CN105327338B

CN105327338B - 一种治疗溃疡性结肠炎的药物及其制备方法

Info

Publication number: CN105327338B
Application number: CN201510810779.8A
Authority: CN
Inventors: 霍贵成; 徐敏; 王松
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2015-11-23
Filing date: 2015-11-23
Publication date: 2018-11-23
Anticipated expiration: 2035-11-23
Also published as: CN105327338A

Abstract

本发明公开了一种治疗溃疡性结肠炎的药物及其制备方法，其中，治疗溃疡性结肠炎的药物即牛初乳生长因子与益生菌联合使用。本发明以Balb/c小鼠为试验对象，建立溃疡性结肠炎模型，从试验小鼠的表观状态、体重变化、结肠长度、病理学状况等角度出发，研究本发明药物的抗溃疡性结肠炎作用；试验结果表明，本发明药物不仅具有良好的抗溃疡性结肠炎作用，而且短期内不会出现复发的症状，能够很好的修复溃疡性结肠炎肠黏膜损伤，可广泛应用于基础医学领域。

Description

一种治疗溃疡性结肠炎的药物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种治疗溃疡性结肠炎的药物及其制备方法，即三株益生菌与牛初乳生长因子联合使用的药物，属于医药技术领域。

背景技术

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是炎症性肠病(inflammatory boweldisease，IBD)的一个主要类型，是一种原因不明的慢性非特异性肠道炎症。资料显示，每年美国UC患病率为200/10万人，治疗UC的花费在1至1.5亿美元左右，截止到2012年，UC患者总数是2000年的2.5倍，且复发率达72％；近年来我国UC的患病人数呈明显上升趋势。

溃疡性结肠炎病变主要位于结肠粘膜和粘膜下层；临床表现为腹泻，黏液脓血便，腹痛，里急后重等，多呈反复发作的慢性病程。溃疡性结肠炎的发生已经严重影响到患者的身体健康和生活质量，被世界卫生组织列为现代难治病之一。溃疡性结肠炎的病因与发病机制尚不十分清楚。多认为UC的病因可能与环境因素、遗传因素、免疫因素等有关；其中，遗传及免疫因素在UC致病中起着至关重要的作用。UC发病机制虽还未完全阐明，但可以肯定肠黏膜屏障功能失调参与了UC的发生。肠黏膜屏障主要包括机械屏障、免疫屏障及生物屏障。机械屏障由肠上皮细胞、肠黏液组成；免疫屏障(即肠道免疫防御***)，主要由分泌性免疫球蛋白和肠相关淋巴组织构成；生物屏障由肠道正常菌群构成。肠道上皮屏障破坏，黏膜通透性增加，肠组织长期暴露于大量抗原中，导致肠道免疫***过度反应和错误识别，引起巨噬细胞和淋巴细胞的激活，释放一系列细胞因子和炎症介质，激活机体的免疫应答，炎症反应逐级放大，最终导致组织损伤，出现UC的病理改变和临床表现。

目前治疗溃疡性结肠炎的方法主要包括药物治疗、营养治疗、心理治疗及手术治疗，其中药物治疗是最主要的方法。在临床上用于治疗UC的药物主要有氨基水杨酸类药物、肾上腺糖皮质激素类和免疫抑制剂类等。氨基水杨酸类药物能很好的抑制***素合成，清除氧自由基从而减轻炎症反应；然而其无法根治UC，且患者服药剂量偏大时，易产生诸多不良反应(如：头疼、恶心、白细胞下降等)。糖皮质激素是重度或爆发性UC患者的首选药；然而该类药物易导致机体代谢紊乱、水潴留等副作用，可作为应急药物，无法长期使用。免疫抑制类药物药物依赖性大，治疗期较长，且可能致毒致癌，副作用较大，所以一般只作为辅助治疗使用。总体来说，上述药物治疗见效快、疗效好，可缓解UC患者燃眉之苦，但仍存在很多问题。首先，无法根治患者UC，治标不治本；其次，不良作用大，易引起患者头疼、恶心，造成机体消化***、血液***异常；然后，潜在的致毒致癌性；最后，抗生素类药物(如应用最广的SASP)易导致机体耐药抗药性。

