CN105274075A - 一种黑曲霉在制备β-呋喃果糖苷转移酶中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种黑曲霉在制备β-呋喃果糖苷转移酶中的应用，所述黑曲霉(Aspergillus？niger)FOS-0620，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC？No.6640。黑曲霉FOS-0620在诱导发酵培养基中发酵后，经过过滤、洗涤、冷冻干燥、酶解破壁后得到β-呋喃果糖苷转移酶粗酶液，粗酶液通过分离纯化，获得高纯度的β-呋喃果糖苷转移酶。本发明所制备的β-呋喃果糖苷转移酶酶活高，具有较广泛的温度适用范围；利用该酶以蔗糖为底物催化制备的蔗果低聚糖，工艺简单，含量高，达到国家标准。

Description

一种黑曲霉在制备β-呋喃果糖苷转移酶中的应用
技术领域
本发明涉及生物制品领域，具体涉及一种黑曲霉在制备β-呋喃果糖苷转移酶中的应用。
背景技术
蔗果低聚糖(FOS)，是由1～3个果糖基通过β-1,2糖苷键与蔗糖(GF)中的果糖基结合生成的蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)和蔗果五糖(GF4)等的混合物，是一种新型的功能性低聚果糖。FOS热量低，具有降血脂、防龋齿、防止有害菌生长等优异性能，还具有促进人体双歧杆菌等益生菌生长等生理活性，因此被广泛应用于食品、饲料和化妆品等行业。
目前生产FOS的方法主要有5种：(1)直接从天然植物原料中提取；(2)利用天然多糖的酶水解、酸水解反应获得；(3)通过化学合成的方法获得；(4)利用菌体进行液体深层发酵获得；(5)利用转移酶、水解酶催化的糖基转移反应合成(苏加坤，王机，姚评佳，等.β-呋喃果糖苷转移酶的抑制及其在低聚果糖生产中的应用.化学与生物工程，2007，24(5)：64-66)。前三种方法原料需求量大、能源消耗较高，且FOS的得率较低。菌体液体深层发酵法所生产出来的产品成分复杂，不仅要除去大量的菌丝体，蛋白质和无机盐等杂质，而且还容易发生美拉德褐变，给后期的分离纯化带来诸多的困难，并且易使产品色度加深，影响感官质量。而利用微生物及其相应的酶制备FOS不仅能够提高生产效率，还能够降低生产成本，具有良好的发展前景。
β-呋喃果糖苷转移酶(β-Fructofuranosidase，简称β-FFase)是一种来自于植物和微生物中的酶，以蔗糖为原料，由β-呋喃果糖苷转移酶β-进行果糖基转移反应而合成蔗果低聚糖，蔗糖既是果糖的供应者也是接收者(刘冬梅，于淑娟，李国基，等.一种新型的功能性低聚糖-蔗果低聚糖及其生产方法，食品工业，1998，3：14-16)。植物中的果糖基转移酶催化活性很弱，产率低，且受到季节限制，而来自微生物的果糖基转移酶比植物的催化活性高，可催化较高浓度的蔗糖进行转糖基反应，反应过程受杂菌污染的机会较少，使用方便。
但目前报道的生产菌株产量不高，其中β-的酶活低且不稳定(马歌丽，张学军，靳丽.黑曲霉产β-呋喃果糖苷酶酶学性质研究.中国酿造，2009，207(6)：22-24)，因此筛选出高产和稳定的菌株并分离纯化出其转移酶，是目前该行业的重要研究内容之一。
发明内容
本发明目的在于提供一种黑曲霉在制备β-呋喃果糖苷转移酶中的应用，利用一种黑曲霉，通过发酵培养制备粗酶液，进一步通过层析分离制备电泳纯β-呋喃果糖苷转移酶。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种黑曲霉在制备β-呋喃果糖苷转移酶中的应用，包括如下步骤：
(1)以体积百分比5％～10％的接种量，将处于对数期生长的黑曲霉FOS-0620的菌悬液接种于发酵诱导培养基中，进行诱导发酵培养，将得到的培养液离心或过滤得菌泥，用无菌水清洗后再离心或过滤，冷冻干燥，得到黑曲霉菌体；
(2)在上述黑曲霉菌体中加入提酶缓冲液，使黑曲霉FOS-0620菌体浓度为5mg/mL～30mg/mL，加入蜗牛酶，混匀后进行菌体破壁，破壁后的菌液经离心后的上清液为β-呋喃果糖苷转移酶粗酶液，经分离纯化，得到β-呋喃果糖苷转移酶。
