CN105349562A - 表达猪细小病毒vp2蛋白的重组载体、重组菌及其应用 - Google Patents

表达猪细小病毒vp2蛋白的重组载体、重组菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供表达猪细小病毒VP2蛋白的重组载体、重组菌及其应用，属于生物技术领域。表达猪细小病毒VP2蛋白的重组载体，是将猪细小病毒VP2蛋白编码基因***原核表达载体pEASY-blunt？E1后得到。本发明还提供表达猪细小病毒VP2蛋白的重组菌，是将所述重组载体导入大肠杆菌后获得。本发明表达猪细小病毒VP2蛋白的重组载体，导入大肠杆菌后，能够可溶性表达VP2蛋白，该VP2蛋白具有血凝性和优异的抗原性，有望应用于制备猪细小病毒疫苗。采用本发明重组菌能够高效制备猪细小病毒VP2蛋白，生产成本低、操作简单、不操作猪细小病毒具有更好的生物安全性。

Description

表达猪细小病毒VP2蛋白的重组载体、重组菌及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及表达猪细小病毒VP2蛋白的重组载体、重组菌及其应用。
背景技术
猪细小病毒(porcineparvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一，尤其是初产母猪在没有免疫的条件下发病更为严重，以死胎、木乃伊胎、死产、母猪流产、延期发情和产弱仔为主要特征。1967年Cartwright首次分离出PPV后,该病毒在世界范围内广泛传播和流行。上世纪80年代我国改革开放以后，随着规模化猪场逐渐增多，PPV在我国的感染越发严重,阳性检出率达90%以上，给我国的养猪产业带来了巨大的经济损失。PPV属于细小病毒科，细小病毒属，PPV基因组编码有3种结构蛋：VP1、VP2和VP3，3种非结构蛋白：NS1、NS2和NS3。其中VP2蛋白是构成PPV病毒衣壳的主要结构蛋白,且是最重要的免疫保护性抗原。
许多研究和临床实践表明疫苗免疫是控制PPV流行的一个很有效的方法。猪体免疫后，主要通过产生体液免疫应答来获得抵抗PPV感染的保护力。我国用于预防PPV的疫苗主要为灭活疫苗，即将PPV在ST细胞等猪源传代细细胞系上进行培养，分离去除细胞杂质获得具有感染性病毒，之后用化学试剂灭活、佐剂混合制成疫苗。PPV灭活疫苗具有安全性好、不需要低温保存等优点。但灭活疫苗也存在着生产成本昂贵、生产耗时长、需要大量劳动力、且免疫效果不稳定的缺点；另外，灭活的化学试剂和残留病毒DNA可能对免疫猪体存在危险性。新型PPV亚单位疫苗获得了广泛的研究，VP2在体外表达后不仅具有良好的免疫原性,而且可以诱导产生强烈免疫保护性。目前用于研究猪细小病毒亚单位疫苗抗原的表达***主要是杆状病毒感染的昆虫细胞表达***，其表达蛋白具有高可溶性和血凝性，能产生病毒样颗粒，免疫保护效果较好，但其生产成本比PPV灭活疫苗高出数倍，在生产操作方面更为复杂，对人员素质要求更高。通常情况下，原核表达***相比较于真核***，蛋白表达量高、生产成本低，生产操作更为简单，对人员素质要求也更低，但是现有技术中，采用原核表达***制备的VP2蛋白为不具有可溶性和血凝性的包涵体，免疫原性较差，免疫后免疫指标不好用通用HI试验进行评定。
发明内容
本发明目的是提供表达猪细小病毒VP2蛋白的重组载体，将该重组载体导入大肠杆菌后，能够可溶性表达VP2蛋白，该VP2蛋白具有血凝性和优异的抗原性。
本发明的另一目的是提供制备猪细小病毒VP2蛋白的重组菌，能够可溶性表达VP2蛋白，该VP2蛋白具有血凝性和优异的抗原性，可以用于制备猪细小病毒疫苗。
本发明的再一目的是提供制备猪细小病毒VP2蛋白的方法，该方法能够高效制备VP2蛋白、生产成本低、操作简单，不操作猪细小病毒具有更好的生物安全性。从实际操作性考虑，有望代替灭活疫苗制苗用抗原。
本发明的目的采用如下技术方案实现。
表达猪细小病毒VP2蛋白的重组载体，是将猪细小病毒VP2蛋白编码基因***原核表达载体pEASY-bluntE1后得到。
在本发明中，所述猪细小病毒VP2蛋白编码基因来源于猪细小病毒PPV-JS株。