牛初乳生长因子可通过与肠黏膜细胞酪氨酸激酶受体结合，从而促使肠黏膜细胞生长和增殖，增加肠绒毛高度，促进肠道发育；并可通过调控炎性因子水平来促进机体免疫力。益生菌可通过与有害菌竞争位点来调节肠道菌群平衡，而且植物乳杆菌可产生细菌素，抑制有害菌的增殖；嗜酸乳杆菌具有很好的益生作用。因此，我们假设牛初乳生长因子联合益生菌具有很好的抗溃疡性结肠炎用途。因此，开发一种高效、安全且副作用较小的安全的治疗UC的药物，具有十分重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种治疗溃疡性结肠炎的药物，可以有效的治疗溃疡性结肠炎，并且毒副作用较小，不易产生抗性。

本发明的另一个目的是提供一种治疗溃疡性结肠炎的药物的制备方法。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种治疗溃疡性结肠炎的药物，包括132～198体积份益生菌和432～684质量份牛初乳生长因子，其中体积份/质量份＝ml/mg。

优选地，上述治疗溃疡性结肠炎的药物，包括165体积份益生菌和540质量份牛初乳生长因子。所述的牛初乳生长因子为从牛初乳中提取的生长因子粗提物。所述的益生菌为嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和瑞士乳杆菌；且均为活菌菌体形式。所述的益生菌活菌菌体是由均处于稳定初期的乳杆菌液体培养物分别离心收集的菌泥。

优选地，所述的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和瑞士乳杆菌的数量比为1∶1∶1。

上述治疗溃疡性结肠炎的药物中，所述益生菌用量为1.5×10¹⁰CFU/kg，所述的牛初乳生长因子用量为216～342mg/kg。即每千克的动物、人体等所用的药物中嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和瑞士乳杆菌的总数量为1.5×10¹⁰CFU，牛初乳生长因子用量为216～342mg，具体地，可以根据实际情况进行计算，比如，一个重量为20g的大鼠，其用药中含有嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和瑞士乳杆菌的总数量为3×10⁸CFU，牛初乳生长因子用量为4.32～6.84mg；一个重量为50kg的人，其用药中嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和瑞士乳杆菌的总数量为7.5×10¹¹CFU，牛初乳生长因子用量为10.8～17.1g。

前述治疗溃疡性结肠炎的药物的制备方法，包括如下步骤：

(1)分别将嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和瑞士乳杆菌在MRS培养基培养；

(2)分别选取培养14～18h的瑞士乳杆菌、培养12～16h的嗜酸乳杆菌和培养12～16h的植物乳杆菌；

(3)分别取步骤(2)得到的瑞士乳杆菌菌液77～115体积份，嗜酸乳杆菌菌液40～60体积份，植物乳杆菌菌液15～23体积份，离心取菌泥，然后分别将它们溶于10体积份无菌PBS中，得混合菌泥；

(4)对牛初乳离心脱脂、酸沉酪蛋白、二次超滤、透析及冷冻干燥制得牛初乳生长因子粗提物；

(5)将牛初乳生长因子粗提物432～684质量份加入到上述混合菌泥中，搅拌均匀，然后加入合适的辅料制成临床可接受的剂型。

优选地，治疗溃疡性结肠炎的药物的制备方法，包括如下步骤：

(2)选取对数期末稳定期初的益生菌，即分别选取培养16h的瑞士乳杆菌、培养14h的嗜酸乳杆菌和培养14h的植物乳杆菌；

(3)分别取步骤(2)得到的瑞士乳杆菌菌液96体积份，嗜酸乳杆菌菌液50体积份，植物乳杆菌菌液19体积份，离心取菌泥，然后分别将它们溶于10体积份无菌PBS中，得混合菌泥；

(5)将牛初乳生长因子粗提物540质量份加入到上述混合菌泥中，搅拌均匀，然后加入合适的辅料制成临床可接受的剂型。

本发明的有益效果：

本发明以益生菌与牛初乳生长因子粗提取物制成的药物具有较好的抗溃疡性结肠炎作用。具体表现在显著改善溃疡性结肠炎小鼠的表观状态，增加溃疡性结肠炎小鼠的体重、结肠长度，并显著提高小鼠结肠组织的完整性。

