CN102648977B - 滤泡素抑制素样蛋白1在调节钠钾atp酶活性中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及滤泡素抑制素样蛋白1(FSTL1)在调节钠钾ATP酶活性中的用途，具体涉及FSTL1在提高钠钾ATP酶活性从而治疗、缓解或改善与该活性相关的疾病或症状的用途，或FSTL1抑制剂在降低钠钾ATP酶活性从而治疗、缓解或改善与该活性相关的疾病或症状的用途，还提供了调节钠钾ATP酶活性的药物或其筛选的新方法。本发明的多肽、核苷酸、组合物及方法在治疗、缓解或改善与钠钾ATP酶活性相关的疾病或症中具有巨大的应用前景。

Description

滤泡素抑制素样蛋白1在调节钠钾ATP酶活性中的用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及滤泡素抑制素样蛋白1(即FSTL1)在提高钠钾ATP酶活性从而用于治疗、缓解或改善相关疾病或症状(尤其是疼痛)中的用途。

背景技术

目前的研究发现：钠钾ATP酶在人体的正常代谢中具有非常重要的作用，广泛分布于各种组织器官的细胞膜上，如肾、心脏、肺和神经***等。钠钾泵(即钠钾ATP酶)的活性与某些疾病或症状密切相关，其活性的提高或降低对这些疾病或症状产生重要的影响。

例如，以下疾病或症状与钠钾泵的活性过高有关，或可通过抑制钠钾泵的活性得到缓解或治疗：研究表明钠钾泵可能在肾性高血压的发病机制中有一定的作用，钠钾泵的活性增高促进离子转运，从而助长血压升高(Wang等，CurrOpin Nephrol Hypertens.2009Sep；18(5)：412-20；Ferrari等，Cell Mol Biol(Noisy-le-grand).2006Dec 30；52(8)：15-8)；有文献报道在人类的黑色素瘤细胞中钠钾泵的α亚基表达明显升高(Mathieu等，J Cell Mol Med.2009Feb 20.[Epubahead of print])；培养的感觉神经元突起的生长以及肿瘤的生长和发生也与钠钾泵的活性过高有关，有文献报道钠钾泵的抑制剂如地高辛，可以明显抑制培养的感觉神经元突起的生长以及抑制肿瘤的生长和发生(Penniyainen等，NeurosciBehav Physiol.2009Mar；39(3)：301-4.；Mijatovic等，Expert Opin Ther Targets.2008Nov；12(11)：1403-17.)。有文献报道钠钾泵α1为治疗神经胶质瘤和非小细胞肺癌的治疗靶点，钠钾泵α1抑制剂有希望被用于治疗(如一种强心苷的新型衍生物2″-oxovoruscharin(UNBS1450))治疗胶质母细胞瘤和非小细胞肺癌(KissR等，.Neoplasia.2008Mar；10(3)：198-206；Kiss R等，J Pathol.2007Jun；212(2)：170-9.).

以下疾病或症状与钠钾泵的活性偏低有关，或可通过提高钠钾泵的活性得到缓解或治疗：在家族性偏瘫型偏头痛病人中，已发现钠钾泵上有较多缺失突变，已证实这些突变和临床症状有密切的关系；还有一些病人会出现癫痫症状(Aperia，J Intern Med.2007 Jan；261(1)：44-52.)；在糖尿病的动物模型中发现钠钾泵的活性和表达都有降低，其中红细胞中的C多肽也有明显的减少，外源补充C多肽会明显提高钠钾泵的活性和缓解糖尿病的症状(Vague等，ExpDiabesity Res.2004Jan-Mar；5(1)：37-50.)；在一些重症抑郁症患者中红细胞上的钠钾泵活性明显降低，给予锂盐治疗后好转；中度的抑制钠钾泵的活性也可导致躁狂的发生(Lichtstein和Rosen，Neurochem Res.2001 Sep；26(8-9)：971-8.)；临床上见到的洋地黄中毒就是由于过度抑制钠钾泵的活性导致心肌过度兴奋所致(Vivo等，Am JMed Sci.2008Nov；336(5)：423-8.)；以往研究还证实提高肺泡钠钾泵的活性可以明显改善肺损伤，肺水肿的症状(Factor等，J Clin Invest.1998 Oct 1；102(7)：1421-30.；Lecuona等，J Bioenerg Biomembr.2007Dec；39(5-6)：391-5.；Sznajder等，J Appl Physiol.2002 Nov；93(5)：1860-6)。

背根神经节(Dorsal Root Ganglia，DRG)的小神经元负责向脊髓传递温度觉和痛觉。当外周端受到物理或化学性刺激时，这些小神经元的传入纤维末稍在脊髓背角通过胞吐形式释放突触囊泡或大致密芯泡(LDCV)中的兴奋性递质谷氨酸和神经肽。目前认为，这种兴奋性信息传递可以被脊髓背角的中间神经元和下行通路释放的抑制性因子包括神经肽类物质阿片肽、神经递质γ-氨基丁酸(GBGA)、氨基乙酸(Glycine)和5-羟色胺(Serotonin)等调节。这种抑制性调节对于正常的躯体感觉和痛觉调制都有着功能上的重要意义。

已经发现了一些选择性高表达在背根神经节小神经元细胞膜表面的受体和通道，这加深了人们对感觉信息传递机制的理解。这些受体和通道包括ATP门控的P2X₃受体、瞬时受体电位通道V1(TRPV1)和A1(TRPA1)、电压门控Na_v1.8通道和Mas相关G蛋白偶联受体。这些膜表面分子与初级感觉传递、感觉神经元的敏化及伤害性反应的易化过程有关。

尽管目前本领域已经发现了上述一些在感觉信息传递中起作用的分子，然而还迫切需要研究在感觉信息传递过程中还有那些分子在起作用，以推动对感觉信息传递的了解，提出新的镇痛策略和开发新的镇痛药物。

发明内容

本发明的主要目的在于提供滤泡素抑制素样蛋白1在提高钠钾ATP酶活性从而用于治疗、缓解或改善相关疾病或症状(尤其是改善躯体感觉，特别是疼痛觉或温度觉)中的用途。

本发明的另一目的在于提供一种滤泡素抑制素样蛋白1的生物活性片段，所述的活性片段具有良好的抑制躯体感觉的作用。

在本发明的第一方面，提供滤泡素抑制素样蛋白1在制备组合物中的用途，所述组合物用于通过提高钠钾ATP酶活性来治疗、缓解或改善与钠钾ATP酶活性相关的疾病或症状。

在本发明的一个实施方式中，所述疾病或症状选自：疼痛、家族性偏瘫型偏头痛、糖尿病、抑郁症、洋地黄中毒、肺损伤或肺水肿。

在本发明的另一个实施方式中，所述组合物用于治疗、缓解或改善疼痛。在一个优选例中，所述疼痛是身源性疼痛，优选神经病理性疼痛或伤害感受性疼痛。

在本发明的另一个实施方式中，所述神经病理性痛选自：背根神经节神经源性痛、三叉神经节神经源性痛或坐骨神经痛。在另一个优选例中，所述神经病理性疼痛为选自下组的由中枢或周围神经***的损伤或病理改变引起的疼痛：腰背痛、神经痛、纤维性肌痛、糖尿病相关的神经痛、多发性硬化相关的神经痛、带状疱疹后神经痛以及与HIV有关联的神经病理性神经痛。

在本发明的另一个实施方式中，所述伤害感受性疼痛选自：躯体伤害感受性疼痛或内脏伤害感受性疼痛。在一个优选例中，所述伤害感受性疼痛选自：癌痛、关节炎痛、术后痛或与HIV有关联的伤害感受性疼痛。

在本发明的另一个实施方式中，所述滤泡素抑制素样蛋白1是：

(a)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质；

(b)(a)中所限定的蛋白质的保守性变异蛋白质或其活性片段；或

(c)将(a)中氨基酸序列经过1-20个(优选1-10个，更优选1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高钠钾ATP酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

在本发明的另一个实施方式中，所述(b)选自：

(1)具有SEQ ID NO：1中第156-173氨基酸序列的多肽；

(2)具有SEQ ID NO：2中第158-175位氨基酸序列的多肽；

(3)由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列缺失滤泡素抑制素结构域(即FS结构域)所形成的多肽；

(4)由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列缺失Von Willebrand型C结构域(即VWC结构域)所形成的多肽；

(5)由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列缺失EF手型II结构域所形成的多肽；或

(6)由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列缺失EF手型连接结构域所形成的多肽。

在本发明的第二方面中，提供了一种分离的多肽，所述多肽选自：

(1)具有SEQ  ID  NO：1中第156-173位氨基酸序列NGDSHLDSSEFLKFVEQN的多肽，条件是该多肽不是SEQ ID NO：1所示的蛋白质；

(2)具有SEQ ID NO：2中第158-175位氨基酸序列的NGDSRLDSSEFLKFVEQN的多肽，条件是所述多肽不是SEQ ID NO：2所示的蛋白质；

(3)由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列缺失滤泡素抑制素结构域(即FS结构域)所形成的多肽；

(4)由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列缺失Von Willebrand型C结构域(即VWC结构域)所形成的多肽；

(5)由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列缺失EF手型II结构域所形成的多肽；或

(6)由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列缺失EF手型连接结构域所形成的多肽。

在本发明的第三方面中，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明如上所述的多肽或SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的蛋白质。

在本发明的第四方面中，提供了一种载体，所述载体含有本发明如上所述的多核苷酸。

在本发明的第五方面中，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明如前所述的载体；或其基因组中整合有本发明如前所述的多核苷酸。

在本发明的第六方面中，提供了本发明如前所述的多肽或SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的蛋白质的制备方法，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养本发明如前所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出本发明如前所述的多肽或SEQID及NO：1或SEQID和NO：2的蛋白质。

在本发明的第七方面中，提供了一种通过提高钠钾ATP酶活性来治疗、缓解或改善与钠钾ATP酶活性相关的疾病或症状的药物组合物，它含有：(a)安全有效量的本发明的多肽、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的蛋白质；以及(b)药学上可接受的载体。

在本发明的一个实施方式中，本发明的药物组合物用于治疗、缓解或改善选自下组的疾病或症状：家族性偏瘫型偏头痛、糖尿病、抑郁症、洋地黄中毒、肺损伤、肺水肿或疼痛。在一个优选例中，所述的疼痛是身源性疼痛，优选伤害感受性疼痛或神经病理性疼痛。

在本发明的另一个实施方式中，所述的神经病理性痛选自：背根神经节神经源性痛、三叉神经节神经源性痛或坐骨神经痛。在本发明的另一实施方式中，所述神经病理性疼痛为选自下组的由中枢或周围神经***的损伤或病理改变引起的疼痛：腰背痛、神经痛、纤维性肌痛、糖尿病相关的神经痛、多发性硬化相关的神经痛、带状疱疹后神经痛以及与HIV有关联的神经病理性神经痛。

在本发明的另一个实施方式中，所述伤害感受性疼痛选自：躯体伤害感受器性疼痛和内脏伤害感受器性疼痛。在本发明的一个优选例中，所述伤害感受性疼痛选自：癌痛、关节炎痛、术后痛或与HIV有关联的伤害感受性疼痛。

在本发明的第八方面中，提供了本发明的多肽、SEQ ID NO：1所示的蛋白质和/或SEQ ID NO：2所示的蛋白质在制备用于通过提高钠钾ATP酶活性来治疗、缓解或改善与钠钾ATP酶活性相关的疾病或症状的药物组合物中的用途。

在本发明的一个实施方式中，所述药物组合物用于治疗、缓解或改善选自下组的疾病或症状：家族性偏瘫型偏头痛、糖尿病、抑郁症、洋地黄中毒、肺损伤、肺水肿或疼痛。在一个优选例中，所述的疼痛是身源性疼痛，优选伤害感受性疼痛或神经病理性疼痛。

在本发明的另一个实施方式中，所述的神经病理性痛选自：背根神经节神经源性痛、三叉神经节神经源性痛或坐骨神经痛。在本发明的另一实施方式中，所述神经病理性疼痛为选自下组的由中枢或周围神经***的损伤或病理改变引起的疼痛：腰背痛、神经痛、纤维性肌痛、糖尿病相关的神经痛、多发性硬化相关的神经痛、带状疱疹后神经痛以及与HIV有关联的神经病理性疼痛。

