CN105331546A - 一种富硒光滑假丝酵母菌株fxy-4及其培养方法和作为鱼饲料添加剂的应用 - Google Patents
一种富硒光滑假丝酵母菌株fxy-4及其培养方法和作为鱼饲料添加剂的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种富硒光滑假丝酵母菌株FXY-4及其培养方法和作为鱼饲料添加剂的应用，属于微生物技术领域。本发明是将泡菜汁样品稀释后涂布到YEPD培养基上培养，挑取出单菌落，然后用含Na2SeO3(终浓度为0.5g/L)的YEPD培养基进行富硒酵母菌筛选，再通过化学诱变方法获得，其分类命名为：光滑假丝酵母(Candida？glabrata)FXY-4，已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为：CCTCC？NO：M？2015664。本发明的光滑假丝酵母(Candida？glabrata)FXY-4具有显著增强免疫、促生长的功能，并通过动物试验验证其对水产动物生长和健康具有促进作用，可将其作为添加剂直接应用于鱼饲料中。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种富硒光滑假丝酵母菌株FXY-4及其培养方法和作为鱼饲料添加剂的应用。
背景技术
硒(Se)是动物体必需的微量元素，在维护动物健康方面发挥着重要作用，但过量的硒会对机体产生毒害作用，因此硒在动物饲料中最适添加量的研究得到了广泛开展。鱼类饲料中硒的营养学研究表明，饲料中过高或过低的硒含量均会影响鱼类健康。水产集约化养殖过程中，一些致病菌，特别是肠道条件性致病菌，能迅速繁殖，进而引发相应的疾病。目前，主要是通过在饲料中添加抗生素的方法来控制和减弱应激。抗生素补给后可以抑制鱼肠道致病菌的生长繁殖、有利于有益菌的生长，从而维持肠道的正常微生物群落结构。然而，抗生素在饲料中的大量使用存在着严重的弊端，比如抗生素引起内源性感染和二重感染、耐药菌株的产生、免疫力下降和水产品及环境中残留等。益生菌具有安全、无污染、具有免疫增强功能等优点，成为抗生素替代品的首选，而酵母更是益生菌中使用最广泛的一种微生态制剂。
充分发挥富硒酵母增强免疫和促进生长的活性，筛选得到富硒能力强的酵母，对水产养殖业具有重要的现实意义。本专利筛选具有增强免疫和抗应激功能的富硒能力强的光滑假丝酵母菌株；同时，饲料中添加该菌株后，可以降低抗生素在饲料中的添加量，从而有效降低饲料生产成本。目前，高产富硒光滑假丝酵母在水产养殖饲料中的应用尚未有报道。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种富硒光滑假丝酵母，然后通过化学诱变方法，获得了1株高产富硒酵母FXY-4。通过鉴定，该菌株不仅具有光滑假丝酵母(Candidaglabrata)的生理生化特性，且同时具备高富硒能力和益生属性。
本发明另一目的在于提供了上述所述光滑假丝酵母(Candidaglabrata)FXY-4的培养方法。
本发明的还一目的在于提供了上述所述富硒光滑假丝酵母(Candidaglabrata)FXY-4作为鱼饲料添加剂的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术方案：一种富硒光滑假丝酵母FXY-4，其获得方式如下：
将泡菜汁样品稀释后涂布到YEPD(10g酵母粉，20g蛋白胨，20g葡萄糖，1L水，pH6.0)培养基的平板上，28℃下培养，每隔一段时间观察菌落生长状态，并挑取单菌落转接到YEPD斜面上保存，然后用含Na2SeO3(终浓度为0.5g/L)的YEPD培养基中进行富硒酵母菌的筛选，随后将初筛得到的酵母菌用YEPD培养基进行培养，每株菌分为空白组和实验组进行培养，在实验组中加入Na2SeO3(终浓度为0.5g/L)，空白组中不加入，培养24h后，采用国家标准方法(GB5009.93-2010)—原子荧光光度计法测定硒元素含量，获得1株富硒能力最强的酵母原始菌株，经化学诱变后与生理生化鉴定后确定其分类命名为：光滑假丝酵母(Candidaglabrata)FXY-4，该细菌已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，其保藏编号为：CCTCCNO：M2015664，保藏日期为2015年11月6日。
