CN105277666A - 一种用于评价三七抗凝活性的生物效价检定方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种用于评价三七抗凝活性的生物效价检定方法。本申请的生物效价检定方法操作简单，方便，且能够从整体上对三七药材的质量进行评价，并能够评价不同产地、不同批次、不同生长时间等的三七药材的质量。
Description
技术领域
本申请涉及一种用于评价三七抗凝活性的生物效价检定方法。
背景技术
三七是一种常用的中药，其法定来源为五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根和根茎。又名为田七、山漆、金不换等。支根习称“筋条”，根茎习称“剪口”[5]。三七始载于《本草纲目》，距今已有400多年的用药史。在国内外久负盛名，有“止血神药”的美称[12-14]。其性甘、微苦、温；归肝、胃经。具有散瘀止血、消肿定痛的功效。临床上多用于活血、止血。
《中国药典》2010年版，在三七药材项下主要收载性状、显微和薄层鉴别等，难以全面评价三七药材品质，而建立适宜的活血化瘀生物活性检测方法用于三七质量控制和品质评价，可以体现三七药材功效特点，补充和完善现有的三七药材质控模式的不足。
将生物活性测定法引入中药质量控制和评价体现，不仅可以鉴定中药品种和质量，而且可以评价药效，尤其对于三七等化学成分复杂、理化方法不能表征其含量及理化测定不能反映生物活性和临床疗效的中药而言，此方法对于不能反映生物活性和临床疗效的中药而言，更能凸显其优越性。
生物评价因具有药效相关、整体可控等技术优势，作为符合中医药特点的质量标准控制模式及方法，已成为中药质量标准化的重要发展方向之一。中药受品种、产地、加工方法等诸多因素的影响，造成了中药质量的物质基础变化大、质量难以控制的现象，并且其成分复杂、药理作用多样，仅控制少数成分不足以确保药材或制剂的质量，无法担任控制质量或反映疗效的重任。因此，本申请试图通过建立基于生物评价的中药质量研究的方法，完善现有的质量控制标准，使临床用药更为安全有效。
参考文献
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发明内容
本申请的目的是提供一种用于评价三七抗凝活性的生物效价检定方法。
中药质量生物评价方法不等同于一般的药理学实验方法，其同时具备定量药理学与药检分析的双重属性和要求。本申请意在用生物效价检测方法来评价三七药材的品质，从而为其质量控制提供参考依据。一般来说，药理学实验方法主要是重现其趋势和规律，重在证实试验结果与对照组比较是否有统计学意义；因此，三七抗凝指标检测结果主要是重现其抗凝活性的趋势和规律，不一定要重现实验数据的绝对值，重在证实实验结果与对照组比较是否具有显著性差异及统计学意义；而药检分析则要求重现试验数据的绝对值，但允许有一定的误差范围，因此抗凝活性效价的检定与化学成分分析方法相比，可从整体上对三七药材的质量进行评价。此外，生物检定重在评价活性作用大小，而不是要求证某一药物是否具有某种药理作用，更不是要求证其是通过什么药理机制而发生作用的。
具体地，本申请提供一种用于评价三七抗凝活性的生物效价检定方法，所述生物效价检定方法包括以下步骤：
a.配制供试品溶液和供试品稀释液
制备三七药材样品的干浸膏；
在测定前，用生理盐水将所述干浸膏配置成供试品溶液，过滤除菌，贮存，优选地在4℃下进行贮存，备用；
测定时，估计供试品抗凝效价，用所述生理盐水稀释所述供试品溶液，得到不同浓度的供试品稀释液；
b.配制对照品溶液和对照品稀释液
用所述生理盐水将阿司匹林配制成对照品溶液，过滤除菌，贮存，优选地在4℃下进行贮存，备用；
测定时，用所述生理盐水稀释所述对照品溶液，得到不同浓度的对照品稀释液；
c.测试
取凝血仪测试杯，向每个通道加入血浆并加入供试品稀释液或对照品稀释液，充分混匀，预温后，用全自动凝血仪进行检测；
