CN105229084A - 分离蓝色的花青素苷级分的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基于含花青素苷的蔬菜和水果的汁和提取物中的花青素苷分子的极性的差异，在选择的pH下从含花青素苷的蔬菜和水果的汁和提取物或者它们的组合中分离花青素苷分子的级分的方法。
Description
发明背景
技术领域
本发明涉及通过从含花青素苷的蔬菜和水果的汁和提取物选择性分离花青素苷分子的级分来得到含花青素苷的天然蓝色着色剂组合物的方法。
背景技术
在食品工业中对用天然着色剂替代合成材料来着色食品的兴趣日益增大。
在用天然着色剂替代合成着色剂中的一个挑战是鉴定提供与由合成着色剂所提供的颜色特征相似的颜色特征的天然着色剂。
迄今为止，尚未发现提供与合成的蓝色着色剂美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号(FD&CBlueNo.1)相同的颜色特征的天然着色剂。缺乏合适的天然青蓝色色调的着色剂也已使得从天然的蓝色着色剂和黄色着色剂的混合物中得到期望的天然绿色色调着色剂成为一种挑战。蓝绿藻衍生的材料螺旋藻蓝(SpirulinaBlue)被用作天然的蓝色着色剂，但其不提供与美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号相同的颜色特征。
花青素苷(anthocyanin)是在水果、蔬菜和花瓣，以及有时在植物的根、叶、茎和苞片的细胞液泡中发现的水溶性化合物。至少部分地由于其宽泛的可用性，含花青素苷的蔬菜和水果的汁和提取物已经被用作天然的可食用着色剂，并用于生产着色剂组合物，特别是天然的红色、紫色和蓝色色调的着色剂组合物。
花青素苷(anthocyanin)包含与一个或多个糖分子(糖基(glycone))酯化以形成糖苷的花色素(anthocyanidin)(糖苷配基(aglycone))。糖分子可附接至C-3、C-5、C-7、C-3’、C-4’和/或C-5’位。在花青素苷结构中发现的糖分子的例子是：***糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、芸香糖、接骨木二糖(sambubiose)、槐糖和木糖。
花青素苷还可被酰化，即，它们可具有一个或多个与糖分子酯化的分子，通常位于单糖的6-位，但还可能在2-位、3-位或4-位。最常见的酰基单元包括来自香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、芥子酸、没食子酸、丙二酸、醋酸、苹果酸、琥珀酸、香草酸和草酸的那些酰基单元。
花色素结构以如下的黄盐(flavylium)阳离子形式示出，该形式是酸性条件下的主要形式。花色素可在不同位置被氢、羟基和/或甲氧基取代：
其中R3是H或OH，
R5是H、OH或OCH3，
R6是H或OH，
R7是OH或OCH3，
R3'是H、OH或OCH3，
R4'是OH或OCH3，且
R5'是H、OH或OCH3。
以下结构示出了最常见的天然花色素：
因此，基于主要结构、糖基化和酰化模式的差异，这类被称为花青素苷的化合物涵盖大量的结构多样的化合物。
已知的花青素苷的植物来源包括：(1)蔬菜，例如，红卷心菜、紫甘薯、蓝马铃薯、红马铃薯、红萝卜、黑胡萝卜、紫胡萝卜、紫玉米、红玉米、红洋葱、紫花椰菜、红花椰菜、紫菜花、大黄、黑豆、红叶莴苣、黑米和茄子；和(2)水果，例如，草莓、树莓、蔓越橘、越橘、红葡萄、苹果、黑加仑、红加仑、樱桃、蓝莓、接骨木莓、越桔、岩高兰、黑莓、花楸果、醋栗、黑浆果油桃、桃、李子、血橙和蓝番茄。各花青素苷源包含不同量的多种不同的花青素苷种类，给定的植物源中通常具有15至30种结构不同的花青素苷分子。
含花青素苷的蔬菜和水果的汁和提取物的颜色特征因pH的变化而变化。含花青素苷的汁和提取物在低pH下通常呈现出红色色调，并且随着pH增大该色调迁移至紫色。随着pH进一步增大，仅有一些汁和提取物呈现出蓝色色调。
由pH变化引起的含花青素苷的汁和提取物的颜色变化与花青素苷的许多次级结构相关，在水性溶液中这些次级结构与主要的黄盐阳离子结构平衡存在。当pH变化时，不同的平衡结构的相对量将变化。在给定的pH下，一种或多种结构形式可占优势，而其他结构形式以较低的量存在或不存在。例如，在非常低的pH下，黄盐阳离子形式占优势。随着pH增大，黄盐阳离子形式的分子可被去质子化并转化成甲醇假碱形式，该甲醇假碱可分别可通过失去水分子和质子进一步转化成中性的和离子化的醌式碱形式，并进一步转化成查耳酮形式。这些转化减少了黄盐阳离子形式的分子的量，并且不同程度地增加了其它平衡形式的量。因此，与低pH相比，在较高的pH下，不同平衡结构以不同的相对量存在。各结构形式的花青素苷可有差别地吸收光，导致不同感知的颜色，包括无色。因此，随着溶液的pH变化，不同结构形式的相对量的变化可导致溶液颜色的变化。
各种不同花青素苷分子的特征在于其自身的一种结构转化为另一种结构的反应的平衡分子结构和平衡常数组。例如，将一种花青素苷平衡结构转化成另一种的反应可具有与其相关的特定的酸解离常数Ka。所述反应还可根据对数常数pKa来描述，即，定义为–log10Ka。
黄盐阳离子和醌式碱结构具有连接花青素苷分子的所有三个环的共轭键。大范围的不定域的π键允许黄盐阳离子和醌式碱吸收可见光，导致在低pH下黄盐阳离子的感知到的红色色调，以及在较高的pH下产生离子化的醌式碱的紫色或蓝色色调。相比而言，甲醇假碱和查耳酮结构不具有连接所有三个环的不定域的π键，并且是无色或淡黄色。
花青素苷的取代方式也影响颜色。例如，通常观察到当氢原子被羟基取代时，色调从粉色迁移至紫色。相似地，观察到，糖基(糖)单元的数量和酰基单元的数量和类型影响颜色。但是，这些现象未得到充分的理解，或者不可预测。
此外，分子间和分子内的相互作用也影响花青素苷的颜色。相同的花青素苷可取决于其他分子的存在而产生不同色调。例如，人们相信花青素苷糖上的酰基可折叠起来并保护黄盐阳离子C-2不受亲核攻击。因此，该分子内的相互作用防止形成无色的甲醇假碱结构。相似地，人们相信，由花青素苷浓度的两倍升高的事实证明的花青素苷分子的自连接(self-associate)可导致色度增加300倍，并且可改变色调和值。假设该自连接类似于分子内的堆积(intramolecularstacking)，并防止亲核攻击和甲醇假碱结构的形成。
虽然已知例如pH、花青素苷化学结构、取代方式、分子间和分子内的相互作用等因素都影响在含花青素苷的蔬菜和水果的汁和提取物中观察到的颜色，但是对于这些因素如何相互作用以改变颜色的理解并不充分，即，具体的原因和作用是不可预测的。
