CN105353063A - 复方感冒灵流膏化学成分标准指纹图谱及构建方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种复方感冒灵流膏的化学成分指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：(A)将蒙花苷、木犀草苷以及绿原酸三种对照品溶液注入液相色谱仪并记录出峰位置，液相色谱仪的操作条件为：流动相A为乙腈，相B为磷酸水溶液，流速控制在0.8-1.2ml/min，柱温30-35℃，检测波长控制在320-330nm；(B)将复方感冒灵流膏制成标准样品溶液在上述液相色谱操作条件下注入进行梯度洗脱得到化学成分指纹图谱。本发明实施例得到的化学成分指纹图谱能够清晰的反应出复方感冒颗粒各有效成分的特征峰出峰位置，准确性以及清晰度很高，能够完善复方感冒灵颗粒的质量控制体系。

Description

复方感冒灵流膏化学成分标准指纹图谱及构建方法、应用

技术领域

本发明涉及复方感冒灵颗粒的质量检测领域，具体而言，涉及一种复方感冒灵流膏的化学成分标准指纹图谱及其构建方法、应用。

背景技术

复方感冒灵颗粒应用非常普遍，主要用于辛凉解表，清热解毒，风热感冒及温病之发热，微恶风寒，头身痛，口干而渴，鼻塞涕浊，咽喉红肿疼痛，咳嗽，痰黄粘稠等病症，尤其对治疗感冒、头疼、发热等身体状况有奇效。而且采用中药为原料，不会增加肠胃负担，尤其不会对肝有损害，相比于容易致人体产生抗药性，使得病人对药物产生依赖性，还会对机体功能有不同程度的损害的西药，其具有显著的功效。

众所周知，复方感冒灵颗粒主要采用山银花、五指柑、野菊花、三叉苦、南板蓝根、岗梅、对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏以及咖啡因制得，为了保证复方感冒灵颗粒的出厂质量均会建立一定的质量监控体系，但是现有技术中一般是采用滴定法检测对乙酰氨基酚的含量，或者采用简单的薄层色谱法检测对乙酰氨基酚以及马来酸氯苯那敏的含量，但是这些质量检测方法不够完善，仅仅检测了原料组成，对各个原料中所含的中药有效成分没有进行有效的测定，导致其每个批次的药效不够稳定，质量上有所差异，从而会间接影响到复方感冒灵颗粒药品的推广力度，以及影响其对患者病情的治疗程度，因此如何建立一套完善健全的复方感冒灵颗粒的质量体系是现有技术中亟待解决的技术问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种复方感冒灵流膏的化学成分标准指纹图谱的构建方法，该方法切实解决了现有技术中存在的诸多技术问题，具有方法简单、操作方便，实现了全方位多方面的检测复方感冒颗粒，并实现了中间过程的质量监控，提高了复方感冒灵颗粒整体的品质，完善了质量检测体系，利于药品本身的扩大应用范围等优点。

本发明的第二目的在于提供由上述构建方法得到的复方感冒灵流膏的化学成分标准指纹图谱，该指纹图谱能够清晰的反应出复方感冒颗粒各有效成分的特征峰的出峰位置，准确性以及清晰度很高，能够完善复方感冒灵颗粒的质量控制体系，并且提高了药物的质量后也有利于扩大市场，提高产品的知名度，更能加快患者病情好转的速度，可谓益处多多。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明实施例提供了一种复方感冒灵流膏的化学成分指纹图谱的构建方法，包括：(A)将蒙花苷、木犀草苷以及绿原酸三种对照品溶液注入液相色谱仪并记录出峰位置，液相色谱仪的操作条件为：流动相A为乙腈，相B为磷酸水溶液，流速控制在0.8-1.2ml/min，柱温30-35℃，检测波长控制在320-330nm；

