CN107102087A - 一种离子色谱检测黄连中多种有机酸含量的方法 - Google Patents

一种离子色谱检测黄连中多种有机酸含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种离子色谱检测多种有机酸含量的方法，步骤如下：a、制备供试品溶液；b、制备对照品溶液；c、分别将供试品溶液和对照品溶液注入离子色谱仪检测；d、根据检测结果计算得到黄连中的有机酸含量。本发明方法可以同时测定黄连中多种有机酸含量，准确可靠、简便快速，为黄连的临床应用提供了有效的参考。

Description

一种离子色谱检测黄连中多种有机酸含量的方法
技术领域
本发明涉及一种离子色谱检测黄连中多种有机酸含量的方法。
背景技术
黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.、三角叶黄连Coptisdeltoidea C.Y.Chenget Hsiao或云连Coptis teeta wall.的干燥根茎，三种分别习称“味连”、“雅连”和“云连”。主产四川，湖北、湖南、陕西、甘肃等省亦有栽培。味苦、性寒，归心、脾、胃、肝、胆、大肠经。具有清热燥湿，泻火解毒的功效。主要用于湿热痞满、呕吐吞酸、泻痢、黄疸、高热神昏、心火亢盛、心烦不寐、血热、目赤、牙痛、痈肿疔疮，外治湿疹、湿疮、耳道流脓。
黄连含有黄酮类物质、氨基酸、有机酸等多种有效成分，有机酸是黄连的重要物质组成，研究表明，有机酸类成分具有抗肿瘤、抑菌、抗血酸、降血脂等广泛的生物活性，可以用来作为质量控制的指标。
目前，已有文献报道了对黄连中有机酸的分离及检测，方法主要有薄层色谱法、毛细管电泳法和高效液相色谱法，但测定的有机酸种类仅涉及香草酸、阿魏酸等不超过4种有机酸，种类较少。考虑到黄连药材中的有机酸成分繁多，以少数有机酸的含量作为质量标准的指标可靠性不高。但目前尚无一次性对黄连中的奎尼酸、乙酸、酒石酸、草酸、柠檬酸等五种以上有机酸，进行同时测定的报道。
发明内容
为了更有效的控制黄连药材质量，本发明的目的在于提供一种同时黄连中多种有机酸含量的方法。
本发明提供了一种离子色谱检测多种有机酸含量的方法，步骤如下：
a、制备供试品溶液：
取黄连粉末，加水提取，过滤，得供试品溶液；
b、制备对照品溶液：配制有机酸的混合标准工作溶液；
c、分别将供试品溶液和对照品溶液注入离子色谱仪检测，色谱条件如下：
色谱柱：AS11-HC色谱柱；
流动相：KOH溶液；
流速：0.9～1.1mL/min；
梯度程序为：
柱温：30℃；
d、根据检测结果计算得到黄连中的有机酸含量。
其中，所述有机酸为奎尼酸、乙酸、酒石酸、草酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、甲酸、乌头酸中的2种以上。
进一步地，所述有机酸为奎尼酸、乙酸、酒石酸、草酸和柠檬酸；
其中，所述有机酸还包括甲酸和乌头酸；和/或，所述有机酸还包括苹果酸和琥珀酸。
其中，步骤a中，所述加水提取的条件为：在黄连粉末中加入50倍量的水，超声30min，然后放置30分钟。
其中，步骤a中，所述过滤的条件为：将加水处理后的样品抽滤，过RP柱，然后过0.2um微孔滤膜即可。
其中，步骤c中，所述离子色谱仪型号为ICS-2100。
其中，所述色谱条件的流速为1.0mL/min。
其中，所述色谱条件的电导检测器检测池温度为35℃。
其中，所述供试品溶液和对照品溶液的进样量为25μL。
本发明通过对提取方法和色谱条件的筛选，成功建立了同时测定黄连中多种有机酸含量的离子色谱方法，该方法准确可靠、简便快速，为提高黄连的质量控制水平、促进药材的开发利用奠定了基础。同时，本发明的方法还可以准确检测不同基源黄连品种中5种以上有机酸成分，为黄连的临床应用提供了有效的参考。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1各种有机酸标准图谱
具体实施方式
下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
本发明所用的实验试剂，均可通过商业方式购买。
其中，离子色谱仪：型号为ICS-2100，厂家为美国热电。
实施例1本发明方法测定黄连中有机酸含量
1、标准溶液配制
奎尼酸、乙酸、甲酸、酒石酸、草酸、柠檬酸、乌头酸混合标准储备溶液:分别称取各有机酸50mg于50mL容量瓶中，加水溶解定容，混匀，于4℃保存，其中各有机酸的质量浓度为1000μg/mL。
奎尼酸、乙酸、甲酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、草酸、柠檬酸和乌头酸混合标准曲线工作液：分别吸取混合标准溶液(3.4.1)0.50mL、1.00mL、2.00mL、5.00mL、10.00mL于25mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，混匀，于4℃保存。
2、样品处理
先用磨碎机将少量试样磨碎，弃去，再磨碎其余部分，充分混匀，作为待测试样。称取2g±0.0020左右的黄连样品，置于250mL容量瓶中，精确加入100mL超纯水提取样品，摇匀，超声提取30min，放置30分钟后抽滤，过RP柱，过0.2um微孔滤膜，放置30min后待测。
过RP柱的具体操作如下：RP柱首先用10ml甲醇活化，然后过15ml水，活化半小时后直接上样品提取液，弃掉前面3ml，收集后面流出液，即可。
3.离子色谱
1)色谱条件如下：
色谱柱：AS11-HC
流动相：KOH溶液(免化学试剂)外加水模式
流速：1.0mL/min。
检测器：电导检测器，检测池温度：35℃。
柱温：30℃。
进样量为25μL。
2)标准曲线绘制：
将标准系列工作液分别注入高效液相色谱仪中,测定相应的峰高或峰面积。以标准工作液的浓度为横坐标,以色谱峰高或峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。
3)样品溶液的测定
将样品溶液注入离子色谱仪中,得到峰高或峰面积,根据标准曲线得到待测液中有机酸的浓度。
4.结果分析
试样中有机酸的含量按下式计算：
式中：
X----试样中被测组分含量，单位为克每千克(g/kg)；
C----从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为微克每毫升(μg/ml)；
V----样品溶液最终定容体积，单位为毫升(ml)；
M----样品溶液所代表最终试样的质量，单位为克(g)。
以下通过试验例具体说明本发明的有益效果。
试验例1本发明方法的工艺参数筛选
一、样品不同处理方式的比较
实验比较了C18、RP柱对去除黄连提取液大分子有机物干扰的效果，方法如下：制备黄连供试品溶液时，通过将黄连提取液分别经过C18和RP柱，收集洗脱液，比较洗脱前后离子色谱干扰峰的面积，得出各小柱对黄连提取液有机物的去除率。
结果见表1。
表1 C18、RP柱对去除黄连提取液大分子有机物干扰的结果
可见，RP柱去除黄连提取液大分子有机物的效果最佳，可达93％，显著优于C18柱。
二、不同色谱柱的分离效果比较
实验比较了两种色谱柱(AS 11-HC和AS-15)的分离效果，结果表明，As-15色谱柱在奎尼酸、乙酸和甲酸的分离效果不如As11-HC，分离度较差，达不到基线分离；而AS 11-HC相比AS-15对本发明的有机酸均有良好的分离效果。
试验例2本发明方法对不同基源黄连的测定结果
分别取雅连(采自四川峨眉)、云连(采自云南福贡)、味连(采自重庆石柱)，按照实施例1的方法测定各自的有机酸成分。结果见表2。
表2 对不同黄连有机酸的检测结果
雅连(mg/g) 云连(mg/g) 味连(mg/g)
奎尼酸 4.00 27.83 2.90
乙酸 1.03 0.18 0.78
苹果酸+琥珀酸 9.93 15.25 9.82
酒石酸 0.76 0.46 0.96
草酸 1.25 0.34 0.64
柠檬酸 1.40 1.53 1.19
甲酸 未检出 未检出 未检出
乌头酸 未检出 未检出 未检出
可见，本发明方法可以测定不同基源的黄连中各种有机酸含量。
试验例3本发明方法的方法学验证
1、线性关系的考察
配制包含以下线性范围的有机酸混合标准溶液，按照实施例1的方法进行离子色谱分析，并以各离子浓度和峰面积作图，得到各离子的工作曲线，结果见表3。
表3 不同有机酸的线性范围
可见，各对照品在各自质量浓度范围内线性关系良好，说明本发明方法线性范围广，准确度高。
2、检测限的考察
配制10个接近空白的标准溶液，按照实施例1的方法，分别进行离子色谱分析，以3倍信噪比计算出各有机酸的定性检出限(以浓度表示)，10倍信噪比为各有机酸的定量检测限(浓度)。通过实施例1的称样量和定容体积，计算出检出限(以含量表示)。
表4 不同有机酸的检测限
可见，本发明方法可以检测各种低浓度的有机酸，灵敏度高。
3、回收率的考察
以云连为例，分别在样品中添加三个浓度水平的各有机酸(1.添加50％的样品浓度；2.添加100％的样品浓度；3.添加150％的样品浓度)，按照实施例1的方法检测，得到的回收率范围见表5。
表5 有机酸的回收率(以云连为例)
可见，使用本发明方法，样品回收率较高，说明本发明方法准确度高。。
4、重复性的考察
以云连为例，按照实施例1的方法，分别进行了6次重复测定，计算测定结果的RSD，结果见表6。
表6 有机酸的重复性(以云连为例)
可见，使用本发明方法，各有机酸的相对标准偏差均小于10％，，说明本发明方法重复性良好。
综上，本发明通过对提取方法和色谱条件的筛选，成功建立了同时测定黄连中多种有机酸含量的离子色谱方法，该方法准确可靠、简便快速，为提高黄连的质量控制水平、促进药材的开发利用奠定了基础。