例如，已经通过HPLC分离到了单个的花青素苷分子，但是该分离总是在低pH下发生，并且在低pH下分析了单个的花青素苷的颜色特征。类似地，已经研究了pH对含花青素苷的蔬菜和水果的汁和提取物的颜色特征的影响，但是这些研究已经分析了所述汁和提取物中天然存在的复杂的花青素苷混合物。然而，pH的变化如何影响从天然来源的单个花青素苷分子或花青素苷级分的颜色特征，并没有得到充分理解，或者是不可预测的。现有技术公开了取代基(例如糖基和酰基)的数量和类型影响颜色；然而，其没有公开和不知道这些取代基如何随着pH的变化来影响颜色。最后，虽然现有技术假设，多种分子间和分子内相互作用影响颜色，但是其没有公开pH变化如何影响这些分子间和分子内相互作用，以及最终影响所观察到的花青素苷的颜色。
WO2009/100165A2公开了从含花青素苷的水果和蔬菜的汁中的其他酚类分子分离花青素苷的方法。WO2009/100165A2没有公开基于分子的电荷和极性的差异来选择性地分离花青素苷分子的级分以产生具有期望的与包含花青素苷的汁不同的颜色的级分。
色谱分析法杂志A卷(J.ChromatographyA.),1148(2007),38-45中描述了分析规模地分离单种花青素苷。所述分离在低pH，即，小于2的pH，下进行，使用HPLC以协助鉴定单种花青素苷。该方法分离花青素苷分子用于检测而非用于产生具有花青素苷混合物的级分。
WO2004/012526公开了一种pH7.9的红卷心菜花青素苷的蓝着色剂溶液，其用于包裹糖食芯的糖浆中。没有将该红卷心菜花青素苷分离成级分。
现有技术中不存在基于花青素苷分子电荷和极性的差异在选择的pH下从含花青素苷的蔬菜和水果的汁和提取物分离花青素苷分子的级分的例子。此外，尚没有公开用于得到提供与由源汁和提取物提供的颜色特征不同的颜色特征的花青素苷级分的方法。特别地，现有技术尚未描述用于得到提供与合成的蓝色着色剂美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号所提供的颜色特征相似的颜色特征的天然的含花青素苷的蓝色着色剂组合物的方法。
期望具有可用于对食物进行着色的丰富多彩的天然着色剂。长期感到对天然的蓝色着色剂的需要，该天然的蓝色着色剂提供的颜色特征与合成的美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号提供的颜色特征相似。因此，从含花青素苷的蔬菜和水果的汁和提取物得到这样的天然的蓝色着色剂的方法是期望的。
发明内容
本发明涉及得到含花青素苷的天然蓝色着色剂组合物的方法，该含花青素苷的天然蓝色着色剂组合物提供的颜色特征与合成的蓝色着色剂美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号(FD&CBlueNo.1)提供的颜色特征相似花青素苷。所述含花青素苷的天然蓝色着色剂通过基于花青素苷分子电荷和极性的差异在选择的pH下从含花青素苷的蔬菜和水果的汁和提取物分离包含花青素苷分子的混合物的级分来得到。
在一个实施方式中，本发明涉及从含花青素苷的蔬菜或水果的汁或提取物或它们的组合中分离花青素苷的级分的方法，所述方法包括：a)将含花青素苷的蔬菜或水果的汁或提取物或它们的组合上样至离子交换柱；b)基于花青素苷分子的电荷和极性的差异，使用选择的pH的溶剂，在所述离子交换柱上选择性地分离花青素苷，其中所述pH值为至少约2；以及c)选择包含分离的花青素苷的一个级分或级分组合，以使当在pH8.0的水性溶液中时，所述一个级分或所述多个级分的组合中的所述分离的花青素苷具有615nm至635nm的最大吸光度。所选择的含花青素苷的级分或级分组合包含分离的花青素苷，该分离的花青素苷提供的颜色特征更接近美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号提供的颜色特征，但与含花青素苷的蔬菜或水果的汁或提取物或它们的组合的颜色特征不同，即，是分级的子集。
附图说明
图1示出了两个透视图，其为作为水性溶液中浓度的函数的CIE1976CIELABL*a*b*颜色空间中美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号提供的颜色特征的三维表示。
图2示出了两个透视图，其为作为水性溶液中浓度的函数的CIE1976CIELCHL*C*h°颜色空间中美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号提供的颜色特征的三维表示。
图3表示两个透视图，其为CIE1976CIELABL*a*b*颜色空间中与美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号提供的颜色差3或更小的ΔE的颜色的区域，以及一个由颜色空间数据定义的分段管的图示。
图4示出了不同pH值的水性溶液中的不同水果和蔬菜提取物提供的颜色的比较。
图5示出了两个透视图，其为作为水性溶液中浓度的函数的CIE1976CIELABL*a*b*颜色空间中美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号提供颜色特征的三维表示，以及与蓝1号(BlueNo.1)提供的颜色差3或更小的ΔE的颜色的区域，并还示出了两个透视图，其为作为水性溶液中浓度的函数的螺旋藻蓝提供的颜色特征的三维表示(更接近x-轴的白线)。
图6示出了红卷心菜提取物溶液以及使用强阳离子交换柱从红卷心菜提取物溶液分离的两种级分在520nm检测下的HPLC色谱图。
图7示出了红卷心菜提取物溶液以及使用强阳离子交换柱从红卷心菜提取物溶液分离的四种级分在520nm检测下的HPLC色谱图。
图8示出了红卷心菜提取物溶液在520nm检测下的HPLC色谱图，鉴定了靶向分离的两组峰。这两组峰被分离为“520-nm级分”和“530-nm级分”。
图9提供了对不同pH值的520-nm级分和530-nm级分提供的颜色的视觉比较。图9还允许对520-nm级分和530-nm级分提供的颜色与涂覆经美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号着色的糖浆的糖食制品的颜色的视觉比较。
图10示出了红卷心菜提取物溶液以及使用半制备型HPLC从红卷心菜提取物溶液分离的两种级分在520nm检测下的HPLC色谱图。图10示出，520-nm级分和530-nm级分各包含三种不同的花青素苷化合物，并且鉴定了这些花青素苷化合物上的官能团和糖。
具体实施方式
含花青素苷的蔬菜和水果的汁和提取物现在被用作天然的可食用着色剂，并且用于生产着色剂组合物，特别是天然的红色、紫色和蓝色色调的着色剂组合物。所述汁和提取物包含天然存在于蔬菜和水果来源中的所有花青素苷分子的混合物，以及许多其他种类的化合物。因此，现在可用的花青素苷着色剂被限制于与天然存在于蔬菜和水果来源的花青素苷混合物相关的那些颜色。本发明涉及分离花青素苷分子混合物的方法，该花青素苷分子混合物不同于天然存在于蔬菜和水果的汁和提取物中的复杂的花青素苷混合物。所述方法涉及基于花青素苷分子的电荷和极性的差异在选择的pH下从蔬菜和水果的汁和提取物中的复杂混合物分离花青素苷分子的级分。