步骤(1)所述诱导发酵培养的条件为30℃～40℃，100r/min～200r/min摇床培养，发酵时间为36h～72h。
所述的发酵诱导培养基：按重量份计，蔗糖2～10份，酵母浸膏1～5份，玉米粉1～5份，NaNO30.1～0.5份，pH6.0～7.5，用蒸馏水定容至100份，灭菌后冷却即可。
步骤(2)所述蜗牛酶的浓度为0.2mg/mL～0.8mg/mL。
步骤(2)所述提酶缓冲液中含有胰蛋白酶抑制剂和二硫苏糖醇，其浓度分别为1μg/mL～3μg/mL和0.5μmol/mL～2.0μmol/mL。
所述β-呋喃果糖苷转移酶粗酶液分离纯化的步骤如下：所述粗酶液经过高流速离子型琼脂糖凝胶(DEAESepharoseFastFlow)阴离子交换层析柱和苯基-琼脂糖凝胶(PhenylSepharoseCL-4B)疏水亲和层析柱中的一种或两种层析，制得β-呋喃果糖苷转移酶。
所述阴离子交换层析是将粗酶液上样至阴离子交换层析柱上，先用不含NaCl的Tris-HCl缓冲液将层析柱洗至基线，再用含0mM～300mM的NaCl的Tris-HCl缓冲液进行NaCl梯度洗脱，分部收集，测定每个洗脱峰的β-呋喃果糖苷转移酶酶活，合并具有β-呋喃果糖苷转移酶的组分，透析除盐后用聚乙二醇20000浓缩；
所述疏水亲和层析是经阴离子交换层析后所得的β-呋喃果糖苷转移酶组分上样至疏水亲和层析柱上，先用含(NH4)2SO4为25％的Tris-HCl缓冲液将层析柱洗至基线，再用含0％～25％(NH4)2SO4的Tris-HCl缓冲液进行从高浓度到低浓度的梯度洗脱，分部收集，测定每个洗脱峰的β-呋喃果糖苷转移酶酶活，合并具有β-呋喃果糖苷转移酶的组分，透析除盐并用聚乙二醇20000浓缩。
所述Tris-HCl缓冲液的浓度为20mM～100mM，pH为7.0～7.5；
所述阴离子交换层析和疏水亲和层析中洗脱的流速分别为1mL/min和0.5mL/min。
步骤(1)所述清洗和离心或过滤的操作至少重复1次；步骤(2)所述菌体破壁时间为2h～5h，破壁温度为30℃～40℃。
所得电泳纯β-呋喃果糖苷转移酶可用于制备蔗果低聚糖(FOS)，温度为20℃～60℃，pH为5.0～8.0。优选地，所述β-呋喃果糖苷转移酶用于制备FOS的温度为33℃，pH为6.5。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
(1)本发明中使用的黑曲霉FOS-0620进行急性毒理实验证明是食用安全的，其发酵产酶稳定，培养基来源广泛，发酵生产成本低，具有良好的商业前景。
(2)利用本发明方法的黑曲霉FOS-0620，得到的β-呋喃果糖苷转移酶活力高，例如以200g/L的蔗糖为底物测定酶液的酶活，其最大酶活达到16.95U/mg。
(3)所制备的β-呋喃果糖苷转移酶活力高，β-呋喃果糖苷转移酶制备蔗果低聚糖的条件简单，最适酶作用温度为33℃，在20℃～60℃酶活稳定性较好，在60℃保温30min仍有50％的酶活性，具备较好的高温耐受性；该酶的最适pH为6.5，在pH5.0～8.0内具有较好的酶活稳定性。本发明所公开的条件可使β-呋喃果糖苷转移酶的酶活损失少，得到的β-呋喃果糖苷转移酶纯度高，增加了工业用耐高温果糖苷转移酶的种类。
(4)本发明方法制备的β-呋喃果糖苷转移酶纯度高，用来制备固定化酶后，可以多次重复使用，提高了使用率。
(5)本发明方法制备的β-呋喃果糖苷转移酶加入到FOS的转化体系中，所得的FOS糖液不需要经过脱色，不需要经过离子交换柱脱盐，只需要经过简单的过滤，浓缩后即可得到固形物中的总低聚糖的含量≥50％的FOS糖浆，符合GB/T23528-2009低聚果糖中的非强制性国家标准，整个工艺简单，操作方便，生产成本明显降低。
本发明所述黑曲霉是黑曲霉(Aspergillusniger)FOS-0620，已于2012年9月28日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCCNo.6640。该菌株已经在专利CN103045489A中公开，属于现有技术。