Claims (10)

1.一种离子色谱检测多种有机酸含量的方法，其特征在于：步骤如下：
a、制备供试品溶液：
取黄连粉末，加水提取，过滤，得供试品溶液；
b、制备对照品溶液：配制有机酸的混合标准工作溶液；
c、分别将供试品溶液和对照品溶液注入离子色谱仪检测，色谱条件如下：
色谱柱：AS11-HC色谱柱；
流动相：KOH溶液；
流速：0.9～1.1mL/min；
梯度程序为：
柱温：30℃；
d、根据检测结果计算得到黄连中的有机酸含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述有机酸为奎尼酸、乙酸、酒石酸、草酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、甲酸、乌头酸中的2种以上。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述有机酸为奎尼酸、乙酸、酒石酸、草酸和柠檬酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述有机酸还包括甲酸和乌头酸；和/或，所述有机酸还包括苹果酸和琥珀酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a中，所述加水提取的条件为：在黄连粉末中加入50倍量的水，超声30min，然后放置30分钟。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a中，所述过滤的条件为：将加水处理后的样品抽滤，过RP柱，然后过0.2um微孔滤膜即可。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中，所述离子色谱仪型号为ICS-2100。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述色谱条件的流速为1.0mL/min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述色谱条件的电导检测器检测池温度为35℃。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述供试品溶液和对照品溶液的进样量为25μL。
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