CN104531850B - 一种检测slc26a4基因突变的试剂盒及其应用 - Google Patents

一种检测slc26a4基因突变的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测SLC26A4基因突变的试剂盒及其应用，属于基因检测技术领域。根据四引物扩增受阻突变体系PCR技术，针对SLC26A4基因IVS7(‑2)位点A>G突变设计出一组特异引物，正常外引物序列如SEQ ID NO.1所示，突变外引物序列如SEQ ID NO.2所示，正常内引物序列如SEQ ID NO.3所示，突变内引物序列如SEQ ID NO.4所示。利用这四条引物对待测样品进行PCR检测，并根据琼脂糖电泳结果判断待测样品中SLC26A4基因的基因型。本发明引物特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度好，为SLC26A4基因IVS7‑2A>G突变提供了检测方法。

Description

一种检测SLC26A4基因突变的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体地说涉及用于检测耳聋相关基因SLC26A4IVS7-2A>G突变的试剂盒及其应用。
背景技术
溶质转运蛋白家族26,成员4(solute carrier family 26,member 4；SLC26A4)基因定位于7q31，编码离子转运相关蛋白，对SO4 2-，HCO3-，I-，Cl-等多种单价或二价离子进行转运，在机体离子成分平衡的维持中发挥重要作用。内耳具有复杂而精细的液体平衡***，因此任何致病性的基因突变都会导致内耳离子成分和渗透压的改变，从而对人的听觉和身体平衡产生重要影响。SLC26A4纯合或杂合突变是大前庭水管综合征明确的致病原因。
该基因突变在中国聋哑人群中的发病率约8-12％。该基因可以有数以百计的突变形式，但中国聋哑人群中常见致病突变为SLC26A4基因IVS7-2A＞G，该突变筛查为纯合突变或复合杂合突变者时，意为发现了患儿耳聋的遗传致病因素，可以通过预防感冒，避免颅脑外伤、剧烈运动等防止听力波动和防止聋哑的发生，并进行定期检测，对发现听力下降者给与早期干预和治疗。
目前针对单核苷酸多态性(Single-nucleotide polymorphism，SNP)基因突变检测的方法有数十种，如基因芯片法、荧光定量PCR法、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)法和金标准PCR产物直接测序法等，但这些方法普遍存在技术要求高、仪器设备要求高、成本高等特点，因此在基层使用具有一定局限性。迫切需要一种简便、快速检测SLC26A4IVS7-2A>G突变的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测SLC26A4基因突变的试剂盒及其应用。
四引物扩增受阻突变体系PCR法(Tetras-primer amplification refractorymutationsystem-PCR，四引物ARMS-PCR)其基本原理是：针对一个SNP位点设计2个延伸方向相反的内侧引物(Inner primer)，2个引物的3’末端碱基分别与SNP位点的1个碱基相同(或互补)，并引入错配碱基增加引物的特异性，然后按正常的方法设计2个方向相反的外引物(Outer primer)；用这4个引物链组成的3对引物在1个PCR反应中进行扩增(巢式PCR)；扩增产物用凝胶电泳检测，出现2条带的是纯合型，出现3条带的是杂合型。
本发明根据四引物扩增受阻突变体系PCR技术原理，针对SLC26A4基因IVS7(-2)位点A>G突变设计出一组特异引物，正常外引物序列如SEQ ID NO.1所示，突变外引物序列如SEQ ID NO.2所示，正常内引物序列如SEQ ID NO.3所示，突变内引物序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明提供用于检测的引物组合，其特征在于，包括以下四条引物：
正常外引物S-1：5‘-CATATGAGAATTGATTGTGTGTGTGTGC-3’(SEQ ID NO.1)
突变外引物S-2：5‘-TGTTTCTTCCAGATCACACACAAATAGG-3’(SEQ ID NO.2)
正常内引物S-3：5‘-ATGAAATGGCAGTAGCAATTATCGGCT-3’(SEQ ID NO.3)
突变内引物S-4：5‘-GGAGTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTCCG-3’(SEQ ID NO.4)。
本发明提供了上述引物组合在检测SLC26A4基因突变中的应用。
本发明还提供了上述引物组合在制备SLC26A4基因突变检测试剂盒中的应用。