在本发明的另一个实施方式中，所述伤害感受性疼痛选自：躯体伤害感受器性疼痛和内脏伤害感受器性疼痛。在本发明的一个优选例中，所述伤害感受性疼痛选自：癌痛、关节炎痛、术后痛或与HIV有关联的伤害感受性疼痛。

在本发明的第九方面中，提供了本发明的多肽在制备用于治疗类风湿性关节炎和/或缺血性心脏病的药物组合物中的用途。

在本发明的第十方面中，提供了一种筛选可通过提高钠钾ATP酶活性治疗、缓解或改善与该活性相关的疾病或症状的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1)将候选物质与表达滤泡素抑制素样蛋白1的体系接触；

(2)检测候选物质对滤泡素抑制素样蛋白1的影响；

若所述候选物质可提高滤泡素抑制素样蛋白1的表达、活性和/或分泌，则表明该候选物质是可用于通过提高钠钾ATP酶活性来治疗、缓解或改善与该活性相关的疾病或症状的潜在物质。

在一个优选例中，所述疾病或症状选自：家族性偏瘫型偏头痛、糖尿病、抑郁症、洋地黄中毒、肺损伤、肺水肿或疼痛。在另一优选例中，所述的疼痛是神经病理性痛，优选背根神经节神经源性痛或三叉神经节神经源性痛。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达滤泡素抑制素样蛋白1的体系中；和/或步骤(2)包括：检测测试组的体系中滤泡素抑制素样蛋白1的表达、活性和/或分泌，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达滤泡素抑制素样蛋白1的体系；如果测试组中滤泡素抑制素样蛋白1的表达、活性和/或分泌在统计学上高于(优选显著高于，如高20％以上，较佳的高50％以上；更佳的高80％以上)对照组，就表明该候选物质是可用于通过提高钠钾ATP酶活性来治疗、缓解或改善与该活性相关的疾病或症状的潜在物质。

在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系(如小神经元细胞)(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

在另一优选例中，所述方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定有用的物质。

在本发明的第十一方面中，提供了一种筛选治疗或缓解疼痛的潜在物质的方法，所述的方法包括：

(1)将候选物质与钠钾ATP酶的体系接触；

(2)检测候选物质对钠钾ATP酶的影响；

若所述候选物质可提高钠钾ATP酶的活性，则表明该候选物质是可用于治疗或缓解疼痛的潜在物质。

在本发明的第十二方面中，提供了滤泡素抑制素样蛋白1的抑制剂在制备通过降低钠钾ATP酶活性来治疗、缓解或改善与钠钾ATP酶活性相关的疾病或症状的组合物中的用途。

在本发明的一个实施方式中，所述疾病或症状选自：肾性高血压、肿瘤(优选黑色素瘤、胶质母细胞瘤或非小细胞肺癌)。

在本发明的另一个实施方式中，所述抑制剂选自：抗滤泡素抑制素样蛋白1或其活性片段的抗体；针对滤泡素抑制素样蛋白1编码序列的反义寡核苷酸或小干扰RNA；或来源于钠钾ATP酶的肽段。

在本发明的另一个实施方式中，所述抑制剂选自：

(i)具有SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的多肽；

(ii)(i)中所限定的多肽的保守性变异多肽或其活性片段；或

(iii)(i)或(ii)中任意多肽或活性片段的组合。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1.FSTL1在DRG小神经元中高表达

图1A.通过基因芯片检测的候选基因在成年大鼠组织中的表达谱和背根神经节信号强度与其他组织信号强度的比值。图中，在各种组织中基因信号与DRG中比值的log2比例范围用不同的色调显示。Avil代表advillin；Calca代表CGRPα；Htr3a代表5-羟色胺受体3A(5-hydroxytryptamine receptor 3A)；Plekha4代表含血小板同源性结构域的家族A的成员4(pleckstrin homologydomain containing，family A member 4)；Mpz代表髓鞘蛋白0(myelin proteinzero)；P2rx3代表P2X3受体；Prph1代表外周蛋白1(peripherin 1)；Nef3代表神经微丝3(neurofilament 3)；Scn7a代表钠离子通道电压门控型VIIα(sodiumchannel，voltage-gated type VII，α)；背根神经节GAPDH信号强度为阳性对照。

图1B.RNA印迹法检测Fstl1mRNA在大鼠成年神经***中的表达情况，以核糖体18s RNA作为上样量对照；

图1C.免疫印迹检测FSTL1蛋白(～37kD)在大鼠成年神经***中的表达情况，以肌动蛋白作为上样量对照；

图1D.免疫组化和免疫印迹显示大鼠在胚胎期、出生后和成年时期背根神经节中FSTL1的表达情况。FSTL1的表达在胚胎15天开始，在出生后28天达到最高水平。以肌动蛋白作为上样量对照；

图1E.免疫荧光双标法检测在背根神经节和脊髓背角中，FSTL1分别与CGRP或IB4的共定位情况，FSTL1存在于CGRP阳性或IB4阳性的神经元中。其中，绿色表示FSTL1表达；红色表示CGRP或IB4表达；

图1F.免疫荧光检测FSTL1与Na_v1.8通道蛋白的表达情况，FSTL1表达在含有Na_v1.8通道蛋白的DRG神经元中。其中上图中绿色表达FSTL1表达，中图中红色表示Na_v1.8通道蛋白表达，下图为上图和中图的叠加(merge)。

图1G.FSTL1在不同DRG神经元类型中的分布情况；

图1H.背根节神经元总数情况，以及背根节FSTL1阳性的神经元情况。

图1I.免疫荧光双标法检测FSTL1与P物质的表达和共定位情况。绿色表示FSTL1表达，红色表示P物质表达，箭头所指为FSTL1表达的囊泡；

图1J.免疫荧光双标法检测FSTL1分别与TRPV1或P2X₃的共定位情况。其中，红色表示FSTL1表达；绿色表示TRPV1或P2X₃表达；

图1K.RNA印迹法检测Fstl1 mRNA在大鼠各组织中的表达情况，以核糖体18s RNA作为上样量对照。

图2.证明FSTL1由小清亮囊泡分泌的实验结果

图2A.免疫荧光双标法检测在大鼠DRG的肽能神经元和IB4阳性小神经元中FSTL1的囊泡分布(箭头所示)，FSTL1不在含CGRP的大致密芯泡(LDCV)中，大部分也不在突触孔蛋白(synaptoporin，Synpr)阳性的囊泡中。其中，绿色表示FSTL1表达，红色表示CGRP、IB4或Synpr表达；

图2B.免疫金标记检测DRG小神经元胞体中FSTL1的定位情况，FSTL1位于高尔基网外侧附近的小清亮囊泡(箭头)中；

图2C.用蔗糖密度梯度离心分离亚细胞组分的方法分离大鼠脊髓背角不同囊泡群，免疫印迹法检测分离出的囊泡群中FSTL1、Synpr和CGRP的表达情况。FSTL1主要存在于含有Synpr的囊泡群中，但不存在于含CGRP的囊泡群中；

图2D.免疫金标记检测背根的传入纤维及脊髓背角I、II层的传入纤维末梢中含FSTL1囊泡的情况。FSTL1位于背根的传入纤维及脊髓背角I、II层的传入纤维末梢的小清亮囊泡(箭头所示)中，箭头所示含FSTL1的囊泡位于突触前膜附近。三角标识指示突触后致密带；

图2E.小鼠的后根结扎的示意图。结扎小鼠的后根24小时以阻断囊泡顺向运输，会导致传入纤维靠近DRG一端FSTL1的积聚；

图2F.免疫印迹实验检测在无刺激条件下培养的大鼠DRG神经元分泌FSTL1的情况。以细胞裂解液中FSTL1的总表达情况作为上样量对照，其中柱形图是对各泳道FSTL1分泌情况的定量分析。可以看到在大鼠DRG神经元的培养液中FSTL1分泌量随时间而增加。与对照组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01；

图2G.免疫印迹实验检测在高钾刺激(55mM KCl，1h)和有无细胞外钙条件下培养的大鼠DRG神经元分泌FSTL1的情况。以细胞裂解液中FSTL1的总表达情况作为上样量对照，其中柱形图是对各泳道FSTL1分泌情况的定量分析。与未加高钾刺激的对照组相比，^*P＜0.05(高钾加钙刺激(即柱2)与未加高钾但加钙刺激(即柱1)的对照组相比)，^#P＜0.05(高钾加钙刺激(即柱2)与加高钾未加钙刺激(即柱4)的对照组相比)；

图2H.免疫印迹检测在高钾刺激(55mM KCl，15min)条件下大鼠脊髓脑片FSTL1的分泌情况。高钾刺激使FSTL1在脊髓薄片中的分泌量显著增加，以细胞裂解液中肌动蛋白的表达作为上样量对照。在相同的样品中，通过免疫印迹和HPLC检测方法显示CGRP和谷氨酸(Glu)水平升高。与未加高钾刺激的对照组相比，^*P＜0.05；

图2I.免疫印迹检测在高钾刺激和有无细胞外钙条件下大鼠脊髓背角的突触球中FSTL1的分泌情况。高钾刺激使FSTL1在脊髓背角的突触球中的分泌量显著增加，以细胞裂解液中肌动蛋白的表达作为上样量对照，其中柱形图是对各泳道FSTL1分泌情况的定量分析，同时也表示经免疫印迹检测FSTL1与CGRP存在共分泌。与未加高钾刺激的对照组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01(加钙的高钾刺激组(即柱3和柱4))；

图2J.免疫印迹实验检测在KCl、辣椒素(Capsaicin，Cap)和/或capsaizepine(CPZ)存在下，用年轻大鼠DRG培养的神经元细胞分泌的FSTL1水平。以细胞裂解液中FSTL1的总表达情况作为上样量对照，其中柱形图是对各泳道分泌情况的定量分析。与未加刺激的对照组相比，^**P＜0.01(仅加KCl或Cap刺激与未加任何刺激的对照组相比)，^##P＜0.01(仅加Cap刺激与加Cap和CPZ刺激相比)。

图3.FSTL1对于感觉传递的抑制作用

图3A.FSTL1及其突变体M1(EF手型结构域缺失)和M2(第165位由E变为A)的表达质粒构建示意图，FSTL1及其突变体的C端与Myc和His标签融合；

图3B.在成年大鼠脊髓薄片上进行全细胞记录，记录了31个脊髓II层神经元在嵌制电压-70mV(V_H)下的sEPSC。在16个神经元中，重组FSTL1同时降低了自发性兴奋性突触后电流(sEPSC)的频率和幅度。兔抗全长FSTL1抗体(1∶1000)可增强sEPSC的电流频率和幅度，免疫前血清(1∶1000)用作对照。所有定量分析采用3min内灌流FSTL1收集的数据。与未加FSTL1的对照组或免疫前血清组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01；

图3C.0.2Hz(强度：210-650μA)刺激背根诱导了C纤维的谷氨酸能单突触eEPSC，平均幅度166±23pA(37-459pA；V_H＝-70mV)。在24个被记录的脊髓II层神经元中，C纤维激发的单突触诱发性兴奋性突触后电流(eEPSC)被FSTL1(60nM，n＝14；300nM，n＝5)抑制，但不被M1(n＝4)和M2(n＝5)抑制。当标准化为对照eEPSCs的峰电流水平后，被抑制的eEPSCs的衰减时间常数无显著变化。FSTL1抗体(1∶1000)也增强C纤维的eEPSC(n＝5)。与未加FSTL1的对照组或免疫前血清组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01；

图3D.FSTL1(60nM)仅降低微小性兴奋性突触后电流(mEPSC)的频率。与未加FSTL1的对照组相比，^**P＜0.01；

图3E.免疫印迹检测FSTL1、M1和M2重组蛋白的表达情况；

图3F.纯化的人重组滤泡素抑制素对成年大鼠脊髓薄片上记录的sEPSC没有影响。加了FSTL1的实验组，与未加FSTL1的对照组相比，^**P＜0.01；与加FSTL1的组相比，^#P＜0.05。

图4.在DRG神经元中条件性敲除Fstl1基因

图4A.Fstl1条件性基因敲除小鼠的构建示意图。用两个loxP序列(灰色三角，Fstl1^F)来将编码FSTL1信号肽的外显子2删除。在内含子区域的neo也被loxP删除。PCR检测显示含单拷贝Fstl1的杂合子(Fstl1^F/+)包括399bp和505bp两个条带；纯合子(Fstl1^F/F)仅有一个505bp条带；而野生型(Fstl1^+/+)有399bp一个条带。通过与SNS-Cre小鼠杂交，neo和外显子2被去除；