附图说明
图1为实施例1中黑曲霉FOS-0620的β-呋喃果糖苷转移酶粗酶液用阴离子交换层析柱(DEAESepharoseFastFlow)分离后的蛋白质曲线图(其中第3个峰有β-呋喃果糖苷转移酶活性)。
图2为实施例1中黑曲霉FOS-0620粗酶液经阴离子柱分离后第3个峰的蛋白质用疏水亲和层析(PhenylSepharoseCL-4B)分离后的蛋白质曲线图(其中第3个峰有β-呋喃果糖苷转移酶活性)。
图3为实施例1中β-呋喃果糖苷转移酶催化生产蔗果低聚糖的HPLC(FOS-Nytose为蔗果四糖、蔗果五塘；1-Kestose为蔗果三糖；Sugar为蔗糖；glucose为葡萄糖；fructose为果糖)。
图4为实施例1中经凝胶层析柱分离后β-呋喃果糖苷转移酶的SDS-PAGE电泳图(分离胶浓度为12.5％，浓缩胶浓度为4％，从左至右1、2、3条带分别为蛋白质标准、经阴离子柱层析柱分离后、经阴离子柱层析柱和疏水亲和层析柱分离后)。
图5为实施例1中β-呋喃果糖苷转移酶在不同温度下的稳定性曲线。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)以体积百分比5％的接种量，将处于对数期生长的黑曲霉FOS-0620的菌悬液接种于发酵诱导培养基中，于33℃和133r/min的恒温摇床上进行诱导发酵培养48h后，将得到的培养液用400目的滤袋过滤，所得菌泥用无菌水清洗后再用400目的滤袋过滤，清洗和过滤的操作重复2次，得到菌体，在-40℃、真空度为0.030psi下干燥得到具有β-FFase活性的黑曲霉菌体。所述的发酵诱导培养基：按重量份计，蔗糖7份，酵母浸膏2份，玉米粉1.5份，NaNO30.3份，pH6.5，用蒸馏水定容至100份，混合均匀后于121℃下灭菌冷却后备用。
(2)在(1)中黑曲霉菌体中，加入含2μg/mL的胰蛋白酶抑制剂和1.5μmol/mL的二硫苏糖醇(简称DTT)提酶缓冲液，使黑曲霉菌体浓度为10mg/mL，加入蜗牛酶并使其浓度为0.5mg/mL，混匀后于37℃和120r/min下进行黑曲霉FOS-0620菌体破壁3h，然后在4℃用8000r/min离心10min，离心后的上清液为β-FFase粗酶液，其β-FFase酶活为0.2517U/mg，取粗酶液进行分离纯化。
以蔗糖为底物，采用高效液相色谱法测定各步骤得到的β-FFase酶活和产物中蔗果低聚糖的含量。具体测定和计算方法如下：
β-FFase反应体系和反应过程：将0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和0.1mol/L柠檬酸溶液配制成pH6.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，用上述缓冲液配制200g/L的蔗糖溶液，用作底物溶液；在2mL底物溶液中加入50μL酶液，在30℃～40℃、133r/min气浴摇床中反应24h，100℃水浴中煮沸10min终止反应，最后测定反应体系中各糖组分的含量。
采用高效液相色谱法检测FOS的含量。流动相为双蒸水，使用前经0.22μm滤膜过滤，超声脱气，流动相流速为0.6mL/min，柱温80℃；样品溶液在8000r/min下离心10min后取上清液，然后再用0.22μm膜过滤后进样，进样体积为10μL；蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、葡萄糖、果糖等标准品的质量浓度均为1.333g/L、2.670g/L、3.560g/L、5.333g/L；蔗糖标准品浓度分别为1.333g/L、3.333g/L、4.670g/L、6.670g/L。用Empower积分软件进行数据处理。FOS含量为蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖绝对含量的总和，单位为g/L。β-FFase催化生产得到的FOS糖浆的各糖组分的HPLC结果如图4所示，蔗果四糖和蔗果五糖无法分开，一起出峰时间为8.410min，蔗果三糖、蔗糖、葡萄糖和果糖的出峰时间分别为8.855、9.725、11.504、和14.610min。
