CN105319309A

CN105319309A - 一种甘氨酰-l-谷氨酰胺手性异构体的分离检测方法

Info

Publication number: CN105319309A
Application number: CN201510193641.8A
Authority: CN
Inventors: 尚宝虎; 马静静
Original assignee: Beijing Zimeng Tongda Science And Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Zimeng Tongda Science And Technology Co Ltd
Priority date: 2015-04-23
Filing date: 2015-04-23
Publication date: 2016-02-10

Abstract

本发明提供了一种甘氨酰-L-谷氨酰胺手性异构体的衍生化分离检测方法，属分析化学领域。该方法在甘氨酰-L-谷氨酰胺进入液相色谱柱之前用衍生化试剂进行衍生化，其衍生化试剂为N^α-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-氨基酸类化合物。分离测定所用方法为高效液相色谱法。使用的色谱柱为碱基化十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱。分离检测步骤主要包括：①样品溶液及衍生溶液配制；②衍生化反应；③衍生化反应后处理；④用高效液相色谱仪分离测定。本发明提供的柱前衍生化方法具有反应条件温和、衍生产物稳定，反应速度快、副反应少、过量衍生化试剂不干扰测定且使用普通色谱柱即可实现甘氨酰-L-谷氨酰胺及其手性异构体分离等优点。

Description

一种甘氨酰-L-谷氨酰胺手性异构体的分离检测方法

技术领域

本发明涉及一种甘氨酰-L-谷氨酰胺手性异构体的分离检测方法，属分析化学领域。

技术背景

甘氨酰-L-谷氨酰胺是谷氨酰胺的重要来源，是复方氨基酸(15)双肽(2)注射液中二肽组成之一，克服了谷氨酰胺在溶液中不稳定的难题，丰富了氨基酸液的配方。其化学名甘氨酰-L-谷氨酰胺一水合物，分子式如下：

从分子式中可以看出其存在手性异构体，其化学名为甘氨酰-D-谷氨酰胺，现有的技术及文献当中无甘氨酰-L-谷氨酰胺异构体测定的相关报道。

甘氨酰-L-谷氨酰胺的手性异构体为其杂质，是甘氨酰-L-谷氨酰胺的重要控制指标，是药品生产及药品申报重点关注项目。但甘氨酰-L-谷氨酰胺为末端吸收，紫外吸收不强，采用手性色谱柱进行分离测定甘氨酰-L-谷氨酰胺的异构体不但成品高，而且分离难度大。现有技术中已有其它紫外吸收较弱的产品采用衍生化试剂衍生化后通过普通色谱柱进行分离的报道，较为典型的报道包含中国专利200510057381.8(一种普瑞巴林手性异构体的分离测定方法)和中国专利2001010297844.9(一种分离测定乙酰半胱氨酸手性异构体的方法)。

本发明提供的一种柱前衍生化方法与使用普通色谱柱即可实现甘氨酰-L-谷氨酰胺与其手性异构体分离的测定方法。填补了此项空白，可对甘氨酰-L-谷氨酰胺中的甘氨酰-D-谷氨酰胺进行有效控制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种甘氨酰谷氨酰手性异构体的检测方法，该方法采用衍生化试剂N^α-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-氨基酸类化合物与甘氨酰-L-谷氨酰胺及其手性异构体同时进行衍生化反应，再经普通色谱柱进行分离测定。

为实现上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

甘氨酰-L-谷氨酰胺在进柱前用衍生化试剂进行衍生化，其衍生试剂为N^α-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-氨基酸类化合物，所述的衍生化试剂选自N^α-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-丙氨酰胺、N^α-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-***酰胺、N^α-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-脯氨酰胺或N^α-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-缬氨酰胺中的一种，其分离测定过程包括：

①取甘氨酰-L-谷氨酰胺，用水溶解并稀释制成每1ml中约含20mg～40mg的溶液；

②取N^α-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-氨基酸类化合物试剂适量，精密称定，加有机溶剂溶解并稀释制成10mg/ml的溶液，摇匀，置于冰箱冷藏(2℃～8℃)保存；

③取甘氨酰-L-谷氨酰胺溶液、衍生化试液和碳酸盐溶液，混匀；

④于20～60℃反应2～7小时，反应完毕加入盐酸溶液；

⑤反应物在预置五氧化二磷与氢氧化钾的干燥***中干燥至溶剂充分挥尽后，加二甲基亚砜或N，N-二甲基甲酰胺使残留物溶解，滤过，滤液作为供试品溶液；

⑥用高效液相色谱法分离测定上一步的供试品溶液。

其中甘氨酰-L-谷氨酰胺与衍生化试剂的摩尔比为1∶1～1∶250。

其中步骤⑥所说的高效液相色谱法使用的色谱柱可以是十八烷基键合硅胶或是以辛基硅烷建合硅胶为填料的色谱柱，优选碱基钝化后的十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱，检测波长为200～380nm，优选340±5nm，流速为1.5～2.5ml/min，优选1.8ml/min，洗脱程序为梯度洗脱程序，优选但不限于如下程序：