本发明另一目的在于提供了上述所述富硒光滑假丝酵母(Candidaglabrata)FXY-4的培养方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将光滑假丝酵母(Candidaglabrata)FXY-4在摇瓶中进行发酵培养，发酵温度为28～30℃，pH值为6.0～6.8，转速为180～200r/min，发酵时间为24～32h，摇瓶发酵培养基为YEPD液体培养基：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母粉1％；
(2)摇瓶发酵结束后在发酵罐中进行中试发酵，取摇瓶发酵种子液接种到10L发酵罐中，接种量为6～8％，发酵罐中装4～7L的培养基，发酵温度为28～30℃，pH值为6.3～6.8，搅拌速度为300r/min，发酵28～32h，通气比为1:1，发酵结束后将发酵培养液置于4℃备用，其中，发酵培养基为：乳糖15g、蛋白胨20g、酵母粉10g、硝酸钾2g、Na2SeO30.5g、去离子水1000ml，pH6.5～6.8。
一种富硒光滑假丝酵母FXY-4作为鱼饲料添加剂的应用，其应用方法为：将本发明的富硒光滑假丝酵母(Candidaglabrata)FXY-4发酵液直接在商业鱼饲料中添加，添加量为5×106～1010CFU/Kg鱼饲料。
所述鱼类可以为鲤鱼、罗非鱼、边鱼、武昌鱼等。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明的光滑假丝酵母(Candidaglabrata)FXY-4具有显著增强免疫、促生长的功能，并通过动物试验验证其对水产动物生长和健康具有促进作用，从而节省养殖成本，提高经济效益，具有良好的应用前景；
2、本发明的光滑假丝酵母(Candidaglabrata)FXY-4能在生长繁殖过程中富硒，从而在饲料中实现有机硒的补给；
3、本发明的光滑假丝酵母(Candidaglabrata)FXY-4添加到饲料中后，可以增加水产品中的有机硒含量，增加其附加值，节省有机硒在饲料中的添加量，从而有效降低饲料生产成本。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围，如未特别说明，本发明所用方法为常规技术，所用试剂均购自生化商店。
实施例1：
光滑假丝酵母FXY-4，其获得方式如下：
原始菌株的分离：
将泡菜汁样品稀释后涂布到YEPD培养基的平板上，28℃下培养，每隔一段时间观察菌落生长状态，并挑取单菌落转接到YEPD斜面上保存，经过初筛筛选到如下酵母菌株：FXY-1、FXY-3、FXY-4、FXY-5、FXY-7、FXY-10、FXY-11、FXY-19、FXY-21、FXY-23、FXY-24、FXY-25、FXY-38、FXY-42、FXY-43、FXY-44、FXY-46、FXY-47、FXY-49、FXY-50、FXY-53、FXY-55、FXY-56。
在含Na2SeO3(终浓度为0.5g/L)的YEPD培养基中进行富硒酵母菌的筛选，随后将初筛得到的酵母菌用YEPD培养基进行培养，每株菌分为空白组和实验组进行培养，在实验组中加入Na2SeO3(终浓度为0.5g/L)，空白组中不加入，培养24h后，采用国家标准方法(GB5009.93-2010)——原子荧光光度计法测定硒元素含量，获得1株富硒能力最强的酵母原始菌株。接着将此菌株接种到YEPD培养基中，摇瓶180转/min，30℃培养到对数生长期，取菌液5mL离心并用pH值为7.0的磷酸缓冲液(PBS)洗两次，再用PBS稀释到浓度约为1010个/mL，转入10mL离心管中，加入0.8％的硫酸二乙酯(DES)溶液，30℃诱变处理20min，再按照2.5倍DES溶液体积加入25％硫代硫酸钠溶液终止反应，将诱变后的菌液取200μL涂布在含Na2SeO3(终浓度为0.5g/L)的YEPD平板上，30℃培养48h后挑取单菌落，获得一批诱变菌株，最后采用原子荧光光度计法测定每株诱变酵母菌的硒含量，得到1株富硒能力最强的诱变酵母菌株，经过18SITSRNA序列测定与生理生化鉴定后被命名为富硒光滑假丝酵母(Candidaglabrata)FXY-4，该细菌已于2015年11月6日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：光滑假丝酵母(Candidaglabrata)FXY-4；保藏编号：CCTCCNO：M2015664；地址：中国武汉武汉大学。