酶活计算方法：以反应体系中每分钟转移1μmol果糖基所需的酶量为一个果糖转移酶活力单位(U)，酶的比活力是反应体系中每毫克蛋白的酶活力，单位为U/mg。酶活计算公式如下：
Activity(U)＝(m1/504+(2×m2)/666+(3×m3)/828)/t
其中m1为酶解产物中蔗果三糖的质量，单位为μg，504为蔗果三糖的摩尔质量，单位为g/mol；m2为酶解产物中蔗果四糖的质量，单位为μg,666为蔗果四糖的摩尔质量，单位为g/mol；m3为酶解产物中蔗果五糖的质量，单位为μg，828为蔗果五糖的摩尔质量，单位为g/mol；t为反应时间，单位为min。
(3)将经过第(2)步所得的β-FFase粗酶液于4℃和8000r/min下离心5min，上清液上样至预先用pH7.2的不含NaCl的50mM的Tris-HCl缓冲液平衡好的阴离子交换层析柱上，先用无NaCl的缓冲液将蛋白质洗至基线，再用含0mM～300mM的NaCl的Tris-HCl缓冲液进行NaCl梯度洗脱，流速为1mL/min，分部收集，测定每个洗脱峰的β-FFase酶活，合并具有β-FFase组分，透析除盐后用聚乙二醇20000浓缩，结果如图1所示，第3个峰有β-FFase活性，其β-FFase酶活为6.003U/mg。
(4)将经过第(3)步所得的β-FFase组分上样至预先用pH7.2的含25％(NH4)2SO4的Tris-HCl缓冲液平衡的疏水亲和层析柱上，再用含(NH4)2SO4为0％～25％的Tris-HCl缓冲液进行从高浓度到低浓度的梯度洗脱，流速为0.5mL/min，分部收集，测定每个洗脱峰的β-FFase酶活，合并具有β-FFase酶活的组分，透析除盐后用聚乙二醇20000浓缩，结果如图2所示，第3个峰有β-FFase活性，其β-FFase酶活为16.95U/mg。
本例第(4)步得到的β-FFase催化反应中蔗果低聚糖的总含量(占干物质)为56.64％，符合GB/T23528-2009低聚果糖中的非强制性国家标准的固形物中的总低聚糖的含量≥50％的要求。
以上阴离子交换层析和疏水亲和层析等步骤中，β-FFase的纯化倍数和得率如下表1所示。各步骤分离后获得的β-FFase的SDS-PAGE电泳图如图4所示，经阴离子交换层析和疏水亲和层析收集的β-FFase经SDS-PAGE电泳后可以看到较明显的条带，疏水亲和层析后的目的蛋白条带含量很少，因此跑出来的条带颜色很浅，β-FFase的分子量最可能为75KDa，与文献(LHS,TerenziHF,PolizeliML,etal.Productionandcharacterizationofathermostableextracellularβ-d-fructofuranosidaseproducedbyAspergillusochraceuswithagroindstrialresiduesascarbonsources.EnzymeandMicrobialTechnology,2007,42(1):52-57)中从A.ochraceus中分离出的β-FFase的分子量79KDa接近。取经过以上疏水亲和层析收集的β-FFase进行酶的反应及温度稳定性实验，还对产物蔗果低聚糖进行检测。
表1黑曲霉FOS-0620的β-FFase纯化
备注：No.1为β-FFase粗酶；No.2为经过阴离子层析柱纯化后β-FFase；No.3为经过阴离子层析柱疏水亲和层析纯化后的β-FFase。
β-FFase的温度稳定性实验：考察了温度范围为20℃～70℃酶活变化，将β-FFase在20、30、40、50、60、70℃下分别保温30min，在pH6.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制的β-FFase反应体系中进行酶活测量，结果如图5所示。结果表明，该酶的最适反应温度为30℃～40℃，在60℃仍保留有50％以上的酶活，具有高温反应活性。
实施例2
