CN103255086B

CN103255086B - 芽孢杆菌及其产生的壳聚糖酶和该酶水解获得的壳寡糖

Info

Publication number: CN103255086B
Application number: CN201310147265.XA
Authority: CN
Inventors: 袁建平; 高永闯; 侯晓强; 王淑敏; 李洁; 马立芝
Original assignee: Langfang Normal University
Current assignee: Langfang Normal University
Priority date: 2013-04-25
Filing date: 2013-04-25
Publication date: 2017-11-21
Anticipated expiration: 2033-04-25
Also published as: CN103255086A

Abstract

本发明涉及一种菌种及其用途，同时还涉及该菌种所产的壳聚糖酶和由该酶水解获得的壳寡糖。本发明所用的壳聚糖酶活性高、底物专一性强，且利用本发明的专一性壳聚糖酶能够降解制得数均分子量为1246.38，聚合度4‑6的壳寡糖，所得壳寡糖纯度高，具有较高的生物活性。

Description

芽孢杆菌及其产生的壳聚糖酶和该酶水解获得的壳寡糖

技术领域

本发明涉及一种菌种及其用途，同时还涉及该菌种所产的壳聚糖酶和由该酶水解获得的壳寡糖。

背景技术

壳聚糖由N-乙酰基葡萄糖聚合而成，是自然界中第二大生物大分子多糖，近20年来已引起国内外的广泛关注，开展了大量的研究。目前壳聚糖的多种生理活性已被证实，并在保健食品、生物医药、日用化工、环境保护等诸多领域中得以开发应用，但由于壳聚糖不溶于水及其他许多无机溶剂，限制了其在多领域的开发应用。壳寡糖为壳聚糖的降解产物，是由β-1,4糖苷键连接的2-氨基葡萄糖组成的聚合度为2～20的低聚糖，与壳聚糖相比具有相对分子质量小、水溶性好、生物活性高、易于吸收、应用范围广等优点。壳寡糖具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、增强机体免疫等功能，广泛应用于医药、食品、饮料、化妆品和化工等多种领域中。在众多降解壳聚糖获取壳寡糖的方法中，酶解法是近年来应用最为广泛的降解方法。大多数的壳聚糖酶是以内切方式水解部分乙酰化的壳聚糖。壳寡糖生物活性的高低与其聚合度有着密切联系，研究表明，聚合度为5～6的壳寡糖生物活性最高。目前在壳寡糖制备及应用研究中，壳寡糖聚合度难以控制，大多为宽聚合度范围的混合物，其生物活性不稳定。有关壳聚糖酶的研究与进一步开发利用已成为壳寡糖生产和应用的关键与瓶颈。通过筛选获得的专一性壳聚糖酶的高产菌株产生优质壳聚糖酶，并利用专一性壳聚糖酶降解壳聚糖具有反应温和，易控制，易分离处理，不污染环境，产物活性高等优点。

发明内容

为解决现有技术中存在的不足，本发明提供一株发酵可获取高活性的专一性壳聚糖酶、通过该壳聚糖酶水解壳聚糖可获得聚合度为4～6的高生物活性的壳寡糖的芽孢杆菌（Bacillus sp.）。

为实现上述发明目的，本发明的芽孢杆菌（Bacillus sp.）Dg属于芽孢杆菌，其于2012年12月21日在中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.7024。

该菌株大小为0.5-0.7×1.2-2.8um，端生芽孢，无荚膜，有鞭毛，革兰氏阳性杆菌。于PDA培养基上生长良好，PDA培养基上菌落特征为：菌落较厚，表面光滑、易挑起、无光泽、浅乳白色不透明，边缘整齐。最适生长温度为36±1℃。兼性厌氧菌。该菌株发酵葡萄糖、果糖、麦芽糖产酸，不能利用乳糖、***糖、木糖、琼脂糖、半乳糖和蔗糖产酸；吲哚试验阳性，甲基红试验阳性；V-P试验阴性；硫化氢试验阳性；能利用柠檬酸盐作为唯一碳源。

同时本发明提供了该菌株的用途，其应用在以壳聚糖为诱导物发酵产生壳聚糖酶中。

同时本发明还涉及一种壳聚糖酶，其由保藏编号为 CGMCC No.7024的芽孢杆菌（Bacillus sp.）Dg,以壳聚糖为诱导物发酵产生。

作为对上述技术方案的限定，在由芽孢杆菌（Bacillus sp.）Dg以壳聚糖为诱导物发酵产生壳聚糖酶中，产酶条件为壳聚糖含量为0.5%-2%，牛肉膏含量为0.25-0.35%，温度为30-40℃，接种量为5%-15%。