实施例2
酵母菌株FXY-4(保藏编号：CCTCCNO：M2015664)18SITSrRNA基因序列分析：
(1)染色体DNA(小量)的提取：
1.取1.5mL菌液于1.5mLEppendorf管中，12000r/min离心5min；
2.弃上清，900μL磷酸缓冲液(PBS)重悬沉淀，4℃12000r/min离心5min；
3.弃上清，加入300TE和200μL10mg/mL溶菌酶，吹吸混匀，37℃温育1h，每隔15min颠倒混匀一次；
4.向沉淀加入600TENS裂解液(200mmol/LNaCl，100mmol/LTril-HClpH8.0，2.0％SDS，50mmol/LEDTA，0.5％TritonX-100)和20mg/mL蛋白酶K10μL，颠倒混匀，55℃温育1h，每隔15min颠倒混匀一次；
5.4℃12000r/min离心5min，取上清；
6.向上清中加入等体积的P︰C︰I(25︰24︰1)充分混匀，4℃12000r/min离心10min；
7.重复步骤6；
8.将上清转入新的EP管中，加入1/10体积的3mol/L醋酸钠，2倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃下放置60min，4℃12000r/min离心10min；
9.弃上清，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体后风干，加入30μL无菌水和10mg/mLRNaseA0.5μL，-20℃保存。
1.218SITSrRNA基因序列的PCR扩增
(2)PCR扩增
以刚提取并检测合格的染色体DNA为模板，利用由上海英骏生物公司合成的引物(上游引物ITS1，5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；下游引物ITS4，5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')进行ITSrRNA基因序列的PCR扩增，PCR扩增体系见表1。
表1PCR扩增引物
| 试剂 | 用量(μL) |
| premix Taq酶 | 25 |
| 上游引物(20μmol/L) | 1 |
| 下游引物(20μmol/L) | 1 |
| 模板DNA(200ng/μL) | 1 |
| 去离子水 | 22 |
| 总体积 | 50 |
PCR扩增条件：
(3)18SITSrRNA基因PCR产物的纯化
(参照OmegaBio-tek公司PCR产物纯化试剂盒说明书)
1.将PCR的产物从琼脂糖胶上相应的位置切下回收至Eppendorf管中，加人Bindingbuffer(1g/mL)，在65℃水浴7min直到完全溶解；
2.将溶液转移至吸附柱中，10000r/min离心1min，弃去收集管中废液；
3.加入300μL的Bindingbuffer，10000r/min离心1min，弃收集管中废液；
4.加入700μL的SPWbuffer，室温下放置2～3min，10000r/min离心1min，弃去收集管中废液。重复一次；
5.10000r/min空柱离心2min，弃去收集管中废液；
6.将吸附柱放入一个干净的Eppendorf管中，加入30-50μL的Elutionbuffer，12000r/min离心2min收集产物。
(4)18SITSrRNA基因的测序
18SITSrRNA基因序列测定由上海英骏公司完成，测序结果见序列表中的序列1。
(5)18SITSrRNA基因序列相似度分析
将测序后的18SITSrRNA基因序列通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/网页中的比对程序进行同源性分析。
通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/网页中的比对程序进行同源性分析，得出同源性排名前十的菌种如下表2，由此可知，该菌种属于假丝酵母属，我们将其命名为FXY-4。