(1)以体积百分比5％的接种量，将处于对数期生长的黑曲霉FOS-0620的菌悬液接种于发酵诱导培养基中，于30℃和100r/min下培养36h后，所得发酵液用400目的滤袋过滤，所得菌泥用无菌水清洗后再8000r/min离心10min，清洗和离心的操作重复2次，得到菌体，在-40℃、真空度为0.030psi下干燥得到黑曲霉菌体。所述的发酵诱导培养基：按重量份计，蔗糖2份，酵母浸膏1份，玉米粉1.0份，NaNO30.1份，pH6.0，用蒸馏水定容至100份，混合均匀后于121℃下灭菌冷却后备用。
(2)在(1)中黑曲霉菌种中，加入含1μg/mL的胰蛋白酶抑制剂和0.5μmol/mL的DTT的提酶缓冲液，使黑曲霉菌体浓度为5mg/mL，加入蜗牛酶并使其浓度为0.2mg/mL，混匀后于37℃和120r/min下进行黑曲霉FOS-0620菌体破壁2h，然后在4℃用8000r/min离心10min，离心后的上清液为β-FFase粗酶液，其βFFase酶活为0.0782U/mg。
(3)将经过第(2)步所得的β-FFase粗酶液于4℃和8000r/min下离心5min，上清液上样至预先用pH7.0的不含NaCl的50mM的Tris-HCl缓冲液平衡好的阴离子交换层析柱上，先用无NaCl的缓冲液将蛋白质洗至基线，再用含0mM～300mM的NaCl的Tris-HCl缓冲液进行NaCl梯度洗脱，流速为1mL/min，分部收集，从左到右蛋白峰的洗脱NaCl浓度为0mM、30mM、100mM，整个洗脱阶段出现3个大小不一的蛋白质峰，在测定每个洗脱峰的β-FFase酶活时发现第3个峰具有酶活性，合并具有β-FFase组分，透析除盐后用聚乙二醇20000浓缩，其β-FFase酶活为1.687U/mg。
(4)将经过第(3)步所得的β-FFase组分上样至预先用pH7.0的含(NH4)2SO4为25％的Tris-HCl缓冲液平衡的疏水亲和层析柱上，再用含(NH4)2SO4为0％～25％的Tris-HCl缓冲液进行从高浓度到低浓度的梯度洗脱，流速为0.5mL/min，分部收集，洗脱过程中出现4个不同的蛋白质峰，在对各个洗脱峰进行活性测定时发现第3个峰具有酶活性，合并具有β-FFase酶活的组分，透析除盐后用聚乙二醇20000浓缩，其β-FFase酶活为4.274U/mg。
在2mL的蔗糖浓度为600g/L溶液中加入50μL的第(4)步得到的β-FFase酶液，按照实施例1的条件进行反应后，采用HPLC法测定反应体系中蔗果低聚糖的总含量(占干物质)为55.74％。
实施例3
(1)以体积百分比10％的接种量，将处于对数期生长的黑曲霉FOS-0620的菌悬液接种于发酵诱导培养基中，于40℃和200r/min下培养72h后，所得发酵液用400目的滤袋过滤，所得菌泥用无菌水清洗后再用400目的滤袋过滤，清洗和过滤的操作重复2次，得到菌体，在-40℃、真空度为0.030psi下干燥得到黑曲霉菌体。所述的发酵诱导培养基：按重量份计，蔗糖10份，酵母浸膏5份，玉米粉5份，NaNO30.5份，pH7.5，用蒸馏水定容至100份，混合均匀后于121℃下灭菌冷却后备用。
(2)在(1)中黑曲霉菌种中，加入含3μg/mL的胰蛋白酶抑制剂和2μmol/mL的DTT的提酶缓冲液，使黑曲霉菌体浓度为30mg/mL，加入蜗牛酶并使其浓度为0.8mg/mL，混匀后于37℃和120r/min下进行黑曲霉FOS-0620菌体破壁5h，然后在4℃用8000r/min离心10min，离心后的上清液为β-FFase粗酶液，其β-FFase酶活为0.1863U/mg。
(3)将经过第(2)步所得的β-FFase粗酶液于4℃和8000r/min下离心5min，上清液上样至预先用pH7.5的不含NaCl的50mM的Tris-HCl缓冲液平衡好的阴离子交换层析柱上，先用无NaCl的缓冲液将蛋白质洗至基线，再用含0mM～300mM的NaCl的Tris-HCl缓冲液进行NaCl梯度洗脱，流速为1mL/min，分部收集，从左到右蛋白峰的洗脱NaCl浓度为0mM、30mM、100mM，整个洗脱阶段出现3个大小不一的蛋白质峰，在测定每个洗脱峰的β-FFase酶酶活性，合并具有β-FFase组分，透析除盐后用聚乙二醇20000浓缩，其β-FFase酶活为4.057U/mg。