(B)将复方感冒灵流膏制成标准样品溶液在上述液相色谱操作条件下注入进行梯度洗脱得到化学成分标准指纹图谱。

现有技术中，都是采用高效液相色谱或者化学滴定法将原料成分比如对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏的含量进行测定，但是这种方法仅仅检测了原料组成，对各个原料中所含的化学有效成分没有进行有效的测定，其实真正产生药效的是每一种原料中所含的有效成分，化学有效成分含量的多与少也是复方感冒灵颗粒质量监控的关键，但是现有技术的质量检测体系往往忽略了这一点，导致其质量检测不够严格，从而不能充分保证药品的药效。本发明的方案恰恰解决了这一问题的出现，通过将山银花、五指柑、野菊花、三叉苦、南板蓝根、岗梅这些原料中所含的主要化学有效成分蒙花苷、木犀草苷以及绿原酸进行定性检测，从而完善质量体系，对这三种有效成分的检测正好弥补了现有技术中的技术空白，而且本发明创造性的针对复方感冒灵流膏建立质量体系，并不是像现有技术中针对最终产品复方感冒灵颗粒进行质量检测，显然本发明通过对药品生产的中间过程进行质量把控可以更有利于配方以及工艺的随时调整，更具有现实意义。

另外，本发明通过具体实践得知出较优的液相色谱梯度洗脱的工艺条件，这些工艺条件均是发明人通过大量的创造性实验得出，并不是随便选择的，通过液相色谱从而最终知晓蒙花苷、木犀草苷以及绿原酸三种对照品溶液的具体出峰位置，这三种对照品溶液可以混合进样也可以单独进样，根据实际条件自行选择。然后将复方感冒灵流膏制成标准样品溶液也在该梯度洗脱的操作条件下注入液相色谱，得到完整的复方感冒灵流膏的化学成分指纹图谱，这个指纹图谱上除了常规的复方感冒灵颗粒的原料的出峰位置，还创造性的增加了蒙花苷、木犀草苷以及绿原酸这三个峰，从而在后续检测样品时，更能准确的把关药品的质量，保证复方感冒灵颗粒的质量的稳定性。为了使得得到的化学成分指纹图谱更加准确，本发明进一步优化了色谱条件，更优的液相色谱操作条件为：流速控制在0.9-1.0ml/min，柱温32-33℃，检测波长控制在325-326nm。

进一步的，蒙花苷、木犀草苷以及绿原酸对照品溶液采用甲醇作为溶剂进行溶解制得，蒙花苷对照品溶液的浓度最好控制在25-30μg/ml，木犀草苷对照品溶液的浓度最好控制在40-50μg/ml，绿原酸对照品溶液的浓度最好控制在0.5-0.6mg/ml，相B的磷酸水溶液的质量百分比浓度控制在0.4-0.5％，浓度不能太高，这样在后续进行洗脱操作时保证溶液均一稳定的通过色谱柱。

本发明所采用的检测样品复方感冒灵流膏为复方感冒灵颗粒生产过程中的中间产品，其主要制备方法为将山银花、五指柑、野菊花、三叉苦、南板蓝根、岗梅混合后反复煎煮1-2次，合并煎液浓缩即得，得到的流膏再加其他三味药以及白糖等辅料，干燥制成最终颗粒产品。每次煎煮的时间最好控制在1-2h，优选1.5-1.8h，一般煎煮两次第一次2h，第二次1.5h，煎液合并后过滤浓缩，加乙醇使其含乙醇量达60-65％，搅匀、静置、过滤浓缩得到流膏，通过对流膏的质量检测实现生产中间过程的质量监控，现有技术中还没有针对复方感冒灵流膏建立的质量检测方法，本发明尚属首创。

检测之前，将复方感冒灵流膏与甲醇溶液混合搅拌均匀，加热提取、定量、过滤制成标准样品溶液，其中加热提取的操作温度控制在90℃以上，加热提取的操作时间控制在1-2h，具体操作时，先精密称取复方感冒灵流膏1.0g至锥形瓶中，精密加入50ml的50％甲醇溶液，称重，至90℃以上水浴锅回流1-2h，冷却，重新称重，并以50％甲醇溶液补重定容，摇匀，滤过，即得。

