进一步的方面，宿主细胞是巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）。
上述宿主细胞和因此使用低等真核生物宿主细胞的方法进一步包括实施方案，其中所述宿主细胞已遗传工程化以产生具有人样N-聚糖的蛋白或糖蛋白，尤其是重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白。因此，上述重组宿主细胞可以进一步包括以下遗传操作的任何组合以提供这样的宿主细胞，其能够表达其中N-糖基化模式是哺乳动物样或人样或人源化的或其中特定N-聚糖种类是主要的蛋白或糖蛋白。这可以通过消除选定的内源糖基化酶和/或供应内源酶来实现，如由Gerngross等美国专利号7,449,308描述的，其公开内容通过引用并入本文，并且降低酵母中O-糖基化的一般方法已描述在国际申请号WO2007061631中。以这种方式，可以产生其中特定期望的糖形在组合物中是主要的蛋白或糖蛋白组合物。如需要，可以进行糖基化的另外的遗传工程，从而使得可以产生具有或不具有核心岩藻糖基化的蛋白或糖蛋白。使用低等真核生物宿主细胞诸如酵母是进一步有利的，其中这些细胞能够产生蛋白或糖蛋白相对同源的组合物，从而使蛋白或糖蛋白的主要糖形可以存在为大于组合物中蛋白或糖蛋白的30摩尔％。在具体的方面，主要糖形可以以大于40摩尔％、50摩尔％、60摩尔％、70摩尔％，和最优选地，大于80摩尔％的存在于组合物中的蛋白或糖蛋白存在。这可以通过消除选定的内源糖基化酶和/或供应内源酶来实现，如由Gerngross等美国专利号7,029,872和美国专利号7,449,308所描述的，其公开内容通过引用并入本文。例如，宿主细胞可以选择或工程化以减少α1,6-甘露糖基转移酶活性，其将另外添加甘露糖残基至糖蛋白上的N-聚糖中。例如，在酵母中，此类α1,6-甘露糖基转移酶活性由OCH1基因编码，并且OCH1的缺失或破坏抑制酵母诸如巴斯德毕赤酵母或酿酒酵母中高甘露糖或高甘露糖基化N-聚糖的产生。（参见例如，Gerngross等在美国专利号7,029,872中; Contreras等在美国专利号6,803,225中; 和Chiba等在EP1211310B1中，其公开内容通过引用并入本文）。
在一个实施方案中，宿主细胞进一步包括α1,2-甘露糖苷酶催化结构域，其融合至通常不与该催化结构域连接的细胞靶向信号肽，并且选择以将α1,2-甘露糖苷酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白经过宿主细胞的ER或高尔基体产生包含糖形的重组蛋白或糖蛋白，例如，主要包含糖形的重组蛋白或糖蛋白组合物。例如，美国专利号7,029,872、美国专利号7,449,308和美国公开的专利申请号2005/0170452（其公开内容均通过引用并入本文）公开了能够产生包含糖形的重组异源的、非内源蛋白或蛋白糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。
在进一步的实施方案中，刚刚前面的宿主细胞进一步包括N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I (GlcNAc转移酶I或GnT I)催化结构域，其融合至通常不与该催化结构域连接的细胞靶向信号肽，并且选择以将GlcNAc转移酶I活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白经过宿主细胞的ER或高尔基体产生包含糖形的重组糖蛋白，例如，主要包含糖形的重组糖蛋白组合物。美国专利号7,029,872、美国专利号7,449,308和美国公开的专利申请号2005/0170452（其公开内容均通过引用并入本文）公开了能够产生包含糖形的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。在上述细胞中产生的糖蛋白可以用氨基己糖苷酶(hexaminidase)体外处理来产生包含糖形的重组蛋白或糖蛋白。
在进一步的实施方案中，刚刚前面的宿主细胞进一步包括甘露糖苷酶II催化结构域，其融合至通常不与该催化结构域连接的细胞靶向信号肽，并且选择以将甘露糖苷酶II活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白经过宿主细胞的ER或高尔基体产生包含糖形的重组糖蛋白，例如，主要包含糖形的重组糖蛋白组合物。美国专利号7,029,872和美国专利号7,625,756（其公开内容均通过引用并入本文）公开了表达甘露糖苷酶II酶并能够产生主要具有糖形的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。在上述细胞中产生的糖蛋白可以用去除末端GlcNAc残基的氨基己糖苷酶体外处理来产生包含糖形的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白，或者氨基己糖苷酶可以与宿主细胞中的糖蛋白共表达来产生包含糖形的重组糖蛋白。
在进一步的实施方案中，刚刚前面的宿主细胞进一步包括N-乙酰氨基葡萄糖转移酶II (GlcNAc转移酶II或GnT II)催化结构域，其融合至通常不与该催化结构域连接的细胞靶向信号肽，并且选择以将GlcNAc转移酶II活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白经过宿主细胞的ER或高尔基体产生包含糖形的重组糖蛋白，例如，主要包含糖形的重组糖蛋白组合物。美国专利号7,029,872和7,449,308和美国公开的专利申请号2005/0170452（其公开内容均通过引用并入本文）公开了能够产生包含糖形的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。在上述细胞中产生的糖蛋白可以用去除末端GlcNAc残基的氨基己糖苷酶体外处理来产生包含糖形的重组蛋白或糖蛋白，或者氨基己糖苷酶可以与宿主细胞中的糖蛋白共表达来产生包含糖形的重组蛋白或糖蛋白。
在进一步的实施方案中，刚刚前面的宿主细胞进一步包括半乳糖基转移酶催化结构域，其融合至通常不与该催化结构域连接的细胞靶向信号肽，并且选择以将半乳糖基转移酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白经过宿主细胞的ER或高尔基体产生包含或糖形或其混合物的重组糖蛋白，例如，主要包含糖形或糖形或其混合物的重组蛋白或糖蛋白组合物。美国专利号7,029,872和美国公开的专利申请号2006/0040353（其公开内容均通过引用并入本文）公开了能够产生包含糖形的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。在上述细胞中产生的蛋白或糖蛋白可以用半乳糖苷酶体外处理来产生包含糖形的重组蛋白或糖蛋白，例如主要包含糖形的重组蛋白或糖蛋白组合物，或者半乳糖苷酶可以与宿主细胞中的糖蛋白共表达来产生包含糖形的重组蛋白或糖蛋白，例如主要包含糖形的重组糖蛋白组合物。
在进一步的实施方案中，刚刚前面的宿主细胞进一步包括唾液酸转移酶催化结构域，其融合至通常不与该催化结构域连接的细胞靶向信号肽，并且选择以将唾液酸转移酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白经过宿主细胞的ER或高尔基体产生主要包含糖形或糖形或其混合物的重组糖蛋白。对于低等真核生物宿主细胞诸如酵母和丝状真菌，宿主细胞进一步包括用于提供CMP唾液酸用于转移至聚糖的方法是有用的。美国公开的专利申请号2005/0260729（其公开内容通过引用并入本文）公开了遗传工程化低等真核生物以具有CMP唾液酸合成途径的方法，并且美国公开的专利申请号2006/0286637（其公开内容通过引用并入本文）公开了遗传工程化低等真核生物以产生唾液酸化的糖蛋白的方法。上述细胞中产生的蛋白或糖蛋白可以用神经氨酸酶体外处理来产生主要包含糖形或糖形或其混合物的重组蛋白或糖蛋白，或者神经氨酸酶可以与宿主细胞中的糖蛋白共表达来产生主要包含糖形或糖形或其混合物的重组蛋白或糖蛋白。
在进一步的方面，能够产生具有糖形的蛋白或糖蛋白的上述宿主细胞可以进一步包括甘露糖苷酶III催化结构域，其融合至通常不与该催化结构域连接的细胞靶向信号肽，并且选择以将甘露糖苷酶III活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白经过宿主细胞的ER或高尔基体产生包含糖形的重组蛋白或糖蛋白，例如，主要包含糖形的重组蛋白或糖蛋白组合物。美国专利号7,625,756（其公开内容均通过引用并入本文）公开了表达甘露糖苷酶III酶并能够产生主要具有糖形的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白的低等真核生物宿主细胞的用途。
前述宿主细胞的任一种可以进一步包括一种或多种选自GnT III、GnT IV、GnT V、GnT VI和GnT IX的GlcNAc转移酶，以产生具有二等分的(GnT III)和/或多触角的(GnT IV、V、VI和IX) N-聚糖结构的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白，诸如公开于美国专利号7,598,055和美国公开的专利申请号2007/0037248，其公开内容均通过引用并入本文。
在进一步的实施方案中，产生主要具有 N-聚糖的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白的宿主细胞进一步包括半乳糖基转移酶催化结构域，其融合至通常不与该催化结构域连接的细胞靶向信号肽，并且选择以将半乳糖基转移酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白经过宿主细胞的ER或高尔基体产生主要包含糖形的重组糖蛋白。