本发明的一个方面涉及从含花青素苷的蔬菜和水果的汁和提取物分离花青素苷分子级分，以得到提供与合成的蓝色着色剂美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号所提供的颜色特征相似的特定的、目标颜色特征的着色剂组合物。本文所用的提供与美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号“相似的”颜色特征是指，该颜色在颜色特征上比任何其他天然着色剂(例如，螺旋藻蓝)都更接近。
申请人发现，在选择的pH下使用溶剂分离花青素苷以及花青素苷分子极性的差异将产生包含提供与合成蓝色着色剂美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号所提供的颜色特征相似的的颜色特征的花青素苷混合物的级分。每种花青素苷来源包含不同量的多种不同的花青素苷分子，并且每种分子可以以一种或多种二级结构平衡存在。不同的花青素苷分子之间的电荷和/或极性以及它们的平衡分子结构可存在差异。通过基于花青素苷分子的电荷和极性的差异在选择的pH下进行分离，申请人能够分离具有与复杂的花青素苷混合物不同的光谱特征的花青素苷级分。所述级分的光谱特征与在汁或提取物中发现的复杂的花青素苷混合物的光谱特征不同，并且不表现后者的光谱特征。申请人已经鉴定了提供比任何已知的天然蓝色着色剂(包括螺旋藻蓝)可提供的颜色特征更接近合成的美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号所提供的颜色特征的颜色特征的花青素苷级分。
“含花青素苷的蔬菜或水果的汁”可通过对水果或蔬菜压榨出液体来得到。“含花青素苷的蔬菜或水果的提取物”可通过用溶剂(例如，水、醇)洗涤经浸渍的水果或蔬菜来得到。汁和提取物包含花青素苷以及许多其他天然存在的化合物，包括例如，碳水化合物、酸、类黄酮、金属离子、酚酸、酚酸酯和维生素。术语“蔬菜或水果的汁或提取物”等同于下列术语“蔬菜汁、水果汁、蔬菜提取物或水果提取物”，并且包括经处理的汁和提取物，包括例如，复原的汁和提取物、脱腥的汁和提取物，以及经历了其他方法以去除特定的或广泛种类的化合物的汁和提取物。
“分级”是从含花青素苷的蔬菜或水果的汁或提取物中的复杂的花青素苷混合物选择并分离部分花青素苷的方法。用于本发明的方法的花青素苷来源是在高pH值下提供蓝色色调的含花青素苷的蔬菜或水果的汁或提取物。在一些实施方式中，用于本发明的方法的花青素苷来源是：红卷心菜、紫甘薯、蓝马铃薯、紫胡萝卜或黑胡萝卜，或它们的组合。
“级分”是分级的产物。“花青素苷级分”包含与从其中分离该级分的含花青素苷的汁或提取物中的花青素苷混合物不同的花青素苷混合物。基于所存在的不同花青素苷分子的电荷和极性的差异在选择的pH下从所述汁或提取物分离花青素苷级分。
在分离花青素苷以及进行花青素苷的颜色表征二者的上下文中，“选择的pH”是2或更高的pH，例如，范围介于约2至约9的pH。在另一些实施方式中，所述pH可为3或更高、4或更高、5或更高、6或更高，或者7或更高，例如，在以下各范围中的一个pH，即，约3至约9、约4至约9、约5至约9、约6至约9，或约7至约9。
“最大吸光度”、“兰布达最大值(lambdamax)”或“λmax”是物质吸收的光的最大级分的以纳米计的波长。一般而言，当用紫外/可见(UV/VIS)分光光度计或比色计测量时，可将最大吸光度用作比较物质的特征值。
对“美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号(FD&CBlueNo.1)”的引用包括赋予相同的合成的蓝色着色剂的不同名称，亮蓝FCF(BrilliantBlueFCF)和欧盟委员会E133(EuropeanCommissionE133)。美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号的兰布达最大值是630nm。
“着色剂”是通过吸收或散射不同波长的光从而赋予颜色的任何物质。“天然着色剂”是天然存在或天然产生的，或天然来源的着色剂。“蓝色着色剂”是反射波长在450nm至495nm区域内的光并在615nm至635nm范围内具有最大UV/VIS波长吸光度的着色剂。“含花青素苷的天然着色剂”是包含来源于植物的花青素苷的天然着色剂。
含花青素苷的天然着色剂是可以仅包含花青素苷或者可以还包含其他植物组分的组合物。所述组合物可采取固体形式，例如粉末，或液体溶液，例如水性液体。
在一个实施方式中，本发明涉及从含花青素苷的蔬菜或水果的汁或提取物或它们的组合中分离花青素苷的级分的方法，所述方法包括：a)将含花青素苷的蔬菜或水果的汁或提取物或它们的组合上样至离子交换柱；b)基于所述花青素苷分子的电荷和极性的差异，使用选择的pH的溶剂，在所述离子交换柱上选择性地分离花青素苷；以及c)选择包含分离的花青素苷的一个级分或多个级分的组合，以使当在pH8.0的水性溶液中时，所述一个级分或所述多个级分的组合中的所述分离的花青素苷具有615nm至635nm的最大吸光度。在一个实施方式中，用pH为约2至约9的范围中的溶剂从含花青素苷的蔬菜或水果的汁或提取物分离含花青素苷的级分，或者所述pH在以下范围中的一个中，即，约3至约9、约4至约9、约5至约9、约6至约9，或约7至约9。
“色调”是指为颜色命名的颜色性质，例如，红色、橙红色、蓝色、紫色等。
“色度”是表示颜色纯度的颜色性质，其中较高的色度与较高纯度的色调以及较少被白色、灰色或黑色稀释有关。
“值”是表示颜色的亮度或暗度的颜色性质，其中较高的值与较高的亮度相关。
术语“颜色”和“颜色特征”可互换使用，并且涵盖颜色性质，例如色调、色度，以及用于描述这些性质的值和颜色模型***参数，例如国际照明委员会(CommissionInternationaledel’Eclairage)CIE1976CIELAB颜色空间L*a*b*值和CIELCH颜色空间L*C*h°值。CIELAB和CIELCH颜色模型提供了比更早期的颜色模型视觉上更均匀的颜色空间。用分光光度计分析着色剂，并从谱数据计算CIELABL*a*b*值和CIELCHL*C*h°值。L*a*b*值和L*C*h°值提供了表示颜色特征以及评估两种颜色之间的差异的大小的方法。除非另有说明，否则在所有例子中，本文示出的CIELABL*a*b*值和CIELCHL*C*h°值由由柯尼卡美能达(KonicaMinolta)分光光度计CM-3500d获得的光谱数据计算，该分光光度计以透射模式，采用CIE标准光源D65和10°的观察角来操作。