本发明还提供表达猪细小病毒VP2蛋白的重组菌，是将所述重组载体导入大肠杆菌后获得。
所述大肠杆菌为BL-21。
本发明还提供所述重组菌在制备猪细小病毒VP2蛋白方面的应用。
在本发明中，所述应用包括诱导所述重组菌表达猪细小病毒VP2蛋白的步骤。
优选的技术方案在，在重组菌培养物OD600达到0.4-0.6时，采用IPTG诱导表达猪细小病毒VP2蛋白。
优选的技术方案中，IPTG添加至重组菌培养物中的终浓度为0.05-0.2mM。
本发明表达猪细小病毒VP2蛋白的重组载体，导入大肠杆菌后，能够可溶性表达VP2蛋白，该VP2蛋白具有血凝性和优异的抗原性，有望应用于制备猪细小病毒疫苗。采用本发明重组菌能够高效制备猪细小病毒VP2蛋白，生产成本低、操作简单、不操作猪细小病毒具有更好的生物安全性。
附图说明
图1显示了VP2蛋白编码基因的扩增结果，其中泳道M为DL2000Marker，其余泳道为PCR扩增产物。
图2显示了重组质粒p-PPV-VP2的双酶切鉴定结果，其中泳道M为DL2000Marker，泳道1为阳性重组质粒p-PPV-VP2。
图3显示了VP2蛋白在BL-21-VP2和对照菌BL-21-p中的表达情况。Marker：ThermoScientificPageRuler预染Ladder；1：对照菌BL-21-p裂解液上清；2：BL-21-VP2裂解液上清；3：对照菌BL-21-p裂解液沉淀；4：BL-21-VP2裂解液沉淀。
图4是各样品血凝性检测结果，每行左边显示了孔的编号，每行样品从左往右浓度依次降低。
图5显示了OD600为0.4、0.5和0.6时诱导后，菌体裂解液上清的血凝性检测结果，其中最左边的标记表明每行样品诱导前的OD600值，右边给出每行样品的血凝效价。
图6.采用PPV-JS或BL-21-VP2的4单位抗原检测待检血清的HI抗体效价结果，其中左边的文字指出每行检测的血清，右边的文字指出孔的编号。
具体实施方式
实施例1构建表达VP2蛋白的重组菌
一构建重组表达载体
1.引物设计
参照PPV-NADL2株基因序列（KF049424.1），应用Primerpremier5.0软件设计引物PPV-VP2-kpni和PPV-VP2-bamhi，用于扩增猪细小病毒PPV-JS株（缩写为PPV-JS株，公开于CN102965345A，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCCNO.6605）VP2蛋白编码基因全部序列。
PPV-VP2-kpni的核苷酸序列（SEQIDNO：2）如下：ggtaccATGAGTGAAAATGTGGAACAAG，PPV-VP2-bamhi的核苷酸序列（SEQIDNO：3）如下：ggatccCTAGTATAATTTTCTTGGTAT，由上海英骏生物有限公司合成。其中PPV-VP2-kpni携带KpnⅠ酶切位点，PPV-VP2-bamhi携带BamhⅠ酶切位点。
2.PPV-JS株基因组DNA的提取
（1）取PPV-JS株病毒样品450μl加入50μl、浓度为10%的SDS溶液，加入3μl蛋白酶K；
（2）在56℃水浴中震荡条件下孵育30min；
（3）加入500μl的TRIS-酚，混匀，5分钟后，在4℃、10000-12000r/min条件下离心10分钟；
（4）取上清，加入1:1（V/V）混合的TRIS-酚和氯仿混合物500μl，作用5分钟后10000-12000r/min离心10分钟；
（6）取上清，加入500μl的氯仿，作用5分钟，10000-12000r/min离心10分钟；
（7）取上清，加上清体积2倍的无水乙醇和10%（体积百分浓度）的醋酸钠水溶液；
（8）将步骤（7）所得混合物置于-20℃下30分钟以上；
（9）取-20℃下放置的样品在4℃、10000r/min离心10分钟；
（10）弃上清，在沉淀中加入75%（体积百分浓度）的乙醇水溶液，在4℃、6500r/min离心5分钟，弃去上清；重复2遍；
（11）吸干或者晾干乙醇；
（12）加入30μl的ddH2O溶解，得到PPV-JS株基因组DNA，置于-20℃下保存。
3.VP2蛋白编码基因的扩增和纯化回收