附图说明

图1为嗜酸乳杆菌镜检图片(100倍)；

图2为嗜酸乳杆菌菌落图；

图3为瑞士乳杆菌镜检图片(100倍)；

图4为瑞士乳杆菌菌落图；

图5为植物乳杆菌镜检图片(100倍)；

图6为植物乳杆菌菌落图；

图7为三株乳酸杆菌生长曲线；

图8为肠炎组小鼠表观状态；

图9为肠炎组小鼠表观状态特写；

图10为肠炎组小鼠解剖图；

图11为肠炎组小鼠结肠长度代表图；

图12为完全空白组小鼠结肠长度代表图；

图13为肠炎组小鼠HE染色图；

图14为试验方案设计图；

图15为联合组小鼠表观状态图；

图16为联合组小鼠解剖图；

图17为后续观察联合组小鼠表观状态；

图18为抗生素组小鼠表观状态；

图19为抗生素组小鼠解剖图；

图20为后续观察抗生素组小鼠表观状态；

图21为完全空白组小鼠表观状态；

图22为空白组小鼠解剖图；

图23为后续观察空白组小鼠表观状态；

图24为联合组小鼠结肠长度代表图；

图25为抗生素组小鼠结肠长度代表图；

图26为完全空白组小鼠结肠长度代表图；

图27为联合组小鼠HE染色图；

图28为抗生素组小鼠HE染色图；

图29为完全空白组小鼠HE染色图；

图30为联合组小鼠后续观察HE染色图；

图31为抗生素组小鼠后续观察HE染色图；

图32为完全空白组小鼠后续观察HE染色图。

具体实施方式

本发明人针对当今全球医药领域对溃疡性结肠炎的治疗都感到棘手的情况下，依据益生菌及生长因子可以增强机体免疫力，对人体肠道病(如腹泻等)有很好的治疗效果，故将三株益生效果较好的乳杆菌活菌菌体与牛初乳生长因子粗提物联合制成药物，用于动物试验研究，以下是对本发明的详细描述。

实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。本发明所采用的各种材料、试剂或用具如无特殊说明，均可以从市场中获得。

为了证明本发明的有效性，申请人进行了如下试验。

(一)材料与试剂

1、培养基：MRS培养基。

MRS培养基配制：蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖20g/L，无水乙酸钠5g/L，柠檬酸氢二胺2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，吐温-80 1ml/L，pH6.3+0.1，121℃、15分钟灭菌。

2、主要试剂：牛初乳来自黑龙江完达山松北牧场；葡聚糖硫酸钠盐来自北京毕特博生物技术有限责任公司公司；柳氮磺胺吡啶片来自上海信谊天平药业有限公司；甲醛溶液来自天津博迪化工股份有限公司；磷酸二氢钾来自天津东丽区天大化学仪器厂；磷酸氢二钠来自天津市巴斯夫化工有限公司。

3、主要仪器：电子显微镜来自Motic公司；紫外可见分光光度计来自DU800美国BECKMAN公司；眼科解剖盒来自沈阳市久鸣铝制品厂；注射器来自江苏治宇医疗器械有限公司。

(二)灌胃益生菌的准备

1、三株益生菌菌落形态观察

将保存的嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌和植物乳杆菌分别取出，反复活化2代于固体培养基上进行三区画线，37℃培养24h左右，进行革兰氏染色和油镜观察。

嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌和植物乳杆菌的镜检图片分别见见图1、图3和图5，其菌落形态分别见图2、图4和图6，三株益生菌菌体形态和镜检结果与伯杰氏细菌鉴定手册上的描述基本一致，为典型的嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌和植物乳杆菌。

2、益生菌灌胃时间的选取

从培养的固体培养基上挑取半个菌落，活化一代后，传进0h、1h、2h、3h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h、26h、28h、30h，共18个时间段的液体培养基，到达上述时间时，取出用紫外分光光度计，测定OD600，作生长曲线；以培养时间为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制3株乳酸杆菌的生长曲线，见图7。根据三株乳杆菌的生长曲线，可知瑞士乳杆菌、嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌进入稳定期的时间分别为16h、14h和14h。