在进一步的实施方案中，产生主要具有 N-聚糖的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白的刚刚前述的宿主细胞进一步包括唾液酸转移酶催化结构域，其融合至通常不与该催化结构域连接的细胞靶向信号肽，并且选择以将唾液酸转移酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白经过宿主细胞的ER或高尔基体产生包含糖形的重组蛋白或糖蛋白。
通常，酵母和丝状真菌不能产生具有包括岩藻糖的N-聚糖的蛋白或糖蛋白。因此，本文公开的N-聚糖将缺乏岩藻糖，除非宿主细胞特定修饰以包括合成GDP岩藻糖的途径和岩藻糖基转移酶。因此，在其中期望具有其中N-聚糖包括岩藻糖的糖蛋白的具体方面，前述宿主细胞的任一种进一步修饰以包括岩藻糖基转移酶和产生岩藻糖并转运岩藻糖至ER或高尔基体的途径。修饰巴斯德毕赤酵母使其能够产生其中其上的一种或多种N-聚糖被岩藻糖基化的蛋白或糖蛋白的方法实例公开于公开的国际申请号WO 2008112092中，其公开内容通过参考并入本文。在本发明的具体方面，巴斯德毕赤酵母宿主细胞进一步修饰以包括岩藻糖基化途径，其包含GDP-甘露糖-4,6-脱水酶、GDP-酮-脱氧-甘露糖-差向异构酶/GDP-酮-脱氧-半乳糖-还原酶、GDP-岩藻糖转运蛋白和岩藻糖基转移酶。在一个具体的方面，岩藻糖基转移酶选自α1,2-岩藻糖基转移酶、α1,3-岩藻糖基转移酶、α1,4-岩藻糖基转移酶、和α1,6-岩藻糖基转移酶。
多种前述宿主细胞进一步包括一种或多种糖转运蛋白诸如UDP-GlcNAc转运蛋白（例如，乳酸克鲁维酵母和小家鼠(Mus musculus)UDP-GlcNAc转运蛋白）、UDP-半乳糖转运蛋白（例如，黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)UDP-半乳糖转运蛋白）、和CMP-唾液酸转运蛋白（例如，人唾液酸转运蛋白）。因为低等真核生物宿主细胞诸如酵母和丝状真菌缺乏上述转运蛋白，因此优选将低等真核生物宿主细胞诸如酵母和丝状真菌遗传工程化以包括上述转运蛋白。
宿主细胞进一步包括巴斯德毕赤酵母，其通过缺失或破坏一个或两个磷酸甘露糖基转移酶基因PNO1和MNN4 (也称为MNN4B)的表达来遗传工程化以产生具有很少或无可检测的磷酸甘露糖残基的蛋白或糖蛋白（参见例如，美国专利号7,198,921和7,259,007；其公开内容均通过参考并入本文），其在进一步方面还可以包括缺失或破坏MNN4L1 (也称为MNN4A)基因。破坏包括破坏编码特定酶的可读框或破坏可读框的表达或使用干扰RNA、反义RNA等消除编码一种或多种β-甘露糖基转移酶和/或磷酸甘露糖基转移酶的RNA的翻译。宿主细胞可以进一步包括任一种前述的修饰以产生特定N-聚糖结构的宿主细胞。
为了降低或消除宿主细胞能够产生具有有β-连接的甘露糖残基的N-聚糖和O-聚糖（其对α-甘露糖苷酶是抗性的）的重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白的可能性，将重组糖工程化的宿主细胞通过缺失或破坏一个或多个β-甘露糖基转移酶基因(例如BMT1、BMT2 、 BMT3和BMT4)来遗传工程化以消除具有α-甘露糖苷酶抗性的N-聚糖的糖蛋白（参见美国专利号7,465,577、美国专利号7,713,719、和公开的国际申请号WO2011046855，其每一个通过参考并入本文）。BMT2和BMT1、BMT3和BMT4的一个或多个的缺失或破坏还降低或消除抗体针对宿主细胞蛋白的交叉反应性。
蛋白或糖蛋白的产量可以在一些情况下通过过表达编码哺乳动物或人蛋白伴侣蛋白的核酸分子或用编码一种或多种哺乳动物或人蛋白伴侣蛋白的核酸分子替代编码一种或多种内源蛋白伴侣蛋白的基因来改进。此外，宿主细胞中哺乳动物或人蛋白伴侣蛋白的表达还似乎控制该细胞中的O-糖基化。因此，进一步包括的是本文的宿主细胞，其中至少一种编码蛋白伴侣蛋白的内源基因的功能已降低或消除，并且编码所述蛋白伴侣蛋白的至少一种哺乳动物或人同源物的载体在该宿主细胞中表达。还包括的是其中表达内源宿主细胞蛋白伴侣和哺乳动物或人蛋白伴侣蛋白的宿主细胞。在进一步的方面，低等真核生物宿主细胞是酵母或丝状真菌宿主细胞。宿主细胞（其中将人蛋白伴侣蛋白引入以改进产量并降低或控制重组蛋白的O-糖基化）的蛋白伴侣的使用实例已公开于公开的国际申请号WO2009105357和WO2010019487（其公开内容通过参考并入本文）。
宿主细胞进一步包括低等真核生物细胞（例如酵母诸如巴斯德毕赤酵母），其通过缺失或破坏一种或多种蛋白O-甘露糖基转移酶(Dol-P-Man:蛋白(Ser/Thr) 甘露糖基转移酶基因) (PMTs) (参见美国专利号5,714,377；其公开内容通过参考并入本文)来遗传修饰以控制重组异源的、非内源蛋白或糖蛋白的O-糖基化，或者生长在存在Pmtp抑制剂和/或α1,2甘露糖苷酶的情况下，如公开于公开的国际申请号2007061631中，其公开内容通过参考并入本文。破坏包括破坏编码Pmtp的可读框或破坏可读框的表达或使用干扰RNA、反义RNA等消除编码一种或多种Pmtp的RNA的翻译。宿主细胞可以进一步包括任一种前述的修饰以产生特定N-聚糖结构的宿主细胞。
Pmtp抑制剂的实例包括但不限于亚苄基噻唑烷二酮类，诸如公开于美国专利号7,105,554和美国公开的申请号20110076721中的那些。可以使用的亚苄基噻唑烷二酮类的实例是5-[[3,4-双(苯基甲氧基)苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸；5-[[3-(1-苯基乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸；5-[[3-(1-苯基-2-羟基)乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸；和，美国公开的申请号20110076721中的实施例4化合物）。然而，尽管这些方法已成功控制O-糖基化，但这些PMT抑制剂的确降低细胞活力，其进而影响了重组蛋白产量。
在具体的实施方案中，宿主细胞不展示Alg3p蛋白活性，或者具有ALG3基因表达的破坏，如公开的美国申请号20050170452或US20100227363中描述的，其通过引用并入本文。Alg3p是-PP-萜醇基(dolichyl) α-1,3 甘露糖基转移酶，其转移甘露糖残基至以α-1,3 连接的脂质连接的的α-1,6臂的甘露糖残基(图19, GS 1.3)，以产生脂质连接的(图19, GS 1.4)，其为用于脂质连接的的合成的前体，随后将其通过寡糖基转移酶转移至糖蛋白的天冬酰胺(aspargine)残基，随后去除葡萄糖（Glc）残基。在缺乏Alg3p蛋白活性的宿主细胞中，脂质连接的寡糖可以通过寡糖基转移酶转移至糖蛋白的天冬酰胺残基。在进一步包括α1,2甘露糖苷酶的此类宿主细胞中，将连接至蛋白或糖蛋白的寡糖修整为三甘露糖（寡甘露糖）结构(图19, GS 2.1)。(GS 1.3)结构与图19中显示的(GS 2.0)是可区分的，并且其在表达-PP-萜醇基(dolichyl) α-1,3 甘露糖基转移酶(Alg3p)的宿主细胞中产生。
因此，本文公开的方法可以使用已遗传修饰以产生包含图19中显示的至少一种N-聚糖的蛋白或糖蛋白的任何宿主细胞。本文公开的方法可以使用任何宿主细胞，其已遗传修饰以产生这样的糖蛋白，其中主要N-聚糖选自复合N-聚糖、杂合N-聚糖、和高甘露糖N-聚糖，其中复合N-聚糖选自(寡甘露糖)、、和；杂合N-聚糖选自、和；并且高甘露糖N-聚糖选自,(GS 2.0)、、、和。在进一步的实施方案中，宿主细胞产生主要具有由 (GS 1.3)结构组成的N-聚糖结构的糖蛋白。
为了增加重组宿主细胞中产生的糖蛋白上的N-糖基化位点占据，在宿主细胞中表达糖蛋白之前或同时，编码异源单亚基寡糖基转移酶的核酸分子（其能够功能性抑制包含内源宿主细胞异-寡聚寡糖基转移酶(OTase)复合物的一个或多个必要亚基的致死突变）在重组宿主细胞中过表达。硕大利什曼原虫(Leishmania major)STT3A蛋白、硕大利什曼原虫STT3B蛋白和硕大利什曼原虫STT3D蛋白是已显示抑制酿酒酵母中的STT3基因座缺失的致死表型的单亚基寡糖基转移酶(Naseb等, Molec.Biol.Cell 19:3758-3768 (2008))。Naseb等（同前）进一步显示硕大利什曼原虫STT3D蛋白能够抑制WBP1、OST1、SWP1或OST2基因座缺失的致死表型。Hese等(Glycobiology 19:160-171 (2009))教导硕大利什曼原虫STT3A (STT3-1)、STT3B (STT3-2)和STT3D (STT3-4)蛋白能够功能性互补OST2、SWP1和WBP1基因座的缺失。如公开的国际申请号WO2011106389中所示，其以其整体通过引用并入本文，硕大利什曼原虫STT3D (LmSTT3D)蛋白是异源单亚基寡糖基转移酶，其能够抑制Δ stt3突变的致死表型和Δ wbp1、Δ ost1、Δ swp1和Δ ost2突变（其显示在本文的实施例中，能够增强异源糖蛋白例如由宿主细胞产生的抗体的N-糖基化位点占据）的至少一种致死表型。
因此，在本文的方法的进一步方面中，提供遗传工程化以能够产生具有哺乳动物样或人样复合物或杂合N-聚糖的蛋白糖蛋白的酵母或丝状真菌宿主细胞，其中所述宿主细胞进一步包括编码异源单亚基寡糖基转移酶(OTase)复合物的核酸分子。
通常，在上述方法和宿主细胞中，单亚基寡糖基转移酶能够功能性抑制OTase复合物的至少一种必需蛋白突变的致死表型。在进一步的方面，OTase复合物的必需蛋白由STT3基因座、WBP1基因座、OST1基因座、SWP1基因座或OST2基因座或其同源物编码。在进一步的方面，例如单亚基寡糖基转移酶是硕大利什曼原虫STT3D蛋白。