（1）将反应体系设定为50μL体系：0.5μLPrimerSTAR高保真酶，10μL5×PSBuffer，4μLdNTPs，引物PPV-VP2-kpni和PPV-VP2-bamhi各1μL（20μmol/L），2μLPPV-JS株基因组DNA，28.5μLddH2O。
（2）反应条件：98℃2min；98℃15s，60℃30s，72℃2min，30个循环；72℃5min。产物在4℃保存。
（3）采用1%琼脂糖凝胶电泳回收扩增的基因片段，以DL2000Marker作为对照。结果如图1所示，在大约1.7kb处出现特异性的VP2蛋白编码基因条带。采用OMEGADNA凝胶回收试剂盒回收VP2蛋白编码基因。具体操作见说明书。
猪细小病毒PPV-JS株VP2蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。
PCR过程中用到的试剂购自TAKARA。
4.表达质粒的构建
（1）将VP2蛋白编码基因***pEASY-bluntE1原核表达载体（购自北京全式金生物技术有限公司），构建重组质粒p-PPV-VP2。连接体系为5μL体系：2μLVP2蛋白编码基因胶回收产物，1μLpEASY-bluntE1载体，2μLddH2O。24℃连接20min。
（2）将连接产物加入到100μL的DH5α感受态细胞中，冰浴30min，之后42℃热休克90s，冰浴5min。加入1mLLB培养基，37℃摇床上180rpm培养1h，取出后10000g离心1min，弃800μL上清，留200μL上清重悬菌体，全部涂布具有氨苄（Amp）抗性的LB平板上，37℃培养过夜。
（3）随机挑取上述LB平板上的单菌落，接种于具有氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃过夜培养。
5.质粒的提取
采用鼎国质粒小量提取试剂盒提取本实施例步骤4中挑选到的重组菌内的质粒，具体操作步骤见试剂盒说明书。
6.重组质粒的鉴定
10μL双酶切鉴定体系：0.5μLBamHⅠ，0.5μLKpnⅠ，1μL10×KBuffer，4μL质粒，4μLddH2O，37℃酶切1h。酶切产物的电泳图如图2所示，质粒经BamHⅠ和KpnⅠ酶切鉴定正确，为阳性重组质粒，命名为p-PPV-VP2。将重组质粒p-PPV-VP2送英骏公司测序，测序正确。
二构建重组菌
1.重组质粒p-PPV-VP2转化表达菌
（1）按照常规方法，将p-PPV-VP2重组质粒转化大肠杆菌BL-21的感受态细胞，然后涂布于含50μg/mLAmp（氨苄青霉素）抗性的LB平板上，37℃培养过夜。
（2）挑取上述Amp抗性LB平板上的单菌落，命名为重组菌BL-21-VP2，接种于含50μg/mLAmp抗性的LB液体培养基中，在37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。
按照上述相同方法，将质粒pEASY-bluntE1转化BL-21的感受态细胞，得到对照菌BL-21-p。
2.重组菌诱导表达和SDS-PAGE鉴定
（1）将BL-21-VP2和对照菌BL-21-p培养液分别按1:100（体积比）接种含50μg/mlAmp的LB液体培养基。
（2）在37℃、200rpm条件下培养下2h，此时OD600大约为0.4。
（3）加入终浓度为0.1mM的IPTG，在37℃、200rpm条件下振荡培养4小时。
（4）培养结束后，分别取5mlBL-21-VP2和对照菌BL-21-p菌液，超声破碎处理后，离心分离菌体裂解液上清和沉淀，进行SDS-PAGE电泳。结果如图3所示，BL-21-VP2裂解液上清中存在目的条带，且上清具有较高血凝活性，HA效价达到29，重组菌BL-21-VP2裂解液沉淀中存在目的蛋白的包涵体，血凝活性很低，HA效价仅为25，说明VP2蛋白在BL-21-VP2中实现了可溶性表达，且表达的VP2蛋白血凝效价较高。HA效价的检测方法见实施例2。
实施例2VP2蛋白血凝性鉴定和血凝价（HA）测定
1.1%豚鼠红细胞液的制备
（1）用注射器吸取抗凝剂（4%柠檬酸钠溶液）1mL；取至少1只SPF豚鼠，采血约4mL，与1mL抗凝剂混合，然后缓慢加入10mL离心管中混匀。