由于对数期的益生菌活力最高，而稳定期的益生菌菌数达到最大，所以选取对数期末稳定期初的益生菌对溃疡性结肠炎小鼠进行治疗，即分别培养16h、14h和14h的瑞士乳杆菌、嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌。

3、灌胃菌数的测定

将瑞士乳杆菌、嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌分别培养至16h、14h和14h，进行了梯度平板计数，结果表明，瑞士乳杆菌、嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌到达稳定期初的菌数分别为1.25×10⁹CFU/mL、2.42×10⁹CFU/mL、6.3×10⁹CFU/mL。

研究得到，小鼠的灌胃量为3×10⁸CFU/20g(菌数/小鼠体重)时，具有很好的修复肠黏膜损伤作用；本实验小鼠平均体重以20g计算，按照1∶1∶1比例，瑞士乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌应分别为1×10⁸CFU，因此，取均稳定期出的瑞士乳杆菌菌液0.96mL，嗜酸乳杆菌菌液0.5mL，植物乳杆菌菌液0.19mL，离心取菌泥，然后分别重置于0.1mLPBS中，用于每只小鼠的益生菌灌胃剂量。

(三)牛初乳生长因子粗提物的制备

通过对牛初乳离心脱脂、酸沉酪蛋白、二次超滤、透析及冷冻干燥制得的牛初乳生长因子粗提物；本发明所指的离心、超滤、透析、干燥等处理方法，可使用本领域普通技术人员公知的任何方法，只要其能保持生长因子功效，优选的话，离心通过4℃离心，干燥采用冷冻干燥。

(四)治疗溃疡性结肠炎的药物的制备

牛初乳生长因子粗提物，灌胃剂量为5.4mg/20g(牛初乳生长因子粗提物质量/小鼠重量)；牛初乳生长因子粗提物的灌胃形式为，取出溶于0.1mL无菌PBS溶液中的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌菌泥小管、混合，然后加入所述剂量的牛初乳生长因子粗提物。

(五)抗生素组小鼠灌胃药物：抗生素的灌胃剂量为9.2mg/20g(柳氮硫胺吡啶粉质量/小鼠重量)；柳氮硫胺吡啶的灌胃形式为，取出溶于0.3mL无菌PBS溶液中，混合，然后4℃保存，以备灌胃。

下面结合动物实验对本发明的药物做进一步的研究，以说明本发明的有效性。

(一)溃疡性结肠炎小鼠模型的制作及试验设计

将葡聚糖硫酸钠(DSS)溶于水瓶中，让Balb/c小鼠自由饮用8天，以诱发试验性溃疡性结肠炎小鼠模型，然后以小鼠体重变化、表观状况、结肠长度、病理学等为指标，验证小鼠溃疡性结肠炎模型是否建立成功。

建模期间小鼠体重下降率为13.76％；且肠炎组小鼠表观状态不佳，具体表现在小鼠目光呆滞、毛发暗沉卷曲，有羌毛现象，见图8；并且，肠炎组小鼠尾根处有血斑，说明小鼠有显性便血现象，见图9；解剖后的肠炎组小鼠结肠处有溃烂现象，肠道组织有发脓、浊化现象，见图10；而且，建模期间，肠炎组小鼠结肠长度约为8.64cm，较于空白组小鼠结肠12.82cm，显著缩短，见图11、图12；并且，由HE染色图(见图13)可知，模型组小鼠结肠组织，肠黏膜萎缩，黏膜表面钝化，隐窝破坏。

综上所述，急性溃疡性结肠炎模型建立成功，可进行下一步药物治疗试验，本实验试验设计方案见图14。

(二)实验结论

(1)试验说明

治疗期间，仅对肠炎空白组小鼠进行PBS灌胃，不进行治疗，结果灌胃期间肠炎空白组小鼠死亡11只；一方面说明溃疡性结肠炎模型建立成功，另外一方面说明溃疡性结肠炎小鼠不能靠自我修复得以痊愈；所以，后续的对比，均为横向对比，即同组前后的对比，小鼠治疗后与治疗前的对比。