采用本发明上述构建方法得到的复方感冒灵流膏化学成分标准指纹图谱能够清晰的反应出复方感冒颗粒各有效成分的特征峰出峰位置，准确性以及清晰度很高，能够完善复方感冒灵的质量控制体系，提高了药物的质量也有利于扩大市场，提高产品的知名度，更能加快患者病情好转的速度，可谓益处多多。

还有，复方感冒灵流膏的化学成分标准指纹图谱在复方感冒灵颗粒的质量检测方面具有很好的应用，具体应用时将复方感冒灵流膏制成待测品(样品)溶液在上述优化后的最佳液相色谱操作条件下进行梯度洗脱得到待测品化学成分指纹图谱，并与化学成分标准指纹图谱进行对比，以确定其产品是否合格。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明创造性的将蒙花苷、木犀草苷以及绿原酸这三种有效成分的检测纳入质量体系，通过增加这三个指标检测，从而在后续检测样品时，更能准确的把关药品的质量，保证复方感冒灵颗粒的质量的稳定性，得到的复方感冒灵流膏的化学成分指纹图谱更加清晰完整；

(2)本发明通过具体实践得知了较优的液相色谱梯度洗脱的工艺条件，这些工艺条件均是发明人通过大量的创造性实验得出来的，并不是随便选择的，在最佳的工艺条件下操作更能提高结果的准确性，完善整个药品的质量检测体系；

(3)本发明还创造性的第一次提出了针对复方感冒灵流膏构建化学成分指纹图谱，打破了现有技术只是针对最终产品构建指纹图谱的传统，具有开拓性的意义；

(4)本发明的构建方法操作成本较低，简单方便，不用专业人员也可进行操作，所涉及的实验仪器价格也比较平民化，人力成本以及操作成本都比较低，整个测定过程中所涉及的试剂均为常见化工原料，量大价低，原料易得；

(5)本发明所用的各种试剂对环境友好、不含重金属和有害成分，对人体健康没有伤害，不会给操作人员带来任何身体上的危害，非常环保。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例一的不同检测波长的条件下标准溶液对应的HPLC图谱；

图2为本发明实施例一的不同流动相的条件下标准溶液的HPLC图谱；

图3为本发明实施例一的对照品溶液与标准溶液的HPLC图谱对比；

图4为本发明实施例一的复方感冒灵流膏的化学成分指纹图谱；

图5为本发明实验例一的十批复方感冒灵颗粒流膏样品的HPLC色谱图；

图6为本发明实验例一的十批复方感冒灵颗粒流膏样品经过校正后得到的化学指纹图谱。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

1)分别精密称取适量蒙花苷对照品、木犀草苷对照品和绿原酸对照品，用甲醇溶解并超声处理直至完全溶解，分别制成每1ml含蒙花苷25μg、木犀草苷40μg、绿原酸0.5mg的对照品溶液；

2)分别精密称取复方感冒灵流膏1.0g至锥形瓶中，精密加入50ml的质量百分比浓度为50％的甲醇溶液，称重，至90℃水浴锅回流1h，冷却，重新称重，并以50％甲醇溶液补重，摇匀，滤过，即得标准样品溶液，其中复方感冒灵流膏的制备方法包括：将山银花、五指柑、野菊花、三叉苦、南板蓝根、岗梅混合后反复煎煮1次，煎煮的时间控制在1-2h，再将煎液浓缩即可；

3)液相色谱条件的确定

a.波长的选择：KromasilC18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)；流动相为乙腈(A)-0.4％的磷酸水溶液(B)梯度洗脱。柱温:30℃；流速:1.0mL/min；进样量10μL。梯度程序如下表1：

表1梯度洗脱程序

时间(min)	乙腈％	0.4％磷酸溶液％
			0-20	3→15	97→85
20-45	15→24	85→76
			45-55	24→40	76→60
55-60	40→3	60→97