（2）洗涤豚鼠红细胞：将步骤（1）中10mL离心管中的血液混合物在1500rpm条件下离心10min，弃上清，取沉淀物，加入5mlPBS缓冲液（pH7.2,是含有下述成分的水溶液：NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO410mmol/L，KH2PO42mmol/L，下同），轻轻混合，再经1500rpm离心10min，吸管移去上清和沉淀红细胞上层的白细胞薄膜。洗涤过程重复2次后，加入5mLPBS缓冲液（pH7.2）轻轻混合红细胞，4℃保存备用，5天内使用。
（3）20%豚鼠红细胞液：取步骤（2）处理后得到的红细胞，在锥形刻度离心管中1500rpm离心10分钟，弃去清，观察离心管中红细胞体积，加入4倍体积的PBS缓冲液（pH7.2），混合均匀，得到20%豚鼠红细胞液。
(4)10%豚鼠红细胞液：取步骤（2）处理后得到的红细胞，在锥形刻度离心管中1500rpm离心10分钟，弃去清，观察离心管中红细胞体积，加入9倍体积的PBS缓冲液（pH7.2），混合均匀，得到10%豚鼠红细胞液。
(5)1%豚鼠红细胞液：取10%豚鼠红细胞液1mL，加入9mLPBS缓冲液（pH7.2），混合均匀，得到1%豚鼠红细胞液。
2.VP2蛋白血凝性鉴定和血凝（HA）效价测定
取实施例1标题二中步骤2制备的BL-21-VP2裂解液上清液和沉淀，来验证本发明方法制备的VP2蛋白的血凝性。将BL-21-VP2裂解液沉淀采用上清等体积的PBS缓冲液（pH7.2）重悬，得到VP2蛋白包涵体重悬液。
96孔V型血凝反应板每行孔检测不同的样品，分别编号为PBS空白对照、PPV阳性对照、对照菌BL-21-p阴性对照、样品孔1（VP2蛋白包涵体重悬液）和样品孔2（BL-21-VP2裂解液上清液）。每孔中先加入25μL的PBS缓冲液（pH7.2），然后在每排孔的第一个孔中加入样品，样品孔1中加入25μLVP2蛋白包涵体重悬液，样品孔2中加入25μLBL-21-VP2裂解液上清液，PBS空白对照中加入25μLPBS缓冲液（pH7.2），PPV阳性对照中加入25μL血凝价为29的PPV-JS株病毒抗原液（采用ST细胞扩增PPV-JS株病毒抗原获得），对照菌BL-21-p阴性对照中加入25μL对照菌BL-21-p全菌诱导前超声裂解液。对各样品分别进行2倍倍比稀释，然后在每孔中加入25μL的PBS缓冲液（pH7.2），最后在每孔中加入1%豚鼠红细胞液25μL，在37℃作用2h后，观察结果。
结果如图4，BL-21-VP2表达的可溶性VP2蛋白具有血凝性，血凝效价高达29，与PPV-JS株病毒抗原液的血凝价相似；VP2蛋白包涵体的血凝效价（HA）较低，仅仅只有25。
实施例3VP2蛋白制备方法条件优化
1.重组菌BL-21-VP2诱导前的最适菌浓度优化
（1）将BL-21-VP2菌液按体积比为1:100接种至含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中。
（2）在37℃、200rpm条件下培养2~3h，选择OD600(菌体细胞密度)为0.4、0.5和0.6时的菌液，分别加入终浓度为0.1mM的IPTG，然后在37℃、200rpm条件下振荡培养4小时，进行诱导表达。
（3）培养结束后，取5ml菌液超声，12000rpm离心，取裂解液上清，按照实施例2中方法检测血凝效价，以判断可溶性VP2蛋白的表达量。
结果如图5所示，OD600为0.4、0.5和0.6时诱导后，菌体裂解液上清的血凝效价分别达到29、210和211。即在菌体浓度OD600=0.6时进行诱导，VP2蛋白原核表达的血凝效价最高，达到211。
实施例4VP2蛋白制作4单位抗原应用于血凝抑制试验（HI）
1.原核表达的VP2蛋白制作4单位抗原
取血凝效价是29的PPV-JS株病毒液（采用ST细胞扩增获得）采用PBS缓冲液（pH7.2）稀释成4倍抗原，即将PPV-JS株病毒液进行2倍倍比稀释，直至稀释液的血凝效价为22，得到PPV-JS的4单位抗原。将实施例3中血凝效价为29的BL-21-VP2裂解液上清进行2倍倍比稀释，取血凝效价为22的稀释液作为BL-21-VP2的4单位抗原。