含有上述引物组合的试剂盒也属于本发明的保护范围。
可以将本发明引物以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。因此含有上述引物组合的试剂盒也属于本发明的保护范围。
本发明的试剂盒可以是由多个隔断所形成，以容纳固定一个或多个如管或小瓶的容器。这些容器之一或者多个可以装有本发明的引物，根据需要该引物可以是冻干形式或溶于缓冲液中的状态。另外，本发明的试剂盒中还可以包括用于PCR反应的一种或多种酶/试剂，以及实施本发明所需要的其它成分及用具。
进一步地，本发明试剂盒的工作程序为，当总体系为20μL时，如下：
进一步地，本发明试剂盒的工作程序为：预变性94℃、5min；再经94℃变性30s，60℃退火25s，72℃延伸25s，34个循环；最后72℃延伸10min，降温至4℃，结束。
本发明试剂盒的工作程序还包括将PCR产物用2～3％琼脂糖凝胶进行电泳。
具体操作为：取PCR扩增产物，3％琼脂糖凝胶电泳检测，判断样品SLC26A4基因IVS7(-2)位点基因型；若电泳结果在566bp和368bp出现两条带，则说明样本为SLC26A4基因IVS7(-2)位点正常；若电泳结果在566bp和255bp出现两条带，则说明样本为SLC26A4基因IVS7(-2)位点纯合突变；若电泳结果在566bp、368bp和255bp出现三条带，则说明样本为SLC26A4基因IVS7(-2)位点杂合突变。
进一步，本发明提供了一种检测SLC26A4基因突变的方法，该方法以样品总DNA为模板，利用本发明的引物组合进行PCR反应，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后根据电泳条带判定结果。
其中，样品总DNA来自人类血液、体液或组织。
本发明采用四引物扩增受阻突变体系PCR技术，针对SLC26A4基因IVS7(-2)位点A>G突变设计两条延伸方向相反的内侧引物(innerprimer)，两条引物的3‘末端碱基分别与SNP位点的一个碱基相同(或互补)，及两条正常的方向相反的外引物(outer primer)。这四个引物可以组成三个引物对，在同一个扩增体系进行反应，扩增产物用凝胶电泳检测时，出现两条带的是纯合基因型，出现三条带的是杂合基因型。具有检测操作简单、成本低、设备要求低、检测结果特异性高及结果易判读，实用性强等特点。本发明引物特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度高，为SLC26A4基因IVS7-2A>G突变提供了检测方法。
附图说明
图1为本发明引物筛选实验的凝胶电泳结果图，其中泳道1-6为引物组合一，7-12为引物组合二，13-18为引物组合三；其样本顺序分别为：1、7和13为人血基因组DNA样本一，2、8和14为人血基因组DNA样本二，3、9和15为SLC正常对照，4、10和16为SLC纯合突变对照，5、11和17为SLC杂合突变对照，6、12和18为空白对照；M为GeneRuler100bp DNA Ladder。
图2为本发明PCR体系筛选实验的凝胶电泳结果图，其中泳道1-6为体系一，7-12为体系二，13-18为体系三；其样本顺序分别为：1、7和13为人血基因组DNA样本一，2、8和14为人血基因组DNA样本二，3、9和15为SLC正常对照，4、10和16为SLC纯合突变对照，5、11和17为SLC杂合突变对照，6、12和18为空白对照；M为GeneRuler 100bp DNA Ladder。
图3为本发明PCR程序筛选实验的凝胶电泳结果图，其中泳道1-6为退火温度为55℃，7-12为退火温度为60℃，13-18为退火温度为65℃；其样本顺序分别为：1、7和13为人血基因组DNA样本一，2、8和14为人血基因组DNA样本二，3、9和15为SLC正常对照，4、10和16为SLC纯合突变对照，5、11和17为SLC杂合突变对照，6、12和18为空白对照；M为GeneRuler100bp DNA Ladder。
图4为本发明引物检测样品的凝胶电泳结果图，其中，泳道1-12分别为：正常人血基因组DNA样本一、正常人血基因组DNA样本二、正常人血基因组DNA样本三、正常人血基因组DNA样本四、SLC纯合突变人血基因组DNA样本五、SLC纯合突变人血基因组DNA样本六、SLC纯合突变人血基因组DNA样本七、SLC纯合突变人血基因组DNA样本八、SLC杂合突变人血基因组DNA样本九、SLC杂合突变人血基因组DNA样本十、SLC杂合突变人血基因组DNA样本十一、SLC杂合突变人血基因组DNA样本十二；M为GeneRuler 100bp DNA Ladder。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1引物的设计
本发明通过分析SLC26A4基因IVS7-2位点序列的基础上，利用软件设计引物，经过多轮筛选，发现以下引物能够快速、准确地对SLC26A4基因IVS7-2A>G突变进行检测。