将标准样品溶液采用HPLC法检测，且检测波长在200-350nm之间，以15nm为单位间隔，以不同波长对同一样品进样，以色谱峰数、分离度等评价，所得结果见附图1，从图中可以看出检测波长为326nm时，色谱峰数较多，主要色谱峰面积较高，杂质峰面积相对较低，指纹特征明显，故选定为最优波长，结合本发明的主要原料山银花、野菊花等药材的主要有效成分吸收波长在320-330nm之间，更优的还可以选择波长为325-326nm；

b.流动相的选择：由于复方感冒流膏中的野菊花、山银花等药材所含有效成分略偏酸性，流动相应略偏酸，山银花中主要成分的HPLC分离一般采用有机相为乙腈，水相为0.4％磷酸溶液组合。由于色谱峰较多，为更好确保分离度和峰形，设置了五组不同流动相比例进行梯度条件的优化，具体流动相比例参考下表2；

表2梯度洗脱程序

通过采用不同的流动相比例将标准溶液进行洗脱，得到的谱图见附图2，从图中可以看出，使用梯度4进行洗脱，得到的图谱效果较好，基线平稳，谱峰分离较好，峰数较多，色谱峰高适中，故选择梯度4做为流动相洗脱梯度。

c.参照物的选择

将本发明的三种对照品溶液混合后与标准溶液分别注入液相色谱10μl，将混合对照液与标准溶液的色谱图进行比较，具体图谱见附图3，从图3中可以看出，绿原酸、木犀草苷和蒙花苷色谱峰在色谱图中位置适中，吸收强度大，分离良好，符合参照物选择的标准。

各个操作条件以及参照物均确定的条件下，将标准溶液注入液相色谱仪，得到的色谱图附图4即为复方感冒灵流膏的化学指纹图谱，可以看出其指纹图谱分别呈现出与参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰。

附图4中共有10个峰，通过与对照品比对，峰2为绿原酸，峰5为木犀草苷，峰10为蒙花苷，峰1为山银花特征峰，峰4、6为野菊花特征峰，峰3、7为山银花、野菊花共有特征峰；峰8、9为山银花、野菊花、岗梅、五指柑共有特征峰，后续进行质量检测时样品需要与该指纹图谱的近似度达到0.9以上才算合格产品。

实施例2

本实施例的其他操作步骤与实施例1基本相同，只是色谱的流动相为乙腈(A)-0.5％的磷酸水溶液(B)梯度洗脱，柱温:35℃，流速:0.9mL/min。

实施例3

本实施例的其他操作步骤与实施例1基本相同，只是色谱的流动相为乙腈(A)-0.5％的磷酸水溶液(B)梯度洗脱，柱温:32℃，流速:0.8mL/min。

实施例4

本实施例的其他操作步骤与实施例1基本相同，只是色谱的流动相为乙腈(A)-0.5％的磷酸水溶液(B)梯度洗脱，柱温:33℃，流速:1.2mL/min。

实施例5

本实施例的其他操作步骤与实施例1基本相同，只是色谱的流动相为乙腈(A)-0.5％的磷酸水溶液(B)梯度洗脱，柱温:33℃，流速:1.2mL/min。

实施例6

本实施例的其他操作步骤与实施例1基本相同，只是制备对照品溶液时，分别制成每1ml含蒙花苷30μg、木犀草苷50μg、绿原酸0.6mg的对照品溶液。

实施例7

本实施例的其他操作步骤与实施例1基本相同，只是复方感冒灵流膏的制备方法为：将山银花、五指柑、野菊花、三叉苦、南板蓝根、岗梅混合后反复煎煮2次，每次煎煮的时间控制在1.5-1.8h，加乙醇使其含乙醇量达60-65％，搅匀、静置、过滤浓缩即得，制标准溶液过程中95℃水浴锅回流2h。