2.猪PPV阴性血清、阳性血清处理
取200μL猪PPV阴性血清和PPV疫苗免疫过后的阳性血清分别进行如下处理：将血清在56℃水浴锅中灭活处理30min，加入400μL、25%（质量百分浓度）白陶土悬液，混匀后室温放置30min，4000rpm离心10min，取上清液，加入200μL、20%豚鼠红细胞液，振荡混匀后在37℃作用1h；4000rpm离心10min，吸取上清，作为1：4稀释的血清样品。
3.血凝抑制试验
分别采用BL-21-VP2、PPV-JS的4单位抗原来检测处理后的猪PPV阳性血清的HI抗体效价,以考察BL-21-VP2表达的VP2蛋白的抗原性。同时设对照菌BL-21-p阴性对照（对照菌BL-21-p全菌诱导前超声裂解液）。
在标准96孔v型血凝反应板各孔中都加入25μL的PBS缓冲液（pH7.2），每行孔检测不同的样品，分别编号为BL-21-VP2抗原孔、PPV-JS抗原孔和对照菌BL-21-p阴性对照。每行中第1孔中加入25μL处理后的待检血清，混匀，取出25μL加至第2孔，依此类推对处理后的待检血清进行2倍倍比稀释，直到第12孔，弃25μL。BL-21-VP2抗原孔中，每孔加入BL-21-VP2的4单位抗原25μL；PPV-JS抗原孔中，每孔加入PPV-JS的4单位抗原25μL；对照菌BL-21-p阴性对照中，每孔加入对照菌BL-21-p全菌诱导前超声裂解液。37℃作用1h，每孔加入1%豚鼠红细胞液25μL，振荡混匀，置37℃作用2h，观察结果。
结果如图6，可见以PPV-JS或BL-21-VP2的4单位抗原检测到的待检血清的HI抗体效价大小相同，均为27，显示本发明制备的VP2蛋白与PPV-JS株病毒具有相同抗原性，抗原表位与原病毒相似，这是现有技术中原核表达的VP2蛋白所不具备特性，因此本发明制备的VP2蛋白具有应用于疫苗的前景。上述结果说明，本发明制备的VP2蛋白不仅与PPV-JS株病毒具有相同的凝集豚鼠红细胞血凝性，且均能与血清中PPV特异性抗体发生反应，抑制红细胞凝集。
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<210>2
<211>28
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>引物PPV-VP2-kpni
<400>2
ggtaccatgagtgaaaatgtggaacaag28
<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>PPV-VP2-bamhi
<400>3
ggatccctagtataattttcttggtat27

Claims (8)

1.表达猪细小病毒VP2蛋白的重组载体，其特征在于将猪细小病毒VP2蛋白编码基因***原核表达载体pEASY-bluntE1后得到。
2.根据权利要求1所述表达猪细小病毒VP2蛋白的重组载体，其特征在于所述猪细小病毒VP2蛋白编码基因来源于猪细小病毒PPV-JS株。
3.表达猪细小病毒VP2蛋白的重组菌，是将权利要求1-2之一所述重组载体导入大肠杆菌后获得。
4.根据权利要求3所述表达猪细小病毒VP2蛋白的重组菌，其特征在于所述大肠杆菌为BL-21。
5.权利要求3-4之一所述重组菌在制备猪细小病毒VP2蛋白方面的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于包括诱导所述重组菌表达猪细小病毒VP2蛋白的步骤。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于在重组菌培养物OD600达到0.4-0.6时，采用IPTG诱导表达猪细小病毒VP2蛋白。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于IPTG添加至重组菌培养物中的终浓度为0.05-0.2mM。
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