对于遗传工程化的酵母，可选择标志物可用于构建重组宿主细胞，其包括药物抗性标志物和允许酵母宿主细胞合成必需细胞营养物例如氨基酸的遗传功能。通常用于酵母的药物抗性标志物包括氯霉素、卡那霉素、甲氨蝶呤、G418 (遗传霉素)、Zeocin等。允许酵母宿主细胞合成必需细胞营养物的遗传功能与在相应基因组功能中具有营养缺陷突变的可用酵母菌株使用。通常的酵母可选择标志物提供用于合成亮氨酸(LEU2)、色氨酸(TRP1和TRP2)、脯氨酸(PRO1)、尿嘧啶(URA3、URA5 、 URA6)、组氨酸(HIS3)、赖氨酸(LYS2)、腺嘌呤(ADE1或ADE2)等的遗传功能。其他酵母可选择标志物包括来自酿酒酵母的ARR3基因，其赋予在亚砷酸盐存在的情况下生长的酵母细胞亚砷酸盐抗性(Bobrowicz等, Yeast, 13:819-828 (1997); Wysocki等, J. Biol.Chem.272:30061-30066 (1997))。多种合适的整合位点包括在美国专利号7,479,389中列举的那些（其公开内容通过引用并入本文），并包括酿酒酵母和其他酵母或真菌已知基因座的同源物。整合载体入酵母中的方法是众所周知的（参见例如美国专利号7,479,389、美国专利号7,514,253、美国公开的申请号2009012400和WO2009/085135；其公开内容均通过引用并入本文）。***位点的实例包括但不限于毕赤酵母ADE基因；毕赤酵母TRP (包括TRP1至TRP2)基因；毕赤酵母MCA基因；毕赤酵母CYM基因；毕赤酵母PEP基因；毕赤酵母PRB基因；和毕赤酵母LEU基因。毕赤酵母ADE1和ARG4基因已描述于Lin Cereghino等, Gene 263:159-169 (2001)和美国专利号4,818,700（其公开内容通过引用并入本文），HIS3和TRP1基因已描述于Cosano等, Yeast 14:861-867 (1998)，HIS4已描述于GenBank检索号X56180。
在仍进一步的方面中，宿主细胞缺乏一种或多种选自甘露糖基转移酶和磷酸甘露糖基转移酶的酶的活性。在仍进一步的方面中，宿主细胞不表达选自1,6甘露糖基转移酶、1,3甘露糖基转移酶、和1,2甘露糖基转移酶的酶。
在任一种上述宿主细胞的具体方面中，宿主细胞是巴斯德毕赤酵母或酿酒酵母。在进一步的方面中，宿主细胞是巴斯德毕赤酵母或酿酒酵母的och1突变体。
在进一步的方面中，提供质粒载体，其包含具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3的至少25、50、75或100个邻接的核苷酸的核酸分子。在进一步的实施方案中，质粒载体进一步包括编码选择标志物的核酸分子。在具体的实施方案中，选择标志物是编码潮霉素抗性、Ura5p、Ura3p、zeocin抗性、亚砷酸盐抗性或诺尔丝菌素抗性的核酸分子。在进一步的实施方案中，质粒载体包含编码选择标志物的第一核酸分子，其一侧侧接包含VRG4基因的5'区的第二核酸分子并在另一侧侧接包含VRG4基因的3'区的第三核酸分子。在进一步的实施方案中，第二核酸分子包含SEQ ID NO:1的至少25、50、75或100个邻接的核苷酸，并且第三核酸分子包含SEQ ID NO:2的至少25、50、75或100个邻接的核苷酸。在具体的方面中，包含VRG4基因的5'区的第二核酸分子和包含VRG4基因的3'区的第三核酸分子是非邻接的，并且编码选择标志物的第一核酸分子位于第二和第三核酸分子之间。
进一步提供产生其中VRG4基因的表达被破坏的低等真核生物宿主细胞的方法，其包括（a）提供质粒载体，所述质粒载体包含编码选择标志物的第一核酸分子，所述第一核酸分子在一侧侧接包含VRG4基因的5'区的第二核酸分子，并且在另一侧侧接包含VRG4基因的3'区的第三核酸分子；（b）用所述质粒载体转化宿主细胞，其中通过双交换同源重组将选择标志物整合入VRG4基因中，以产生这样的宿主细胞，其中所述编码选择标志物的第一核酸分子在VRG4基因（其分别与第二和第三核酸分子同源或具有同一性）的5'区和3'区之间被整合入VRG4基因中，和（c）选择包含整合入VRG4基因中的编码选择标志物的核酸分子的宿主细胞，以产生其中VRG4基因的表达被破坏的宿主细胞。在具体的方面中，包含VRG4基因的5'区的第二核酸分子和包含VRG4基因的3'区的第三核酸分子是不邻接的，并且编码选择标志物的第一核酸当整合入VRG4基因中时，替代宿主细胞中的VRG4基因的5'和3'区之间的区域，以产生其中VRG4基因的表达被破坏的宿主细胞。在进一步的方面，编码选择标志物的第一核酸分子替代编码Vrg4p的VRG4基因中的可读框（ORF）。进一步提供来由上述方法产生的宿主细胞。
上述宿主细胞可以是这样的宿主细胞，其具有外链(OCH1)基因或其同源物、获得性热耐受性1(ATT1)基因或其同源物、或两者的表达的破坏。表达的破坏包括但不限于编码Och1p的OCH1基因或ORF的缺失或破坏和/或编码Att1p的ATT1基因或ORF的缺失或破坏。包含上述任一种破坏的宿主细胞已在实施例中显示支持VRG4基因表达的破坏（参见例如菌株YGLY2-3 (och1 Δ和ATT1)或YGLY27836 (att1 Δ和OCH1)）。在具体的方面，宿主细胞可以具有YGLY2-3或YGLY27836的表型或与之类似的表型，或者是来自YGLY2-3或YGLY27836的宿主细胞后代或与YGLY2-3或YGLY27836相似表型的菌株。
破坏VRG4基因表达后有活力的宿主细胞还可以这样提供：通过随机诱变宿主细胞来产生破坏VRG4基因后有活力的宿主细胞。例如，可以用上述质粒载体转化宿主细胞，并通过UV诱变来诱变转化的宿主细胞，如由Winston (Curr.Protoc.Mol.Biol.82:13.3B.1-13.3B.5 (2008))描述。酵母细胞的转化是本领域中熟知的，并可以例如通过原生质体形成随后以本身已知的方式转化来实现。用于培养细胞的培养基可以是适合于生长酵母生物的任何常规培养基。在一个实施方案中，转化的酵母细胞在24℃下过夜生长在YSD液体培养基中。OD600达到约5后，将一等分试样的培养物转移入空培养皿中并打开盖，用约12 mJ/cm2的UV照射处理。UV处理后，将培养皿立即用铝箔覆盖（以防止光诱导的DNA修复）。允许诱变的细胞在黑暗中在24℃下恢复3小时。随后将转化的、诱变的细胞浓缩并在液体培养基（例如，BMGY培养基）中培养一段时间，并随后在选择性条件下铺板于琼脂板（例如，YSD琼脂板）上，以鉴定并选择有活力的克隆。分析克隆以确定VRG4基因表达的破坏。
在本发明的上述实施方案或方面任一项的具体实施方案中，异源的、非内源蛋白或糖蛋白可以是治疗性蛋白或糖蛋白。治疗性蛋白和糖蛋白包括在用于向哺乳动物或人施用以治疗疾病或病况的组合物中。治疗性蛋白或糖蛋白的实例，人或哺乳动物，包括但不限于***（EPO）；细胞因子诸如干扰素α、干扰素β、干扰素γ、和干扰素ω；和粒细胞集落刺激因子（GCSF）；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）；凝血因子诸如因子VIII、因子IX、和人蛋白C；抗凝血酶III；凝血酶；可溶性IgE受体α链；免疫球蛋白诸如IgG、IgG片段、IgG融合体和IgM；免疫黏附和其他Fc融合蛋白诸如可溶性TNF受体-Fc融合蛋白；RAGE-Fc融合蛋白；白细胞介素；尿激酶；糜蛋白酶；尿素胰蛋白酶抑制剂；IGF结合蛋白；表皮生长因子；生长激素释放因子；锚定蛋白V融合蛋白；血管他丁；血管内皮生长因子-2；骨髓祖细胞抑制因子-1；骨保护素；α-1-抗胰蛋白酶；α-胎蛋白；DNase II；人纤溶酶原的三环3（kringle 3）；葡萄糖脑苷脂酶；TNF结合蛋白1；促卵泡激素；细胞毒素T淋巴细胞相关抗原4-Ig；跨膜激活剂和钙调节剂和亲环蛋白配体；胰高血糖素样蛋白1；胰岛素及其类似物、GLP1受体激动剂诸如GLP1及其类似物、胃泌酸调节素及其类似物、胰高血糖素样肽的抑制剂-4(exendin-4)及其类似物、等等；胰高血糖素受体激动剂或拮抗剂；成纤维细胞生长因子诸如FGF-21及其类似物、FGF-19及其类似物，等等；瘦蛋白及其类似物；胰淀素及其类似物；IL-2受体激动剂、或类似物或其突变蛋白。
在任一种上述宿主细胞的进一步的实施方案中，治疗性糖蛋白是抗体，其实例包括但不限于抗Her2抗体、抗RSV（呼吸道合胞病毒）抗体、抗TNFα抗体、抗VEGF抗体、抗CD3受体抗体、抗CD41 7E3受体、抗CD25抗体、抗CD52抗体、抗CD33抗体、抗IgE抗体、抗CD11a抗体、抗EGF受体抗体、或抗CD20抗体。
以下实施例旨在促进本发明的进一步理解。
实施例1
本实施例描述构建来证明本发明的菌株。使用早期描述的方法从野生型巴斯德毕赤酵母菌株NRRL-Y 11430构建菌株(参见例如，美国专利号7,449,308；美国专利号7,479,389；美国公开的申请号20090124000；公开的PCT申请号WO2009085135；Nett和Gerngross, Yeast 20:1279 (2003)；Choi等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:5022 (2003)；Hamilton等, Science 301:1244 (2003))。所有质粒使用标准分子生物学程序在pUC19质粒中制备。对于对在巴斯德毕赤酵母中表达优化的核苷酸序列，通过GENEOPTIMIZER软件(GeneArt, Regensburg, Germany)分析天然核苷酸序列，并且结果用于产生其中密码子对巴斯德毕赤酵母表达优化的核苷酸序列。通过电穿孔转化酵母菌株（使用由电穿孔仪制造商BioRad推荐的标准技术）。
用质粒pGLY6（靶向URA5基因座的整合载体）转化NRR-Y 11430。质粒含有包含酿酒酵母转化酶基因或转录单元(ScSUC2; SEQ ID NO:9)的核酸分子，其在一侧侧接包含来自巴斯德毕赤酵母URA5基因的5'区的核苷酸序列(SEQ ID NO:10)的核酸分子，并且在另一侧侧接包含来自巴斯德毕赤酵母URA5基因的3'区的核苷酸序列(SEQ ID NO:11)的核酸分子。将质粒pGLY6线性化并将线性化的质粒转化入野生型菌株NRRL-Y 11430中，以产生大量其中通过双交换同源重组将ScSUC2基因***到URA5基因座内的菌株。从产生的菌株中选择菌株YGLY1-3并对尿嘧啶是营养缺陷型的。