图4B.免疫印迹检测Fstl1^+/+、Fstl1^+/-、Fstl1^-/-小鼠DRG中FSTL1的表达情况。显示FSTL1在Fstl1^-/-DRG中基本不存在；

图4C.在Fstl1^-/-小鼠的DRG中，FSTL1免疫反应阳性的神经元降低到约10％，而一些主要分子的表达没有改变。

图5.FSTL1的缺失诱导躯体感觉超敏

图5A.全细胞记录脊髓II层神经元的sEPSC，显示由15mM KCl(1min)诱导的sEPSC频率增加在Fstl1^-/-小鼠中比在Fstl1^+/+小鼠中更显著。以不加KCl刺激作为对照，^**P＜0.01(Fstl1^-/-小鼠)；

图5B.在体记录小鼠脊髓背角的广动力神经元反应(WDR)，Fstl1^-/-小鼠(n＝6)的脊髓背角的WDR神经元对于热刺激(左)和机械刺激(右)更敏感(与Fstl1^+/+小鼠相比，^*P＜0.05)。鞘内给予(i.t.)FSTL1可逆转Fstl1^-/-小鼠这种增强的WDR神经元反应(n＝3，^*P＜0.05)；

图5C.Fstl1^+/+、Fstl1^F/F、Fstl1^-/-小鼠的温度刺激缩足反应延后时间(左)和机械刺激缩足阈值(右)的比较。Fstl1^-/-对于热(左)和机械刺激(右)更敏感(n＝12；与Fstl1^+/+小鼠和Fstl1^F/F小鼠相比，^**P＜0.01)；

图5D.Fstl1^+/+、Fstl1^F/F、Fstl1^-/-小鼠在加速旋转试验中跌落延后时间的比较结果(n＝6)；

图5E.Fstl1^+/+、Fstl1^F/F、Fstl1^-/-小鼠后脚掌注射***诱导炎性痛模型中小鼠舔足时间的比较。Fstl1^-/-小鼠显示更明显的疼痛反应(n＝6，与Fstl1^+/+小鼠和Fstl1^F/F小鼠比较，^*P＜0.05)；

图5F.Fstl1^-/-小鼠鞘内注射(i.t.)不同浓度FSTL1后对热刺激的缩足延后时间的影响，对照组注射载体(0.01M PBS)。FSTL1降低Fstl1^-/-小鼠对热刺激的反应。与注射载体的Fstl1^-/-小鼠相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01；

图5G.成年大鼠鞘内注射抗FSTL1全长蛋白的抗体(1∶100，20μl)或免疫前血清，观察大鼠对热刺激的缩足延后时间的变化。给予抗体后大鼠对热刺激更敏感(n＝6，与注射免疫前血清的小鼠相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01)。

图6.FSTL1表达的下降对神经源性痛有贡献

图6A.原位杂交显示Fstl1 mRNA水平，坐骨神经切断14天后大鼠腰4-5节段DRG中含有Fstl1 mRNA的小神经元数目显著减少，以大鼠未切断的对照侧为对照，^**P＜0.01；

图6B.免疫印迹显示大鼠坐骨神经切断后背根节不同时间FSTL1的变化。以GAPDH作为上样量对照；

图6C.免疫标记显示在坐骨神经切断14天后FSTL1阳性DRG数量减少。免疫荧光双标法显示，在损伤的DRG神经元[以活化转录因子3(ATF3)标记]中FSTL1缺失。坐骨神经切断14天后，在腰5节段中传入纤维(以三角箭头标示)中FSTL1显著下降；

图6D.由坐骨神经分支切断引起的神经源性痛模型中，切断14天后腰5DRG中FSTL1阳性神经元的数目显著下降。以大鼠未切断的对照侧为对照，^**P＜0.01；

图6E.在坐骨神经分支切断引起的神经源性痛模型中，鞘内注射FSTL1蛋白对于大鼠机械刺激缩足阈值的影响；

图7.FSTL1蛋白与α1钠-钾ATP酶(NKA)亚基的结合

图7A.用重组的FSTL 1-myc孵育培养的大鼠背根节神经元，同时加入了不透膜的交联剂(BS³)，用myc抗体检测到FSTL1在近150kD处可见一条带，实验重复3次；

图7B.与图7A同样处理的样品用α1NKA亚基的单克隆抗体检测，可见部分α1NKA亚基分子量从110kD增加到150kD，α3NKA亚基未见此现象，实验重复3次；

图7C.免疫组化染色显示α1NKA亚基主要定位于背根节神经元的小细胞中，与FSTL1有共定位；

图7D.大鼠背根节的免疫共沉淀实验显示，用FSTL1抗体免疫共沉淀下来的蛋白质中可以检测到α1NKA亚基，实验重复3次；

图7E.在COS7细胞中共转带flag标签的α1NKA亚基和FSTL1-myc(在flag抗体免疫共沉淀下来的蛋白质中可以检测到FSTL1-myc(实验重复3次))；

图7F.斯卡查德分析显示¹²⁵I-FSTL1剂量依赖性地结合共表达α1NKA亚基和β1亚基的COS7细胞(Kd＝43nM)；

图7G.在表达FSTL1-myc和α1NKA亚基的COS7细胞中，免疫共沉淀实验显示在flag抗体免疫共沉淀下来的蛋白质中存在FSTL1-myc，在共表达FSTL1-myc和α1NKA亚基^E314G-flag或α1NKA亚基^T889N-flag或α1NKA亚基^{E314G，T889N}-flag的细胞中，flag抗体免疫共沉淀下来的蛋白质中存在的FSTL1-myc显著下降，FSTL1-myc不与α3NKA亚基结合，但与α3NKA亚基^{G304E，N879T}-flag结合，实验重复3次。

图8.FSTL1激活α1NKA亚基

图8A.在COS7细胞中共转α1NKA-flag和带myc标签的β1亚基，可以检测到FSTL1剂量依赖性地上调NKA的活性，共转α3NKA-flag时则不能。在培养的背根节神经元中也可以检测到FSTL1呈剂量依赖性地上调NKA的活性；

图8B.FSTL1在共转α1NKA亚基^E314G-flag或α1NKA亚基^T889N-flag或α1NKA亚基^{E314G，T889N}-flag和β1亚基的COS7细胞中不能增加NKA的活性，FSTL1^E165A不能提高共表达α1NKA亚基和β1亚基的COS7细胞中NKA的活性。与共表达α1NKA亚基和β1亚基的COS7细胞相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01；

图8C.COS7全细胞记录观察到FSTL1(30nM)对共转α1NKA-flag和β1-myc亚基的细胞(n＝15)显著降低细胞膜电位，对不转染的细胞(n＝12)或共转α3NKA-flag和β1-myc亚基的细胞(n＝8)膜电位没有影响。与不转染的细胞相比，^**P＜0.01；

图8D.在共表达α1NKA亚基和β1亚基的COS7细胞中，预孵育M3M4(EC₅₀＝3.6μM)或M7M8(EC₅₀＝2.9μM)肽段可以使¹²⁵I-FSTL1的结合率显著下降，M1M2肽段不能降低；

图8E.在共表达α1NKA亚基和β1亚基的COS7细胞中，预孵育M3M4或M7M8肽段可以减弱FSTL1引起的NKA活性增强作用。与不加FSTL1的对照相比，^**P＜0.01；

图8F.全细胞记录急性分离的成年大鼠背根节小神经元，FSTL1(30nM)降低动作电位的频率，并且诱导膜超极化(记录16个细胞有7个有作用)，这种影响当同时给予NKA的特异性抑制剂哇巴因(OB 100μM)时被翻转，FSTL1引起的膜超极化的效应可被哇巴因翻转，也可以被预孵育α1NKA的第2个胞外环M3M4肽段所拮抗。

图8G.在脊髓背角中α1NKA的表达情况，免疫组化显示α1NKA与FSTL1共存于初级传入末梢中；

图8H.脊髓脑片II层神经元全细胞记录显示FSTL1(60nM)降低sEPSC的频率，这种影响当同时给予NKA的特异性抑制剂哇巴因(OB 100μM)时被翻转。与不加FSTL1的对照相比，^**P＜0.01(n＝5)；

图8I.脊髓脑片II层神经元全细胞记录显示M3M4(20μM，3min)肽段孵育增加sEPSC的频率。与不加肽段的对照相比，^*P＜0.05(n＝6)；

图8J.脊髓脑片II层神经元全细胞记录显示M3M4(20μM，3min)肽段孵育增加C纤维刺激引起的eEPSC幅度。与不加肽段的对照相比，^*P＜0.05(n＝5)。

图9.FSTL1蛋白的各功能区域对于细胞内钙和α1NKA酶活性的影响

分别得到去除FS、VWC、EF手型结构域和第165位氨基酸突变成丙氨酸的真核表达的重组蛋白，在急性分离的初级感觉神经元上用钙成像的方法检测蛋白质对辣椒素(Capsaicin，Cap)引起的DRG神经元细胞内钙升高的影响，全长FSTL1显著降低Cap引起的细胞内钙升高，缺失FS和VWC结构域对FSTL1的作用没有影响，但缺失EF手型结构域和第165位突变均显著影响FSTL1的功能。在稳定转染α1NKA和β1NKA亚基的COS7细胞上检测α1NKA酶活性，FSTL1全长可以显著激活α1NKA酶的活性，EF1手型结构域中第156-173位氨基酸序列合成多肽(SP76)也能显著激活α1NKA酶的活性。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次论证了滤泡素抑制素样蛋白1(Follistatin-Like 1，FSTL1)或其生物活性片段可提高钠钾ATP酶的活性，从而可用于治疗、缓解或改善与该活性相关的疾病或症状。例如，在感觉信息传递过程，下调FSTL1使得钠钾ATP酶活性下降会导致痛觉敏感性增加，这种调节作用是一种全新的感觉信息传递调节机制。因此，FSTL1其本身或其上调剂能够通过提高钠钾ATP酶活性而用于抑制哺乳动物躯体感觉(如减少哺乳动物的痛觉)。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“与钠钾ATP酶活性相关的疾病或症状”是指通过调节(包括上调或下调)钠钾ATP酶活性可获得治疗、缓解或改善的疾病或症状。与钠钾ATP酶活性降低或过低相关的疾病或症状包括但不限于：家族性偏瘫型偏头痛(Familial hemiplegic migraine)、糖尿病(diabetes)、抑郁症(depression)、洋地黄中毒(digoxin toxicity)、肺损伤(lung injury)、肺水肿(lung edema)或哺乳动物躯体感觉(如痛觉或温度觉过明显)，这些疾病或症状可通过提高钠钾ATP酶活性(在本发明中可通过例如增加FSTL1数量或提高FSTL1活性实现)而得到治疗、缓解或改善。与钠钾ATP酶活性提高或过高相关的疾病或症状包括但不限于：肾性高血压、肿瘤(优选黑色素瘤、胶质母细胞瘤和非小细胞肺癌)，这些疾病或症状可通过降低钠钾ATP酶活性(在本发明中可通过例如减少FSTL1数量、降低FSTL1活性、抑制FSTL激活钠钾ATP酶或阻断FSTL与钠钾ATP酶结合而实现)而得到治疗、缓解或改善。

如本文所用，所述的“躯体感觉”是指哺乳动物对于外在刺激(如机械损伤)或内在刺激产生的感觉反应，其通常由神经***(包括背根神经节)传递。所述的感觉包括(但不限于)：疼痛觉、温度觉。所述的疼痛包括神经源性痛，如背根神经节神经源性痛或三叉神经节神经源性痛。所述的温度觉是指对躯体接触到高温或低温后的感觉反应。

就疼痛而言，其可分为身源性(somatogenic)疼痛和心因性(psychogenic)疼痛。身源性疼痛又可分伤害感受性疼痛(nociceptive pain)与神经病理性疼痛(Neuropathic Pai)。神经病理性疼痛是由于中枢或周围神经***的损伤或病理改变引起，包括但不限于腰背痛(lower back pain)、神经痛(neuralgia)、纤维性肌痛(Fibromyalgia)、糖尿病相关的神经痛(diabetic neuropathic pain，DNP)、多发性硬化相关的神经痛(pain associated with multiple sclerosis)、带状疱疹后神经痛(PHN)和HIV有关联的(神经病理性)神经痛(HIVNP)等。伤害感受器性疼痛是由于人体内的伤害感受器受到机械、热、化学刺激或损伤引起，可分为躯体伤害感受器性疼痛和内脏伤害感受器性疼痛，包括但不限于癌痛(cancer-relatedpain)、关节炎痛(arthritic pain)、术后痛(post-operative pain)和HIV有关联的(伤害感受器性)神经痛(HIVNP)等。其中，神经痛(neuralgia)包括但不限于三叉神經痛(Trigeminal neuralgia)、坐骨神经痛(sciatic neuralgia)等。