d.生物效价计算
以所述全自动血凝仪所检测的凝血酶原时间(PT，单位：s)、活化部分凝血活酶时间(APTT，单位：s)、凝血酶时间(TT，单位：s)及纤维蛋白原(FIB，单位：g/L)为评价指标且对给药浓度取对数，优选地，以活化部分凝血活酶时间为评价指标，按照2010年版《中国药典》生物检定统计法项下的量反应平行线法(2·2)计算三七样品的抗凝效价及实验误差，可信限率FL％不得超过40％，优选地不超过30％。
在一些实施方式中，所述干浸膏可以通过以下制备：
将三七药材样品粉碎成粗粉，置于圆底烧瓶中，加提取溶剂浸泡，回流提取，抽滤，减压回收溶剂，真空干燥，得干浸膏并计算收率；
在一些实施方式，所加入的提取溶剂的以毫升计的体积可以为三七样品粗粉的以克计的重量的5-15倍。
在一些实施方式中，浸泡时间可以为30分钟，且可以回流提取两次，每次1.5小时。本领域的技术人员已知的是，浸泡的时间或每次回流的时间可以适当延长或缩短，且回流的次数可以适当地增加或减少，这样的调整不会不利地影响方法的准确性。
在一些实施方式中，所述提取溶剂可以是体积百分数为75％的乙醇、体积百分数为75％的甲醇或水。
在一些实施方式中，所述提取溶剂可以为水，优选地，所述提取溶剂可以为去离子水。当然，本领域的技术人员将理解的是，在本申请中用作提取溶剂的水还可以为去离子水、蒸馏水等。
在一些实施方式中，在步骤a和步骤b中，可以用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
在一些实施方式中，所述供试品溶液的浓度可以为10mg·ml-1，所述对照品溶液的浓度可以为5mg·mL-1。当然，本领域的技术人员将理解的是，所述供试品溶液和对照品溶液也可以采用其它的浓度，比如20mg·ml-1等。
在一些实施方式中，用于测试的血浆可以为大鼠血浆、家兔新鲜血浆、兔血冻干血浆或健康人冻干血浆。
在另外的实施方式中，所述血浆还可以为家兔新鲜血浆。
在一些实施方式中，所述家兔新鲜血浆可以通过以下制备：
取家兔4只，禁食12小时，用一次性采血针自家兔耳缘静脉取血，迅速注入一次性枸橼酸钠抗凝管中，充分混匀，3000r/min离心15min，分离血浆并置于冰浴中备用。
在一些实施方式中，在步骤c中，加入到通道的血浆的体积可以为200μL；加入到通道的供试品稀释液或对照品稀释液的体积可以为200μL；预温时间可以为100-200s。当然，本申请的技术人员将理解的是加入的血浆和供试品稀释液或对照品稀释液也可以采用其它的体积。
在一些实施方式中，所述供试品稀释液的浓度可以为0.89～5.0mg·mL-1。
在另外的实施方式中，所述供试品稀释液的浓度可以为1.33mg·mL-1和1.77mg·mL-1。
在一些实施方式中，所述对照品稀释液的浓度可以为0.48～2mg·mL-1。
在另外的实施方式中，所述对照品稀释液的浓度可以为0.75mg·mL-1和1.00mg·mL-1。
其中，本文所给出的供试品溶液或供试品稀释液的浓度以mg·mL-1为单位，其相当于每毫升溶液中含有的生药量，比如2.50mg/ml表示相当于每毫升2.50毫克生药量的溶液。且供试品溶液或供试品稀释液的浓度是依据以下公式换算的：(称取的三七药材样品×收率)÷溶液的体积。
与现有技术相比，本申请的生物效价检定方法操作简单，方便，且能够从整体上对三七药材的质量进行评价，并能够评价不同产地、不同批次、不同生长时间等的三七药材的质量。
具体地，与现有的中药质量评价方法相比，本申请的三七生物效价检定方法具有如下优点：
1.在化学评价的基础上增加生物评价的方法，以补充和完善化学质量控制模式的不足，同时满足生产和临床上对可靠、有效的药物质量评价方法的需求。
2.以生物评价为核心的中药质量控制模式及方法与临床功效关联更为紧密，可有效反映其内在质量和临床疗效。
3.对于三七等化学成分复杂、理化方法不能表征其含量及理化测定不能反映生物活性和临床疗效的中药而言，生物活性检测方法更具有优越性。