用质粒pGLY40转化菌株YGLY1-3，所述质粒pGLY40是靶向OCH1基因座并且含有包含巴斯德毕赤酵母URA5基因或转录单元(SEQ ID NO:12)的核酸分子的整合载体，所述核酸分子侧接包含lacZ重复(SEQ ID NO:13)的核酸分子，其依次在一侧侧接包含来自OCH1基因的5'区的核苷酸序列(SEQ ID NO:15)的核酸分子，并且在另一侧侧接包含来自OCH1基因的3'区的核苷酸序列(SEQ ID NO:15)的核酸分子。用SfiI将质粒pGLY40线性化，并将线性化的质粒转化入菌株YGLY1-3中，以产生大量其中由lacZ重复侧接的URA5基因已通过双交换同源重组***到OCH1基因座中的菌株。从产生的菌株中选择菌株YGLY2-3并对URA5是原养型的。将菌株在5-氟乳清酸(5-FOA)存在的情况下反选择，以产生大量其中URA5基因已丢失并且仅lacZ重复存在于OCH1基因座中的菌株。这使得菌株对尿嘧啶是营养缺陷型的。选择菌株YGLY4-3。菌株YGLY2-3和YGLY4-3产生具有GS1.0糖形(和 N-聚糖)的糖蛋白。
用质粒pGLY43a转化菌株YGLY4-3，所述质粒pGLY43a是靶向BMT2基因座并含有包含乳酸克鲁维酵母UDP-N-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)转运蛋白基因或转录单元(KlMNN2-2, SEQ ID NO:16)的核酸分子（其邻近包含侧接有包含lacZ重复的核酸分子的巴斯德毕赤酵母URA5基因或转录单元的核酸分子）的整合载体。邻近基因在一侧由包含来自BMT2基因的5'区的核苷酸序列(SEQ ID NO:17)的核酸分子侧接，并在另一侧由包含来自BMT2基因的3'区的核苷酸序列(SEQ ID NO:18)的核酸分子侧接。用SfiI将质粒pGLY43a线性化，并将线性化的质粒转化入菌株YGLY4-3中，以产生大量其中由lacZ重复侧接的KlMNN2-2基因和URA5基因已通过双交换同源重组***到BMT2基因座中的菌株。BMT2基因已公开于Mille等, J. Biol.Chem.283:9724-9736 (2008)和美国专利号7,465,557中。从产生的的菌株中选择菌株YGLY6-3并对尿嘧啶是原养型的。将菌株YGLY6-3在5-FOA存在的情况下反选择，以产生其中URA5基因已丢失并且仅lacZ重复保留的菌株。这使得菌株对尿嘧啶是营养缺陷型的。选择菌株YGLY8-3。菌株YGLY6-3和YGLY8-3产生具有GS1.0糖形(和 N-聚糖)的糖蛋白。
用质粒pGLY48转化菌株YGLY8-3，所述质粒pGLY48是靶向MNN4L1基因座并含有包含编码UDP-GlcNAc转运蛋白(SEQ ID NO:19)可读框(ORF)的小鼠同源物的核酸分子的表达盒的整合载体，所述可读框可操作地在5'端连接包含巴斯德毕赤酵母GAPDH启动子(SEQ ID NO:20)的核酸分子并在3'端连接包含酿酒酵母CYC终止序列(SEQ ID NO:21)的核酸分子，其邻近包含由lacZ重复侧接的巴斯德毕赤酵母URA5基因的核酸分子，并且其中表达盒一同在一侧由包含来自巴斯德毕赤酵母MNN4L1基因的5'区的核苷酸序列(SEQ ID NO:22)的核酸分子侧接，并在另一侧由包含来MNN4L1基因的3'区的核苷酸序列(SEQ ID NO:23)的核酸分子侧接。用SfiI将质粒pGLY48线性化，并将线性化的质粒转化入菌株YGLY8-3中，以产生大量其中编码小鼠UDP-GlcNAc转运蛋白和URA5基因的表达盒已通过双交换同源重组***到MNN4L1基因座中的菌株。MNN4L1基因（也称为MNN4B）已公开于美国专利号7,259,007中。从产生的菌株中选择菌株YGLY10-3，并随后在5-FOA存在的情况下反选择，以产生大量其中URA5基因已丢失并且仅lacZ重复保留的菌株。选择菌株YGLY12-3。菌株YGLY10-3和YGLY12-3产生具有GS1.0糖形(和 N-聚糖)的糖蛋白。
用质粒pGLY45转化菌株YGLY12-3，所述质粒pGLY45是靶向PNO1/MNN4基因座并且含有包含巴斯德毕赤酵母URA5基因或转录单元的核酸分子的整合载体，所述核酸分子侧接包含lacZ重复的核酸分子，其依次在一侧侧接包含来自PNO1基因的5'区的核苷酸序列(SEQ ID NO:24)的核酸分子，并且在另一侧侧接包含来自MNN4基因的3'区的核苷酸序列(SEQ ID NO:25)的核酸分子。用SfiI将质粒pGLY45线性化，并将线性化的质粒转化入菌株YGLY12-3中，以产生大量其中由lacZ重复侧接的URA5基因已通过双交换同源重组***到PNO1/MNN4基因座中的菌株。PNO1基因已公开于美国专利号7,198,921中，并且MNN4基因（也称为MNN4B）已公开于美国专利号7,259,007中。从产生的菌株中选择菌株YGLY14-3，并随后在5-FOA存在的情况下反选择，以产生大量其中URA5基因已丢失并且仅lacZ重复保留的菌株。选择菌株YGLY16-3。菌株YGLY14-3和YGLY16-3产生具有GS1.0糖形(和 N-聚糖)的糖蛋白。
用质粒pGLY1430转化菌株YGLY16-3，所述质粒是靶向ADE1基因座而不破坏基因座表达并且含有串联的四个表达盒的KINKO整合载体，所述表达盒编码（1）人GlcNAc转移酶I催化结构域（NA），其在N-末端融合至巴斯德毕赤酵母SEC12前导肽(10)以将嵌合酶靶向ER或高尔基体，（2）UDP-GlcNAc转运蛋白(MmTr)的小鼠同源物，（3）小鼠甘露糖苷酶IA催化结构域（FB），其在N-末端融合至酿酒酵母SEC12前导肽(8)以将嵌合酶靶向ER或高尔基体，和（4）巴斯德毕赤酵母URA5基因或转录单元。KINKO（具有很少或无敲除的敲入(Knock-In with little or No Knock-Out)）整合载体能够将异源DNA***靶基因座内而不破坏靶基因座上基因的表达，并且已描述于美国公开的申请号20090124000中。编码NA10的表达盒包含编码人GlcNAc转移酶I催化结构域的核酸分子，其对在巴斯德毕赤酵母中表达进行密码子优化(SEQ ID NO:26)，并在5'端融合至编码SEC12前导序列10的核酸分子(SEQ ID NO:27)，其在5'端可操作地连接至包含巴斯德毕赤酵母PMA1启动子的核酸分子，并在3'端可操作地连接至包含巴斯德毕赤酵母PMA1转录终止序列的核酸分子。编码MmTr的表达盒包含编码UDP-GlcNAc转运蛋白ORF的小鼠同源物的核酸分子，其在5'端可操作地连接至包含巴斯德毕赤酵母SEC4启动子的核酸分子(SEQ ID NO:28)，并在3'端可操作地连接至包含巴斯德毕赤酵母OCH1终止序列的核酸分子(SEQ ID NO:29)。编码FB8的表达盒包含编码小鼠甘露糖苷酶IA催化结构域的核酸分子(SEQ ID NO:30)，其在5'端融合至编码SEC12-m前导序列8的核酸分子(SEQ ID NO:31)，其在5'端可操作地连接至包含巴斯德毕赤酵母GADPH启动子的核酸分子，并在3'端可操作地连接至包含酿酒酵母CYC转录终止序列的核酸分子。URA5表达盒包含含有巴斯德毕赤酵母URA5基因或转录单元（其侧接包含lacZ重复的核酸分子）的核酸分子。四个串联盒在一侧侧接包含来自ADE1基因的5'区和完整ORF的核苷酸序列(SEQ ID NO:32)随后为巴斯德毕赤酵母ALG3终止序列(SEQ ID NO:33)的核酸分子，并在另一侧侧接包含来自ADE1基因的3'区的核苷酸序列(SEQ ID NO:34)的核酸分子。用SfiI将质粒pGLY1430线性化，并将线性化的质粒转化入菌株YGLY16-3中，以产生大量其中四个串联表达盒已通过双交换同源重组***到ADE1基因座内紧接ADE1 ORF后的菌株。从产生的菌株中选择菌株YGLY2798并且对精氨酸是营养缺陷型并且现在对尿苷、组氨酸和腺嘌呤是原养型的。随后将菌株在5-FOA存在的情况下反选择以产生大量现在对尿苷是营养缺陷型的菌株。选择菌株YGLY2798和YGLY3794，并且能够产生主要具有GS3.0糖形( N-聚糖)的糖蛋白。
用质粒pGLY582转化菌株YGLY3794，所述质粒是靶向HIS1基因座并含有串联的四个表达盒的整合载体，所述表达盒编码（1）酿酒酵母UDP葡萄糖差向异构酶(ScGAL10)，（2）人半乳糖基转移酶I (hGalT)催化结构域，其在N-末端融合至酿酒酵母KRE2-s前导肽(33)以将嵌合酶靶向ER或高尔基体，（3）巴斯德毕赤酵母URA5基因或转录单元，其侧接lacZ重复，和（4）黑腹果蝇UDP半乳糖转运蛋白(DmUGT)。编码ScGAL10的表达盒包含编码ScGAL10 ORF的核酸分子(SEQ ID NO:35)，其在5'端可操作地连接至包含巴斯德毕赤酵母PMA1启动子的核酸分子(SEQ ID NO:36)，并在3'端可操作地连接至包含巴斯德毕赤酵母PMA1转录终止序列的核酸分子(SEQ ID NO:37)。编码嵌合半乳糖基转移酶I的表达盒包含编码hGalT催化结构域的核酸分子，其对在巴斯德毕赤酵母中表达进行密码子优化(SEQ ID NO:38)，并在5'端融合至编码KRE2-s前导序列33的核酸分子(SEQ ID NO:39)，其在5'端可操作地连接至包含巴斯德毕赤酵母GAPDH启动子的核酸分子，并在3'端可操作地连接至包含酿酒酵母CYC转录终止序列的核酸分子。URA5表达盒包含含有巴斯德毕赤酵母URA5基因或转录单元（其侧接包含lacZ重复的核酸分子）的核酸分子。编码DmUGT的表达盒包含编码DmUGT ORF的核酸分子(SEQ ID NO:40)，其在5'端可操作地连接至包含巴斯德毕赤酵母OCH1启动子的核酸分子(SEQ ID NO:41)，并在3'端可操作地连接至包含巴斯德毕赤酵母ALG12转录终止序列的核酸分子(SEQ ID NO:42)。四个串联盒在一侧侧接包含来自HIS1基因的5'区的核苷酸序列(SEQ ID NO:43)的核酸分子，并在另一侧侧接包含来自HIS1基因的3'区的核苷酸序列(SEQ ID NO:44)的核酸分子。将质粒pGLY582线性化，并将线性化的质粒转化入菌株YGLY3794中，以产生大量其中四个串联表达盒已通过同源重组***到HIS1基因座内的菌株。选择菌株YGLY3853并且对于组氨酸是营养缺陷型的，并且对尿苷是原养型的。菌株YGLY3853能够产生主要具有GS3.5糖形( N-聚糖)的糖蛋白。