如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

FSTL1蛋白或其生物活性片段

在寻找特异性表达在DRG神经元上的新功能分子的过程中，本发明人发现FSTL1在DRG小神经元上选择性高表达。

FSTL1是一种糖蛋白，最早被发现是一种转化生长因子(TGF)β1诱导蛋白。FSTL1属于滤泡素抑制素基因家族，拥有滤泡素抑制素样结构域和一对EF-手型结构，但是不能与激活素(Activin)结合。FSTL1可以抑制肿瘤细胞的生长，而且是类风湿性关节炎自身免疫抗体的靶蛋白。尽管已知包括DRG在内的神经***中存在Fstl1 mRNA，但是以往FSTL1在神经***中的生理功能仍不为人知。

本发明人在深入研究中意外发现，FSTL1可与钠-钾ATP酶(Na⁺，K⁺-ATPase)结合，且其中结合的关键点在于钠-钾ATP酶α1NKA亚基第二个胞外环M3M4和第四个胞外环M7M8中。并且，FSTL1与钠-钾ATP酶结合之后，可激活钠-钾ATP酶的活性，从而可用于治疗、缓解或改善与钠钾ATP酶活性降低或过低相关的疾病或症状。

反之，研究还证明了来源于钠钾ATP酶的肽段或它们的同源序列，包括但不限于：SEQ ID NOs：5和6所示的M3M4肽段、SEQ ID NOs：7和8所示的M7M8肽段)，通过抑制FSTL1与钠-钾ATP酶结合，可降低钠钾ATP酶的活性，从而可治疗、缓解或改善与钠钾ATP酶活性提高或过高相关的疾病或症状。

本发明中利用上调或下调FSTL1来治疗、缓解或改善与钠钾ATP酶活性相关的疾病或症状的方法，在同时存在FSTL1和钠钾ATP酶的组织或细胞(例如背根神经节、心脏、肺、肾脏等)中尤为有效。

钠钾ATP酶α1NKA亚基的序列在本领域中是已知的，或可通过本领域常规方法确定。例如，大鼠和人的钠钾ATP酶α1NKA亚基的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3(1023Aa)和SEQ ID NO：4(1023Aa)所示，它们的序列相同性达到96％。大鼠和人钠钾ATP酶α1NKA亚基中的关键胞外环如下表1所示：

表1.钠钾ATP酶α1NKA亚基和关键胞外环

^*第2列中的序列号以SEQ ID NO：3所示氨基酸序列中的氨基酸号为基准

^**第3列中的序列号以SEQ ID NO：4所示氨基酸序列中的氨基酸号为基准

发明人在进一步深入研究发现，FSTL1可以从初级感觉神经元和神经末梢分泌，对感觉信息传递过程有调节作用。FSTL1在DRG小神经元细胞中高表达，通过小的清亮囊泡运输至传入神经末梢并可与兴奋性递质共同释放。电生理记录表明，FSTL1可通过激活钠-钾ATP酶(Na⁺，K⁺-ATPase)使DRG小神经元细胞膜超极化。特异性敲除DRG神经元中的FSTL1，可导致传入运输增加，并增加哺乳动物的痛觉敏感度。重要的是，神经损伤会下调DRG神经元FSTL1的表达，而脊髓鞘内注射FSTL1可减轻神经损伤引起的痛觉反应。因此，传入纤维末梢分泌的FSTL1在正常生理范围内是作为一种重要的自身抑制调节因子起作用以维持正常的躯体感觉。FSTL1可有效减轻神经损伤引起的痛觉反应提示：FSTL1、或者可激活或上调FSTL1的分子在神经源性痛中有治疗价值。

在本发明中，所用的FSTL1蛋白可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自哺乳动物。此外，所述的FSTL1蛋白也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组FSTL1蛋白。优选的，本发明可采用重组的FSTL1蛋白。

任何适合的FSTL1蛋白均可用于本发明。所述的FSTL1蛋白包括全长的FSTL1蛋白或其生物活性片段(或称为“活性片段”或“本发明的多肽”)。例如，所述的FSTL1蛋白的氨基酸序列可以与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的序列基本上相同。

经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的FSTL1蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中。FSTL1蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施，并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等，“Molecular Biology of The Gene”(《基因分子生物学》，第四版，1987，本杰明/库明出版公司，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224)。

任何一种FSTL1蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，FSTL1蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的FSTL1蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长FSTL1蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长FSTL1蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

作为本发明的优选方式，所述的FSTL1蛋白的生物活性片段(在本发明中也称为“本发明的多肽”)可包括(但不限于)：(1)具有SEQ ID NO：1中第156-173位或SEQ ID NO：2中第158-175位的基酸序列的多肽；(2)SEQ ID NO：1或SEQID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质，且其中缺失滤泡素抑制素(Follistatin，FS)结构域；(3)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质，且其中缺失Von Willebrand型C结构域(VWC)；(4)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质，且其中缺失EF手型II结构域；或(5)SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的蛋白质，且其中缺失EF手型I结构域和EF手型II结构域之间的连接结构域。经验证，FSTL1蛋白的上述生物活性片段保留了全长FSTL1蛋白的生物活性，或比全长FSTL1蛋白具有更优异的生物活性。

在本发明的实施方式中，在SEQ ID NO：1中，以SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中的氨基酸号为基准，所述滤泡素抑制素(FS)结构域为28-96位，VWC结构域为231-285位；EF手型结构域为142-226位，其中：EF手型I结构域为142-178位，EF手型连接结构域为179-190位，EF手型II结构域为191-226位。

在本发明的实施方式中，在SEQ ID NO：2中，以SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中的氨基酸号为基准，所述滤泡素抑制素(FS)结构域为30-98位，VWC结构域为233-287位；EF手型结构域为144-228位，其中：EF手型I结构域为144-180位，EF手型连接结构域为181-192位，EF手型II结构域为193-228位。

SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的FSTL1序列中各片段和结构域的分布如下表2所示：

表2.FSTL1中各片段和结构域的分布

^*第2列中的序列号以SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中的氨基酸号为基准

^**第3列中的序列号以SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中的氨基酸号为基准

本发明也可采用经修饰或改良的FSTL1蛋白，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢和/或蛋白质的效力而加以修饰或改良的FSTL1蛋白。所述经过修饰或改良的FSTL1蛋白可以是一种FSTL1蛋白的共轭物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的FSTL1蛋白可以是与天然存在的FSTL1蛋白具有较小的共同点，但也能抑制哺乳动物躯体感觉，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响FSTL1蛋白的生物活性的变化形式都可用于本发明中。

一旦分离获得了所述蛋白质的序列，就可以用重组法来大批量地获得该蛋白质。这通常是将其编码基因克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到。此外，对于较短的蛋白质而言，也可采用人工合成(如通过多肽合成仪合成)的方法来合成有关序列，人工合成的方法可简便且快速地得到所需要的蛋白质。

本发明还包括了编码所述的FSTL1蛋白的生物活性片段的分离的核酸，也可以是其互补链。编码FSTL1蛋白的生物活性片段的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法获得。在获得了编码所述的FSTL1蛋白的生物活性片段的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后通过培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到所要的蛋白质。

本发明还包括了包含编码所述FSTL1蛋白的生物活性片段的核酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于蛋白质的表达。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

此外，含有编码所述FSTL1蛋白的生物活性片段核酸序列的重组细胞也包括在本发明中。“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；例如可为大肠杆菌细胞(E.coli)，如大肠杆菌HMS174(DE3)、或BL21(DE3)。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。

基于本发明人的新发现，本发明提供了FSTL1蛋白或其生物活性片段的用途，用于制备抑制哺乳动物躯体感觉的组合物；或用于筛选抑制哺乳动物躯体感觉的物质。

FSTL1蛋白或其生物活性片段的抑制剂

本发明中还提供了FSTL1蛋白或其生物活性片段的抑制剂，这些抑制剂可通过降低钠钾ATP酶的活性而用于治疗、缓解或改善与该活性相关的疾病，例如肾性高血压、肿瘤(优选黑色素瘤、胶质母细胞瘤和非小细胞肺癌)。

FSTL1蛋白或其生物活性片段的抑制剂可选自：抗滤泡素抑制素样蛋白1或其活性片段的抗体；针对滤泡素抑制素样蛋白1编码序列的反义寡核苷酸、小干扰RNA；来源于钠钾ATP酶的肽段；或它们的同源序列，包括但不限于：SEQ ID NOs：5和6所示的M3M4肽段、SEQ ID NOs：7和8所示的M7M8肽段。

本领域普通技术人员在知晓FSTL1蛋白、其生物活性片段或其编码序列的结构或获得所述蛋白、片段或编码序列之后，可通过本领域中的常规方法获得或筛选所述抑制剂。

组合物

本发明提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt％；较佳的0.00001-20wt％；更佳的，0.0001-10wt％)的所述的FSTL1蛋白或其生物活性片段、或者可激活或上调FSTL1的分子，以及药学上可接受的载体。

本发明的组合物可直接用于提高钠钾ATP酶活性，以治疗、缓解或改善与该活性相关的疾病或症状，例如调节哺乳动物躯体感觉。此外，还可同时与其它治疗剂或辅剂联合使用。

通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和***反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的组合物含有安全有效量的FSTL1蛋白以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

本发明所述的FSTL1蛋白或其生物活性片段的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的FSTL1蛋白或其生物活性片段的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的FSTL1蛋白或其生物活性片段每天以约0.00001-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

此外，本发明中还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt％；较佳的0.00001-20wt％；更佳的，0.0001-10wt％)的所述的FSTL1蛋白或其生物活性片段或其编码序列的抑制剂、或者下调FSTL1的分子，以及药学上可接受的载体。本发明的组合物可直接用于减低钠钾ATP酶活性，以治疗、缓解或改善与该活性相关的疾病或症状，例如提高哺乳动物躯体感觉的敏感度。此外，还可同时与其它治疗剂或辅剂联合使用。

本发明组合物中的pH或载体等可如上文所述，并可由本领域普通技术人员根据需要和常识进行选择。

通常，当本发明的抑制剂每天以约0.00001-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

提高/降低钠钾ATP酶活性的方法以及给药方式

本发明提供了一种提高钠钾ATP酶活性以治疗、缓解或改善与该活性相关的疾病或症状的方法，包括给予受试者有效量的FSTL1蛋白或其生物活性片段或者可激活或上调FSTL1的分子。当用于调节哺乳动物躯体感觉时，优选采用重组的FSTL1蛋白或其生物活性片段。

本发明的FSTL1蛋白或其生物活性片段或者可激活或上调FSTL1的分子的给药方式没有特别的限制，可以是全身的或局部的。优选的，本发明的FSTL1蛋白或其生物活性片段可通过脊髓鞘内注射的方式给予动物。

在得知了所述的FSTL1蛋白的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的FSTL1蛋白或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。优选的，可采用基因治疗的手段进行，比如可直接将FSTL1蛋白通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带FSTL1基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的FSTL1蛋白。

作为本发明的一种实施方式，可将所述的FSTL1蛋白直接给药于哺乳动物(比如人)，或者，可将编码FSTL1蛋白的基因通过常规的方法克隆到适当的载体(如常规原核或真核表达载体、或病毒载体如疱疹病毒载体或腺病毒载体)中，将所述的载体导入到可表达所述FSTL1蛋白的细胞中，使所述的细胞表达FSTL1蛋白。可通过将适量的所述细胞引入到哺乳动物身体的适当部位，实现FSTL1蛋白的表达。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含FSTL1蛋白编码基因的序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

包含上述的适当基因序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

在上面的方法中的重组蛋白可在细胞内表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

在相反的方面，本发明还提供了一种降低钠钾ATP酶活性以治疗、缓解或改善与该活性相关的疾病或症状的方法，包括给予受试者有效量的FSTL1蛋白或其生物活性片段或其编码序列的抑制剂、或者可下调FSTL1的分子。这些物质的给药方式没有特别的限制，可以是全身的或局部的。优选的，本发明的FSTL1蛋白或其生物活性片段可通过脊髓鞘内注射的方式给予动物。