附图说明
图1显示不同提取方式对三七抗凝活性影响的比较；
图2显示不同提取溶剂对三七抗凝活性影响的比较；
图3显示不同检测指标对三七抗凝活性影响的比较；
图4显示供试品稀释液剂量与三七抗凝活性的量效关系；
图5显示对照品稀释液剂量与三七抗凝活性的量效关系；
图6显示不同产地的三七药材抗凝活性效价的柱状图。
具体实施方式
下面通过实施例来描述本申请的实施方式，本领域的技术人员应当认识到，这些具体的实施例仅表明为了达到本申请的目的而选择的实施技术方案，并不是对技术方案的限制。根据本申请的教导，结合现有技术对本申请技术方案的改进是显然的，均属于本申请保护的范围。
以下实施例中采用的物质，除了注明的之外，其余均为市售。
实施例1
供试品：三七样品(产地：云南省昆明市官渡区小哨街道办)
对照品：阿司匹林(厂家：上海扶生实业有限公司；批号：20130523)，赋值1mg＝0.5u，u为三七抗凝活性效价的单位数
生理盐水：产自石家庄四药有限公司；批号：121007405
全自动血凝仪：SysmexCA-0007，日本
a.比较不同提取方式对三七样品抗凝活性的影响
回流提取：取三七粗粉20g，置于磨口圆底烧瓶中，加入去离子水，去离子水的以毫升计的体积为三七粗粉的以克计的重量的10倍，浸泡30min，回流提取1h，提取液进行抽滤，减压回收溶剂，真空干燥，得干浸膏备用，计算收率。
超声提取：取三七粗粉20g，置于磨口锥形瓶中，加入去离子水，去离子水的以毫升计的体积为三七粗粉的以克计的重量的10倍，浸泡30min，超声波处理(功率300W，频率40kHz)1h，抽滤，减压回收溶剂，真空干燥，得干浸膏备用，计算收率。
冷浸提取：取三七粗粉20g，置于磨口锥形瓶中，加入去离子水，去离子水的以毫升计的体积为三七粗粉的以克计的重量的10倍，浸泡30min，冷浸(在室温下)1h，抽滤，减压回收溶剂，真空干燥，得干浸膏备用，计算收率。
用生理盐水将不同提取方式制得的三七样品浸膏配置成浓度为10mg·mL-1的供试品溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，在4℃下进行贮存，备用；测试时，用生理盐水进一步配置成5mg·mL-1的供试品稀释液。
取家兔4只，禁食12小时，用一次性采血针自家兔耳缘静脉取血，迅速注入一次性枸橼酸钠抗凝管中，充分混匀，3000r/min离心15min，分离血浆并置于冰浴中备用。
采用全自动血凝仪进行检测，取凝血仪测试杯，向每个通道加入200μL的血浆并加入200μL上述供试品稀释液，充分混匀，预温100s后，检测三种药材样品的活化部分凝血活酶时间(APTT)，结果如图1所示。
从图1可以看出，不同提取方式得到的干浸膏对三七药材抗凝活性影响差异较大，其中回流提取所得到的三七药材干浸膏的APTT显著高于超声提取及冷浸提取的三七干浸膏的APTT，可能原因为三七生用止血活性较强，但其止血活性成分三七素不稳定，容易被加热破坏，炮制后主要体现为活血作用。故优选地选择回流提取法来制备三七药材干浸膏。
b.比较用不同溶剂提取三七药材样品对三七抗凝活性的影响
分别称取三七药材粗粉20g，分别置于磨口圆底烧瓶中，加入不同的提取溶剂(分别为去离子水，75％乙醇，75％甲醇)，提取溶剂以毫升计的体积为三七药材粗粉以克计的重量的10倍，浸泡30min，回流提取1h，抽滤，滤液减压回收溶剂，真空干燥，制得干浸膏，计算收率。
用生理盐水将上述干浸膏配制成浓度为10mg·mL-1的供试品溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，在4℃下进行贮存，备用；测试时，用生理盐水进一步配置成的5mg·mL-1的供试品稀释液。
取家兔4只，禁食12小时，用一次性采血针自家兔耳缘静脉取血，迅速注入一次性枸橼酸钠抗凝管中，充分混匀，3000r/min离心15min，分离血浆置冰浴备用。