酵母FXY-418SITSrRNA基因序列的长度为1140bp，具体测序结果见序列表中的序列1。
表2同源性比对分析
实施例3
酵母FXY4(保藏编号：CCTCCNO：M2015664)，BioMérieuxVITEK2自动鉴定分析
挑取待测菌株菌苔接种于YEPD平板上，30℃培养至对数生长期，用灭菌棉签蘸取试剂盒中Vitek液体后将平板上菌苔刮下，再溶入1.8mlVitek液体中，振荡混匀；使用浊度仪调浊度至指定范围(2MacF)；再用移液枪将菌悬液加入Vitek鉴定板中，菌液搞好装满鉴定孔；然后30℃培养24～48h时取出鉴定板，用BioMérieuxVITEK2自动鉴定分析仪对鉴定板进行数据读取和分析，结果见表3，此生理生化结果与光滑假丝酵母(Candidaglabrata)典型生理生化反应相同。
表3：酵母FXY-4其生理生化特性如下：
注：-表示显阴性，+表示显阳性。
实施例4
本发明的光滑假丝酵母(Candidaglabrata)FXY-4(保藏编号：CCTCCNO：M2015664)的培养方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将2ml浓度为108～1010CFU/ml的活菌接种于100ml培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵温度为30℃，pH值为6.8，转速为200r/min，发酵时间为24h，摇瓶发酵培养基为YEPD液体培养基：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母粉1％；
(2)摇瓶发酵结束后进行发酵罐中试试验，取100ml摇瓶发酵种子液(种子液的浓度为108CFU/ml)接种到10L发酵罐中，装液量5L，发酵温度为30℃，pH值为6.8，搅拌速度为300r/min，发酵24h，通气比为1:1，其中，发酵培养基为：乳糖15g、蛋白胨20g、酵母粉10g、硝酸钾2g、Na2SeO30.5g、去离子水1000ml，pH6.5～6.8，发酵结束后将发酵培养液置于4℃备用。
实施例5
本发明的一株光滑假丝酵母(Candidaglabrata)FXY-4富硒能力分析，具体包含如下步骤：
(1)在每瓶YEPD液体培养基中加10mL硒标液(5‰)，空白组不加硒，每个摇瓶中都加入一环活化后的菌种FXY-4，全部的摇瓶在30℃、180r/min环境下培养36h，将长好的菌体加入离心管中，在5000r/min下离心5min，离心后倒掉上清液，再加入去离子水洗涤菌体，震荡摇匀后再离心，一共重复上述操作5次，将菌体清洗干净，将洗涤好后的菌体放入烘箱中烘干；
(2)称取烘干后的菌体0.5g(精确至0.1mg)，放入100ml烧杯中，加10mLHNO3浸泡过夜，再加入2mLHCIO4，同时作空白对照，摇匀，于电热板上低温加热消化至白烟冒尽，如果消解液为黑色或酱褐色，则补加HNO3继续消化至黑色或酱褐色消失且溶液呈淡黄色，剩余约1mL溶液时，加入5mL6moI/LHCI，加热微沸5～10min，冷却，洗入25mL容量瓶中，用6mol/LHCI稀释至刻度。采用国家标准方法(GB5009.93-2010)—原子荧光光度计法测定硒元素含量，测得菌体FXY-4硒含量为5.04mg/g。
实施例6
一种富硒光滑假丝酵母(Candidaglabrata)FXY-4作为鱼饲料添加剂的应用，其应用过程如下：
试验采用400条体重接近，健康的罗非鱼(约2.00g/条)、锦鲤(约1.80g/条)做为实验动物，随机分成4个处理组，每个处理4个重复，每个重复25条。处理1为对照组，商业饲料，不含任何药物添加剂；处理2为抗生素组，在商业饲料中添加一定量抗生素；处理3为低量添加富硒光滑假丝酵母FXY-4组，在商业饲料中补给本发明中的富硒光滑假丝酵母FXY-4(饲料中终浓度5×108CFU/Kg)；处理4为高量添加富硒光滑假丝酵母FXY-4组，在商业饲料中补给本发明中的富硒光滑假丝酵母FXY-4(饲料中终浓度5×1010CFU/Kg)，日投食量按照体重的3％，每天投食2次，喂食30天后，测定锦鲤生长与免疫指标，由试验结果可知，添加富硒光滑假丝酵母均能显著提高锦鲤生长与免疫学指标。