实施例2-7通过实验发现最佳洗脱条件与实施例1基本相同，说明本发明的洗脱条件通过反复实践已经达到在最优条件下操作，这种条件的选择也是发明人通过反复实验付出大量的创造性劳动获得，通过现有技术的简单选择是绝对得不到的，最终得到的化学成分指纹图谱与实施例1得到的图谱也基本类似。

实验例1

取复方感冒灵颗粒流膏样品，共计10批，按照实施例1的制备方法制备，色谱条件测定，记录色谱图(见图5)，色谱图扣除0～3.0min(溶剂峰)，生成的图谱与实施例1的化学指纹图谱进行比对(见图6)，同时计算相似度，所得结果见表3。

表3不同批次图谱相似度评价

批号	相似度
		样品1	1.000
样品2	1.000
		样品3	1.000
样品4	0.999
		样品5	1.000
样品6	1.000
		样品7	1.000
样品8	1.000
		样品9	1.000
样品10	1.000

从表3的试验结果可以看出，大批的工艺生产的试制产品与本发明的化学指纹图谱的相似度几乎接近100％，说明本发明的化学指纹图谱应用效果好，可以很好的达到控制产品质量的目的，从图5-6中也可以看出，十批供试品的化学指纹图谱与本发明的化学指纹图谱非常类似，精密度以及稳定性均较好。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种复方感冒灵流膏的化学成分标准指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(A)将蒙花苷、木犀草苷以及绿原酸三种对照品溶液注入液相色谱仪并记录出峰位置，液相色谱仪的操作条件为：流动相A为乙腈，相B为磷酸水溶液，流速控制在0.8-1.2ml/min，柱温30-35℃，检测波长控制在320-330nm；

(B)将复方感冒灵流膏制成标准样品溶液在上述液相色谱操作条件下注入进行梯度洗脱得到化学成分标准指纹图谱。

2.根据权利要求1所述的一种复方感冒灵流膏的化学成分标准指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤(A)中，蒙花苷、木犀草苷以及绿原酸分别采用甲醇溶解制成对照品溶液，蒙花苷对照品溶液的浓度控制在25-30μg/ml，木犀草苷对照品溶液的浓度控制在40-50μg/ml，绿原酸对照品溶液的浓度控制在0.5-0.6mg/ml。

3.根据权利要求1所述的一种复方感冒灵流膏的化学成分标准指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤(A)中，相B的磷酸水溶液的质量百分比浓度控制在0.4-0.5％。

4.根据权利要求1所述的一种复方感冒灵流膏的化学成分标准指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤(A)中，流速控制在0.9-1.0ml/min，柱温32-33℃，检测波长控制在325-326nm。

5.根据权利要求1所述的一种复方感冒灵流膏的化学成分标准指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤(B)中，所述复方感冒灵流膏的制备方法包括：将山银花、五指柑、野菊花、三叉苦、南板蓝根、岗梅混合后反复煎煮1-2次，合并煎液浓缩即得。

6.根据权利要求5所述的一种复方感冒灵流膏的化学成分标准指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤(B)中，每次煎煮的时间控制在1-2h，优选1.5-1.8h。

7.根据权利要求5所述的一种复方感冒灵流膏的化学成分标准指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤(B)中，将复方感冒灵流膏与甲醇溶液混合搅拌均匀，加热提取、定量、过滤即得标准样品溶液；

优选地，所述步骤(B)中，加热提取的操作温度控制在90℃以上。

8.根据权利要求7所述的一种复方感冒灵流膏的化学成分标准指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤(B)中，加热提取的操作时间控制在1-2h。

9.采用权利要求1-8任一项所述的构建方法构建得到的复方感冒灵流膏化学成分标准指纹图谱。

10.权利要求9所述的复方感冒灵流膏的化学成分标准指纹图谱在复方感冒灵的质量检测方面的应用；

优选的，所述应用为将复方感冒灵流膏制成待测品溶液在权利要求1所述的液相色谱操作条件下进行梯度洗脱得到待测品化学成分指纹图谱，并与所述的化学成分标准指纹图谱进行对比。