采用全自动血凝仪进行检测，取凝血仪测试杯，向每个通道加入200μL的血浆并加入200μL上述供试品稀释液，充分混匀，预温200s后，检测三种样品的活化部分凝血活酶时间，结果如图2所示。
从图2可以看出，不同提取溶剂得到的样品的三七抗凝活性没有显著性差异，为了降低经济成本及减少化学试剂带来的毒性，故优选地选择去离子水来提取三七药材样品。
c.不同检测指标对三七抗凝活性的影响
根据以上a部分所述的相同的回流提取步骤制备三七药材的干浸膏，除了去离子水的以毫升计的体积为三七粗粉的以克计的重量的5倍，回流提取2次，每次1.5小时以外。
用生理盐水将所制备的干浸膏配置成浓度为10mg·mL-1的供试品溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，在4℃下进行贮存，备用；测试时，用生理盐水进一步配置成的5mg·mL-1的供试品稀释液。
取家兔4只，禁食12h，采用一次性采血针自家兔耳缘静脉取血，迅速加入到一次性枸橼酸钠抗凝管中，来回颠倒混匀，3000r/min离心15min，分离血浆备用。
取凝血仪测试杯，每通道加入所制备血浆200μL，供试品稀释液200μL，充分混匀，准确预温180s后，用全自动血凝仪检测凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)及纤维蛋白原(FIB，单位：g/L)，结果如图3所示。
从图3可以看出，用三七药材样品所测得APTT与对照品及空白组(其中，对照品为阿司匹林，其测试浓度为2mg·mL-1；空白组为不加药组，即生理盐水组)的比较具有显著性差异，PT、TT及FIB与对照品及空白组(其中，对照品为阿司匹林，其测试浓度为2mg·mL-1；空白组为不加药组，即生理盐水组)的比较也具有差异，但是它们的差异性比APTT的差异性小，因此优选地选择检测活化部分凝血活酶时间(APTT)用于三七抗凝活性效价的评价指标。
d.供试品剂量与三七抗凝活性的量效关系
取c部分所制备的干浸膏，并按照1:0.75的剂间比，如c部分所述地配置成浓度为0.89mg·mL-1、1.187mg·mL-1、1.582mg·mL-1、2.109mg·mL-1、2.813mg·mL-1、3.75mg·mL-1、5mg·mL-1的供试品稀释液。
取家兔4只，禁食12h，采用一次性采血针自家兔耳缘静脉取血，迅速加入到一次性枸橼酸钠抗凝管中，来回颠倒混匀，3000r/min离心15min，分离血浆备用。
取凝血仪测试杯，每通道加入所制备的200μL血浆和200μL上述供试品稀释液，充分混匀，准确预温180s后，用全自动血凝仪检测活化部分凝血活酶时间(APTT)，结果发现在0.89～5mg·mL-1范围内，给药浓度的对数与APTT之间呈现出良好的量效关系。
以给药浓度的对数为横坐标，以APTT为纵坐标，进行线性回归。如图4所示，得到一条近似通过原点的直线(r2>0.98)，说明给药剂量与APTT之间具有明显的量效关系。
优选地，将1.33mg·mL-1和1.77mg·mL-1的给药浓度用于二剂量法的计算。
e.对照品剂量与三七抗凝活性的量效关系
取适量阿司匹林对照品，用生理盐水配制成浓度为5mg·mL-1的对照品溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，在4℃下进行贮存，备用；测试时，按照1:0.75的剂间比，用生理盐水进一步稀释成浓度为0.48mg·mL-1、0.633mg·mL-1、0.844mg·mL-1、1.125mg·mL-1、1.5mg·mL-1、2mg·mL-1的对照品稀释液。
取家兔4只，禁食12h，采用一次性行采血针自家兔耳缘静脉取血，迅速加入到一次性枸橼酸钠抗凝管中，来回颠倒混匀，3000r/min离心15min，分离血浆备用。