(4)将经过第(3)步所得的β-FFase组分上样至预先用pH7.5的含(NH4)2SO4为25％的Tris-HCl缓冲液平衡的疏水亲和层析柱上，再用含(NH4)2SO4为0％～25％的Tris-HCl缓冲液进行从高浓度到低浓度的梯度洗脱，流速为0.5mL/min，分部收集，洗脱过程中出现4个不同的蛋白质峰，在对各个洗脱峰进行酶活性测定，合并具有β--]FFase酶活的组分，透析除盐后用聚乙二醇20000浓缩，其β-FFase酶活为11.306U/mg。
在2mL的蔗糖浓度为300g/L溶液中加入50μL的第(4)步得到的β-FFase酶液，按照实施例1的条件进行反应后，采用HPLC法测定反应体系中蔗果低聚糖的总含量(占干物质)为58.52％。
实施例4
(1)以体积百分比7％的接种量，将处于对数期生长的黑曲霉FOS-0620的菌悬液接种于发酵诱导培养基中，于37℃和150r/min下培养60h后，所得发酵液用400目的滤袋过滤，所得菌泥用无菌水清洗后再8000r/min离心10min，清洗和离心的操作重复2次，得到菌体，在-40℃、真空度为0.030psi下干燥得到黑曲霉菌体。所述的发酵诱导培养基：按重量份计，蔗糖4份，酵母浸膏3份，玉米粉2份，NaNO30.3份，pH7.0，用蒸馏水定容至100份，混合均匀后于121℃下灭菌冷却后备用。
(2)在(1)中黑曲霉菌种中，加入含2μg/mL的胰蛋白酶抑制剂和1μmol/mL的DTT的提酶缓冲液，使黑曲霉菌体浓度为15mg/mL，加入蜗牛酶并使其浓度为0.5mg/mL，混匀后于37℃和120r/min下进行黑曲霉FOS-0620菌体破壁4h，然后在4℃用8000r/min离心10min，离心后的上清液为β-FFase粗酶液，其β-FFase酶活为0.1356U/mg。
(3)将经过第(2)步所得的β-FFase粗酶液于4℃和8000r/min下离心5min，上清液上样至预先用pH7.3的不含NaCl的50mM的Tris-HCl缓冲液平衡好的阴离子交换层析柱上，先用无NaCl的缓冲液将蛋白质洗至基线，再用含0mM～300mM的NaCl的Tris-HCl缓冲液进行NaCl梯度洗脱，流速为1mL/min，分部收集，从左到右蛋白峰的洗脱NaCl浓度为0mM、30mM、100mM，整个洗脱阶段出现3个大小不一的蛋白质峰，在测定每个洗脱峰的β-FFase酶酶活性，合并具有β-FFase组分，透析除盐后用聚乙二醇20000浓缩，其β-FFase酶活为2.918U/mg。
(4)将经过第(3)步所得的β-FFase组分上样至预先用pH7.3的含(NH4)2SO4为25％的Tris-HCl缓冲液平衡的疏水亲和层析柱上，再用含(NH4)2SO4为0％～25％的Tris-HCl缓冲液进行从高浓度到低浓度的梯度洗脱，流速为0.5mL/min，分部收集，洗脱过程中出现4个不同的蛋白质峰，在对各个洗脱峰进行酶活性测定，合并具有β-FFase酶活的组分，透析除盐后用聚乙二醇20000浓缩，其β-FFase酶活为7.278U/mg。
在2mL的蔗糖浓度为400g/L溶液中加入50μL的第(4)步得到的β-FFase酶液，按照实施例1的条件进行反应后，采用HPLC法测定反应体系中蔗果低聚糖的总含量(占干物质)为57.48％。
实施例5
(1)以体积百分比8％的接种量，将处于对数期生长的黑曲霉FOS-0620的菌悬液接种于发酵诱导培养基中，于33℃和150r/min下培养72h后，所得发酵液用400目的滤袋过滤，所得菌泥用无菌水清洗后再用400目的滤袋过滤，清洗和过滤的操作重复2次，得到菌体，在-40℃、真空度为0.030psi下干燥得到黑曲霉菌体。所述的发酵诱导培养基：按重量份计，蔗糖8份，酵母浸膏4份，玉米粉3份，NaNO30.4份，pH6.5，用蒸馏水定容至100份，混合均匀后于121℃下灭菌冷却后备用。
