CN103048407A - 一种复方a 酮酸片中赖氨酸的含量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种复方a酮酸片中赖氨酸的含量检测方法，首先，配制浓度为10mg/ml的邻苯二甲醛反应液（OPA试剂），其中含2%~3%（v/v）的3-巯基丙酸；然后，以自动柱前衍生的方法，在pH为10.2±0.1的硼酸缓冲液***中将赖氨酸与反应液以约1:1（v/v）的比例混合，室温反应；最后，采用高效液相色谱法在338nm处测定赖氨酸的含量。利用本发明的方法检测赖氨酸的含量，有效的解决了在已有OPA柱前衍生方法中赖氨酸出现的双峰问题，提高了赖氨酸在自动柱前衍生测定中的进样精密度，并且大大缩短了检测时间，特别适合实验室测定氨基酸样品中赖氨酸的含量。
Description
技术领域：
本发明涉及一种赖氨酸的含量检测方法，特别涉及一种复方a酮酸片中赖氨酸的含量检测方法。
背景技术：
目前对于氨基酸类的分析较为常用的是氨基酸分析仪及反相高效液相色谱与各种柱前或柱后衍生物相结合的氨基酸分析技术。近年来，柱前衍生反相高效液相色谱法测定氨基酸的技术取得了很大的进展。与氨基酸分析仪相比，柱前衍生法具有快速、灵敏度高、不需专用仪器等优点。常用的柱前衍生试剂有邻苯二甲醛（OPA）、9-芴基甲氧基羰酰氯（FMOC-Cl）、异硫氰酸苯酯（PITC）和丹酰氯（Dansyl-Cl）等。其中以OPA的应用最广，因为OPA衍生步骤简单，反应速度快，剩余试剂不干扰测定，衍生物可用紫外、荧光或电化学检测器检测。
赖氨酸学名为2，6-二氨基己酸。其为蛋白质中唯一带有侧链伯氨基的氨基酸。结构式如下：
赖氨酸与其它一级氨基酸一样，与OPA的反应原理是氨基酸结构中的伯氨基与OPA在碱性条件下可反应生成吲哚环从而具有紫外吸收，但赖氨酸分子结构中存在两个伯胺，所以与OPA试剂反应时宜生成其它的衍生产物。
目前，采用OPA柱前衍生化法检测氨基酸含量的报道中尚未提到赖氨酸检测时出现的双峰问题，其原因在于在检测多种氨基酸样品时赖氨酸的岀峰时间较晚，当赖氨酸主峰被检测到后，多数研究者会结束采集或换波长后对其他氨基酸进行测定，因此对赖氨酸检测时出现的双峰问题并未受到关注。
直接采用安捷伦公司提供的OPA试剂以及氨基酸检测方法对赖氨酸样品进行检测时，赖氨酸双峰问题显著，且检测精密度不佳。本发明建立了一种可有效解决赖氨酸在OPA柱前衍生中出现的双峰问题，同时提高了检测精密度，对准确测定样品中赖氨酸的含量提供了更可靠的柱前衍生化方法。
发明内容：
本发明的目的是提供一种复方a酮酸片中赖氨酸的含量检测方法，以克服上述检测方法中的不足之处，该方法检测准确，有效的解决了赖氨酸在OPA柱前衍生中出现的双峰问题。
为实现本发明的目的，本发明所采用的技术方案是：
一种复方a酮酸片中赖氨酸的含量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）硼酸缓冲溶液的配制
0.4mol／L硼酸缓冲溶液的配制：取硼酸和氢氧化钠，加水使溶解并稀释制，然后用碱溶液调pH至10.10~10.30；
（2）邻苯二甲醛反应液的配制：
称取邻苯二甲醛适量，加甲醇或乙醇溶解定容，配制成100mg/ml的邻苯二甲醛储备液；吸取邻苯二甲醛储备液适量，加入2%~3%（v/v）的3-巯基丙酸混合均匀后用硼酸缓冲液稀释，配制成邻苯二甲醛浓度为10mg/ml的反应液；
（3）样品溶液的测定：
在可使用自动柱前衍生的高效液相色谱仪下，按如下进样程序对赖氨酸样品进行柱前衍生，并在338nm处对衍生物进行测定：
a：200μL/min的速度吸取硼酸缓冲液2.5μL；
b：200μL/min速度吸取赖氨酸样品液1μL；
c：在空气中以最大速度将硼酸缓冲液和赖氨酸样品液进行混合得第一混合液；
d：等待0.2min；
e：90μL/min的速度吸取纯化水进行洗针；
f：最大速度吸取OPA反应液0.5~2μL；
g：在空气中以最大速度将第一混合液和OPA反应液混合；
h：进样。
在本发明的一个优选方案中，步骤（1）中的硼酸缓冲液pH值为10.20。
在本发明的一个优选方案中，步骤（2）中的3-巯基丙酸的体积浓度为2%（v/v）。
在本发明的一个优选方案中，步骤（3）的步骤（b）中的赖氨酸样品液浓度为0.6~0.01mg/ml。
在本发明的一个优选方案中，步骤（3）中OPA的吸取量为1μL，即与赖氨酸样品液的体积比为1∶1。
利用本发明的方法检测复方a酮酸片中赖氨酸含量，有效的解决了在现有OPA柱前衍生中赖氨酸出现的双峰问题，提高了赖氨酸在自动柱前衍生测定中的进样精密度，并且大大缩短了检测时间，特别适合实验室测定氨基酸样品中赖氨酸的含量。
具体实施方式
通过下面给出的本发明的具体实施例可以进一步清楚地了解本发明，但它们不是对本发明的限定。
对比例1
采用安捷伦OPA试剂测定赖氨酸样品：
采用安捷伦OPA试剂，在可使用自动柱前衍生的高效液相色谱仪下，按如下进样程序对赖氨酸样品进行柱前衍生，并在338nm处对衍生物进行测定：