作为对上述方案的进一步限定，其最优产酶条件为壳聚糖含量为1%，牛肉膏含量为0.3%，温度为30℃，接种量为15%。

作为对壳聚糖酶反应条件的限定，该壳聚糖酶的反应温度为35-55℃，pH为4.5-6。

作为对上述方案的限定，该壳聚糖酶的最适反应温度为45℃，pH为5.5。

此外，本发明还提供了一种壳寡糖，该壳寡糖是由如上所述的壳聚糖酶降解壳聚糖获得，壳寡糖聚合度为4-6。

上述技术方案中，利用以壳聚糖为唯一碳源的选择培养基，采用透明水解圈法筛选获得的菌株Dg具有产酶能力强、所产壳聚糖酶活性高、且酶降解产物为聚合度4-6的高活性壳寡糖等特点，从而确保了通过本发明能够以较低的成本制备大量专一性壳聚糖酶，进而获取高活性壳寡糖。

使用保藏编号为GMCC No.7024的菌株Dg发酵获得专一性壳聚糖酶的过程中，发酵条件确定的依据是：影响菌体产酶活力的四个主要因素依次为：牛肉膏含量、壳聚糖含量、温度、接种量。牛肉膏含量是影响酶活性的首要因素，当牛肉膏含量过低时会造成发酵过程菌体营养基质的不足，从而影响菌体生长和产生壳聚糖酶；牛肉膏含量过高会造成培养基配方中碳氮比的失衡，从而导致发酵液pH严重偏离最适产酶条件，造成酶活较低，同时还会影响发酵液中壳聚糖酶的稳定性，且不经济；壳聚糖是影响酶活性的第二重要因素，壳聚糖酶是一种诱导酶，在发酵培养基中需添加一定量的壳聚糖做诱导物来提高产酶量；发酵温度影响菌体生长和产酶，温度过低菌体生长和产酶较慢，温度过高菌体易衰老，且不利于产酶；接种量过低，延长培养时间，降低发酵罐的生产率；接种量过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多产生代谢废物，也不经济。

酶催化壳聚糖水解反应温度过低时，酶促反应较慢，效率较低；反应温度过高时，壳聚糖酶的稳定性有所降低, 在70℃,30min后酶完全失活。反应体系pH过高过低均会影响酶活，进而影响酶促反应，当反应体系pH值小于等于4.0，大于等于7.0时，该壳聚糖酶丧失酶活。

在壳寡糖制备及应用研究中，壳寡糖聚合度难以控制，大多为宽聚合度范围的混合物，其生物活性不稳定。采用乙酰丙酮法测定本发明中所述的专一性壳聚糖酶酶解壳聚糖制备的壳寡糖，其数均分子量为1246.38，聚合度为4-6，其生物活性较高。

附图说明

下面结合附图及具体实施方式对本发明作更进一步详细说明：

图1是本发明实施例所得的酶液通过SDS-PAGE法，得到的壳聚糖酶凝胶电泳图；

图2为不同温度下壳聚糖酶比活力曲线图；

图3为不同pH下壳聚糖酶比活力曲线图。

具体实施方式

实施例一

本实施例涉及了以保藏编号为 CGMCC No.7024的芽孢杆菌（Bacillus sp.）Dg发酵制备壳聚糖酶的方法，该方法包括以下步骤：

1、菌种活化及发酵

将保藏的Dg菌株接种于PDA斜面培养基上，37℃条件下培养24小时，反复转接两次，进行活化。然后，将活化好的菌种接入PDA液体培养基中，37℃，180rpm摇床培养18h制备种子液。最后，按15%的接种量将种子液接入到发酵培养基中，30℃，180rpm摇床培养24h。

上述培养基的配方，可采用常规的PDA培养基，如本实施例中：

斜面种子培养基（PDA培养基）：马铃薯 200g（去皮），葡萄糖 30g，蛋白胨 2g，琼脂20g，K₂HP0₄ 0.5g，MgS0₄ 0.5g，VB1 10mg，蒸馏水 1000mL。

PDA液体培养基：同斜面种子培养基，但未加琼脂。

本实施例采用的发酵培养基(％，w／v)中，可采用常规的无机盐及微量元素。值得说明的是，培养基中牛肉膏及壳聚糖的含量对产酶影响显著。在本实施例中，发酵培养基(％，w／v)的配方：NaCl、KCl、MgS0₄·7H₂0 各0.5%，K₂HP0₄ 0.075%，FeSO₄ 0.001%，蛋白胨0.85%，牛肉膏 0.3%，壳聚糖 1%，pH 7.5。

2、提取壳聚糖酶

将发酵液经5000rpm，4℃低温离心20min，得粗酶液。粗酶液中壳聚糖酶活性为2000U/ml。

壳聚糖的酶活力测定：以每分钟催化1μg壳聚糖转化成壳寡糖所需要的酶量（ml或mg）作为一个酶活单位U。以每ml（或mg）酶液所含的酶活力单位数为酶比活力。

在本实施例中，酶活的测定采用如下方法：在100mL的三角瓶中分别加入50g 3%的壳聚糖胶体溶液，将其预热至45℃后分别加入5mL粗酶液，45℃、180rpm条件下进行反应，定时取样，滴加1mol/L NaOH 调节pH至8.0 ，沸水浴20min，离心取沉淀，105℃烘干至恒重，称量沉淀重量，最后根据沉淀的的减少量计算酶活。