(2)在(1)中黑曲霉菌种中，加入含2.5μg/mL的胰蛋白酶抑制剂和1.5μmol/mL的DTT的提酶缓冲液，使黑曲霉菌体浓度为20mg/mL，加入蜗牛酶并使其浓度为0.6mg/mL，混匀后于37℃和120r/min下进行黑曲霉FOS-0620菌体破壁3h，然后在4℃用8000r/min离心10min，离心后的上清液为β-FFase粗酶液，其β-FFase酶活为0.1532U/mg。
(3)将经过第(2)步所得的β-FFase粗酶液于4℃和8000r/min下离心5min，上清液上样至预先用pH7.2的不含NaCl的50mM的Tris-HCl缓冲液平衡好的阴离子交换层析柱上，先用无NaCl的缓冲液将蛋白质洗至基线，再用含0mM～300mM的NaCl的Tris-HCl缓冲液进行NaCl梯度洗脱，流速为1mL/min，分部收集，从左到右蛋白峰的洗脱NaCl浓度为0mM、30mM、100mM，整个洗脱阶段出现3个大小不一的蛋白质峰，在测定每个洗脱峰的β-FFase的酶活性，合并具有β-FFase组分，透析除盐后用聚乙二醇20000浓缩，其β--FFase酶活为3.526U/mg。
(4)将经过第(3)步所得的β-FFase组分上样至预先用pH7.2的含(NH4)2SO4为25％的Tris-HCl缓冲液平衡的疏水亲和层析柱上，再用含(NH4)2SO4为0％～25％的Tris-HCl缓冲液进行从高浓度到低浓度的梯度洗脱，流速为0.5mL/min，分部收集，洗脱过程中出现4个不同的蛋白质峰，在对各个洗脱峰进行酶活性测定，合并具有β-FFase酶活的组分，透析除盐后用聚乙二醇20000浓缩，其β-FFase酶活为8.657U/mg。
在2mL的蔗糖浓度为500g/L溶液中加入50μL的第(4)步得到的β-FFase酶液，按照实施例1的条件进行反应后，采用HPLC法测定反应体系中蔗果低聚糖的总含量(占干物质)为53.18％。
实施例6
(1)以体积百分比7％的接种量，将处于对数期生长的黑曲霉FOS-0620的菌悬液接种于发酵诱导培养基中，接入黑曲霉FOS-0620种子液，于37℃和133r/min下培养48h后，所得发酵液用400目的滤袋过滤，所得菌泥用无菌水清洗后再8000r/min离心10min，清洗和离心的操作重复2次，得到菌体，在-40℃、真空度为0.030psi下干燥得到黑曲霉菌体。所述的发酵诱导培养基：按重量份计，蔗糖7份，酵母浸膏2.5份，玉米粉2.5份，NaNO30.3份，pH6.5，用蒸馏水定容至100份，混合均匀后于121℃下灭菌冷却后备用。
(2)在(1)中黑曲霉菌种中，加入含2μg/mL的胰蛋白酶抑制剂和1.5μmol/mL的DTT的提酶缓冲液，使黑曲霉菌体浓度为10mg/mL，加入蜗牛酶并使其浓度为0.4mg/mL，混匀后于37℃和120r/min下进行黑曲霉FOS-0620菌体破壁5h，然后在4℃用8000r/min离心10min，离心后的上清液为β-FFase粗酶液，其β-FFase酶活为0.1783U/mg。
(3)将经过第(2)步所得的β-FFase粗酶液于4℃和8000r/min下离心5min，上清液上样至预先用pH7.2的不含NaCl的50mM的Tris-HCl缓冲液平衡好的阴离子交换层析柱上，先用无NaCl的缓冲液将蛋白质洗至基线，再用含0mM～300mM的NaCl的Tris-HCl缓冲液进行NaCl梯度洗脱，流速为1mL/min，分部收集，从左到右蛋白峰的洗脱NaCl浓度为0mM、30mM、100mM，整个洗脱阶段出现3个大小不一的蛋白质峰，在测定每个洗脱峰的β-FFase酶活性，合并具有β-FFase组分，透析除盐后用聚乙二醇20000浓缩，其β-FFase酶活为3.895U/mg。
(4)将经过第(3)步所得的β-FFase组分上样至预先用pH7.2的含(NH4)2SO4为25％的Tris-HCl缓冲液平衡的疏水亲和层析柱上，再用含(NH4)2SO4为0％～25％的Tris-HCl缓冲液进行从高浓度到低浓度的梯度洗脱，流速为0.5mL/min，分部收集，洗脱过程中出现4个不同的蛋白质峰，在对各个洗脱峰进行酶活性测定，合并具有β-FFase酶活的组分，透析除盐后用聚乙二醇20000浓缩，其β-FFase酶活为10.706U/mg。