用质粒pGLY167b转化菌株YGLY3853，所述质粒是靶向ARG1基因座并含有串联的三个表达盒的整合载体，所述表达盒编码（1）黑腹果蝇甘露糖苷酶II催化结构域（KD），其在N-末端融合至酿酒酵母MNN2前导肽(53)以将嵌合酶靶向ER或高尔基体，（2）巴斯德毕赤酵母HIS1基因或转录单元，和（3）大鼠N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)转移酶II催化结构域（TC），其在N-末端融合至酿酒酵母MNN2前导肽(54)以将嵌合酶靶向ER或高尔基体。编码KD53的表达盒包含编码黑腹果蝇甘露糖苷酶II催化结构域的核酸分子，其对在巴斯德毕赤酵母中表达进行密码子优化(SEQ ID NO:45)，并在5'端融合至编码MNN2前导序列53的核酸分子(SEQ ID NO:46)，其在5'端可操作地连接至包含巴斯德毕赤酵母GAPDH启动子的核酸分子，并在3'端可操作地连接至包含酿酒酵母CYC转录终止序列的核酸分子。HIS1表达盒包含含有巴斯德毕赤酵母HIS1基因或转录单元的核酸分子(SEQ ID NO:47)。编码TC54的表达盒包含编码大鼠GlcNAc转移酶II催化结构域的核酸分子，其对在巴斯德毕赤酵母中表达进行密码子优化(SEQ ID NO:48)，并在5'端融合至编码MNN2前导序列54的核酸分子(SEQ ID NO:49)，其在5'端可操作地连接至包含巴斯德毕赤酵母PMA1启动子的核酸分子，并在3'端可操作地连接至包含巴斯德毕赤酵母PMA1转录终止序列的核酸分子。三个串联盒在一侧侧接包含来自ARG1基因的5'区的核苷酸序列(SEQ ID NO:50)的核酸分子，并在另一侧侧接包含来自ARG1基因的3'区的核苷酸序列(SEQ ID NO:51)的核酸分子。用SfiI将质粒pGLY167b线性化，并将线性化的质粒转化入菌株YGLY3853中，以产生大量（其中三个串联表达盒已通过双交换同源重组***到ARG1基因座内的菌株。从产生的菌株中选择菌株YGLY4754并且对精氨酸是营养缺陷型并且对尿苷和组氨酸是原养型。菌株YGLY4754产生主要具有GS5.0糖形(和复合N-聚糖)的糖蛋白。
实施例2
本实施例提供几种其中已破坏VRG4基因的巴斯德毕赤酵母菌株，并且显示这些突变体菌株具有实质上降低的高尔基体相关的甘露糖基化，其使得菌株能够产生具有降低量的高甘露糖N-聚糖的糖蛋白。
用于破坏巴斯德毕赤酵母中的VRG4基因的质粒载体pGLY8655（图1）包含含有VRG4基因的5'区(SEQ ID NO:1)的核酸分子和含有VRG4基因的3'区(SEQ ID NO:2)的核酸分子。两条核酸片段侧接编码潮霉素抗性(HygR)的表达盒（盒的核苷酸序列显示在SEQ ID NO:52中）。表达盒中编码HYGR的ORF可操作地连接至棉病囊霉(Ashbya gossypii)TEF1启动子和棉病囊霉TEF1终止序列，其也分别显示在SEQ ID NOs:53和54中。HygR表达盒已描述在Goldstein等, Yeast 15:1541 (1999))。VRG4基因的核苷酸序列显示在SEQ ID NO:3中。编码Vrg4p的可读框（ORF）是核苷酸1001-1987。用10 μg的用AccI线性化的pGLY8655各自转化原养型巴斯德毕赤酵母宿主菌株NRRL-Y 11430、YGLY2-3、YGLY6-3、YGLY10-3、YGLY14-3、YGLY3853和YGLY4754，使用如Choi等PNAS USA.100:5022-5027 (2003)和Hamilton等Science 301:1244-1246 (2003)中描述的转化方法。将转化子铺板在100 μg/mL潮霉素YSD板上以选择转化的载体的掺入。VRG4基因的成功敲除通过使用下文列出的5'、3'和敲除引物组的PCR来确认。PCR引物的核苷酸序列是
。将SH512和SH97引物对用于PCR扩增来自5'交换区的1.1 kbp核酸片段。将SH515和SH379 PCR引物对用于PCR扩增来自3'交换区的1.3 kbp核酸片段。将SH520和SH521 PCR引物对用于PCR扩增来自编码Vrg4p的ORF内的300 bp核酸片段。该300 bp片段可以从编码Vrg4p的菌株中扩增，但在其中VRG4基因已缺失的（敲除(KO)）菌株中不存在。
在摇瓶生长条件下，酵母菌株在50 mL BSGY中在24℃下生长约65小时。随后，将培养物在5 mL BSMY (含有1% MeOH代替甘油的BSGY)中诱导并生长至少另外24小时。将培养物以2400 rpm离心5分钟以沉淀细胞。
如图2-1和2-2中所示，当用pGLY8655转化以缺失VRG4基因时，从菌株YGLY2-3、YGLY6-3、YGLY10-3、YGLY14-3、YGLY3853和YGLY4754中获得vrg4敲除(KO)或缺失(vrg4 Δ)突变体。获自YGLY2-3的vrg4 ΔKO突变体是YGLY25241，获自YGLY6-3的vrg4 Δ缺失突变体是YGLY25242，获自YGLY10-3的vrg4 ΔKO突变体是YGLY25243，获自YGLY3853的vrg4 ΔKO突变体是YGLY25245，和获自YGLY4754的vrg4 Δ缺失突变体是YGLY25736。
对于N-聚糖分析，将细胞沉淀重悬并在125 μL去离子H2O中洗涤两次，每次洗涤后以2800 RPM离心5分钟。将125 μL的RCM缓冲液(8M尿素、360mM Tris和3.2mM EDTA, pH 8.6)和50 μL的0.5 mm玻璃珠加入到经洗涤的细胞沉淀中，随后充分涡旋2分钟。将样品煮沸10分钟并随后允许在以2800 RPM离心5分钟前冷却。将含有总细胞糖蛋白的上清液组分转移至新的小瓶中，如之前再次离心，并将上清液组分再次转移至干净的小瓶中。随后使用N-糖苷酶F将N-聚糖从糖蛋白中释放，以释放N-聚糖，其通过正MALDI-TOF分析，如Hamilton等Science 301:1244-1246 (2003)中描述。图3-1和3-2显示来自vrg4敲除(vrg4 Δ)突变体菌株的N-聚糖组合物不含有可检测量的具有多于9个甘露糖（M9）残基例如M10、M11和M12的高甘露糖N-聚糖。由于这些菌株缺乏哺乳动物α1,2-甘露糖苷酶，因此主要的N-聚糖是具有八个甘露糖残基（M8）或九个甘露糖残基（M9）的那些。图4-1或4-2显示来自遗传工程化以产生半乳糖末端的杂合N-聚糖(YGLY3853)或半乳糖末端的复合N-聚糖(YGLY4754)的vrg4 Δ敲除(KO)突变体菌株的N-聚糖也不含有可检测的具有多于9个甘露糖（M9）残基例如M10、M11和M12的高甘露糖N-聚糖。这些结果显示转化YGLY2-3或遗传自YGLY2-3具有设计来破坏VRG4基因表达的质粒载体的菌株产生不产生可检测量的高甘露糖N-聚糖的菌株，并且细胞是有活力的。此外，来自NRRL-Y11430的平行谱系显示对VRG4敲除的相似表型，因此确定敲除该基因的能力对于YGLY2-3谱系不是特异性的。
在载体pGLY8655中的VRG4的3'侧翼区(SEQ ID NO:2)的测序过程中，确定在从基因组DNA中扩增该片段过程中已产生了点突变。突变是在SEQ ID NO:3中显示的基因组序列中1892位的胸苷残基变为胞苷的单核苷酸改变。这对应于在SEQ ID NO:2中显示的载体pGLY8655中的扩增的3'侧翼区中84位的胞苷残基。因此，当pGLY8655用于敲除VRG4时，它向基因组中引入该突变，如VRG4敲除菌株的深度测序所证实的。该突变在基因组中的位置不表明这会对菌株表型有任何作用。然而，为了证实该突变对敲除VRG4的能力或者敲除菌株的所得表型无影响，将在pGLY8655中84位的该胞苷残基突变为天然胸苷，并且将新载体命名为pGLY11989。使用该后一载体证实随后的VRG4敲除，并且所得的VRG4敲除菌株具有与已使用pGLY8655产生的菌株具有相似表型。
实施例3
在本实施例中，构建表达主要具有特定N-聚糖结构的TNFRII-Fc融合蛋白的重组菌株。将获自这些菌株培养物的糖蛋白组合物的N-聚糖组合物与菌株中VRG4基因的表达已破坏后来自这些菌株的N-聚糖组合物相比较。
质粒pGLY8594（图5）是转入(roll-in)整合载体，其靶向THR1基因座并且含有两个表达盒，所述表达盒编码在Fc的CH2区内修饰以掺入与对应于IgG1的F263A和V284A的那些等同的突变的TNFRII-Fc融合蛋白。每一表达盒包含编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包含融合至由具有SEQ ID NO:5的核苷酸序列的核酸分子（对在巴斯德毕赤酵母中表达密码子优化）编码的TNFRII-Fc融合蛋白的N-末端(SEQ ID NO:4)的人血清白蛋白信号肽。将表达盒在5'端可操作地连接至包含巴斯德毕赤酵母AOX1启动子的核酸分子(SEQ ID NO:61)，并在3'端可操作地连接至包含酿酒酵母CYC转录终止序列的核酸分子(SEQ ID NO:21)。质粒还包括ZeocinR表达盒，其包含编码Sh ble ORF的核酸分子(SEQ ID NO:62)（其在5'端可操作地连接至酿酒酵母TEF1启动子(SEQ ID NO:63)并且在3'端可操作地连接至酿酒酵母CYC终止序列(SEQ ID NO:21)）。质粒进一步包括靶向THR1基因座的核酸分子(SEQ ID NO:64)。通过用XbaI消化10 μg载体将质粒pGLY8594转化入期望的原养型的宿主菌株中。将经转化的菌株铺板在含有0.125x、1x或3x Zeocin的YSD平板上并在24℃下孵育。将表达TNFR-Fc的各个克隆分离并分析。菌株YGLY27018是用pGLY8594转化的菌株YGLY2-3，菌株YGLY27020是用pGLY8594转化的菌株YGLY6-3，并且菌株YGLY27026是用pGLY8594转化的菌株YGLY4754。这些菌株均是VRG4。菌株YGLY27028是用pGLY8594转化的菌株YGLY25241，菌株YGLY27031是用pGLY8594转化的菌株YGLY25242，并且菌株YGLY27044是用pGLY8594转化的菌株YGLY25736。这些菌株均是vrg4敲除。