选择3种引物进行PCR扩增实验，入选引物均为针对SLC26A4基因IVS7-2位点序列设计的引物组合。其序列见表1。
表1 针对SLC26A4基因IVS7-2位点的3组引物组合的序列
表2反应体系
样品DNA 5μL
10×PCR buffer，含Mg2+ 2μL
2.5mM dNTPs 0.3μL
20μM的S-1/5 1μL
20μM的S-2/6 1μL
20μM的S-3/7/8 1μL
20μM的S-4/9/10 1μL
5U/μL Taq DNA聚合酶 0.4μL
ddH2O 补至20μL。
表3 反应程序
结果如图1所示，组合一的引物组在检测人血DNA样本时灵敏度不够，组合三的引物组部分扩增条带缺失，只有本发明提供的检测引物(组合二)能够很好的区分SLC26A4基因IVS7(-2)位点的基因型。
因此，本发明提供的检测引物的核苷酸序列：
正常外引物S1：5‘-CATATGAGAATTGATTGTGTGTGTGTGC-3’(SEQ ID NO.1)
突变外引物S2：5‘-TGTTTCTTCCAGATCACACACAAATAGG-3’(SEQ ID NO.2)
正常内引物S3：5‘-ATGAAATGGCAGTAGCAATTATCGGCT-3’(SEQ ID NO.3)
突变内引物S4：5‘-GGAGTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTCCG-3’(SEQ ID NO.4)。
实施例2PCR检测方法的建立
1、采用实施例1确定的最佳引物组(组合二)进行检测SLC26A4基因突变的PCR反应体系筛选试验
表4 反应体系一
样品DNA 5μL
10×PCR buffer，含Mg2+ 2μL
2.5mM dNTPs 0.3μL
20μM的S1 1μL
20μM的S2 1μL
20μM的S3 1μL
20μM的S4 1μL
5U/μL Taq DNA聚合酶 0.4μL
ddH2O 补至20μL。
表5 反应体系二
样品DNA 5μL
10×PCR buffer，含Mg2+ 2μL
2.5mM dNTPs 0.3μL
15μM的S1 1μL
20μM的S2 1μL
15μM的S3 1μL
20μM的S4 1μL
5U/μL Taq DNA聚合酶 0.4μL
ddH2O 补至20μL。
表6 反应体系三
样品DNA 5μL
10×PCR buffer，含Mg2+ 2μL
2.5mM dNTPs 0.3μL
10μM的S1 1μL
20μM的S2 1μL
15μM的S3 1μL
20μM的S4 1μL
5U/μL Taq DNA聚合酶 0.4μL
ddH2O 补至20μL。
表7 反应程序
结果如图2所示，体系一和体系二在检测突变样本时，突变条带弱，体系三在对SLC26A4基因IVS7(-2)位点纯合和杂合突变的区分时条带分别更为均一。因此，本发明确定以体系三作为检测SLC26A4基因IVS7(-2)位点纯合和杂合突变的反应体系。
2、采用实施例1确定的最佳引物组(组合二)进行检测SLC26A4基因突变的PCR反应程序筛选试验，反应体系参照上述体系三。
预变性94℃、5min；再经94℃变性30s，分别选择55℃、60℃和65℃三个温度值作为退火温度，退火25s，72℃延伸25s，34个循环；最后72℃延伸10min。
结果如图3所示，当退火温度为55℃和65℃时，出现错误结果及无法判读的情况，当退火温度为60℃时能准确的扩增出正确的结果。
经过上述各条件参数的优化试验，本发明最终确定最佳选择：
PCR反应体系：以总DNA为模板，进行PCR反应，20μL反应体系：样品DNA 5μL(10-50ng)，10×PCR buffer(含Mg2+)2μL，2.5mM dNTPs 0.3μL，10μM的S1、20μM的S2、15μM的S3、20μM的S4各1μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL，ddH2O补足20μL。
2、PCR反应条件
预变性94℃、5min；再经94℃变性30s，60℃退火25s，72℃延伸25s，34个循环；最后72℃延伸10min，降温至4℃，结束。
3、电泳
取10ul PCR扩增产物，3％琼脂糖凝胶电泳检测，判断样品SLC26A4基因IVS7(-2)位点基因型；所述判断具体为：3％凝胶电泳电泳检测扩增产物，若电泳结果在566bp和368bp出现两条带，则说明样本为SLC26A4基因IVS7(-2)位点正常；若电泳结果在566bp和255bp出现两条带，则说明样本为SLC26A4基因IVS7(-2)位点纯合突变；若电泳结果在566bp、368bp和255bp出现三条带，则说明样本为SLC26A4基因IVS7(-2)位点杂合突变。
实施例3临床应用效果