在2mL的蔗糖浓度为200g/L溶液中加入50μL的第(4)步得到的β-FFase酶液，按照实施例1的条件进行反应后，采用HPLC法测定反应体系中蔗果低聚糖的总含量(占干物质)为56.66％。

Claims (10)

1.一种黑曲霉在制备β-呋喃果糖苷转移酶中的应用，其特征在于，该菌株为黑曲霉(Aspergillusniger)FOS-0620，已于2012年9月28日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.6640。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以体积百分比5％～10％的接种量，将处于对数期生长的黑曲霉FOS-0620的菌悬液接种于发酵诱导培养基中，进行诱导发酵培养，将得到的培养液离心或过滤得菌泥，用无菌水清洗后再离心或过滤，冷冻干燥，得到黑曲霉菌体；
(2)在上述黑曲霉菌体中加入提酶缓冲液，使黑曲霉FOS-0620菌体浓度为5mg/mL～30mg/mL，加入蜗牛酶，混匀后进行菌体破壁，破壁后的菌液经离心后的上清液为β-呋喃果糖苷转移酶粗酶液，经分离纯化，得到β-呋喃果糖苷转移酶。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述诱导发酵培养的条件为30℃～40℃，100r/min～200r/min摇床培养，发酵时间为36h～72h。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的发酵诱导培养基：按重量份计，蔗糖2～10份，酵母浸膏1～5份，玉米粉1～5份，NaNO30.1～0.5份，pH6.0～7.5，用蒸馏水定容至100份，灭菌后冷却即可。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述蜗牛酶的浓度为0.2mg/mL～0.8mg/mL。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述提酶缓冲液中含有胰蛋白酶抑制剂和二硫苏糖醇，其浓度分别为1μg/mL～3μg/mL和0.5μmol/mL～2.0μmol/mL。
7.根据权利要求2或3或4或5或6所述的应用，其特征在于，所述分离纯化的步骤如下：所述粗酶液经过高流速离子型琼脂糖凝胶阴离子交换层析柱和苯基-琼脂糖凝胶疏水亲和层析柱中的一种或两种层析，制得β-呋喃果糖苷转移酶。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，
所述阴离子交换层析是将粗酶液上样至阴离子交换层析柱上，先用不含NaCl的Tris-HCl缓冲液将层析柱洗至基线，再用含0mM～300mM的NaCl的Tris-HCl缓冲液进行NaCl梯度洗脱，分部收集，测定每个洗脱峰的β-呋喃果糖苷转移酶酶活，合并具有β-呋喃果糖苷转移酶的组分，透析除盐后用聚乙二醇20000浓缩；
所述疏水亲和层析是经阴离子交换层析后所得的β-呋喃果糖苷转移酶组分上样至疏水亲和层析柱上，先用含(NH4)2SO4为25％的Tris-HCl缓冲液将层析柱洗至基线，再用含0％～25％(NH4)2SO4的Tris-HCl缓冲液进行从高浓度到低浓度的梯度洗脱，分部收集，测定每个洗脱峰的β-呋喃果糖苷转移酶酶活，合并具有β-呋喃果糖苷转移酶的组分，透析除盐并用聚乙二醇20000浓缩。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，
所述Tris-HCl缓冲液的浓度为20mM～100mM，pH为7.0～7.5；
所述阴离子交换层析和疏水亲和层析中洗脱的流速分别为1mL/min和0.5mL/min。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述清洗和离心或过滤的操作至少重复1次；步骤(2)所述菌体破壁温度为30℃～40℃，破壁时间为2h～5h。
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