流动相A是三氟乙酸水溶液-乙腈体系或三乙胺水溶液-乙腈体系，比例为95∶5～85∶15，优选92∶8，流动相B是乙腈。

综上，本发明具有以下优点：

1、本发明采用N^α-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-氨基酸类化合物与甘氨酰-L-谷氨酰胺进行柱前衍生，不但使衍生后的产物具有较强的紫外吸收，而且可方便快捷的测定甘氨酰-L-谷氨酰胺中的手性异构体甘氨酰-D-谷氨酰胺；

2、本发明具有反应条件温和、反应速度快、过量衍生化试剂不干扰测定等优点；

3、本发明衍生化产物稳定，分析灵敏度高，甘氨酰-L-谷氨酰胺手性异构体的定量限为0.02％(0.067μg/ml))。

4、本发明可采用普通色谱柱(碱基钝化的十八烷基键合硅胶为填料)分离测定甘氨酰-L-谷氨酰胺手性异构体，而不需花费昂贵和不耐用的专用手性色谱柱。

附图：

图1实施例1甘氨酰-L-谷氨酰胺及其异构体高效液相色谱图

(三氟乙酸水溶液pH为2.3，比例94∶6，柱温25℃，流速1.6ml/min，检测波长340nm，衍生试剂量为200μl，35℃衍生6h)

图2实施例2甘氨酰-L-谷氨酰胺及其异构体高效液相色谱图

(三氟乙酸水溶液pH为2.7，比例86∶14，柱温35℃，流速2.0ml/min，检测波长340nm，衍生试剂量为250μl，45℃衍生5h)

图3实施例3甘氨酰-L-谷氨酰胺及其异构体高效液相色谱图

(三氟乙酸水溶液pH为2.5，比例88∶12，柱温30℃，流速1.8ml/min，检测波长335nm，衍生试剂量为300μl，40℃衍生5h)

图4实施例4甘氨酰-L-谷氨酰胺及其异构体高效液相色谱图

(三乙胺水溶液pH为2.5，比例88∶12，柱温30℃，流速1.8ml/min，检测波长345nm，衍生试剂量为400μl，60℃衍生3h)

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

(1)仪器与条件

色谱条件：

色谱柱：碱基钝化的十八烷基键合硅胶色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)

流动相：A相：0.09％三氟乙酸(用NaOH调pH2.3)-乙腈(94∶6)

B相：乙腈

检测波长：340nm；柱温：25℃；流速：1.6ml/min；稀释液：水

梯度洗脱程序：

(2)实验步骤

衍生化试液：取Merfey’s[N^α-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-丙胺酰胺]试剂适量，精密称定，加丙酮溶解并稀释制成10mg/ml的溶液，摇匀，置于冰箱冷藏(2℃～8℃)保存。

样品溶液：取甘氨酰-L-谷氨酰胺及其异构体各适量，用水溶解并稀释制成每1ml约含甘氨酰-L-谷氨酰胺30mg、异构体30μg的混合溶液，取样进行衍生化处理。

衍生化处理：精密量取样品溶液50μl、衍生化试液200μl、1mol/L碳酸氢钠溶液20μl，置同一样品瓶中，密闭，在35℃加热反应6h，反应完毕后加入2mol/L盐酸溶液10μl，在预置五氧化二磷与氢氧化钠的减压干燥***中干燥至溶剂充分挥尽，再加二甲基亚砜4ml分次溶解残渣，并定量转移至量瓶中，摇匀，作为供试品溶液。

取供试品溶液在上述条件下进行分析。结果见图1，其中保留时间为26.851为甘氨酰-D-谷氨酰胺，其中保留时间为28.783为甘氨酰-L-谷氨酰胺，其余峰为未反应完的衍生试剂的峰，分离度为2.20。

实施例2

(1)仪器与条件

色谱条件：

流动相：A相：0.11％三氟乙酸(用NaOH调pH2.7)-乙腈(86∶14)

B相：乙腈

检测波长：340nm；柱温：35℃；流速：2.0ml/min；稀释液：水

梯度洗脱程序：

(2)实验步骤

样品溶液：取甘氨酰-L-谷氨酰胺及甘氨酰-D-谷氨酰胺各适量，用水溶解并稀释制成每1ml约含甘氨酰-L-谷氨酰胺30mg、甘氨酰-D-谷氨酰胺30μg的混合溶液，取样进行衍生化处理。

衍生化处理：精密量取样品溶液50μl、衍生化试液250μl、1mol/L碳酸氢钠溶液20μl，置同一样品瓶中，密闭，在45℃加热反应5h，反应完毕后加入2mol/L盐酸溶液10μl，在预置五氧化二磷与氢氧化钠的减压干燥***中干燥至溶剂充分挥尽，再加二甲基亚砜4ml分次溶解残渣，并定量转移至量瓶中，摇匀，作为供试品溶液。