筛选调节低钠钾ATP酶活性的潜在物质的方法

在得知了所述的FSTL1蛋白对于提高钠钾ATP酶活性的用途后，可以基于该特征来筛选调节FSTL1的表达或活性的物质。

因此，本发明提供一种筛选可用于调节钠钾ATP酶活性的潜在物质的方法，所述的方法包括：将候选物质与表达FSTL1的体系接触；和检测候选物质对FSTL1的影响；若所述候选物质可提高FSTL1的表达或活性或分泌，则表明该候选物质是可用于提高钠钾ATP酶活性的潜在物质；若所述候选物质可降低FSTL1的表达或活性或分泌，则表明该候选物质是可用于降低钠钾ATP酶活性的潜在物质。

在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到FSTL1的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达FSTL1的体系。

所述的体系包括(但不限于)：溶液体系、亚细胞体系、细胞体系、组织体系、器官体系、或动物体系。所述的体系中可含有FSTL1，用于在其中加入候选物质，观察候选物质对FSTL1的影响；或者，所述的体系中可同时含有FSTL1及与钠钾ATP酶相关的调节通路的上下游物质，用于在其中加入候选物质，同时观察候选物质对于FSTL1及其调节通路的影响。

作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于调节钠钾ATP酶活性真正有用的物质。

另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的可用于调节钠钾ATP酶活性的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于调节FSTL1的表达和活性真正有用的物质。

另一方面，本发明还提供了一种筛选治疗或缓解疼痛的潜在物质的方法，其特征在于，所述的方法包括：(1)将候选物质与钠钾ATP酶的体系接触；(2)检测候选物质对钠钾ATP酶的影响；若所述候选物质可提高钠钾ATP酶的活性，则表明该候选物质是可用于治疗或缓解疼痛的潜在物质。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明首次揭示了FSTL1与钠钾ATP酶活性之间的关系，从而提供了一种通过调节钠钾ATP酶活性，从而用于治疗、缓解或改善与该活性相关的疾病或症状的新方法和组合物；

(2)本发明提供了一种全新的感觉信息传递调节机制，首次论证了FSTL1对感觉信息传递过程有调节作用，从而提供了一条调节躯体感觉的新途径。

(3)为治疗疼痛药物的筛选提供了良好的途径。可以以钠钾ATP酶活性作为药物筛选靶点，筛选治疗疼痛的药物。也可以FSTL1作为药物筛选靶点，筛选激活FSTL1的表达物质从而用于制备治疗疼痛的药物。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

I.材料和方法

DRG样品制备

分别取胚胎14天、出生后(P)0、7、14和28天、成年SD大鼠(购自中科院上海实验动物中心，雄性)，麻醉后处死，取腰4和腰5背根神经节，用干冰速冻，用于RNA印迹法和免疫印迹法实验。

免疫组织化学实验

分别取胚胎12和15天SD大鼠，用0.2％苦味酸的4％多聚甲醛(37℃，用0.1mol/L磷酸缓冲液配制，pH 6.9)固定液浸泡12小时，直接进行冰冻切片。取成年SD大鼠，麻醉后通过主动脉先灌入生理盐水(37℃)50ml，然后再灌入固定液50ml，然后立即灌入4℃预冷的固定液200ml，持续5分钟。P14天的大鼠灌注的液体量减少到1/5量。取出腰4和腰5脊髓，在同样的固定液中4℃后固定90分钟，然后在含10％蔗糖的磷酸缓冲液中浸泡24小时。切14μm冰冻切片。

用一抗稀释液(含1％BSA和0.3％Triton X-100的PBS)稀释第一抗体，在4℃放置16-24小时。用0.01mol/LPBS洗后，加入用PBS稀释的荧光标记的第二抗体(1∶100；Jackson ImmunoResearch)，放入37℃温箱中孵育30分钟，洗后封片。切片用激光共聚焦显微镜(Leica SP2)采集图象数据。统计数据每只大鼠取3张切片，每组3只大鼠。

FSTL1-Myc/his融合蛋白的生产和纯化

本发明人将大鼠和人类FSTL1全长编码序列(序列参见GenBank登录号：NM_024369)***pcDNA3.1Myc/his质粒(Invitrogen)的Xho I/Hind III酶切位点内，再通过磷酸钙转染法把这个重组质粒转入293T细胞(ATCC)中，DMEM完全培养基孵育12小时后，换成ISCOVE培养基(Invitrogen)，上清每36小时收取一次，并通过His·Bind纯化法(Qiagen)浓缩和纯化。

将大鼠Fstl1cDNA亚克隆到pcDNA3.1myc/His质粒中。通过PCR扩增FSTL1的不同区域构建FSTL1^ΔEF，并将其克隆到pcDNA3.1myc/His质粒中，所用引物序列如下所示：

FSTL1^1-141：5′-ATGTGGAAACGCTGGCTGGC-3′(正向引物，SEQ ID NO：9)

            5′-ACTGCCTTTAGAGAACCAGC-3′(反向引物，SEQ ID NO：10)；

FSTL1^249-306：5′-TGCGCCCTGGAGGACGAAAC-3′(正向引物，SEQ ID NO：11)

              5′-ATCTCTTTGGTGTTCACCT-3′(反向引物，SEQ ID NO：12)

FSTL1^E165A的构建采用了两轮PCR的方法。第一轮PCR以如下引物扩增FSTL1的不同区域：

5′-ATGTGGAAACGCTGGCTGGC-3′(正向引物，SEQ ID NO：13)

5′-ATTTCAGGAATGCGCTGGAGTCCAGGTGAGAGT-3′(反向引物，SEQID NO：14)；

5′-GGACTCCAGCGCATTCCTGAAATTCGTGGAGCA-3′(正向引物，SEQID NO：15)

5′-ATCTCTTTGGTGTTCACCT-3′(反向引物，SEQ ID NO：16).

在1％琼脂糖凝胶中分离PCR产物并进行纯化，然后混合作为第二轮PCR的模板。FSTL1点突变的全长cDNA用如下引物进行扩增，并克隆到pcDNA3.1myc/His质粒中。

5′-ATGTGGAAACGCTGGCTGGC-3′(正向引物，SEQ ID NO：17)

5′-ATCTCTTTGGTGTTCACCT-3′(反向引物，SEQ ID NO：18)。

抗体制备

将大鼠和人FSTL1C端31个氨基酸和全长编码序列(序列参见GenBank登录号：NM_024369)***pGEX-KG质粒，然后通过GST表达和纯化得到相应的蛋白质。将这两种蛋白质(0.5mg)和完全弗氏佐剂混合后，注射到兔子或小鼠的皮下，三个星期后再次注射蛋白(0.25mg)和完全弗氏佐剂混合液；再过两个星期后再次进行免疫。然后取相应的兔和小鼠的血清制备成兔源和小鼠源的FSTL1抗体。

神经元培养

取SD大鼠麻醉处死后暴露脊髓和神经节，用眼科剪快速将神经节两侧的神经剪断，取下神经节放在含有消化酶(胶原酶1.0mg/ml、胰酶0.4mg/ml和DNA酶0.1mg/ml)的DMEM(Gibco)培养基中，置37℃水浴消化30分钟。对于急性分离的DRG神经元，用粗细适中的巴氏管将含有消化酶的培养基吸取，并用细胞外液(ECS：150mM NaCl、5mM KCl、1mMMgCl₂、2.5mM CaCl₂、10mM HEPES和10mM D-葡萄糖)清洗神经节2-3次后，轻轻吹打神经节直至单个细胞被打散出来，将打散的细胞种在盖玻片上贴壁，在细胞外液中培养在室温或4℃可放8-10h。对用于培养的神经元，用培养基清洗消化酶，将打散后的细胞培养在DMEM+10％FBS(Gibco)完全培养基48小时。

COS-7细胞培养和转染

本发明人将大鼠α1NKA(序列参见GenBank登录号：NM_012504)和α3NKA(NM_012506)全长编码序列***pIRES-EGFP2(Clonteck)，将β1NKA(NM_013113)全长编码序列***pcDNA3.1(-)-A质粒(Invitrogen)。通过脂质体转染法把α1NKA和β1NKA、α3NKA和β1NKA重组质粒分别共转入COS-7细胞(ATCC)中，DMEM完全培养基孵育36-48小时后，用于NKA酶活性试剂盒(南京建成生物工程研究所)检测NKA酶活性。

神经元免疫印迹法刺激后FSTL1分泌实验

从出生后(P)14天的大鼠分离得到的DRG神经元在含10％血清(FBS)的DMEM中培养48小时，之后换成含1％血清的DMEM再培养4小时，在新鲜培养基中孵育2小时后，分别用55mM KCl和1μM辣椒素(Sigma)处理神经元1小时。分别获得处理组和对照组的培养基，用10％三氯醋酸在4℃放置10分钟的方法沉淀培养基中的蛋白质，15,000g离心10分钟，沉淀用100μl SDS样品缓冲液溶解，并进行沸水浴5分钟。

培养的神经元用裂解液裂解。大鼠和小鼠的组织也在4℃做同样处理。样品处理后进行SDS-PAGE电泳，再被转移到多聚二氟乙烯膜上，膜用含5％脱脂牛奶和0.1％Tween20的TBST缓冲液封闭1小时(室温)。然后分别按需要使用兔(Rb)抗FSTL1抗体(1∶4000；如“材料和方法”部分中所述将大鼠FSTL1的C末端31个氨基酸制成的GST融合蛋白免疫兔子所得血清)、小鼠抗肌动蛋白抗体(1∶50000；Chemicon)和小鼠抗Myc抗体(1∶4000；Chemicon)，在4℃条件下杂交过夜。用连有辣根过氧化物酶的相应二抗杂交，并用TBST漂洗之后，由ECL显影液显影曝光。

用ImageQuant 5.1测定蛋白杂交的ECL信号强度，计算处理后培养基内与全细胞裂解液中FSTL1的比值，计算培养基内FSTL1与肌动蛋白强度之间的比值。以每次实验相应的对照组进行标准化。

钙成像记录

应用fura-2染料(对钙敏感的荧光染料，Sigma)对培养皿中DRG细胞进行避光孵育30分钟，然后取出孵育过的细胞放置于荧光倒置显微镜(OlympusIX50)的载物台上，进行钙成像。激发光的波长分别为340nm和380nm，分别得到发射光的荧光强度，计算其比值得到钙浓度的相对值。以上试验在TILLvisION成像***v3.3(T.I.L.L.公司，德国)上完成。

脊髓薄片制作及记录

将麻醉的动物(乌拉坦腹腔注射，1.2g/Kg)行椎板切除术，暴露腰骶膨大处脊髓，取出腰骶膨大处脊髓放置于人工脑脊液的冰水混合液中，除了保留一侧L5后根外，其它前后根均切除，剥去覆盖在脊髓表面的硬膜、蛛网膜及软膜，振动切片机切取带有一条L5后根的脊髓薄片，片厚600-650微米，将其放置于通有95％O₂和5％CO₂的人工脑脊液灌流***中孵育，1小时后开始记录。

Fstl1条件式敲除小鼠的构建

应用P1抗菌素中位置特异性的Cre重组酶可以切割重组两个LoxP位点之间的基因片断的原理，利用pNeotkLoxP载体(南京大学模式动物研究所)，构建了Fstl1的条件性打靶载体，打靶载体中有三个LoxP位点。

Fstl1的外显子2(F2，包含有信号肽)位于一个LoxP位点之间，而用于后期在胚胎干细胞中筛选的正、负标志(neo、tk)位于另一个LoxP位点之间。Not I是线性化的酶切位点。随后将线性化的打靶载体电转入胚胎干细胞，然后将带Cre的质粒转入上述胚胎干细胞，打靶载体可被切成三种情况，挑选本发明人所需要的条件性打靶载体，然后把含有这种条件性打靶载体的胚胎干细胞注射到受体囊胚中，然后移植到假孕母鼠体内发育成个体。这种小鼠体内有二类不同来源的细胞(囊胚自身的细胞和注射的胚胎干细胞)，从而被称为嵌合体。由于胚胎干细胞的全能性，把它注射到一个囊胚腔后，它会和这个囊胚一起发育成为身体的各个器官组织，包括生殖细胞。如果胚胎干细胞发育成生殖细胞，通过同源重组得到的遗传修饰即能被导入嵌合体的生殖细胞系中并且能传到下一代就会得到含有条件性打靶载体的杂合体小鼠，然后用杂合体小鼠配对繁殖，就可得到含有条件性打靶载体的纯合体小鼠。随后应用Na_v1.8-Cre小鼠(Cre重组酶特异性表达在Na_v1.8阳性的初级感觉神经元中、小细胞上，德国海德堡大学提供)与含有条件性打靶载体的小鼠配对繁殖，从而得到特异性敲除初级感觉神经元中Na_v1.8阳性细胞上FSTL1表达的小鼠。