L*a*b*值由在三维笛卡尔坐标系定义的一组坐标值组成。L*是值坐标，或亮度坐标。L*提供了竖直轴上的从黑色(0L*单位)至白色(100L*单位)的亮度标度。a*和b*是与色调和色度有关的坐标。a*提供了水平轴上的从绿色(-a*单位)至红色(+a*单位)的标度，中性色位于中心点处(0a*单位)。b*提供了第二水平轴上的从蓝色(-b*单位)至黄色(+b*单位)的标度，中性色位于中心处(0b*单位)，第二水平轴垂直于第一水平轴。在L*值为50且a*和b*均为0时三个轴相交。
L*C*h°值由在三维圆柱坐标系中定义的一组坐标组成。L*是值坐标，或亮度坐标。L*提供了纵向轴上的从黑色(0L*单位)至白色(100L*单位)的亮度标度。h°是色调坐标。h°被指定为围绕L*轴逆时针反向移动0°至360°的角度。纯红色具有0°的色调角，纯黄色具有90°的色调角，纯绿色具有180°的色调，且纯蓝色具有270°的色调角。C*坐标表示色度，并且被指定为距L*轴的径向距离。随着坐标从L*轴远移(直至100或更多个C*单位)，C*提供在L*轴(0个C*单位)处从非彩色，即，中性的白色、灰色或黑色，至更高纯度的色调。使用方程式1和2可由a*和b*计算C*和h°：
C*＝(a*2+b*2)0.5(1)
“德尔塔E(DeltaE)”、“ΔEab*”或“ΔE”是CIELABL*a*b*颜色空间中表示的两种颜色之间的总的色差大小的量度。据报道，当ΔE为约2.3或更小时，有经验的颜色观察者不能区分两种颜色之间的任何差异。用方程式3计算L*a*b*值为L*1a*1b*1和L*2a*2b*2的两种不同颜色的ΔE：
表1中示出了水溶液中七种不同浓度下的美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号的CIELABL*a*b*值和CIELCHL*C*h°值。这些值由用由柯尼卡美能达分光光度计CM-3500d使用透射设置所得到的光谱数据计算而来。
表1
| 浓度 | L* | a* | b* | C* | h° |
| 1000ppm | 10.49 | 15.82 | -44.99 | 47.69 | 289.37 |
| 500ppm | 24.07 | 9.80 | -58.18 | 59.00 | 279.56 |
| 100ppm | 52.43 | -29.57 | -57.38 | 64.55 | 242.74 |
| 50ppm | 63.64 | -43.71 | -48.31 | 65.14 | 227.86 |
| 10ppm | 84.25 | -37.23 | -23.42 | 43.99 | 212.17 |
| 5ppm | 90.65 | -24.40 | -14.28 | 28.27 | 210.33 |
| 1ppm | 97.69 | -6.43 | -3.57 | 7.36 | 209.02 |
美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号的这些L*a*b*值和L*C*h°值表示美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号的这些的天然蓝色着色剂替代物的理想目标值。具有与这些目标值相比落在2.3或更小的ΔE的L*a*b*值的天然蓝色着色剂将有望提供与美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号提供的颜色特征足够相似的颜色特征，从而使人眼不能区分由天然着色剂与合成着色剂所提供的颜色的差异。显而易见，天然蓝色着色剂的L*a*b*值距合成的目标值更近(即，得到更小的ΔE)，则该天然蓝色着色剂将更好地在可食用应用中替代美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号。
图1示出了两个透视图，其为表1中报告的七种浓度下的的水性溶液的L*a*b*值的三维表示，这些值由线段连接。图2示出了两个透视图，其为表1中报告的七种浓度下的美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号的水性溶液的L*C*h°值的三维表示，这些值由线段连接。
可生成数学模型来表示在L*a*b*和L*C*h颜色空间中任何浓度的美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号提供的颜色特征。例如，所述颜色特征可由连接表1的L*a*b*数据点或L*C*h°数据点的分段线模型来表示。L*a*b*空间中连接表示美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号的两个不同浓度的两个点(P1和P2)的线(L)可用以下方程4来计算：
L＝{P1+t*(P2-P1)}(4)
其中P1是(L*1,a*1,b*1)；P2是(L*2,a*2,b*2)；并且t是任何实数。
因此，可基于七个不同浓度点的L*a*b*值使用如下的方程4来内插L*a*b*颜色空间中的美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号的分段线模型：
对于500ppm至1000ppm之间的浓度，0<t<1：
L*＝10.49+13.58*t
a*＝15.82+-6.02*t
b*＝-44.99+-13.19*t
对于100ppm至500ppm之间的浓度，0<t<1：
L*＝24.07+28.36*t
a*＝9.80+-39.37*t
b*＝-58.18+0.80*t
对于50ppm至100ppm之间的浓度，0<t<1：
L*＝52.43+11.21*t
a*＝-29.57+-14.14*t
b*＝-57.38+9.07*t
对于10ppm至50ppm之间的浓度，0<t<1：
L*＝63.64+20.61*t
a*＝-43.71+6.48*t
b*＝-48.31+24.89*t
对于5ppm至10ppm之间的浓度，0<t<1：
L*＝84.25+6.40*t
a*＝-37.23+12.83*t
b*＝-23.42+9.14*t
对于1ppm至5ppm之间的浓度，0<t<1：
L*＝90.65+7.04*t
a*＝-24.40+17.97*t
b*＝-14.28+10.71*t
图1中描绘了L*a*b*空间中的美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号分段线模型。