取凝血仪测试杯，每通道加入所制备的200μL血浆和200μL上述对照品稀释液，充分混匀，准确预温180s后，用全自动血凝仪检测活化部分凝血活酶时间(APTT)，结果发现在0.48～2mg·mL-1范围内，给药浓度的对数与APTT之间呈现出良好的量效关系。
以给药浓度的对数为横坐标，以APTT为纵坐标，进行线性回归。如图5所示，得到一条近似通过原点的直线(r2>0.98)，说明给药剂量与抑制率之间具有明显的量效关系。
优选地，将0.75mg·mL-1和1.00mg·mL-1的给药浓度用于二剂量法的计算。
f.三七抗凝活性生物效价检测
以阿司匹林对照品溶液为对照组(S)，三七样品稀释液为供试品组(T)，分别测定对照品和供试品的抗凝活性。首先定义阿司匹林抗凝效价为500U·g-1，将对照品溶液和供试品溶液各设高低两个剂量组，随机分组设计实验，每组平行测定5次。以APTT为评价指标，按中国药典2010版二部附录XIV生物检定统计法中的量反应平行线二剂量法计算抗凝活性效价。
其中，取c部分所述的方法制备的干浸膏，并如c部分所述地配置浓度为1.33mg·mL-1和1.77mg·mL-1的三七药材的供试品稀释液；按照e部分所述的方法配置浓度为0.75mg·mL-1和1.00mg·mL-1的对照品稀释液；按照c部分所述的检测方法来检测各个供试品稀释液和对照品稀释液的APTT。
下面具体给出测定不同浓度的三七药材供试品与阿司匹林对照品的效价检定结果(表1)
表1计算三七与阿司匹林的抗凝效价的原始APTT(s)数据
以APTT为指标，以阿司匹林为对照，采用二剂量法计算三七的抗凝活性效价，结果见表2。
表2生物检定可靠性检验结果
采用中国药典生物检定统计软件BS2000计算，可靠性检验结果显示，回归项有非常显著的意义(P<0.01)，说明随着剂量的增加，APTT呈规律地增加；剂间差异有非常显著的意义(P<0.01)，说明试验剂量比例和试验安排合理；偏离平行的差异无显著意义(P>0.05)，说明对照品组(S)和供试品组(T)呈平行直线关系，可用量反应平行线法的(2·2)法检测样品止血效价。
检测效价PT＝175.36U·g-1，PT的可信限率FL＝29.5％，毒价95％的可信限范围为98.3～201.85U·g-1。
j.不同产地的三七抗凝活性生物效价检测
按照f部分所述的相同方法，测定12批不同产地的三七样品的抗凝活性效价，结果如表3及图6所示。
表312批不同产地的三七样品的抗凝活性效价
本文检测资源普查从10个主要生产县和药材市场收集的12份三年生三七样品，产地涉及了三七主要的生产地区，在一定程度上较全面的代表了三七药材的实际情况。由表3及图6可知，抗凝效价值为88.7～218.87U·g-1，不同产地样品效价高低相差近3倍，提示产地对三七药材品质有较大影响，其中采于昆明市寻甸县功山乡羊毛冲村的三七药材抗凝效价最高，从文山县东山乡荒寨村采集的样品以及药材市场购买的2份样品抗凝效价较低。三七主产于云南文山及其周边地区，分布范围十分狭小，三七的种植均集中在东经102°～106°，北纬23°30＇～25°44＇附近的狭小区域，表现出强烈的地域特征[1-3]。由于三七生长环境的特殊性和适宜种植区域分布的狭小性，连作障碍的问题导致三七种植土地周转困难，进而形成了三七适宜种植地块十分紧张，并已呈现出适宜种植区域向次适宜地区转移，检测结果表明，三七的道地产区文山地区抗凝活性效价低于周边产区。云南文山州是我国三七种植的主产区，自然条件复杂，土壤类型多，适宜三七的生长[4]。但三七生长环境的特殊性，要求土壤能提供良好的生长条件外，土壤质地、土壤有机质及营养等均影响其生长发育和品质，连作障碍使土壤中病原菌增多引起病害加重，根的化感作用产生自毒现象以及土壤营养物质消耗使营养不足等因素[5-7]，导致三七的主要生产地区云南文山州地质环境恶化，生产的三七品质下降，因此向周边地区寻找适宜三七生长的地区种植。