行为学观察

协调运动试验(Rota-rod test)

将动物置于Rota-rod Treadmill运动仪匀速转动(12转/min)的转轮上适应30s后，使转轮加速(加速度为5min内3至30转)，记录大鼠自开始加速至跌落转轮的时间，作为反映大鼠运动协调能力的指标。

热刺激潜伏期测量

将动物置于一底部为2mm厚玻璃板的20cm×20cm×25cm的透明有机玻璃箱中，并放置于高于实验台30cm的架子上以便于观察。应用热刺激仪，选择100W卤素投射灯，调节电压至10V，调节灯源与玻璃板之间的距离，使落在足底的照射光圈直径为5mm，记录从开始照射至出现缩足逃避反射时间(s)，此即为热刺激反应潜伏期，重复测量5次，同一部位间隔10min，不同部位间隔5min。去掉第一次测量值，取后4次测量值取平均值，作为热刺激反应潜伏期并作为定量指标。如大于30s无反应则停止照射，以免导致足底组织过度热损伤。

机械刺激阈值测量

以不同粗细和不同长度的尼龙丝制成不同刺激强度的机械刺激器(von-Frey)纤维。将一20cm×20cm×25cm的透明有机玻璃箱放置于顶部为铁丝网的30cm高的架子上，将待测动物置于箱中。实验者手持von-Frey纤维穿过铁丝网格分别刺激大鼠两侧足底中心部位，刺激强度由小到大，每个强度反复刺激10次(次-次间隔3～5s)，将出现缩足反射5次以上之强度定为动物对机械刺激的反应阈值。如以588mN von-Frey纤维刺激大鼠足底不出现缩足反射，则认为大鼠无痛反应，机械刺激阈值＜58.8mN均以58.8mN计。这是一种广泛使用的机械刺激定量方法，因为当尼龙纤维受阻弯曲后其尖端压强不变，所以可以认为每个测量值都是恒定的。

统计学处理

本实验所有数据以平均值±标准差(mean±SEM)表示，应用SPSS软件包对随机分布样本进行非参(Mann-Whitney U test)检验，对配对样本进行方差分析(ANOVA followed by posthoc Fisher’s PLSD or Sheffe test)和t检验，p＜0.05被认为具有显著统计学意义。

实施例1.FSTL1在成年DRG小神经元中选择性高表达的验证

为确定特异性在DRG表达的蛋白质，本发明人在基因库中搜索在DRG中高表达，而在其他组织中表达相对较低的基因。本发明人找到了71个(候选基因，并通过自制基因芯片检测了它们在成年大鼠组织中的表达谱。其中19个基因选择性地在DRG中高表达(在DRG中的表达水平比在其他组织的平均表达水平高3倍或3倍以上)，包括预期的基因如CGRP、P2X₃受体和Na_v1.8通道。在检测到的成年大鼠DRG中特异性表达程度最高的几个基因中，FSTL1也是其中之一(图1A)。

多核苷酸基因芯片结果显示Fstl1主要在成年大鼠的DRG表达，比其它组织水平高出约8倍。并且，Fstl1在大鼠的心脏、肺、肾脏和脊髓中也有高表达。通过RNA印迹法(图1K)对各组织中的Fstl1mRNA进行检测进一步证明，FSTL1在心脏、肺、肾脏中表达水平较高。

RNA印迹法(图1B)和使用FSTL1特异性抗体的免疫印迹实验(图1C)检测进一步证明，FSTL1在成年大鼠DRG中特异性高表达，在脊髓中也有所表达。值得注意的是，胚胎发育过程中，FSTL1在海马和皮层中也有表达，但在出生后这些脑区的表达消退(图1A和1D)。相反，FSTL1在胚胎15天时出现在DRG神经元中，在出生后28天达到高峰并维持其高表达至成年(图1D)。

在成年大鼠DRG中FSTL1主要在小神经元中表达(图1D，1H)。DRG小神经元包括含神经肽如P物质和CGRP的肽能神经元及非肽能神经元IB4(isolectin B4)神经元。免疫荧光双标记显示约46％的FSTL1阳性小神经元表达P物质，而有约54％与CGRP共定位，另外有约45％的FSTL1阳性细胞同时被IB4标记(图1E、1G和1I)。另外，FSTL1也与DRG小神经元细胞的标记物TRPV1通道、P2X3受体和Na_v1.8通道蛋白(图1F、1G和1J)等共表达。在大鼠脊髓，FSTL1存在于I到II层(图1E)，正是大多数肽能传入纤维和IB4阳性传入纤维存在的区域。

由此可见，FSTL1在肽能以及IB4阳性的小神经元胞体中都有表达，并可在其传入纤维末梢中找到。

实施例2.FSTL1由特殊的清亮囊泡运输并分泌

本发明人检测了FSTL1在细胞中的亚细胞定位，发现FSTL1由一种独特的分泌囊泡储存。传入纤维末梢存在突触囊泡和大致密芯泡(LDCV)，当有刺激引起胞内钙升高时会促进这些囊泡分泌其内容物。胞吐后，突触囊泡在轴突末梢可回收再利用，而大致密芯泡则需由胞体运输过来得到补充。免疫荧光双标记表明，在DRG小神经元细胞胞体中FSTL1与非肽类囊泡相关联(图2A，1I)。包埋后免疫电镜金标记显示，FSTL1位于高尔基网外侧附近的小清亮囊泡(直径30-80nm)中(图2B)。

本发明人也检测了FSTL1在传入纤维末梢的分布。用蔗糖密度梯度离心分离亚细胞组分的方法分离得到大鼠脊髓背角不同囊泡群，发现FSTL1主要出现在含有突触孔蛋白(synaptoporin，Synpr)的小囊泡群中，而不是在含CGRP的LDCV组分中(图2C)。突触孔蛋白是突触素(synaptophysin)超家族的一员，被认为是脊髓I到II层传入神经纤维末梢突触囊泡膜的基本组成成分。免疫荧光双标记表明绝大多数FSTL1阳性颗粒都是突触孔蛋白阴性的(图2A)，提示FSTL1主要存在于另一类与突触孔蛋白相异的小囊泡亚群里。电镜免疫金标记表明，FSTL1存在于后根传入纤维及脊髓背角I、II层的传入纤维末梢的小清亮囊泡(图2D)中。有趣的是，含FSTL1的囊泡在突触前膜的活性区也有分布(图2D)。综上所述，FSTL1是在胞体合成，组装入小清亮囊泡，然后被运输到传入末稍进行突触前分泌。

与在DRG神经元胞体内较强的免疫标记相比，FSTL1在大鼠脊髓传入纤维的染色要弱的多，而在小鼠脊髓中基本检测不到免疫阳性。但是，结扎后根24小时以阻断囊泡顺向运输会导致传入纤维靠近DRG一端FSTL1的积聚(图2E)，表明FSTL1存在顺向运输。因此，在脊髓传入纤维末梢检测到较少的FSTL1可能是由于其被迅速分泌释放所致。

本发明人用培养的大鼠DRG神经元直接检测FSTL1的分泌。免疫印迹实验表明，在无刺激的条件下，细胞培养液中FSTL1水平呈现时间依赖性升高(图2F，G)，表明DRG小神经元存在FSTL1的自发分泌。此外，55mM高钾刺激可促进FSTL1分泌，在无细胞外钙存在的情况下高钾的作用被消除(图2G)。

用TRPV1通道激动剂辣椒素(Cap)处理可显著增加培养液中的FSTL1水平，这一反应可被TRPV1通道的阻断剂capsaizepine(CPZ，Sigma)阻断(图2J)。55mM高钾刺激也可以促进成年大鼠脊髓薄片和由大鼠脊髓背角突触球中FSTL1的分泌(图2H，I)。值得注意的是，FSTL1可以与CGRP和谷氨酸共分泌，刺激引发的大鼠脊髓背角突触球FSTL1分泌仅在细胞外钙存在的条件下发生(图2I)。

因此，FSTL1储存在小清亮囊泡运输，并以与其它神经递质相似的方式在传入神经末梢释放。

实施例3.FSTL1抑制感觉传入神经突触传递

本发明人通过在成年大鼠带背根的脊髓薄片上进行全细胞记录来研究FSTL1是否可以调控传入神经的突触传递。

在人胚胎肾脏293T(HEK293T)细胞中转染了可表达带有Myc和His片断的大鼠FSTL1的质粒，并纯化其合成分泌的FSTl1蛋白(图3E)，所表达的FSTL1的结构见图3A。

在记录的大约50％(16/31个神经元)的脊髓II层神经元中，灌流重组FSTL1蛋白(60nM或300nM)，自发的兴奋性突触后电流(sEPSCs)的频率和幅度呈剂量依赖性的减少(图3B)。另外，在记录的大约60％(14/24)的脊髓II层神经元中，重组FSTL1蛋白可降低C纤维诱发的兴奋性突触后电流(eEPSCs)幅度(图3C)。在河豚毒素(TTX，0.5μM)存在时记录微型EPSCs(mEPSCs)，发现FSTL1蛋白可抑制mEPSCs的频率，但对其幅度无显著作用(图3D)，提示FSTL1对谷氨酸释放有突触前抑制作用。FSTL1对sEPSCs和eEPSCs的衰减动力学特性无显著影响，表明FSTL1对突触后膜谷氨酸受体通道的性质没有直接作用(图3B，C)。

本发明人用多种FSTL1蛋白的突变体来进一步检验了FSTL1的功能(图3E)，其中包括钙结合位点(M2)或一对EF手型结构缺失丧失功能(M1)的FSTL1突变体蛋白(结构见图3A，E)。本发明人发现，这些FSTL1突变的重组蛋白失去了对eEPSC的抑制作用(图3C)。另外，纯化的人重组滤泡素抑制素(Follistatin)对传入纤维传递无作用(图3F)。综上所述，外源给予FSTL1对脊髓传入纤维的突触传递有特异的抑制作用。

为进一步研究内源性的FSTL1是否对传入纤维的突触传递也产生抑制作用，本发明人采用常规方法制备并纯化了FSTL1的抗体以封闭脊髓薄片自身分泌的FSTL1。实验发现，灌流FSTL1抗体(1∶1000)可以增加sEPSC的频率及幅度和eEPSC的幅度(图3B，C)，而对照的免疫前血清没有作用，提示在正常生理情况下内源性分泌的FSTL1对传入突触传递即有抑制作用。

实施例4.Fstl1条件基因敲除小鼠躯体感觉敏感性增加

在观察到FSTL1对脊髓背角传入神经的突触传递有抑制作用后，本发明人分析FSTL1可能参与了调节正常的躯体感觉功能。为避免基因全敲除引起的全身变化，本发明人应用条件式基因敲除方法，特异性地敲除小鼠DRG小神经元中的FSTL1来观察其在初级感觉信息传导中的作用。因为表达FSTL1的DRG小神经元中有96.5％与Na_v1.8共定位，所以用具有以loxP为基础的Fstl1条件性等位基因(Fstl1^F)(图4A)的小鼠和Na_v1.8-Cre BAC转基因小鼠品系(SNS-Cre)杂交，可以得到Fstl1条件式基因敲除小鼠(Agarwal等，Genesis.2004，38：122-129)Fstl1^F/F：SNS-Cre(Fstl1^-/-)。

Fstl1^F/F：SNS-Cre(Fstl1^-/-)小鼠活动性好，具有生育能力，没有出现明显的畸形，仅是在DRG神经元中检测不到FSTL1的表达(图4B，C)。这些Fstl1^-/-小鼠的DRG神经元数量和大小分布以及脊髓的解剖结构与野生型小鼠(Fstl1^+/+)类似。而且Fstl1^-/-小鼠的脊髓和DRG神经元中Na_v1.8通道、P2X3受体、TRPV1通道、P物质和其它主要的离子通道、受体、神经肽和信号转导分子表达均未发生明显变化(图4C)。但是，在脊髓薄片对FSTL1敏感的II层神经元的全细胞记录表明，与Fstl1^+/+小鼠相比，Fstl1^-/-小鼠15mM KCl引起的sEPSC频率的增加要更显著(图5A)，表明刺激引起的FSTL1释放(图2G，H)对于抑制过强的突触传递是必要的。