96孔板生长条件如下。用600 μl含有4％甘油的BSGY培养基填充标准96深孔板（2.2 mL容量）。每一孔接种有从选择性培养基平板上挑取的单一菌落。这些“接种平板”用可呼吸的膜密封并在设置为80％湿度、24℃、840 RPM并具有3 mm行程(3 mm throw)的Infors Multitron振荡器组中孵育48小时。初始生长期后，将100 μL培养物与100 μL 50％甘油混合并在-80℃下冷冻用于以后使用。通过TECAN Evo液体操作器将剩余的500 μL转移至含有含4％甘油的3 mL BSGY的24孔板的单个孔。从接种平板，产生四块24孔板。将这些用可呼吸的膜密封并在80％湿度、24℃、650 RPM并具有3 mm行程下孵育48小时。第二生长期后，将板在Sorvall Legend XT离心机内以3000 RPM离心5分钟并去除培养基。用含2％甲醇的2 mL BSMY诱导培养基填充孔。将这些用可呼吸的膜密封并在80％湿度、24℃、650 RPM并具有3 mm行程下孵育48小时。将板随后以3000 RPM离心8分钟，并收获培养基到干净的96孔板内，用于随后的重组蛋白纯化。如果细胞聚糖将进行分析，则首先将培养物通过TECAN液体操作器移至96空板并随后如前所述离心。随后将培养基丢弃并如下所述分析细胞沉淀。
在摇瓶生长条件下，酵母菌株在50 mL BSGY中在24℃下生长约65小时。随后，将培养物在5 mL BSMY (含有1% MeOH代替甘油的BSGY)中诱导并生长至少另外24小时。将培养物以2400 rpm离心5分钟以沉淀细胞。对于重组蛋白分析，移除上清液并如下所述纯化蛋白。
在DASGIP发酵：生长条件下，表达TNFR-Fc的菌株生长在生物反应器内使用如下所述的接种物种子瓶进行。从琼脂板上的酵母斑（从单一菌落中分离）接种接种物种子瓶到0.5-L带挡板的烧瓶中的0.1 L的4％ BSGY中。种子瓶在180 rpm和24℃ (Innova 44, New Brunswick Scientific)下生长48小时。培养在1 L (fedbatch-pro, DASGIP BioTools)生物反应器中完成。用0.54 L of 0.22 μm过滤的4% BSGY培养基(具有4滴/L Sigma 204消泡剂)填充容器并在121℃下高压灭菌45分钟。灭菌并冷却后，将通气、搅拌和温度分别设定为0.7 vvm、400 rpm和24℃。使用30％氢氧化铵调节pH并控制在6.5。用来自种子瓶的60 mL无菌进行制备生物反应器的接种。搅拌逐渐(ramped to)至维持20％溶解氧（DO）饱和。在初始甘油装料消耗后（由溶解氧中的尖锐增加所指示），将含有5 mg/L生物素和10.8 mg/L PMTi-4（在美国公开的申请号20110076721的实施例4中描述的并具有结构
的PMT抑制剂）的50% w/w甘油溶液起动(triggered)来以3.68 mL/hr补料8小时。在甘油批次补料时期过程中，手动注射0.375 mL的PTM2盐。甘油批次补料的完成后为0.5小时的饥饿时期和诱导期的开始。含2.5 mg/L生物素和6.25 mL/L PTM2盐的50％ v/v甲醇溶液的持续补料以1.5 mL/hr的统一速率开始。在诱导开始时和在每一24小时的诱导时间后，加入0.5 mL的含有3.6 mg/mL胃蛋白酶抑制剂A和2.2 mg/mL胰凝乳蛋白酶抑制剂(在甲醇中)的蛋白酶抑制剂溶液的注射。此外，每24小时的诱导加入0.25 mL的0.6 mg/ml PMTi4 (在甲醇中)的注射。在诱导的36-66小时内收获各个发酵。培养基通过以8500 rpm离心(Sorvall Evolution RC, Thermo Scientific)40分钟来澄清，并且将所获的上清液进行纯化。
来自摇瓶和96孔板材料的重组TNFR-Fc纯化如下。使用蛋白A层析从澄清的上清液中纯化分泌的TNFRII-Fc片段融合蛋白(Li等Nat. Biotechnol.24(2):210-5 (2006))。
来自DASGIP材料的重组TNFR-Fc纯化如下。通过亲和层析使用来自GE Healthcare的MABSELECT (PolyA-琼脂糖介质；目录号17-5199-03)从巴斯德毕赤酵母的培养基（上清培养基）中俘获TNFRII-Fc片段融合蛋白。将无细胞上清培养基装载到用3个柱体积的20 mM Tris-HCl pH7.0预平衡的MABSELECT柱上。将柱用2个柱体积的20mM Tris-HCl pH 7.0和5个柱体积的20 mM Tris-HCl , 1 M NaCl pH 7.0洗涤以去除宿主细胞蛋白污染物。用7个柱体积的50 mM柠檬酸钠pH 3.0洗脱TNFRII-Fc片段融合蛋白。将洗脱的融合蛋白立即用1 M Tris-HCl pH 8.0中和。
使用N-糖苷酶F从重组蛋白中释放N-聚糖，并通过MALDI-TOF分析，如Hamilton等Science 301:1244-1246 (2003)中描述。使用2-AB标记和HPLC (中性和带电荷的聚糖)来定量每一糖形的相对量。通常，N-糖苷酶F释放的聚糖用2-氨基联苯胺(2-AB)标记并通过HPLC分析，如Choi等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:5022-5027 (2003)中描述，除了以下改变。通过HPLC用Prevail™碳水化合物ES柱4.6 x 250mm, 5 µm珠(Alltech, Avondale, PA)分析荧光标记的寡糖。流速为1.3 mL/分钟，保持40分钟，并且柱保持在45℃下。等度(70% A:30% B)洗脱3分钟后，使用线性溶剂梯度(70% A:30% B至44% A:56% B)超过20分钟来洗脱中性聚糖，随后为线性溶剂梯度(44% A:56% B至0% A:100% B)超过15分钟来洗脱带电荷的聚糖。溶剂A为乙腈并且溶剂B为甲酸铵的水溶液100 mM (pH 4.5)。在运行之间用溶剂(70% A:30% B)将柱平衡7分钟。
O-聚糖分析(Dionex)如下。使用在100 μL PBS缓冲液中的约0.5 nmole的蛋白进行β-消除(Harvey, Mass Spectrometry Reviews 18:349- 451 (1999), Stadheim等, Nat. Protoc.3:1026-31 (2006)。用25 μL碱性氢硼化物试剂处理蛋白样品并在50℃下孵育16小时。添加10 μL***糖醇作为内标，随后添加10 μL冰醋酸。将样品随后经含有SEPABEADS的Millipore滤器板离心并用水洗涤。将样品（包括洗涤物）转移至玻璃自动采样瓶并在离心蒸发器中蒸发至干燥。将150 μL 1% AcOH/MeOH加入到样品中并在离心蒸发器中将样品蒸发至干燥。将该最后一步重复五次。加入200 μL水并通过偶联有脉冲的电化学检测-HPLC (HPAEC-PAD)的高pH阴离子交换层析根据制造商(Dionex, Sunnyvale, CA)来分析100 μL的样品。
酶消化如下。通过加入0.2 μL的酶到重悬在50 μL的乙酸铵pH 5.0中的干燥样品中来进行α甘露糖苷酶处理，并在37℃下孵育过夜，随后通过MALDI-TOF和/或HPLC来分析。
显示在图6-1和6-2中的正离子的MALDI-TOF示踪显示对于在vrg4敲除(vrg4 Δ)背景中表达重组TNFRII-Fc融合蛋白的每一菌株而言，在从细胞提取的总细胞聚糖中不存在可检测量的具有多于9个甘露糖(M9)残基例如M10、M11、和M12的高甘露糖N-聚糖。
图7显示在VRG4或vrg4敲除背景(分别为菌株YGLY27018和YGLY27028)中的菌株YGLY2-3中产生的TNFRII-Fc的N-聚糖含量的比较。HPLC示踪显示在vrg4敲除背景中，不存在可检测的高甘露糖N-聚糖，并且磷酸化的N-聚糖相比于在VRG4细胞中存在的量大大降低。
图8显示在VRG4或vrg4敲除背景(分别为菌株YGLY27020和YGLY27031)中的菌株YGLY6-3中产生的TNFRII-Fc的N-聚糖含量的比较。HPLC示踪显示在vrg4敲除背景中，不存在可检测的高甘露糖N-聚糖，并且磷酸化的N-聚糖相比于在VRG4细胞中存在的量大大降低。相比于YGLY2-3背景，在YGLY6-3背景中磷酸化的N-聚糖的量似乎高一点点。
图9显示在VRG4或vrg4敲除背景(分别为菌株YGLY27026和YGLY27044)中的菌株YGLY4754中产生的TNFRII-Fc的N-聚糖含量的比较。HPLC示踪显示在vrg4敲除背景中，相比于在VRG4细胞中存在的量，不存在可检测的高甘露糖N-聚糖。两种菌株背景均缺乏可检测的磷酸化的N-聚糖，这是由于这些背景包括PNO1、MNN4和MNN4-L1基因的缺失，其参与N-聚糖的磷酸甘露糖基化。
表1显示存在于获自如上所述的多种VRG4和vrg4菌株的TNFRII-Fc组合物中的N-聚糖的定量分析。附图显示vrg4菌株产生不具有可检测的更高甘露糖（大于）N-聚糖的TNFRII-Fc组合物。磷酸化N-聚糖的量显著降低，并且复合N-聚糖形成的量在vrg4菌株YGLY27044（能够产生具有半乳糖末端的复合N-聚糖的菌株）中相对于在对应的VRG4菌株YGLY27026（也能够产生具有GS5.0糖形的糖蛋白）中产生的增加。
表2显示存在于获自如上所述的多种VRG4和vrg4菌株的TNFRII-Fc组合物中的O-聚糖的定量分析。附图显示vrg4菌株产生相比于对应的VRG4菌株中产生的具有显著降低的O-聚糖复合度的TNFRII-Fc组合物。在能够产生GS1.0聚糖结构的vrg4 Δ菌株中，约大于80％的O-聚糖仅具有一个甘露糖残基。这些菌株缺乏分泌的嵌合的里氏木霉甘露糖苷酶的表达，其通常包括在用于产生异源糖蛋白的产生菌株中以降低O-聚糖链长（参见公开的国际申请号WO2007061631）。
实施例4
在本实施例中，构建表达主要具有特定N-聚糖结构的重组大鼠***(rEPO)的重组菌株。将获自这些菌株培养物的糖蛋白组合物的N-聚糖组合物与菌株中VRG4基因的表达已破坏后来自这些菌株的N-聚糖组合物相比较。