步骤一，选择待测样本：待测样本为经过“PCR扩增-测序”的技术方法检测的DNA样本，步骤为：取一定量受试者的血样DNA作为模板，采用设计合成一对通用的SLC26A4基因引物，序列如下：
测序正向引物S5：5‘-AAGTTCAGCATTATTTGGTTGACA-3’(SEQ ID NO.5)
测序反向引物S2：5‘-TGGTTGTTTCTTCCAGATCACA-3’(SEQID NO.6)
进行PCR扩增，反应结束后，对PCR扩增产物进行测序，根据测序结果对SLC26A4基因IVS7(-2)位点进行基因分型。
从中选择4个SLC26A4基因IVS7(-2)位点正常、4个SLC26A4基因IVS7(-2)位点纯合突变和4个SLC26A4基因IVS7(-2)位点杂合突变的人作为受试者。
步骤二，将提取的12个受试者的DNA样本进行四引物ARMS-PCR，步骤为：取一定量受试者的血样DNA作为模板，采用本发明设计合成的 SLC26A4基因引物进行PCR扩增。
步骤三，PCR反应体系及反应程序设置
PCR反应体系：以总DNA为模板，进行PCR反应，20μL反应体系：样品DNA 5μL(10-50ng)，10×PCR buffer(含Mg2+)2μL，2.5mM dNTPs0.3μL，10μM的S1、20μM的S2、15μM的S3、20μM的S4各1μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL，ddH2O补足20μL。
PCR检测反应程序为：94℃预变性5min；进入循环，94℃变性30s，60℃退火25s，72℃延伸25s，34个循环；72℃延伸5min，降温至4℃，结束。
步骤四，取10ul PCR扩增产物，3％琼脂糖凝胶电泳检测，判断样品SLC26A4基因IVS7(-2)位点基因型。结果如图4所示。
步骤五，结果分析及基因型判定：电泳后基因分型结果为1-4号样本为SLC26A4基因IVS7(-2)位点正常，5-8号样本为SLC26A4基因IVS7(-2)位点纯合突变，9-12号样本为SLC26A4基因IVS7(-2)位点杂合突变，该结果与测序法结果一致。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.检测SLC26A4基因突变的引物组合，其特征在于，其针对SLC26A4基因IVS7-2位点的A>G突变进行检测，包括以下四条引物：
正常外引物S-1：CATATGAGAATTGATTGTGTGTGTGTGC；
突变外引物S-2：TGTTTCTTCCAGATCACACACAAATAGG；
正常内引物S-3：ATGAAATGGCAGTAGCAATTATCGGCT；
突变内引物S-4：GGAGTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTCCG。
2.权利要求1所述的引物组合在制备SLC26A4基因突变检测试剂盒中的应用。
3.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物组合。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，其20μL PCR反应体系为：
5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，其工作程序为：预变性94℃、5min；再经94℃变性30s，60℃退火25s，72℃延伸25s，34个循环；最后72℃延伸10min。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，其工作程序还包括将PCR产物用2～3％琼脂糖凝胶进行电泳。
7.一种非诊断目的的检测SLC26A4基因突变的方法，其特征在于，该方法以样品总DNA为模板，利用权利要求1所述的引物进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后根据电泳条带判定结果；
所述PCR扩增，其20μL PCR反应体系为：
PCR反应程序为：预变性94℃、5min；再经94℃变性30s，60℃退火25s，72℃延伸25s，34个循环；最后72℃延伸10min；
根据电泳条带判定结果的判断标准为：若电泳结果在566bp和368bp出现两条带，则说明样本为SLC26A4基因IVS7(-2)位点正常；若电泳结果在566bp和255bp出现两条带，则说明样本为SLC26A4基因IVS7(-2)位点纯合突变；若电泳结果在566bp、368bp和255bp出现三条带，则说明样本为SLC26A4基因IVS7(-2)位点杂合突变。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，样品总DNA来自人类血液、体液或组织。
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