取空白溶液、***适用性溶液及供试品溶液在上述条件下进行分析。结果见图2，其中保留时间为20.053为甘氨酰-D-谷氨酰胺，其中保留时间为21.367为甘氨酰-L-谷氨酰胺，其余峰为未反应完的衍生试剂的峰，分离度为1.99。

实施例3

(1)仪器与条件

色谱条件：

流动相：A相：0.1％三氟乙酸(用NaOH调pH2.5)-乙腈(88∶12)

B相：乙腈

检测波长：335nm；柱温：30℃；流速：1.8ml/min；稀释液：水

梯度洗脱程序：

(2)实验步骤

衍生化处理：精密量取样品溶液50μl、衍生化试液300μl、1mol/L碳酸氢钠溶液20μl，置同一样品瓶中，密闭，在40℃加热反应5h，反应完毕后加入2mol/L盐酸溶液10μl，在预置五氧化二磷与氢氧化钠的减压干燥***中干燥至溶剂充分挥尽，再加二甲基亚砜4ml分次溶解残渣，并定量转移至量瓶中，摇匀，作为供试品溶液。

取空白溶液、***适用性溶液及供试品溶液在上述条件下进行分析。结果见图3，其中保留时间为25.073为甘氨酰-D-谷氨酰胺，其中保留时间为26.906为甘氨酰-L-谷氨酰胺，其余峰为未反应完的衍生试剂的峰，分离度为2.19。

实施实例4

(1)仪器与条件

色谱条件：

流动相：A相：0.1％三乙胺(用磷酸调pH2.5)-乙腈(88∶12)

B相：乙腈

检测波长：345nm；柱温：30℃；流速：1.8ml/min；稀释液：水

梯度洗脱程序：

(2)实验步骤

衍生化处理：精密量取样品溶液50μl、衍生化试液400μl、1mol/L碳酸氢钠溶液20μl，置同一样品瓶中，密闭，在60℃加热反应3h，反应完毕后加入2mol/L盐酸溶液10μl，在预置五氧化二磷与氢氧化钠的减压干燥***中干燥至溶剂充分挥尽，再加二甲基亚砜4ml分次溶解残渣，并定量转移至量瓶中，摇匀，作为供试品溶液。

取空白溶液、***适用性溶液及供试品溶液在上述条件下进行分析。结果见图4，其中保留时间为23.173为甘氨酰-D-谷氨酰胺，其中保留时间为24.894为甘氨酰-L-谷氨酰胺，其余峰为未反应完的衍生试剂的峰，分离度为2.17。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种分离测定甘氨酰-L-谷氨酰胺手性异构体的方法，其特征在于：甘氨酰-L-谷氨酰胺在进柱前用衍生化试剂进行衍生化，其衍生试剂为N^α-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-氨基酸类化合物，所述的衍生化试剂选自N^α-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-丙氨酰胺、N^α-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-***酰胺、N^α-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-脯氨酰胺或N^α-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-缬氨酰胺中的一种，其分离测定过程包括：

①取甘氨酰-L-谷氨酰胺，用水溶解并稀释制成每1ml中约含20～40mg的溶液；

④于20～60℃反应2～7小时，反应完毕加入1～2mol/L的盐酸溶液；

⑥用高效液相色谱法分离测定上一步的供试品溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于甘氨酰-L-谷氨酰胺与衍生化试剂的摩尔比为1∶1～1∶250。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤②所说的有机溶剂选自丙酮、乙醇和甲醇中的一种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤③所说的碳酸盐选自：碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾或碳酸钠溶液或它们按照任一比混合后所得的组合物。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤⑥所说的高效液相色谱法使用的色谱柱可以是十八烷基键合硅胶或是以辛基硅烷建合硅胶为填料的色谱柱，优选碱基钝化后的十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤⑥所说的高效液相色谱法使用的检测波长为200～380nm，优选340±5nm，流速为1.5～2.5ml/min，优选1.8ml/min。

7.根据权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于：洗脱程序为梯度洗脱程序，优选但不限于如下程序：

8.根据权利要求7所述的测定方法，其特征在于：流动相A是三氟乙酸水溶液-乙腈体系或三乙胺水溶液-乙腈体系，比例为95∶5～85∶15，优选92∶8。

9.根据权利要求8所述的测定方法，其特征在于：三氟乙酸水溶液的浓度为0.01～5％，优选0.1％，并用NaOH调节pH2.0～5.0，优选2.5。

10.根据权利要求8所述的测定方法，其特征在于：三乙胺水溶液的浓度为0.01～5％，优选0.1％，并用稀磷酸调节pH2.0～5.0，优选2.5。

11.根据权利要求7所述的测定方法，其特征在于：流动相B是乙腈。