a：200μL/min的速度吸取硼酸缓冲液2.5μL
b：200μL/min速度吸取赖氨酸样品液1μL
c：在空气中以最大速度进行混合（3.5μL）
d：等待0.2min
f：最大速度吸取OPA反应液0.5μL
g：在空气中以最大速度混合（4μL）
h：吸取磷酸终止液32μL
i：空气中最大速度混合
j：进样
k：等待0.3min
实施例2
本发明的检测方法，含3%（v/v）3-巯基丙酸的自配OPA试剂：
（1）0.4mol／L硼酸缓冲溶液的配制：取4.96g硼酸和2.80g氢氧化钠，加水使溶解并稀释制至200ml。用2mol/LNaOH溶液调pH至10.20。
（2）邻苯二甲醛反应液的配制：称取邻苯二甲醛适量，加甲醇或乙醇溶解定容，配制成100mg/ml的邻苯二甲醛储备液；吸取邻苯二甲醛储备液适量，加入3%（v/v）的3-巯基丙酸混合均匀后用硼酸缓冲液稀释，配制成邻苯二甲醛浓度为10mg/ml的反应液。
（3）样品溶液的测定：在可使用自动柱前衍生的高效液相色谱仪下，按如下进样程序对赖氨酸样品进行柱前衍生，并在338nm处对衍生物进行测定：
a：200μL/min的速度吸取硼酸缓冲液2.5μL
b：200μL/min速度吸取赖氨酸样品液1μL
c：在空气中以最大速度进行混合（3.5μL）
d：等待0.2min
e：90μL/min的速度吸取0μL纯化水
f：最大速度吸取OPA反应液1μL
g：在空气中以最大速度混合（4.5μL）
h：进样。
实施例3
本发明的检测方法，含2%（v/v）3-巯基丙酸的自配OPA试剂：
（1）0.4mol／L硼酸缓冲溶液的配制：取4.96g硼酸和2.80g氢氧化钠，加水使溶解并稀释制至200ml。用2mol/LNaOH溶液调pH至10.20。
（2）邻苯二甲醛反应液的配制：称取邻苯二甲醛适量，加甲醇或乙醇溶解定容，配制成100mg/ml的邻苯二甲醛储备液；吸取邻苯二甲醛储备液适量，加入2%（v/v）的3-巯基丙酸混合均匀后用硼酸缓冲液稀释，配制成邻苯二甲醛浓度为10mg/ml的反应液。
（3）样品溶液的测定：在可使用自动柱前衍生的高效液相色谱仪下，按如下进样程序对赖氨酸样品进行柱前衍生，并在338nm处对衍生物进行测定：
a：200μL/min的速度吸取硼酸缓冲液2.5μL
b：200μL/min速度吸取赖氨酸样品液1μL
c：在空气中以最大速度进行混合（3.5μL）
d：等待0.2min
e：90μL/min的速度吸取0μL纯化水
f：最大速度吸取OPA反应液1μL
g：在空气中以最大速度混合（4.5μL）
h：进样。
试验结果：
以上三组试验测定赖氨酸样品检测结果见表1：
表1
从表1可知，利用本发明的方法检测赖氨酸含量，有效的解决了在现有OPA柱前衍生中赖氨酸出现的双峰问题，并且提高了赖氨酸在自动柱前衍生测定中的进样精密度，特别适合实验室测定氨基酸样品中赖氨酸的含量。
Claims (5)
1.一种复方a酮酸片中赖氨酸的含量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）硼酸缓冲溶液的配制
0.4mol／L硼酸缓冲溶液的配制：取硼酸和氢氧化钠，加水使溶解并稀释制，然后用碱溶液调pH至10.10~10.30；
（2）邻苯二甲醛反应液的配制：
称取邻苯二甲醛适量，加甲醇或乙醇溶解定容，配制成100mg/ml的邻苯二甲醛储备液；吸取邻苯二甲醛储备液适量，加入2%~3%（v/v）的3-巯基丙酸混合均匀后用硼酸缓冲液稀释，配制成邻苯二甲醛浓度为10mg/ml的反应液；
（3）样品溶液的测定：
在可使用自动柱前衍生的高效液相色谱仪下，按如下进样程序对赖氨酸样品进行柱前衍生，并在338nm处对衍生物进行测定：
a：200μL/min的速度吸取硼酸缓冲液2.5μL；
b：200μL/min速度吸取赖氨酸样品液1μL；
c：在空气中以最大速度将硼酸缓冲液和赖氨酸样品液进行混合得第一混合液；
d：等待0.2min；
e：90μL/min的速度吸取纯化水进行洗针；
f：最大速度吸取OPA反应液0.5~2μL；
g：在空气中以最大速度将第一混合液和OPA反应液混合；
h：进样。
2.如权利要求1所述的复方a酮酸片中赖氨酸的含量检测方法，其特征在于，步骤（1）中的硼酸缓冲液pH值为10.20。
3.如权利要求1所述的复方a酮酸片中赖氨酸的含量检测方法，其特征在于，步骤（2）中的3-巯基丙酸的体积浓度为2%（v/v）。
4.如权利要求1所述的复方a酮酸片中赖氨酸的含量检测方法，其特征在于，步骤（3）的步骤（b）中的赖氨酸样品液浓度为0.6~0.01mg/ml。
5.如权利要求1所述的复方a酮酸片中赖氨酸的含量检测方法，其特征在于，步骤（3）中OPA的吸取量为1μL，即与赖氨酸样品液的体积比为1∶1。
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