以上所述仅为本申请的优选实施例，并非对本申请作出任何形式上和实质上的限制。本领域的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，当可利用以上所揭示的技术内容而作出的些许更改、修饰与演变的等同变化均为本申请的等效实施例；同时，凡依据本申请的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更改、修饰与演变等均在本申请的由权利要求界定的范围内。
Claims (10)
1.一种用于评价三七抗凝活性的生物效价检定方法，所述生物效价检定方法包括以下步骤：
a.配制供试品溶液和供试品稀释液
制备三七药材的干浸膏；
在测定前，用生理盐水将所述干浸膏配置成供试品溶液，过滤除菌，贮存，优选地在4℃下进行贮存，备用；
测定时，估计供试品抗凝效价，用所述生理盐水稀释所述供试品溶液，得到不同浓度的供试品稀释液；
b.配制对照品溶液和对照品稀释液
用所述生理盐水将阿司匹林配制成对照品溶液，过滤除菌，贮存，优选地在4℃下进行贮存，备用；
测定时，用所述生理盐水稀释所述对照品溶液，得到不同浓度的对照品稀释液；
c.测试
取凝血仪测试杯，向每个通道加入血浆并加入供试品稀释液或对照品稀释液，充分混匀，预温后，用全自动凝血仪进行检测；
d.生物效价计算
以所述全自动血凝仪所检测的凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间及纤维蛋白原为评价指标且对给药浓度取对数，优选地，以活化部分凝血活酶时间为评价指标，按照2010年版《中国药典》生物检定统计法项下的量反应平行线法(2·2)计算三七药材样品的抗凝效价及实验误差，可信限率FL％不得超过40％，优选地不超过30％。
2.根据权利要求1所述的生物效价检定方法，其中，所述干浸膏通过以下制备：
将三七药材样品粉碎成粗粉，置于圆底烧瓶中，加提取溶剂浸泡，回流提取，抽滤，减压回收溶剂，真空干燥，得干浸膏并计算收率；
优选地，所加入的提取溶剂的以毫升计的体积为三七药材样品粗粉的以克计的重量的5-15倍；浸泡时间为30分钟；回流提取两次，每次1.5小时。
3.根据权利要求2所述的生物效价检定方法，其中，所述提取溶剂是体积百分数为75％的乙醇、体积百分数为75％的甲醇或水，优选地，所述提取溶剂为水，更优选地，所述提取溶剂为去离子水。
4.根据权利要求1所述的生物效价检定方法，其中，在步骤a和步骤b中，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
5.根据权利要求1所述的生物效价检定方法，其中，所述供试品溶液的浓度为10mg·ml-1，所述对照品溶液的浓度为5mg·mL-1。
6.根据权利要求1所述的生物效价检定方法，其中，用于测试的血浆为大鼠血浆、家兔新鲜血浆、兔血冻干血浆或健康人冻干血浆，优选地，所述血浆为家兔新鲜血浆。
7.根据权利要求6所述的生物效价检定方法，其中，所述家兔新鲜血浆通过以下制备：
取家兔4只，禁食12小时，用一次性采血针自家兔耳缘静脉取血，迅速注入一次性枸橼酸钠抗凝管中，充分混匀，3000r/min离心15min，分离血浆并置于冰浴中备用。
8.根据权利要求1所述的生物效价检定方法，其中，在步骤c中，加入到通道的血浆的体积为200μL；加入到通道的供试品稀释液或对照品稀释液的体积为200μL；预温时间为100-200s。
9.根据权利要求1所述的生物效价检定方法，其中，所述供试品稀释液的浓度为0.89～5.0mg·mL-1，优选地，所述供试品稀释液的浓度为1.33mg·mL-1和1.77mg·mL-1。
10.根据权利要求1所述的生物效价检定方法，其中，所述对照品稀释液的浓度为0.48～2mg·mL-1，优选地，所述对照品稀释液的浓度为0.75mg·mL-1和1.00mg·mL-1。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160127 |