(2)本发明的药物明显改善小鼠表观状态

两个疗程的灌胃结束后，本发明药物组小鼠目光聚神、行动活跃，且小鼠毛发顺滑、亮白，见图15，与肠炎时的表观状态相比，差异极明显；而与完全空白组小鼠表观状态(图21)及抗生素组小鼠表观状态(图18)相比，差异不显著。从小鼠解剖图来看，本发明的药物明显改善了肠炎小鼠的结肠组织的溃烂、血斑现象，见图16；且本发明药物组小鼠与完全空白组小鼠(图22)、抗生素组小鼠结肠组织相比(图19)无显著差异。从后续观察图来看，与抗生素组小鼠表观状态(见图20)及完全空白组小鼠表观状态(23)相比，联合组小鼠表观状态正常，无不良反应，见图17，说明本发明的药物对治疗溃疡性结肠炎有很好的作用，且短期内无复发迹象。

(3)本发明的药物(联合组)增长小鼠结肠长度

表1治疗期间小鼠结肠长度变化表

联合组、抗生素组和完全空白组的小鼠结肠长度，分别见图24、图25、图26，并且由表1、图24、图25、图26可知，两个疗程后，本发明的药物(联合组)可显著增长小鼠的结肠组织，由建模后小鼠结肠组织的8.64cm，增长至12.93左右，并且与完全空白组相比差异不显著，而显著优于抗生素组，说明两个疗程的本发明药物治疗已将因溃疡性结肠炎导致的结肠组织萎缩恢复至正常水平，因此，从小鼠结肠长度角度来看，本发明的药物可明显增长小鼠结肠组织长度，增强肠道屏障作用。

(4)本发明的药物增大小鼠体重

表2治疗期间小鼠体重变化表

由表2可知，灌胃一疗程后，本发明的药物作用显著，表现在本发明药物组小鼠非但没有因为肠炎的原因体重下降而死亡，反而体重增长了11.02％，二个疗程结束后，本发明药物组小鼠相对于建模初期体重增长了25.42％，与抗生素疗法相比，差异不显著，说明利用本发明的药物与市面上传统的药物治疗溃疡性结肠炎的方法，无显著差异；后续观察2周的结果表明，本发明药物组小鼠体重持续增长，并未出现复发的迹象。而完全空白组小鼠两个疗程后体重增长率为11.01％，可能是由于此组小鼠并未进行建立模型处理，体重并未降低，处于正常水平，则小鼠体重增长空间较小；另外由于此组小鼠体重基数较大，则小鼠增长率也相对较小。因此，从体重角度来看，本发明的药物具有较好的抗溃疡性结肠炎用途，且短期内不具有复发的迹象。

(5)本发明的药物修复小鼠肠黏膜损伤

利用本发明的药物对小鼠进行两个疗程的治疗后，解剖小鼠，取其结肠组织，进行苏木素-伊红染色(HE染色)，肠炎组、本发明药物组(联合组)、抗生素组、完全空白组的病理图分别见图13、图27、图28、图29；两周的后续观察后，重复一样的处理，本发明药物组、完全空白组、抗生素组的病理图分别见图30、图31、图32。

由图可知，肠炎组小鼠，肠黏膜萎缩，黏膜表面钝化，隐窝破坏，基本处于肠黏膜屏障失衡状态；利用本发明的药物对小鼠进行两个疗程的治疗后，肠黏膜细胞排列基本整齐，肠黏膜结构完整，无组织坏死现象，说明本发明的药物可以很好的修复溃疡性结肠炎小鼠的肠黏膜损伤；并且与抗生素组、完全空白组小鼠相比，无显著差异；后续观察的病理图表明，本发明的药物在短期及长期内均具有很好的抗溃疡性结肠炎作用。

实施例1一种治疗溃疡性结肠炎的药物的制备方法，包括如下步骤：

(2)分别选取培养14h的瑞士乳杆菌、培养12h嗜酸乳杆菌和培养12h的植物乳杆菌；

(3)分别取步骤(2)得到的瑞士乳杆菌菌液77体积份，嗜酸乳杆菌菌液40体积份，植物乳杆菌菌液15体积份，离心取菌泥，然后分别将它们溶于10体积份无菌PBS中，得混合菌泥；