将得到的粗酶液用60%的乙醇醇析沉淀，干燥后得壳聚糖酶的粗品。

3、壳聚糖酶相对分子量的确定

首先，将500mL粗酶液用砂芯过滤装置进行抽虑,得到去除菌体的壳聚糖酶溶液。而后，将去除菌体的壳聚糖酶溶液进行分级醇析，取60%乙醇醇析沉淀即为壳聚糖酶，得到壳聚糖酶沉淀后再用蒸馏水溶解。

采用不连续SDS-PAGE电泳，得到的壳聚糖酶凝胶电泳图，如图1所示，图中，1为纯化后的酶液，2为标准蛋白样品，根据样品蛋白质的相对迁移距离对照标准蛋白质（牛血清蛋白）的相对迁移距离，测定壳聚糖酶的相对分子质量为41.7kD。

4、壳聚糖酶最适反应条件的确定

（1）最适反应温度的测定

将制备的酶液与壳聚糖底物（3%的壳聚糖溶胶，其pH值为5.0）反应，温度分别设定为25℃、35℃、45℃、55℃、65℃，测定剩余酶活力，确定该壳聚糖酶的最适反应温度，其测定曲线如图2所示。

由图2可以看出，随温度升高，壳聚糖酶的活性先升高后降低，在温度为45℃时，酶活达最高。故该壳聚糖酶的最适反应温度为45℃。

（2）最适反应pH值的测定

将制备的酶液与pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5及7.0的壳聚糖底物（3%的壳聚糖溶胶）在45℃反应，测定剩余酶活力，检测此壳聚糖酶反应的最适pH值，其测定曲线如图3所示，由图3可知，随pH值的升高，酶活先升高后降低，在pH值为5.5时，酶活最高，故其最适反应pH值为5.5。

实施例二

本实施例涉及壳寡糖的制备，是以实施例一得到的壳聚糖酶降解壳聚糖获得，其制备方法如下：

将3%壳聚糖胶体溶液pH5.5预热至45℃，之后按每毫升3%壳聚糖胶体溶液加200单位酶活加入壳聚糖酶、180rpm酶解2.5h，滴加1mol/L NaOH调pH至8.0终止反应，4000 r/min离心20分钟，对上清液进行分级醇析，取70%乙醇醇析沉淀，沉淀冻干即为壳寡糖。

对如上制备获得的壳寡糖，采用乙酰丙酮法进行分子量测定，其步骤如下：

标准曲线的绘制：精密量取30μg/ml GluNH₂·HCl溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.Oml，分别置于具塞试管中，各加水至5.Oml，再分别加乙酰丙酮溶液1mL，摇匀，置沸水浴中加热25min，取出，置冷水中冷却，再加DMABA溶液1ml,加无水乙醇至lOmL，摇匀，60℃水浴中保温1h，放冷，以0管为空白，在525nm波长处测定A值，以GluNH₂·HCl微摩尔数为纵坐标，A值为横坐标，绘制标准曲线。得标准曲线方程为：y=0.8554x－0.0293，R²= 0.9992。

精确量取100μg/ml壳寡糖溶液3 ml置于具塞试管中，其余步骤同上，于波长525nm处测定A值。根据标准曲线计算壳寡糖溶液的摩尔浓度，根据公式计算壳寡糖的数均分子量。

壳寡糖的数均分子量M = m/n

式中：m为壳寡糖质量，n为壳寡糖的摩尔数。

壳寡糖溶液于525nm处测得A值为0.316，带入标准曲线方程得n=0.24μmol，则该壳寡糖数均分子量M=1246.38。据此推算该壳寡糖的聚合度为4-6。

综上所述，本发明所用的壳聚糖酶活性高、底物专一性强，且利用本发明的专一性壳聚糖酶能够降解制得数均分子量为1246.38，聚合度4-6的壳寡糖，所得壳寡糖纯度高，具有较高的生物活性。

Claims

1.一种壳聚糖酶的制备方法，其特征在于：所述的壳聚糖酶由芽孢杆菌(Bacillussp.)以壳聚糖为诱导物发酵产生，其中芽孢杆菌(Bacillus sp.)的保藏编号为：CGMCCNo.7024。

2.根据权利要求1所述的壳聚糖酶的制备方法，其特征在于：产酶条件为壳聚糖含量为0.5％-2％，牛肉膏含量为0.25-0.35％，温度为30-40℃，接种量为5％-15％。

3.根据权利要求1所述的壳聚糖酶的制备方法，其特征在于：最优产酶条件为壳聚糖含量为1％，牛肉膏含量为0.3％，温度为30℃，接种量为15％。