表4富硒光滑假丝酵母(Candidaglabrata)FXY-4对罗非鱼生长的影响
| 项目 | 对照组 | 抗生素组 | 低量添加酵母 | 高量添加酵母 |
| 初始平均体重//g | 2.00±0.02 | 2.01±0.01 | 2.03±0.03 | 2.02±0.01 |
| 终末平均体重//g | 28.70±1.62 | 29.90±1.88 | 33.77±2.13 | 35.15±2.36 |
表5富硒光滑假丝酵母(Candidaglabrata)FXY-4对锦鲤免疫***的影响
表6富硒光滑假丝酵母(Candidaglabrata)FXY-4对锦鲤生长的影响
| 项目 | 对照组 | 抗生素组 | 低量添加酵母 | 高量添加酵母 |
| 初始平均体重//g | 1.81±0.02 | 1.80±0.01 | 1.83±0.02 | 1.78±0.01 |
| 终末平均体重//g | 27.70±1.62 | 28.10±1.77 | 32.63±2.27 | 33.20±2.45 |
表7富硒光滑假丝酵母(Candidaglabrata)FXY-4对锦鲤免疫***的影响
实施例7
喂食富硒酵母FXY-4后，对鱼肉中硒含量的影响
称取实施例4中两种鱼(罗非鱼、锦鲤)2.0g(精确至0.1mg)，放入100ml烧杯中，加10mLHNO3浸泡过夜，再加入2mLHCIO4，同时作空白对照，摇匀，于电热板上低温加热消化至白烟冒尽，如果消解液为黑色或酱褐色，则补加HNO3继续消化至黑色或酱褐色消失且溶液呈淡黄色，剩余约1mL溶液时，加入5mL6moI/LHCI，加热微沸5～10min，冷却，洗入25mL容量瓶中，用6mol/LHCI稀释至刻度。国家标准方法(GB5009.93-2010)—原子荧光光度计法测定硒元素含量，测得罗非鱼、锦鲤鱼肉中硒含量较对照组分别增加了1.99mg/kg、2.23mg/kg，达到富硒食品硒含量大于0.2mg/kg的标准。
Claims (3)
1.一种富硒光滑假丝酵母(Candidaglabrata)FXY-4，其特征在于，其保藏编号为CCTCCNO：M2015664。
2.一种权利要求1所述的富硒光滑假丝酵母(Candidaglabrata)FXY-4的培养方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)将光滑假丝酵母(Candidaglabrata)FXY-4在摇瓶中进行发酵培养，发酵温度为28～30℃，pH值为6.0～6.8，转速为180～200r/min，发酵时间为24～32h，摇瓶发酵培养基为YEPD液体培养基：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母粉1％；
(2)摇瓶发酵结束后在发酵罐中进行中试发酵，取摇瓶发酵种子液接种到10L发酵罐中，接种量为6～8％，发酵罐中装4～7L的培养基，发酵温度为28～30℃，pH值为6.3～6.8，搅拌速度为300r/min，发酵28～32h，通气比为1:1，发酵结束后将发酵培养液置于4℃备用，其中，发酵培养基为：乳糖15g、蛋白胨20g、酵母粉10g、硝酸钾2g、Na2SeO30.5g、去离子水1000ml，pH6.5～6.8。
3.权利要求1所述的一种富硒光滑假丝酵母(Candidaglabrata)FXY-4作为鱼饲料添加剂的应用，其特征在于，将所述富硒光滑假丝酵母(Candidaglabrata)FXY-4发酵液直接添加在商业鱼饲料中，添加量为5×106～1010CFU/Kg鱼饲料。
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| CN106906206A (zh) * | 2017-04-26 | 2017-06-30 | 中国科学院合肥物质科学研究院 | 一种富硒酵母、制备方法及应用 |
| CN110241034A (zh) * | 2019-07-15 | 2019-09-17 | 宜春学院 | 一株葡萄汉逊酵母及应用 |
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