(5)将牛初乳生长因子粗提物432质量份加入到上述混合菌泥中，搅拌均匀，然后加入合适的辅料制成临床可接受的剂型。

实施例2一种治疗溃疡性结肠炎的药物的制备方法，包括如下步骤：

(2)分别选取培养18h的瑞士乳杆菌、培养16h嗜酸乳杆菌和培养16h的植物乳杆菌；

(3)分别取步骤(2)得到的瑞士乳杆菌菌液115体积份，嗜酸乳杆菌菌液60体积份，植物乳杆菌菌液23体积份，离心取菌泥，然后分别将它们溶于10体积份无菌PBS中，得混合菌泥；

(5)将牛初乳生长因子粗提物684质量份加入到上述混合菌泥中，搅拌均匀，然后加入合适的辅料制成临床可接受的剂型。

实施例3一种治疗溃疡性结肠炎的药物的制备方法，包括如下步骤：

(2)选取对数期末稳定期初的益生菌，即分别选取培养16h的瑞士乳杆菌、培养14h嗜酸乳杆菌和培养14h的植物乳杆菌；

(5)将牛初乳生长因子粗提物540质量份加入到上述混合菌泥中，搅拌均匀，然后加入合活的辅料制成临床可接受的剂型。

Claims

1.一种治疗溃疡性结肠炎的药物，其特征在于，包括1.32~1.98ml益生菌和4.32~6.84mg牛初乳生长因子；所述的益生菌为嗜酸乳杆菌KLDS20010、植物乳杆菌KLDS00170和瑞士乳杆菌KLDS10010；且均为活菌菌体形式。

2.根据权利要求1所述的治疗溃疡性结肠炎的药物，其特征在于，包括1.65ml益生菌和5.4mg牛初乳生长因子。

3.根据权利要求1或2所述的治疗溃疡性结肠炎的药物，其特征在于，所述的牛初乳生长因子为从牛初乳中提取的生长因子粗提物。

4.根据权利要求1所述的治疗溃疡性结肠炎的药物，其特征在于，所述的嗜酸乳杆菌KLDS20010、植物乳杆菌KLDS00170和瑞士乳杆菌KLDS10010的数量比为1：1：1。

5.根据权利要求1所述的治疗溃疡性结肠炎的药物，其特征在于，所述的活菌菌体是由均处于稳定初期的乳杆菌液体培养物分别离心收集的菌泥。

6.权利要求1、4-5任意一项所述的治疗溃疡性结肠炎的药物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）分别将嗜酸乳杆菌KLDS20010、植物乳杆菌KLDS00170和瑞士乳杆菌KLDS10010在MRS培养基培养；

（2）分别选取培养14~18h的瑞士乳杆菌KLDS10010、培养12~16h的嗜酸乳杆菌KLDS20010和培养12~16h的植物乳杆菌KLDS00170；

（3）分别取步骤（2）得到的瑞士乳杆菌KLDS10010菌液0.77~1.15ml，嗜酸乳杆菌KLDS20010菌液0.4~0.6ml，植物乳杆菌KLDS00170菌液0.15~0.23ml份，离心取菌泥，然后分别将它们溶于0.1ml无菌PBS中，得混合菌泥；

（4）对牛初乳离心脱脂、酸沉酪蛋白、二次超滤、透析及冷冻干燥制得牛初乳生长因子粗提物；

（5）将牛初乳生长因子粗提物4.32~6.84mg加入到上述混合菌泥中，搅拌均匀，然后加入合适的辅料制成临床可接受的剂型。

7.根据权利要求6所述的治疗溃疡性结肠炎的药物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（2）选取对数期末稳定期初的益生菌，即分别选取培养16h的瑞士乳杆菌KLDS10010、培养14h的嗜酸乳杆菌KLDS20010和培养14h的植物乳杆菌KLDS00170；

（3）分别取步骤（2）得到的瑞士乳杆菌KLDS10010菌液0.96ml，嗜酸乳杆菌KLDS20010菌液0.5ml，植物乳杆菌KLDS00170菌液0.19ml份，离心取菌泥，然后分别将它们溶于0.1ml无菌PBS中，得混合菌泥；

（5）将牛初乳生长因子粗提物5.4mg加入到上述混合菌泥中，搅拌均匀，然后加入合适的辅料制成临床可接受的剂型。