质粒pGLY4510 (图10)是转入整合载体，其靶向TRP2基因座并且含有单一表达盒，所述表达盒编码大鼠***，其对在巴斯德毕赤酵母中表达进行密码子优化，并且融合至在N-末端的α-交配因子前信号序列原(pre pro signal sequence)和在C-末端的六组氨酸标签(氨基酸序列SEQ ID NO:6；由核苷酸序列SEQ ID NO:7编码)。将表达盒在5'端可操作地连接至包含巴斯德毕赤酵母AOX1启动子的核酸分子(SEQ ID NO:61)，并在3'端可操作地连接至包含酿酒酵母CYC转录终止序列的核酸分子(SEQ ID NO:21)。质粒还包括ZeocinR表达盒，其包含编码Sh ble ORF的核酸分子（其在5'端可操作地连接至酿酒酵母TEF1启动子(SEQ ID NO:63)并且在3'端可操作地连接至酿酒酵母CYC终止序列(SEQ ID NO:21)）。质粒进一步包括靶向THR1基因座的核酸分子(SEQ ID NO:64)。通过用XbaI消化10 μg载体将质粒pGLY4510转化入期望的原养型的宿主菌株中。将经转化的菌株铺板在含有0.125x、1x或3x Zeocin的YSD平板上并在24℃下孵育。将表达大鼠EPO的各个克隆分离并分析。菌株YGLY27712是用pGLY4510转化的菌株YGLY2-3，菌株YGLY27682是用pGLY4510转化的菌株YGLY6-3，菌株YGLY27685是用pGLY4510转化的菌株YGLY10-3，并且菌株YGLY27691是用pGLY4510转化的菌株YGLY4754：这些菌株均是VRG4并且表达GDP甘露糖跨膜转运蛋白。菌株YGLY27097是VRG4敲除菌株衍生的转化有pGLY4510的YGLY2-3，菌株YGLY27100是VRG4敲除菌株衍生的转化有pGLY4510的YGLY6-3，菌株YGLY27103是VRG4敲除菌株衍生的转化有pGLY4510的YGLY10-3，并且菌株YGLY27109是VRG4敲除菌株衍生的转化有pGLY4510的YGLY4754：这些菌株均是vrg4敲除并且不表达GDP甘露糖跨膜转运蛋白。
表达rEPO的菌株在96孔板、摇瓶和DASGIP中的生长如实施例3中所述进行，除了在生物反应器中不加入胰凝乳蛋白酶抑制剂并且甲醇补料速率为2.16mL/hr代替1.5mL/hr外。而且，PMTi-4抑制剂浓度水平为三倍更高，在初始和随后添加中为32.3 mg/L和1.9mg/L。
来自摇瓶和96孔板材料的重组大鼠***纯化如下。使用Ni-螯合物层析从澄清的上清液中纯化分泌的rEPO，如在Choi等, PNAS USA.100:5022-5027 (2003)和在Hamilton 等, Science 301:1244-1246)中对His标签化的Kringle 3所描述的。
来自DASGIP材料的重组大鼠***纯化如下。His标签化的大鼠EPO蛋白经固定化金属亲和层析（Immobilized Metal Affinity Chromatographic (IMAC)）步骤利用锌离子来纯化。简化螯合培养基(Streamline Chelating medium)(GE healthcare目录号17-1280-01)首先用50mM氯化锌平衡以将柱充装锌离子，随后为5个柱体积的蒸馏水以去除未结合的锌离子，并随后为5个柱体积的平衡缓冲液(20mM TRIS-HCl, 200mM氯化钠, pH 7.9)以平衡柱。将含有His标签化的大鼠EPO蛋白的无细胞上清液样品应用到充装锌的简化螯合培养基中。装载后，将柱用3个柱体积的平衡缓冲液洗涤以去除未结合的宿主细胞蛋白。通过应用10个柱体积的在20mM TRIS-HCl、200mM氯化钠pH 7.9中0-500mM的咪唑的线性梯度来洗脱目标蛋白。将洗脱的级分通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）来分析，并收集含有His标签化的大鼠EPO蛋白的级分并储存在4℃直至使用。
使用N-糖苷酶F从重组蛋白中释放N-聚糖，并通过MALDI-TOF分析，如Hamilton等Science 301:1244-1246 (2003)中描述。使用2-AB标记和HPLC (中性和带电荷的聚糖)来定量每一糖形的相对量。通常，N-糖苷酶F释放的聚糖用2-氨基联苯胺(2-AB)标记并通过HPLC分析，如Choi等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:5022-5027 (2003)中描述，除了以下改变。通过HPLC用Prevail™碳水化合物ES柱4.6 x 250mm, 5 µm珠(Alltech, Avondale, PA)分析荧光标记的寡糖。流速为1.3 mL/分钟，保持40分钟，并且柱保持在45℃下。等度(70% A:30% B)洗脱3分钟后，使用线性溶剂梯度(70% A:30% B至44% A:56% B)超过20分钟来洗脱中性聚糖，随后为线性溶剂梯度(44% A:56% B至0% A:100% B)超过15分钟来洗脱带电荷的聚糖。溶剂A为乙腈并且溶剂B为甲酸铵的水溶液100 mM (pH 4.5)。在运行之间用溶剂(70% A:30% B)将柱平衡7分钟。
酶消化如下。通过加入0.2 μL的酶到重悬在50 μL的乙酸铵pH 5.0中的干燥样品中来进行α甘露糖苷酶处理，并在37℃下孵育过夜，随后通过MALDI-TOF和/或HPLC来分析。
显示在图11-1和11-2中的正离子的MALDI-TOF示踪显示对于在vrg4敲除(vrg4 Δ)背景中表达重组rEPO的菌株而言，在从细胞获得的总细胞N-聚糖的组合物中不存在明显可检测量的具有多于9个甘露糖(M9)残基例如M10、M11、和M12的高甘露糖N-聚糖。
显示在图12-1和12-2和图13中的正离子的MALDI-TOF示踪显示对于在vrg4敲除(vrg4 Δ)背景中表达重组rEPO的每一菌株而言，在从菌株获得的rEPO组合物中获得的N-聚糖的组合物中不存在可检测量的具有多于9个甘露糖(M9)残基例如M10、M11、和M12的高甘露糖N-聚糖。
表3显示存在于获自如上所述的多种VRG4和vrg4 Δ菌株的rEPO组合物中的N-聚糖的定量HPLC分析。该表显示vrg4菌株产生不具有可检测的更高甘露糖（大于Man9GlcNAc2）N-聚糖的rEPO组合物。在能够产生GS1.0聚糖结构的vrg4菌株中，磷酸化的N-聚糖的量显著降低。其中破坏MNN4L1的表达但其表达PNO1和MNN4的菌株产生磷酸化的N-聚糖（例如，菌株YGLY27685）。然而，当进一步包括VRG4破坏的菌株产生rEPO组合物时，磷酸化的N-聚糖的量实质上降低（例如，菌株YGLY27103）。
实施例5
在实施例2-4中上述的菌株中，宿主细胞是och1 Δ。这些菌株缺乏初始α1,6-甘露糖基转移酶的表达并因此缺乏外链甘露糖基化。在本实施例中，几株来自实施例3和4的och1 Δ菌株用包含OCH1基因的质粒载体转化，以观察VRG4破坏对表达α1,6-甘露糖基转移酶并因此能够外链甘露糖基化的宿主细胞中N-聚糖组合物的影响。
OCH1的再引入（敲入）如下进行。质粒pGLY7430（图14）是KINKO整合载体，其包含OCH1基因并靶向TRP1基因座而不破坏该基因座的表达。该质粒的显著特征包括以下。在质粒中的OCH1基因包含核酸分子，其含有包含OCH1启动子的600 bp核酸片段、编码Och1p的1143 bp核酸片段、和包含OCH1终止子序列并具有SEQ ID NO:8中显示的核苷酸序列的504 bp核酸片段。OCH1基因在一侧侧接包含TRP1基因的5'区和完整ORF的核酸分子(SEQ ID NO:65)（其中终止密码子邻近包含巴斯德毕赤酵母ALG3终止序列的核酸分子(SEQ ID NO:33)），并且在另一侧侧接包含TRP1基因的3'区的核酸分子(SEQ ID NO:66)。对于选择转化子，质粒包含编码诺尔丝菌素抗性(NATR) ORF的表达盒（最初来自EROSCARF的pAG25，Scientific Research and Development GmbH, Daimlerstrasse 13a, D-61352 Bad Homburg, Germany,参见Goldstein等, Yeast 15:1541 (1999); GenBank检索号CAR31387.1和CAR31383.1），其位于包含TRP1基因的3'区的核酸分子和包含OCH1基因的核酸分子之间。NATR表达盒具有显示于SEQ ID NO:67中的核苷酸序列，其中NATR ORF由核苷酸494-1066编码，并且在5'端可操作地连接至棉病囊霉TEF1启动子序列（核苷酸494-1066）并且在3'端可操作地连接至具有棉病囊霉TEF1终止序列（核苷酸1067-1313）的核酸分子。
通过用SfiII消化10 μg的pGLY7430并转化来转化原养型巴斯德毕赤酵母宿主菌株YGLY2-3、YGLY2541、YGLY27018和YGLY27028，如Choi等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA.100:5022-5027 (2003)和Hamilton等, Science 301:1244-1246 (2003)中描述 (参见图15)。将转化子铺板在含有100 μg/mL诺尔丝菌素YSD板上以选择转化的载体的掺入。OCH1基因的成功敲入通过PCR以下引物组来确定。
PCR引物和用于从5'交换区PCR扩增1.3 kbp的核酸片段。PCR引物和用于从3'交换区PCR扩增1.3 kbp的片段。PCR引物SH1417 –和SH1418 –用于从编码Och1p的ORF PCR扩增900 bp区域。转化产生菌株YGLY22763 (VRG4和OCH1)、YGLY22766 (vrg4和OCH1)、YGLY22769 (VRG4和OCH1并表达TNFRII-Fc)和YGLY22772 (vrg4和OCH1并表达TNFRII-Fc)。
菌株如实施例3中所述生长并纯化。
使用N-糖苷酶F从重组蛋白中释放N-聚糖，并通过MALDI-TOF分析，如Hamilton等Science 301:1244-1246 (2003)中描述。使用2-AB标记和HPLC (中性和带电荷的聚糖)来定量每一糖形的相对量。通常，N-糖苷酶F释放的聚糖用2-氨基联苯胺(2-AB)标记并通过HPLC分析，如Choi等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:5022-5027 (2003)中描述，除了以下改变。通过HPLC用Prevail™碳水化合物ES柱4.6 x 250mm, 5 µm珠(Alltech, Avondale, PA)分析荧光标记的寡糖。流速为1.3 mL/分钟，保持40分钟，并且柱保持在45℃下。等度(70% A:30% B)洗脱3分钟后，使用线性溶剂梯度(70% A:30% B至44% A:56% B)超过20分钟来洗脱中性聚糖，随后为线性溶剂梯度(44% A:56% B至0% A:100% B)超过15分钟来洗脱带电荷的聚糖。溶剂A为乙腈并且溶剂B为甲酸铵的水溶液100 mM (pH 4.5)。在运行之间用溶剂(70% A:30% B)将柱平衡7分钟。