此外，可在L*a*b*颜色空间对L*a*b*值落在美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号模型的特定ΔE范围内的颜色进行数学建模。选择相对于美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号的特定ΔE值，例如3，并将该ΔE绘制于L*a*b*颜色空间中，产生围绕美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号模型的管状结构，如图3所示。注意到，距该模型上的任何点约2.3或更小的ΔE值的任何颜色与美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号提供的颜色是不可区分的。
为了确定L*a*b*颜色空间的点(X0)是否落在距美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号模型的特定的ΔE值内，必须计算该点与模型(由线段X1至X2表示)之间的最小距离dmin。
可使用方程5来计算dmin：
其中x表示两个向量的向量积，并且竖线表示向量表达式的大小。
如果dmin的值小于或等于所选择的ΔE值，则L*a*b*颜色空间中的点落在美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号模型的特定ΔE值以内。
例如，可确定螺旋藻蓝是否提供了与美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号提供的颜色相比具有12或更小的ΔE的颜色。表2示出了水溶液中两个不同浓度的已知的天然的蓝色着色剂螺旋藻蓝提供的颜色特征。
表2
| 浓度 | L* | a* | b* | C* | h° |
| (404.8mg/L) | 69.97 | -29.69 | -43.56 | 52.72 | 253.72 |
| (206mg/L) | 80.3 | -23.97 | -29.39 | 37.92 | 230.8 |
L*a*b*颜色空间中404.8mg/L螺旋藻蓝溶液的X0为：
X0＝(69.97，-29.69，-43.56)
L*a*b*颜色空间中206mg/L螺旋藻蓝溶液的X0为：
X0＝(80.3，-23.97，-29.39)
X1和X2是分别来自水性溶液中10ppm和50ppm浓度的美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号模型的两个点。
X1＝(63.64，-43.71，-48.31)
X2＝(84.25，-37.23，-23.24)
使用方程5计算dmin，对于404.8mg/L螺旋藻蓝溶液，dmin为12.4，以及对于206mg/L螺旋藻蓝溶液，dmin为14.4。因此，当对照由水性溶液中的10ppm和50ppm美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号的L*a*b*值所限定的分段线来测量时，与水性溶液中的美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号相比，所述螺旋藻蓝溶液不提供具有12或更小的ΔE的颜色。
如表3所示，确定了一些不同的螺旋藻蓝溶液的光谱特征。
表3
螺旋藻溶液数据
| 数据名称 | ppm | L*(D65) | a*(D65) | b*(D65) | C*(D65) | h°(D65) |
| 0.04％螺旋藻 | 400 | 67.69 | -30.25 | -45.87 | 54.94 | 236.6 |
| 0.03％螺旋藻 | 300 | 72.77 | -29.43 | -39.52 | 49.27 | 233.32 |
| 0.02％螺旋藻 | 200 | 78.87 | -25.56 | -30.99 | 40.17 | 230.49 |
| 0.015％螺旋藻 | 150 | 82.98 | -21.82 | -25.29 | 33.4 | 229.22 |
| 0.01％螺旋藻 | 100 | 87.77 | -16.29 | -18.32 | 24.52 | 228.35 |
| 0.0075％螺旋藻 | 75 | 90.46 | -12.94 | -14.27 | 19.27 | 227.79 |
| 0.005％螺旋藻 | 50 | 93.23 | -9.26 | -10.13 | 13.72 | 227.59 |
已经将螺旋藻蓝的数据相对于美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号数据绘制于图5所示的颜色图中。
螺旋藻蓝和美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号提供的颜色特征之间的差异在图5中示出。图5示出了L*a*b*颜色空间中水性溶液中的1ppm至1000ppm浓度的美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号提供的颜色特征的分段线模型，该模型由表示与蓝1号提供的颜色差3或更小的ΔE的区域的管围绕。为了比较，图5还示出了L*a*b*颜色空间中水性溶液中50ppm至400ppm浓度的螺旋藻蓝提供的颜色特征的分段线模型。螺旋藻蓝模型与BlueNo.1模型或相关的管未在L*a*b*颜色空间中的任何点交叉。
本发明包括选择来源于蔬菜、水果或它们的组合的具有含花青素苷的天然蓝色着色剂的级分或级分的组合。所述级分或级分组合包含选择性分离的花青素苷混合物，其中当在pH8.0的水性溶液中时，与由水性溶液中5ppm和10ppm的美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号的L*a*b*值限定的分段线所定义的颜色特征相比，所述着色剂的至少一个浓度提供具有12或更小的ΔE值的颜色特征。在另一些实施方式中，所述ΔE值可小于11、10、9、8、7、6、5、4或3。如果期望对照由水性溶液中不同浓度的美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号限定的多个分段线来测量，则着色剂的至少一个浓度还可为例如，1ppm和5ppm、10ppm和50ppm、50ppm和100ppm、100ppm和500ppm、500ppm和1000ppm，或选自其中的任何组合。例如，当不要求时，着色剂的至少一个浓度可定义为具有，对于在5ppm至10ppm下的第一分段线具有12或更小的ΔE值，对于在1ppm至5ppm下的分段线具有8或更小的ΔE值，并且对于在10ppm至50ppm下的分段线具有12或更小的ΔE值。但是，如果使用ΔE值来描述本发明的着色剂，则要求仅一个分段线来定义着色剂。