为检测FSTL1缺失对机体感觉传递的影响，本发明人对小鼠脊髓后角的广动力域(WDR)神经元进行在体细胞外记录(根据Li和Chen等，Neuroscience，126(2001)：753-762中所记载的方法进行记录)，这些神经元与初级感觉神经元有突触联系，并且对温度和机械刺激均有反应。用温度和机械刺激刺激WDR神经元的感受野可增加这些神经元动作电位的发放。有趣的是，本发明人发现与Fstl1^+/+小鼠相比，Fstl1^-/-小鼠脊髓的WDR神经元动作电位发放更强，而同样的温度和机械刺激会引起放电增加(图5B)。在Fstl1^-/-小鼠中，非伤害性刺激引起的WDR细胞放电频率(38℃，7.0±1.5Hz)和压迫刺激(15.4±1.8Hz)与伤害性刺激在Fstl1^+/+小鼠WDR细胞诱导的放电频率(45℃，7.9±1.0Hz)和捏夹刺激(16.3±3.9Hz)相似。另外，在Fstl1^-/-小鼠脊髓鞘内注射FSTL1可完全改变这种反应，使Fstl1^-/-小鼠WDR神经元的放电频率变至与野生型小鼠相似(图5B)，证明Fstl1^-/-小鼠兴奋性增加是FSTL1缺失的直接后果，而不是由于发育缺陷或是其它原因。这些数据表明，DRG小神经元表达FSTL1是维持脊髓感觉回路生理平衡所必需的。

本发明人进一步通过行为学实验检测Fstl1^-/-小鼠的疼痛反应，以了解在在体情况下DRG神经元中FSTL1的功能意义。本发明人发现，在热辐射实验中Fstl1^-/-小鼠对热刺激的反应时间显著缩短(图5C)，提示Fstl1^-/-小鼠对伤害性热刺激的敏感性提高。另外，机械刺激器von-Frey纤维对小鼠后脚的机械性刺激实验表明，Fstl1^-/-小鼠对机械刺激的阈值也显著降低(图5C)。这些行为学上的改变不是因为Fstl1^-/-小鼠存在运动功能缺陷，因为这些小鼠在加速旋转试验(accelerating rotarod test)中的反应与野生型小鼠相似(图5D)。另外，对小鼠后脚注射***诱导炎性痛模型，Fstl1^-/-小鼠也有增强的痛觉反应，表现在***炎性反应的II相期其舔后脚的时间显著增加(图5E)。综上所述，FSTL1对正常的躯体感觉包括痛觉是必需的，并在急性炎性痛中有作用，FSTL1缺失会导致痛觉敏感。

行为学实验表明，在正常成年大鼠鞘内注射FSTL1，大鼠对伤害性热刺激的反应没有显著改变。然而，给Fstl1^-/-小鼠鞘内注射FSTL1却可充分翻转其对热刺激的敏感性增加(图5F)。此外，注射FSTL1抗体(如“材料和方法”部分中所述方法制备)也可增加大鼠对热伤害性刺激的反应(图5G)。综上所述，FSTL1表达下调或功能性阻断内源性分泌的FSTL1均可导致痛觉敏感。

实施例5.FSTL1抑制神经损伤引起的慢性痛

在证明了感觉神经末梢释放的FSTL1对于维持正常躯体感觉是必需的之后，本发明人想进一步探索它在神经源性痛(多是由于神经损伤引起)中的可能作用。神经源性痛的病理生理学特点是脊髓感觉环路的超兴奋性。本发明人发现在外周神经损伤后DRG神经元FSTL1表达减少，坐骨神经切断后大鼠腰4-5节段DRG里含有Fstl1 mRNA的小神经元数目显著减少(图6A)，并导致在DRG小神经元胞体和脊髓背角内传入纤维内FSTL1蛋白的减少(图6B，图6C)。免疫荧光双标记实验发现，表达活化转录因子3(DRG神经元轴突损伤的标记物)的细胞其FSTL1显著减少，表明FSTL1表达减少直接发生在受损伤的神经元中。

在另一种由坐骨神经分支切断(SNI)引起的神经源性痛模型(根据Decosterd，I.，和Woolf，C.J.(2000)，Spared nerve injury：an animal model ofpersistent peripheral neuropathic pain.Pain 87：149-158中所记载的方法建立该模型)中同样出现DRG神经元FSTL1的下调(图6D)，而鞘内注射FSTL1蛋白呈剂量依赖性的消除由坐骨神经分支切断引起的异常机械痛(图6E)。综上所述，神经损伤后FSTL1的显著减少可通过兴奋性传入传递的去抑制机制参与形成神经源性痛。

实施例6.FSTL1结合α1钠-钾ATP酶(α1NKA)

本发明人进一步来确定FSTL1作用的受体。用重组的FSTL1-myc孵育培养的大鼠背根节神经元，同时加入了不透膜的交联剂(Bis(sulfosuccinimidyl)suberate，BS³)，用myc抗体检测到FSTL1在近150kD处可见一条带(图7A)，而未加交联剂时FSTL1-myc位于37-45kD处(图7A)，提示FSTL1-myc与一个约100kD的蛋白结合。

为了确定该蛋白，对BS³交联后的蛋白成份进行质谱分析，在所分析的蛋白中有FSTL1的肽段序列，同时可以检测到α1钠-钾ATP酶(α1NKA)的3-7个肽段，3次样品的测序涵盖了α1NKA氨基酸序列的15％。同时，在同样处理的样品用α1NKA的单克隆抗体检测，可见部分α1NKA分子量从～110kD增加到～145kD(图7B)，同样样品中用α3NKA抗体只检测到～110kD处的单一条带(图7B)，说明FSTL1与α3NKA不结合。

免疫组化染色显示在背根节神经元中有51％表达α1NKA，其中63％是小神经元，36％是大神经元(图7C)，α1NKA阳性的细胞中有66％含FSTL1(图7C)。免疫共沉淀实验显示，在大鼠背根节中内源性的FSTL1可以结合α1NKA(图7D)。在COS7细胞中共转带flag标签的α1NKA亚基和FSTL1-myc或FSTL1(M1)-myc，在flag抗体免疫共沉淀下来的蛋白中可以检测到FSTL1-myc，但不能检测到FSTL1(M1)-myc(图7E)。

斯卡查德分析(Current Protocols in Protein Science(2000)A.3H.1-A.3H.55)显示¹²⁵I-FSTL1剂量依赖性地结合共表达α1NKA亚基和β1亚基的COS7细胞(Kd＝43nM)(图7F)。因此，FSTL1可以结合α1NKA。

本发明人为了确定在α1NKA亚基中与FSTL1相互作用的关键位点，将α1NKA亚基与α3NKA亚基的胞外环进行了比对，发现了在第二个和第四个胞外环有不同的氨基酸(图7G)。图7G的序列比对显示α1NKA亚基中的第314(E)和第889(T)氨基酸可能和FSTL1的作用有关。在表达FSTL1-myc和α1NKA亚基的COS7细胞中，免疫共沉淀实验显示在flag抗体免疫共沉淀下来的蛋白中存在FSTL1-myc，在共表达FSTL1-myc和α1NKA亚基^E314G-flag或α1NKA亚基^T889N-flag或α1NKA亚基^{E314G，T889N}-flag的细胞中，flag抗体免疫共沉淀下来的蛋白中存在的FSTL1-myc显著下降，证明α1NKA亚基中的第314(E)和第889(T)氨基酸确实和FSTL1的作用有关。同时，FSTL1-myc不与α3NKA亚基结合，但与α3NKA亚基^{G304E，N879T}-flag结合(图7G)，更进一步证明α1NKA亚基中的第314(E)和第889(T)氨基酸在α1NKA和FSTL1结合上的重要性。因此，α1NKA亚基中第二个胞外环M3M4中第314位氨基酸E和第四个胞外环M7M8中第889位氨基酸T是α1NKA亚基与FSTL1的关键作用位点。

实施例7.FSTL1激活α1钠-钾ATP酶(α1NKA)

NKA是一种通过不均匀转运钠离子和钾离子而使细胞膜电位发生改变的膜蛋白。在培养的背根节神经元中也可以检测到FSTL1呈剂量依赖性地上调NKA的活性(图8A)。在COS7细胞中共转α1NKA-flag和带myc标签的β1亚基，可以检测到FSTL1剂量依赖性地上调NKA的活性(图8A)，共转α3NKA-flag时则不能(图8A)。

FSTL1在共转α1NKA亚基^E314G-flag或α1NKA亚基^T889N-flag或α1NKA亚基^{E314G，T889N}-flag和β1亚基的COS7细胞中不能增加NKA的活性，FSTL1^E165A不能提高共表达α1NKA亚基和β1亚基的COS7细胞中NKA的活性α(图8B)。COS7全细胞记录观察到，在共转α1NKA-flag和β1-myc亚基的细胞中FSTL1引起膜超极化(～8mV)，显著降低细胞膜电位(图8C)，在共转α3NKA-flag和β1-myc亚基的细胞FSTL1对膜电位没有影响(图8C)。将β1亚基和α1NKA亚基共转对FSTL1实现强有力和稳定的功能是重要的，在单独转染α1NKA亚基的细胞中FSTL1只能引起瞬间和低水平的膜超极化(～2mV)。因此，FSTL1可以特异性地激活α1NKA，从而引起细胞超极化。这些结果也表示在α1NKA亚基上的314(E)和889(T)氨基酸，以及在FSTL1上的165(E)氨基酸对FSTL1和α1NKA的功能是重要的。

在共表达α1NKA亚基和β1亚基的COS7细胞中，预孵育M3M4(EC₅₀＝3.6μM)或M7M8(EC₅₀＝2.9μM)肽段(由吉泰公司合成)可以使¹²⁵I-FSTL1的结合率显著下降，表示在α1NKA亚基里的M3M4和M7M8肽段含有FSTL1的结合区域，相对地，M1M2肽段不能降低所述结合率(图8D)。预孵育M3M4或M7M8肽段可以减弱FSTL1引起的NKA活性增强作用(图8E)，更证实M3M4或M7M8肽段的重要性。此外，这些结果表示M3M4或M7M8或类似的肽段可以用来作为滤泡素抑制素样蛋白1的抑制剂，因为这些肽段可以和FSTL1结合而减少FSTL1和NKA的结合。

对急性分离的成年大鼠背根节小神经元(直径为15～30微米)做全细胞记录，FSTL1(30nM)降低神经元动作电位的频率，并且诱导膜超极化(，这种影响当同时给予NKA的特异性抑制剂哇巴因(OB 100μM)时被翻转，FSTL1引起的膜超极化的效应可被哇巴因翻转(图8F)，也可以被预孵育α1NKA的第2个胞外环M3M4肽段所拮抗(图8F)。因此，α1NKA是FSTL1的受体。

在脊髓背角中，免疫组化显示α1NKA主要分布在脊髓背角I-V层的神经纤维中(图8G)，这些含α1NKA的神经纤维主要是初级传入末梢，因为以往的研究和目前的研究均未发现脊髓背角神经元有α1亚基的mRNA，这样为FSTL1突触前产生作用提供了基础。带背根的脊髓脑片全细胞记录显示，FSTL1降低sEPSC的频率，这种影响当同时给予NKA的特异性抑制剂哇巴因(OB 100μM)时被翻转(图8H)，预孵育α1NKA的第2个胞外环M3M4肽段可明显增强sEPSC的频率(图8I)。脊髓脑片II层神经元全细胞记录显示M3M4肽段孵育增加C纤维刺激引起的eEPSC幅度(图8J)。因此，分泌的FSTL1调节传入传递是通过激活α1NKA。

实施例8.FSTL1蛋白的功能区域研究

本发明人进一步来确定FSTL1蛋白中产生功能的区域，伤害性刺激辣椒素(Capsaicin)可以引起初级感觉神经元中的小神经元上的辣椒素受体VR1开放，引起钙离子内流，用钙成像的方法可以检测这一过程。在加入辣椒素的同时加入FSTL1各突变体蛋白(加入辣椒素1μM和突变体蛋白的浓度60nM)，检测各突变体蛋白对辣椒素引起的钙内流的影响。