图16-1和16-2显示从获自VRG4细胞和vrg4 Δ GFI 1.0糖工程化菌株（其中OCH1基因已被再引入并因此相比于och1 Δ的菌株，为OCH1）的总细胞团块中提取的细胞N-聚糖的MALDI-TOF分析。示踪显示从vrg4 Δ缺失突变体中获得的总细胞N-聚糖组合物中高甘露糖N-聚糖的比例即使在已将OCH1基因再引入och1 Δ细胞中以使细胞OCH1后仍显著降低。
图17-1和17-2显示从获自VRG4细胞和vrg4 Δ GFI 1.0糖工程化菌株（其中OCH1基因已被再引入并因此相比于och1 Δ的菌株，为OCH1）的总细胞团块中提取的细胞N-聚糖的MALDI-TOF分析。菌株进一步表达TNFRII-Fc为报道蛋白。示踪显示从表达TNFRII-Fc的vrg4 Δ缺失突变体中获得的总细胞蛋白组合物中高甘露糖N-聚糖与总N-聚糖的比例即使在已将OCH1基因再引入och1 Δ细胞中以使细胞OCH1后仍显著降低。
图18-1和18-2显示从获自VRG4细胞和vrg4 Δ GFI 1.0糖工程化菌株（其中OCH1基因已被再引入）的TNFRII-Fc组合物中提取的N-聚糖相比于为och1 Δ的菌株的MALDI-TOF分析。分析显示从vrg4 Δ缺失突变体获得的TNFRII-Fc组合物中高甘露糖N-聚糖与总N-聚糖的比例即使从其中OCH1基因已再引入的菌株中也显著降低。
如实施例3中所述通过HPLC确定N-聚糖组合物，并且结果显示在表4中。与之前分析中显示的结果一致，即使当OCH1基因再引入到vrg4 Δ菌株中，保留的高甘露糖N-聚糖的量显著降低。具有-1或-2电荷的带电荷的N-聚糖的量也保持降低。然而，OCH1基因向vrg4 Δ菌株YGLY27772中的再引入导致约一半的M8 N-聚糖被转化为具有额外己糖的形式并因此在对M9期望的位置上共迁移。在VRG4菌株中，存在从和更高聚糖向和更高聚糖的更显著转化。
实施例6
如图2-1和2-2中所示，使用VRG4敲除质粒pGLY8655破坏菌株YGLY14-3中的VRG4基因表达的尝试似乎不成功。尽管PCR分析显示VRG4基因的5'和3'区的交换已发生，但使用对VRG4基因的内部PCR引物的PCR分析产生这样的核酸片段，其暗示YGLY14-3含有能够表达有功能的GDP甘露糖跨膜转运蛋白活性的VRG4基因的完整拷贝。该结果暗示菌株YGLY14-3含有两个VRG4基因，由于VRG4敲除在菌株YGLY3853中是能获得的，所以当菌株YGLY3853从YGLY14-3构建时，所述VRG4基因随后丢失。
菌株YGLY10-3是菌株YGLY14-3的前期菌株(predecessor)。如图2-1和2-2和3-1和3-2中所示，VRG4基因可以在YGLY10-3中破坏，并且所获的菌株YGLY25243（缺乏GDP甘露糖跨膜转运蛋白活性的表达）是有活力的。菌株YGLY14-3如下从菌株YGLY10-3中再构建。
将菌株YGLY10-3在5-氟乳清酸(5-FOA)存在的情况下反选择，以产生缺乏URA5标记基因的菌株，并随后用质粒pGLY45（已用于构建菌株YGLY14-3的同一载体）转化，以缺失PNO1和MNN4基因的表达，以产生菌株YGLY28269。当用质粒pGLY8655转化该菌株以破坏VRG4基因的表达时，获得为vrg4（缺乏有功能的GDP甘露糖跨膜转运蛋白活性的表达）且有活力的敲除克隆（菌株YGLY29175、YGLY29176和YGLY29177）。在摇瓶中生长的这些菌株之一（菌株YGLY29175）的MALDI-TOF分析显示分离自该菌株的总细胞聚糖降低甘露糖基化，并且主要的N-聚糖为（图20）。图21显示分离自摇瓶中生长的多种菌株（包括三个vrg4克隆(YGLY29175、YGLY29176和YGLY29177)）的总细胞N-聚糖的HPLC分析的结果。
实施例7
之前，由于高菌落背景，在OCH1野生型菌株（NRRL-Y11430或URA5互补的YGLY1-3）中获得vrg4敲除是困难的。在本实施例中，通过在YGLY1-3中互补URA5同时敲除ATT1基因来构建宿主菌株。用VRG4敲除质粒pGLY8655转化这些菌株产生大量vrg4敲除菌株。
如图22-1和22-2中所示，用质粒pGLY5933转化菌株YGLY1-3，其破坏ATT1基因。质粒的显著特征是它包含上文描述的URA5表达盒，其在一端侧接包含ATT1基因的5'或上游区的核酸分子(SEQ ID NO:74)并且在另一端侧接编码ATT1基因的3'或下游区的核酸分子(SEQ ID NO:75)。用质粒pGLY5933转化YGLY1-3，产生大量其中选择菌株YGLY27836的菌株。如实施例2中所述用质粒pGLY8655转化菌株YGLY27836，以产生菌株YGLY29169和YGLY29170。这些菌株均是att1和vrg4敲除。菌株YGLY25241（其是och1和vrg4敲除）的构建显示在实施例2中。
图23-1和23-2显示MALDI-TOFs，其中在YGLY29170中观察到的主要聚糖是和，而没有大于的聚糖。这与在其中OCH1基因再引入vrg4/och1菌株中的菌株中观察到的相似（参见图16-1至18-2）。该结果显示VRG4基因的表达可以在非糖工程化菌株中被破坏并且如在已进行糖工程化的菌株中观察到的，VRG4破坏降低甘露糖基化。
实施例8
设计VRG4敲除载体(pGLY12391)，当整合入巴斯德毕赤酵母基因组中时，其破坏内源VRG4 ORF，同时引入可操作地连接至异源启动子（酿酒酵母DPM1启动子）和异源转录终止序列（酿酒酵母DPM1转录终止序列）的异源VRG4可读框(ORF)、可操作地连接至巴斯德毕赤酵母AOX1启动子和巴斯德毕赤酵母AOX1转录终止序列的Cre重组酶（Cre）基因、和位于两个LoxP重组基序之间的URA5表达盒。整合后，经转化的菌株在甲醇中的生长诱导Cre重组酶的表达，其重组其自身表达盒以及URA5表达盒和异源VRG4基因。成功的重组导致VRG4敲除克隆的产生。利用该载体来操作非糖工程化的巴斯德毕赤酵母菌株YGLY1-3产生VRG4敲除克隆，当测试时，其展示出降低的甘露糖基转移酶活性，产生主要具有和糖形的糖蛋白。
尽管本发明参考举例说明的实施方案在此描述，但应理解本发明不限于此。具有本领域普通技术并有权使用该教导的技术人员将理解额外的修改和实施方案在其范围之内。因此，本发明仅受限于本文所附的权利要求。

Claims (20)

1.低等真核生物宿主细胞，其包括：
(a) 钒酸盐抗性糖基化(VRG4)基因表达的破坏；和
(b) 编码重组糖蛋白的核酸分子，其中所述宿主细胞是有活力的。
2.权利要求1的宿主细胞，其中所述宿主细胞包括获得性热耐受性(ATT1)基因表达或外链1 (OCH1)基因表达的破坏。
3.权利要求1的宿主细胞，其中所述宿主细胞是巴斯德毕赤酵母。
4.权利要求1的宿主细胞，其中所述宿主细胞已遗传工程化以产生人样N-和/或O-聚糖。
5.在低等真核生物宿主细胞中产生重组糖蛋白的方法，其包括：
在其中编码GDP甘露糖跨膜转运蛋白的钒酸盐抗性糖基化(VRG4)基因的表达已被破坏的酵母或丝状真菌宿主细胞中表达编码所述重组糖蛋白的核酸分子。
6.权利要求5的方法，其中所述宿主细胞包括获得性热耐受性(ATT1)基因表达或外链1 (OCH1)基因表达的破坏。
7.权利要求5的方法，其中所述宿主细胞是巴斯德毕赤酵母。
8.权利要求5的方法，其中所述宿主细胞已遗传工程化以产生人样N-和/或O-聚糖。
9.用于降低在低等真核生物宿主细胞中产生的重组糖蛋白的N-和O-聚糖的磷酸甘露糖基化的量的方法，其包括：
在其中编码GDP甘露糖跨膜转运蛋白的钒酸盐抗性糖基化(VRG4)基因的表达已被破坏的低等真核生物宿主细胞中表达编码所述重组糖蛋白的核酸分子，
其中磷酸甘露糖基化的量低于在表达GDP甘露糖跨膜转运蛋白的低等真核生物真菌宿主中产生的重组糖蛋白上的磷酸甘露糖基化。
10.权利要求9的方法，其中所述宿主细胞包括获得性热耐受性(ATT1)基因表达或外链1 (OCH1)基因表达的破坏。
11.权利要求9的方法，其中所述宿主细胞是巴斯德毕赤酵母。
12.权利要求9的方法，其中所述宿主细胞已遗传工程化以产生人样N-和/或O-聚糖。
13.用于降低在低等真核生物宿主细胞中产生的重组糖蛋白上α-连接的甘露糖的量的方法，其包括：
在其中编码GDP甘露糖跨膜转运蛋白的钒酸盐抗性糖基化(VRG4)基因的表达已被破坏的低等真核生物宿主细胞中表达编码所述重组糖蛋白的核酸分子，
其中α-连接的甘露糖的量低于在表达GDP甘露糖跨膜转运蛋白的低等真核生物宿主中产生的重组糖蛋白上的α-连接的甘露糖的量。
14.权利要求13的方法，其中所述宿主细胞包括获得性热耐受性(ATT1)基因表达或外链1 (OCH1)基因表达的破坏。
15.权利要求13的方法，其中所述宿主细胞是巴斯德毕赤酵母。
16.权利要求13的方法，其中所述宿主细胞已遗传工程化以产生人样N-聚糖。
17.用于降低在低等真核生物宿主细胞中产生的重组糖蛋白上β-连接的甘露糖的量的方法，其包括：
在其中编码GDP甘露糖跨膜转运蛋白的钒酸盐抗性糖基化(VRG4)基因的表达已被破坏的低等真核生物宿主细胞中表达编码所述重组糖蛋白的核酸分子，
其中β-连接的甘露糖的量低于在表达GDP甘露糖跨膜转运蛋白的低等真核生物宿主中产生的重组糖蛋白上β-连接的甘露糖的量。
18.权利要求17的方法，其中所述宿主细胞包括获得性热耐受性(ATT1)基因表达或外链1 (OCH1)基因表达的破坏。
19.权利要求17的方法，其中所述宿主细胞是巴斯德毕赤酵母。
20.权利要求17的方法，其中所述宿主细胞已遗传工程化以产生人样N-聚糖。
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