虽然螺旋藻蓝是被视为提供匹配美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号最接近的颜色的天然着色剂，但是来源于蔬菜、水果或它们的组合的所述含花青素苷的天然蓝色着色剂，即，根据本发明的方法得到的级分或级分的组合中的选择性分离的花青素苷混合物，是较好的颜色匹配。特别地，当所选择的级分或级分组合中的所述着色剂的至少一个浓度在pH8.0的水性溶液中时，基于具有L*a*b*颜色空间中定义的不同浓度的美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号的一系列水溶液，该着色剂水性溶液提供了匹配美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号分段线的颜色特征，其中匹配意为，在pH8.0的水性溶液中的所述着色剂的至少一个浓度具有对照所述美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号分段线测量的ΔE值，即，其比对照所述美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号分段线测量的基于具有不同的螺旋藻蓝浓度的一系列水性溶液在相同L*a*b*颜色空间定义的螺旋藻蓝分段线的ΔE值小至少一个单位。在另一些实施方式中，对照美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号分段线测量的pH8.0的水性溶液中的着色剂的至少一个浓度的ΔE值比对照美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号分段线测量的螺旋藻蓝分段线的ΔE值小至少2、3、4、5或6个单位。在另一些实施方式中，对照美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号分段线测量的pH8.0的水性溶液中的着色剂的至少一个浓度的ΔE值比对照美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号分段线测量的螺旋藻蓝分段线的ΔE值小至少7、8、9、10或11个单位。
分析了多种含花青素苷的水果和蔬菜的提取物以鉴定将提供与合成的蓝色着色剂美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号提供的颜色特征最接近的颜色特征的花青素苷来源。图4示出了五种不同pH值的水性溶液中的红卷心菜、紫甘薯、黑胡萝卜、红萝卜、紫玉米和葡萄的六种不同市售提取物。在视觉上，可以看出，来自红萝卜、紫玉米和葡萄的花青素苷在范围介于pH6至pH8中的任何pH的水性溶液中不提供蓝色色调。来自红卷心菜、甘薯和黑胡萝卜的花青素苷在pH范围较高的水溶液中提供蓝色色调。
在高pH值下提供蓝色色调的任何含花青素苷的水果或蔬菜的汁或提取物都可用作花青素苷的来源，以产生本发明的花青素苷级分。在一些实施方式中，从红卷心菜、紫甘薯、蓝马铃薯、紫胡萝卜或黑胡萝卜，或它们的组合的提取物中分离花青素苷级分。
在一个实施方式中，所述方法涉及从红卷心菜提取物选择性地分离含花青素苷的级分，以产生提供与合成的美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号提供的颜色特征相似的颜色特征的含花青素苷的天然着色剂。
可使用离子交换柱或半制备型HPLC柱来分离选择的含花青素苷的水果和蔬菜的汁和提取物的含花青素苷的级分。合适的离子交换介质包括阳离子和阴离子交换介质。合适的半制备型HPLC柱包括C-18柱。在一个实施方式中，在蔬菜或水果的汁或提取物上样之前，用适于该离子交换介质的溶剂来活化所述离子交换柱。
用pH为至少约2，优选至少约4的溶剂从含花青素苷的蔬菜或水果的汁或提取物中分离含花青素苷的级分。在一些实施方式中，用pH为约2至约9的溶剂分离花青素苷级分。在另一个实施方式中，用pH为约3至约9的溶剂分离花青素苷级分。在另一个实施方式中，用pH为约4至约9的溶剂分离花青素苷级分。在另一个实施方式中，用pH为约5至约9的溶剂分离花青素苷级分。在另一些实施方式中，用pH为约6至约9的溶剂分离花青素苷级分。在另一些实施方式中，用pH为约7至约9的溶剂分离花青素苷级分。
适于洗脱所选择的包含花青素苷的级分的溶剂包括甲醇、乙腈、水及它们的混合物，依据柱介质的极性和包含花青素苷的汁或提取物的可溶性来选择。在一些实施方式中，所述溶剂是甲醇水溶液。
可添加至所述溶剂以调节pH的合适的试剂包括磷酸钾、氢氧化钠等。
在另一个实施方式中，本发明涉及从含花青素苷的蔬菜或水果的汁或提取物或它们的组合中分离花青素苷的第二级分的方法，所述方法包括：a)基于花青素苷分子的电荷和极性的差异，使用选择的pH的第二溶剂，在所述离子交换柱上选择性地分离花青素苷，其中所述第二溶剂的pH值与用于洗脱所述第一级分的溶剂的pH值不同，优选高于后者的pH值；以及c)选择包含分离的花青素苷的第二级分或级分组合，以使当在pH8.0的水性溶液中时，如由具有615nm至635nm的最大吸光度所测量的，所述第二级分或级分组合中的所述分离的花青素苷提供了美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号所提供的那些颜色特征。在该实施方式中，可用选择的pH的第一溶剂，例如pH为至少约2的溶剂，从所述离子交换柱分离的所述第一级分不提供分离的花青素苷的混合物，即，当所述分离花青素苷的混合物在pH8.0的水性溶液中时，如由具有615nm至635nm的最大吸光度所测量的，其提供美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号所提供的那些颜色特征。在一个实施方式中，用pH为约2至约9的溶剂来从含花青素苷的蔬菜或水果的汁或提取物分离所选择的第二含花青素苷的级分，或者所述pH在以下更优选的范围中的一个中，即，约3至约9、约4至约9、约5至约9、约6至约9，或最优选约7至约9。
可通过使用离子交换柱或半制备型HPLC柱进一步分级选择的含花青素苷的级分来分离额外的含花青素苷的级分。合适的离子交换介质包括阳离子和阴离子交换介质。合适的半制备型HPLC柱包括C-18柱。
例如，在另一个实施方式中，所述分级方法还可包括以下步骤：d)将所选择的包含分离的花青素苷的一个级分或多个级分的组合上样至离子交换柱；e)基于所述花青素苷分子的电荷和极性的差异，使用选择的pH的溶剂，选择性地分离步骤d)中上样于所述离子交换柱上的所述花青素苷；以及f)选择在步骤e)中分离的包含分离的花青素苷的一个级分或多个级分的组合，以使当在pH8.0的水性溶液中时，在步骤f)中选择的所分离的花青素苷提供620nm至635nm的最大吸光度。如果期望的话，可以相似的方法产生第三、第四和另一些额外的含花青素苷的级分。在另一个实施方式中，与由水性溶液中5ppm和10ppm美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号的L*a*b*值限定的分段线所定义的颜色特征相比，pH8.0的水性溶液中的步骤f)中选择的所述分离的花青素苷提供了具有12或更小的ΔE值的颜色特征。