实验结果显示(图9)：FSTL1全长分子可以显著抑制辣椒素诱导的钙离子内流，缺失FS结构域、VWC结构域的FSTL1蛋白不影响其对辣椒素诱导的钙离子内流的抑制作用，表示在FSTL1中，FS结构域和VWC结构域不参与FSTL1对辣椒素诱导的钙离子内流的抑制作用，相对地，缺失EFI+EF手型连接+EFII或第165位氨基酸突变成丙氨酸的FSTL1蛋白丧失了对辣椒素诱导的钙离子内流的抑制作用，表明第165位氨基酸对FSTL1的此功能是重要的。实际上，在此结构域中第156-173位氨基酸序列合成多肽(SP76)就有FSTL1类似的功能(如下所述)。

进一步在稳定转染α1NKA和β1NKA亚基的COS7细胞上检测α1NKA酶活性，FSTL1全长可以显著激活α1NKA酶的活性，EF手性结构域I中第156-173位氨基酸序列合成多肽(SP76)也能显著激活α1NKA酶的活性。

这些结果表明，FSTL 1蛋白中的FS和VWC片段不参与FSTL1对辣椒素诱导的钙离子内流的抑制作用，EFI+EF手型连接+EFII片段对FSTL1对辣椒素诱导的钙离子内流的抑制作用至关重要，EFII中的第165位氨基酸对FSTL 1对辣椒素诱导的钙离子内流的抑制作用至关重要。大鼠的FSTL1中第156-173位氨基酸序列可能是FSTL1的最小功能片段。

大鼠的这段156-173位氨基酸序列(SEQ ID NO：1)相当于人的158-175位氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。从大鼠和人的序列比对可以看出大鼠的第159(H)位氨基酸在人的序列里被改成161(R)。这是保守性的替代。在本领域里有一般常识者都知道，这些和其它类似的保守性替代(例如：Ala，Leu，Ile互相替代)不太会影响蛋白的活性。所以，本发明包含有保守性替代的此功能片段。

实施例9.筛选药物

以FSTL1表达阳性的小神经元细胞作为用于筛选的细胞模型。

测试组：用候选物质处理的上述细胞的培养物；

对照组：不用候选物质处理的上述细胞的培养物。

如果与对照组相比，测试组中的FSTL1蛋白的表达、活性、存在量或分泌显著上升(例如30％以上)，则说明该候选物质是潜在的钠钾ATP酶激动剂，可用于通过提高钠钾ATP酶活性而治疗或缓解与钠钾ATP酶活性降低相关的疾病，例如减少哺乳动物躯体感觉、治疗或缓解家族性偏瘫型偏头痛、糖尿病或重症抑郁症等。

反之，如果测试组中的FSTL1蛋白的表达、活性、存在量或分泌显著下降(例如30％以上)，则说明该候选物质是潜在的钠钾ATP酶抑制剂，可用于通过降低钠钾ATP酶活性而治疗或缓解与钠钾ATP酶活性过高相关的疾病，例如用于增加哺乳动物躯体感觉、治疗或缓解黑色素瘤或其它肿瘤的生长和发生。

本发明人在深入研究中发现，FSTL1可与钠-钾ATP酶(Na⁺，K⁺-ATPase)结合，且其中结合的关键点在于钠-钾ATP酶α1NKA亚基第二个胞外环M3M4和第四个胞外环M7M8中。并且，FSTL1与钠-钾ATP酶结合之后，可激活钠-钾ATP酶的活性，从而提示FSTL或其促进剂可用于治疗、缓解或改善与钠钾ATP酶活性降低或过低相关的疾病或症状。反之，研究还证明了通过下调FSTL1的活性或抑制FSTL1与钠-钾ATP酶结合，可降低钠钾ATP酶的活性，从而提示FSTL1的抑制剂可用于治疗、缓解或改善与钠钾ATP酶活性提高或过高相关的疾病或症状。

本发明人对于FSTL1与躯体感觉的研究发现，内源FSTL1是躯体感觉的一种调质，而且FSTL1的降低有助于痛觉的产生。本领域人员都知道，兴奋性突触传递可以被脊髓背角的中间神经元和下行抑制***中分泌的抑制因子调节。本发明人的研究揭示FSTL1是一个外周神经末梢自分泌的躯体感觉传递的抑制性调质。FSTL1主要表达在DRG的小细胞上，且通过小的清亮囊泡运输到脊髓背角的传入神经末梢，FSTL1可以和兴奋性的神经递质共释放来执行抑制作用，以维持正常的躯体感觉信息传递。由于FSTL1选择性表达在DRG的小细胞上，因此FSTL1的自分泌作用是DRG的小细胞的一种特异功能可以维持躯体感觉的稳态调节。

FSTL1属于SPARC家族，拥有滤泡素抑制素样结构域(FS结构域)和EF手型结构域。已有的研究显示，FSTL1的滤泡素抑制素结构域并不参与FSTL1诱导产生的抑制作用，而这也和滤泡素抑制素不产生直接抑制作用的结果相符合。FSTL1和蛋白聚糖(agrin)都属于滤泡素抑制素基因亚家族，并且与滤泡素抑制素的功能不同。蛋白聚糖对于突触后分化是至关重要的，它通过抑制Na⁺/K⁺-ATP酶α3亚基来增强皮层神经元的兴奋性反应。本发明人的研究发现FSTL1高表达在DRG小细胞上，且通过激活膜上Na⁺/K⁺-ATP酶来抑制细胞兴奋性。

基质金属蛋白酶(MMP)和***素E2被认为参与类风湿性关节中的关节破坏过程。Fstl1能够降低滑液中MMP和***素E2的产生(Mimori T等.IntImmunol.2003Jan；15(1)：71-7)。在小鼠的类风湿性关节炎疾病模型中，Fstl1和来源于Fstl1 155-176位氨基酸的小肽可以缓解关节炎症(Ozaki S等.ArthritisRheum.2004Feb；50(2)：660-8.)。Fstl1还被认为是一个分泌的肌肉蛋白或者细胞因子，在缺血性损伤中，Fstl1能提高内皮细胞功能(Walsh K等.J Biol Chem.2008Nov 21；283(47)：32802-11.)，直接刺激血管形成和抑制心血管细胞的死亡，因此，Fstl1可能可以被用于治疗缺血性心脏疾病(Walsh K等.Circ J.2009Jan；73(1)：13-8.；Walsh K等.Circulation.2008Jun 17；117(24)：3099-108)。

基于以上研究结果，在DRG的小细胞胞体中FSTL1被合成分拣到小清亮囊泡中，这些含有FSTL1的囊泡被转运到脊髓背角的神经终末进行释放，其释放形式与传统的突触囊泡和大致密囊泡相似。在正常的生理条件下，神经元的兴奋导致FSTL1释放增加，从而使神经末梢超极化，进而抑制突触前的兴奋性递质和调质释放。相反，感觉活动的减少导致FSTL1释放减少，从而使神经末梢去级化，进而易化突触前的兴奋性递质和调质释放。然而在病理条件下，如外周神经损伤或关节炎，导致FSTL1持续性减少，从而导致感觉的超敏感性。

敲除神经元中的FSTL1或给予FSTL1的抗体引起的伤害性超敏感现象说明，FSTL1在突触传递中的功能与神经末梢的超兴奋性和痛敏相关(值得注意的是，神经传递的去抑制作用可以引起临床上慢性疼痛的症状：痛觉过敏和触诱发痛。本领域已经知道在神经损伤后脊髓的抑制性***被打乱，表现为初级传入纤维中Mu阿片受体的减少和GABA能脊髓神经元的丢失。本发明中提出了FSTL1减少是神经源性痛的一个重要因素，这些发现提示FSTL1对神经源性痛有良好的治疗作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (24)

1.滤泡素抑制素样蛋白1在制备组合物中的用途，所述组合物用于通过提高钠钾ATP酶活性来治疗、缓解或改善与钠钾ATP酶活性相关的疾病或症状；所述疾病或症状是疼痛。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的疼痛是家族性偏瘫型偏头痛。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述疼痛是身源性疼痛。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述身源性疼痛选自：神经病理性疼痛或伤害感受性疼痛。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述神经病理性痛选自：背根神经节神经源性痛、三叉神经节神经源性痛或坐骨神经痛。

6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述神经病理性疼痛为选自下组的由中枢或周围神经***的损伤或病理改变引起的疼痛：腰背痛、神经痛、纤维性肌痛、糖尿病相关的神经痛、多发性硬化相关的神经痛、带状疱疹后神经痛以及与HIV有关联的神经病理性神经痛。

7.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述伤害感受性疼痛选自：躯体伤害感受性疼痛或内脏伤害感受性疼痛。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述伤害感受性疼痛选自：癌痛、关节炎痛、术后痛或与HIV有关联的伤害感受性疼痛。

9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述滤泡素抑制素样蛋白1是：

(a)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质；

(b)(a)中所限定的蛋白质的保守性变异蛋白质或其活性片段；

所述(b)选自：

(1)SEQ ID NO:1中第156-173氨基酸序列的多肽；

(2)SEQ ID NO:2中第158-175位氨基酸序列的多肽；

(3)由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列缺失滤泡素抑制素结构域，即FS结构域，所形成的多肽；

(4)由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列缺失Von Willebrand型C结构域，即VWC结构域，所形成的多肽。

10.一种分离的多肽，所述多肽选自：

(1)SEQ ID NO:1中第156-173位氨基酸序列NGDSHLDSSEFLKFVEQN的多肽，条件是该多肽不是SEQ ID NO:1所示的蛋白质；

(2)SEQ ID NO:2中第158-175位氨基酸序列的NGDSRLDSSEFLKFVEQN的多肽，条件是所述多肽不是SEQ ID NO:2所示的蛋白质；

(3)由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列缺失滤泡素抑制素结构域，即FS结构域，所形成的多肽；

(4)由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列缺失Von Willebrand型C结构域，即VWC结构域，所形成的多肽。

11.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求10所述的多肽。

12.一种载体，其特征在于，它含有权利要求11所述的多核苷酸。

13.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求12所述的载体；或其基因组中整合有权利要求11所述的多核苷酸。

14.一种权利要求10所述的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求13所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出权利要求10所述的多肽。

15.一种通过提高钠钾ATP酶活性来治疗、缓解或改善疼痛的药物组合物，它含有：

(a)安全有效量的权利要求10所述的多肽、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的蛋白质；以及

(b)药学上可接受的载体。

16.如权利要求15所述的药物组合物，其特征在于，所述的疼痛是家族性偏瘫型偏头痛。

17.如权利要求15所述的药物组合物，其特征在于，所述的疼痛是身源性疼痛。

18.如权利要求17所述的药物组合物，其特征在于，所述身源性疼痛选自：伤害感受性疼痛或神经病理性疼痛。

19.如权利要求18所述的药物组合物，其特征在于，所述的神经病理性痛选自：背根神经节神经源性痛、三叉神经节神经源性痛或坐骨神经痛。

20.如权利要求18所述的药物组合物，其特征在于，所述神经病理性疼痛为选自下组的由中枢或周围神经***的损伤或病理改变引起的疼痛：腰背痛、神经痛、纤维性肌痛、糖尿病相关的神经痛、多发性硬化相关的神经痛、带状疱疹后神经痛或与HIV有关联的神经病理性神经痛。

21.如权利要求18所述的药物组合物，其特征在于，所述伤害感受性疼痛选自：躯体伤害感受器性疼痛或内脏伤害感受器性疼痛。

22.如权利要求21所述的药物组合物，其特征在于，所述伤害感受性疼痛选自：癌痛、关节炎痛、术后痛或与HIV有关联的伤害感受性疼痛。

23.权利要求10所述的多肽、SEQ ID NO:1所示的蛋白质和/或SEQ ID NO:2所示的蛋白质在制备用于通过提高钠钾ATP酶活性来治疗、缓解或改善与钠钾ATP酶活性相关的疾病或症状的药物组合物中的用途；所述疾病或症状是疼痛。

24.一种筛选用于通过提高钠钾ATP酶活性来治疗、缓解或改善与该活性相关的疾病或症状的潜在物质的方法，其特征在于，所述的方法包括：

(1)将候选物质与表达滤泡素抑制素样蛋白1的体系接触；

(2)检测候选物质对滤泡素抑制素样蛋白1的影响；

若所述候选物质可提高滤泡素抑制素样蛋白1的表达、活性和/或分泌，则表明该候选物质是可用于通过提高钠钾ATP酶活性来治疗、缓解或改善与该活性相关的疾病或症状的潜在物质；

所述疾病或症状是疼痛。