在另一个实施方式中，基于花青素苷分子的电荷和极性的差异在所述离子交换柱上选择性分离所述花青素苷的步骤包括以下步骤：(i)首先使用所选择的pH的溶剂得到第一级分，以及(ii)使用第二选择的pH的第二溶剂，其中所述第二溶剂的pH值与所述第一溶剂的pH值不同，以得到作为一个级分的后续级分或得到作为多个级分的组合的多种后续级分的组合，其中当所述一个级分或多个级分的组合中的所述分离的花青素苷处于pH8.0的水性溶液中的至少一个浓度时，与由水性溶液中5ppm和10ppm美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号的L*a*b*值限定的分段线所定义的颜色特征相比，其提供了具有12或更小的ΔE值的颜色特征。
在另一个实施方式中，基于花青素苷分子的电荷和极性的差异在所述离子交换柱上选择性分离所述花青素苷的步骤包括以下步骤：(i)首先使用所选择的pH的溶剂得到第一级分，所述溶剂是第一洗脱溶剂，以及(ii)使用一个或多个选择的pH的后续洗脱溶剂来得到所述一个级分或多个级分的组合，其中各洗脱溶剂是有差异的，并且所述差异可独立地选自由pH、溶剂组成及其组合所组成的组。优选地，所述第一洗脱溶剂的所选择的pH低于所述一种或多种后续级分的所选择的pH。优选地，所选择的pH将介于约2至约9范围，或以下更优选的范围中的一个中，即，约3至约9、约4至约9、约5至约9、约6至约9，或最优选约7至约9。在另一个实施方式中，当所述一个级分或所述多个级分的组合中的所述分离的花青素苷处于pH8.0的水性溶液中的至少一个浓度时，与由水性溶液中5ppm和10ppm美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号的L*a*b*值限定的分段线所定义的颜色特征相比，其提供了具有12或更小的ΔE值的颜色特征。
分离的花青素苷级分可用作着色剂，或者可进行进一步处理，例如，纯化、浓缩、脱腥或颜色稳定化。
所述选择性分离方法可在产生天然蓝色着色剂的商业有用的量的规模下进行。
可将通过本发明的方法制备的含花青素苷的天然蓝色着色剂应用于或并入所有类型的可食用制品中，包括供人和动物食用的食物、饮料和药剂。可食用制品的例子包括：宠物食品和零食、干货(例如，大米、谷物和谷类植物)、汤和调味汁、糖食制品(例如，所有类型的巧克力、糖和无糖糖果、口香糖、糖棒和包有糖衣的糖食)、甜点制品(例如，布丁、糖霜、糖粉和浇头)、烘焙食品(例如，蛋糕、小甜饼、薄脆饼和饼干)、乳制品(例如，酸乳、生奶油和干酪)、饮料(例如，乳制饮料、水、汁、茶和苏打水)、零食制品(例如，薄饼干、零食棒(snackbars)、咸脆饼干和薯条)以及药物形式(例如，片剂、混悬剂、可咀嚼剂和糖浆剂)。所述含花青素苷的天然蓝色着色剂还可并入食品级着色剂组合物、包衣和焦糖汁(ink)中。在一个实施方式中，所述含花青素苷的蓝色着色剂包括在涂覆糖食制品表面的包衣或焦糖汁中。在另一个实施方式中，所述含花青素苷的蓝色着色剂包括在涂覆糖食制品表面的包衣或焦糖汁中，其中所述糖食制品是具有软质抛光或硬质抛光糖基包衣的糖食芯。在另一个实施方式中，所述含花青素苷的蓝色着色剂包括在涂覆糖食制品表面的包衣或焦糖汁中，其中所述糖食制品是具有软质抛光或硬质抛光无糖包衣的糖食芯。
在一个实施方式中，使用强阳离子交换柱分级红卷心菜提取液。用75％v/v的pH8的0.1M磷酸钾缓冲液和25％v/v甲醇洗脱第一级分。用30％v/v的pH8的0.1M磷酸钾缓冲液和70％v/v甲醇洗脱第二级分。
在另一个实施方式中，使用强阳离子交换柱分级红卷心菜提取液。用75％v/v的pH6的0.1M磷酸钾缓冲液和25％v/v甲醇洗脱第一级分。用75％v/v的pH7的0.1M磷酸钾缓冲液和25％v/v甲醇洗脱第二级分。用75％v/v的pH8的0.1M磷酸钾缓冲液和25％v/v甲醇洗脱第三级分。用30％v/v的pH8的0.1M磷酸钾缓冲液和70％v/v甲醇洗脱第四级分。
在另一个实施方式中，使用C-18半制备型HPLC柱分离红卷心菜提取液。
基于花青素苷分子的电荷和极性的差异从蔬菜和水果的汁和提取物中的复杂的花青素苷混合物选择性分离花青素苷级分的方法产生了提供与所述复杂混合物所提供的颜色特征不同的颜色特征的着色剂。
基于花青素苷分子的极性的差异从复杂的花青素苷混合物选择性分离花青素苷级分的方法实现了长期感到的对得到提供与合成着色剂美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号提供的颜色特征相似的颜色特征的天然着色剂的方法。
现将参照以下实施例阐述本发明的具体实施方式。应理解，公开这些实施例仅用于说明本发明，且在本发明的主旨内的变化是可预期的。
实施例1
使用强阳离子交换柱分级红卷心菜提取物
使用纯甲醇来活化菲罗门(托兰斯，加利福尼亚州)的SCX(强阳离子交换)固相萃取柱(cartridge)。使用0.01％v/v酸化水洗涤柱(cartridge)。将红卷心菜提取物的水性溶液上样至柱中并用0.01％v/v酸化水洗涤。使pH8的磷酸钾缓冲液(0.1M)过柱。pH8的25％v/v甲醇溶液来洗脱并收集级分1。pH8的70％v/v甲醇溶液来洗脱并收集级分2。
用2ml至5ml88％v/v甲酸酸化级分1和级分2。使用旋转蒸发器去除甲醇。
为了去除任何盐，将级分1上样至C-18柱中，并用0.01％v/v酸化水洗脱。将洗脱液收集于0.01％v/v酸化水中，并蒸发残余的甲醇。还使用与针对级分1概述的相同步骤使级分2通过C-18柱。
如下表3所示，在不同的pH值下分析红卷心菜提取液(Redcabbageextractsolution，RCE)和级分1和级分2提供的最大紫外/可见(UV/VIS)波长吸光度和颜色特征。
表3
pH7.6和pH8.0的级分2提供与合成的美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号的λmax值(λmax＝630nm)最接近的λmax值，即，λmax值分别为616.40和619.40。
还可通过将在pH7.6下和在pH8.0下的级分2提供的颜色特征与合成的美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号(FD&CBlueNo.1)提供的颜色特征进行比较来计算ΔE值。该ΔE值等于L*a*b*颜色空间中的级分2颜色点与美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号模型之间的最小距离。
因此，使用方程5由以下数据来计算dmin值或ΔE值：
L*a*b*颜色空间中pH7.6的级分2的X0为：
X0＝(91.62，-4.17，-5.68)
L*a*b*颜色空间中pH8.0的级分2的X0为：
X0＝(91.56，-5.80，-5.81)
X1和X2是来自美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号(FD&CBlueNo.1)模型的两个点：
X1＝(90.65，-24.40，-14.28)
X2＝(97.69，-6.43，-3.57)
对于pH7.6的级分2，计算的dmin值或ΔE值为6.7，对于pH8.0的级分2计算的dmin值或ΔE值为6.0。
图6提供了红卷心菜提取液(RCE)和级分1和级分2的在520nm检测下高效液相色谱图(HPLCchromatogram)。图6示出，来自红卷心菜提取物的级分2具有较高浓度的后洗脱峰(later-elutingpeak)。
实施例2
使用强阳离子交换柱和不同高pH值的溶剂分级红卷心菜提取物
使用菲罗门(托兰斯，加利福尼亚州)的SCX(强阳离子交换)固相萃取柱(cartridge)。将稀释于0.01％v/v酸化水(10ml至15ml)中的红卷心菜提取物上样至柱中并用0.01％v/v酸化水洗涤。使pH6的磷酸钾缓冲液(0.1M)过柱。用pH6的25％v/v甲醇溶液来洗脱并收集级分1。使pH7的磷酸钾缓冲液(0.1M)过柱。用pH7的25％v/v甲醇溶液来洗脱并收集级分2。使pH8的磷酸钾缓冲液(0.1M)过柱。用pH8的25％v/v甲醇溶液来洗脱并收集级分3。用pH8的70％v/v甲醇溶液来洗脱并收集级分4。
用20％v/v甲酸酸化级分1至4。使用旋转蒸发器去除甲醇。
为了洗涤盐，将级分1上样至C-18柱中，并用0.01％v/v酸化水洗脱。将洗脱液收集于0.01％v/v酸化水中，并蒸发残余的甲醇。也使用针对级分1概述的相同步骤使级分2至4通过C-18柱。
如下表4所示，在不同的pH值下分析红卷心菜提取液(RCE)和级分1至4提供的最大紫外可见(UV/VI)S波长吸光度和颜色特征。
表4
pH8.0的级分4提供了与合成的美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号(FD&CBlueNo.1)的λmax值(λmax＝630nm)最接近的λmax值，即，λmax值为622.2。
还可通过将pH8.0的级分4提供的颜色特征与合成的美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号提供的颜色特征进行比较来计算ΔE值。该ΔE值等于L*a*b*颜色空间中的级分4颜色点与美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号模型之间的最小距离。因此，使用方程5由以下数据来计算dmin值或ΔE值：
L*a*b*颜色空间中pH8.0的级分4的X0为：
X0＝(90.08，-7.87，-7.20)
X1和X2是来自美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号模型的两个点：
X1＝(90.65，-24.40，-14.28)
X2＝(97.69，-6.43，-3.57)
对于pH8.0的级分4，计算的dmin值或ΔE值为6.7。
图7提供了在520nm下进行检测的红卷心菜提取物溶液(RCE)和级分1至4的HPLC色谱图。图7示出，来自红卷心菜提取物的级分4具有较高浓度的后洗脱峰(later-elutingpeak)。
实施例3
使用半制备型高效液相色谱(HPLC)分离红卷心菜提取物峰组(peakgroups)
如图8的色谱图所示，可使用半制备型HPLC从红卷心菜提取液中分离并收集与两个特定的峰组相关的级分。将红卷心菜提取液上样至C-18半制备型HPLC柱上，并使用酸性的乙腈和水梯度洗脱两个级分，520-nm级分(λmax＝524nm)和530-nm级分(λmax＝532nm)。用旋转蒸发器从各级分中蒸发残余的乙腈。
在调节级分的浓度并使分离的级分等分试样与缓冲剂混合，以产生pH6、pH6.6、pH7、pH7.6和pH8的5等分后试样，进行颜色特征的表征。分析了520-nm级分等分试样和530-nm级分等分试样的最大UV/VIS波长吸光度和颜色特征，并且在表5中提供了结果。
表5
1ND表示样品的吸收光谱未示出可见光范围内的最大峰。
530-nm级分在pH7.6和pH8.0下具有约621nm的最大吸光度，并且提供了与合成的美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号的λmax(λmax＝630nm)最接近的λmax。
还可通过将pH7.6和pH8.0的530-nm级分提供的颜色特征与合成的美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号提供的颜色特征进行比较来计算ΔE值。该ΔE值等于L*a*b*颜色空间中的530-nm级分颜色点与美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号模型之间的最小距离。因此，使用方程5由以下数据来计算dmin值或ΔE值：
L*a*b*颜色空间中pH7.6的530-nm级分的X0为：
X0＝(87.67，-5.44，-9.90)
L*a*b*颜色空间中pH8.0的530-nm级分的X0为：
X0＝(86.39，-11.79，-11.98)
X1和X2是来自美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号模型的两个点：
X1＝(84.25，-37.23，-23.42)
X2＝(90.65，-24.40，-14.28)
对于pH7.6的530-nm级分，计算的dmin值或ΔE值为12.1，对于pH8.0的530-nm级分，计算的dmin值或ΔE值为9.9。
图9提供了对不同pH值的520-nm级分和530-nm级分的视觉比较。520-nm级分的浓度为107.7mg/L(Cyn-3-glu)，并且530-nm级分的浓度为55.6mg/L(Cyn-3-glu)。在中性和较高的pH下，可见到，530-nm级分在半着色剂浓度下提供了两倍至四倍的520-nm级分的色度(Chroma，通过C*测量)。
图10提供了在520nm下进行检测的红卷心菜提取液以及520-nm级分和530-nm级分的HPLC色谱图。图10表示，各级分包含三种不同的花青素苷化合物。
比较实施例
在pH8.0下制备WO2004/012526的实施例中公开的几种不同浓度的红卷心菜花青素苷溶液。没有对级分进行分离并收集分离的包含花青素苷的着色剂。所得溶液的最大吸光度为610nm。该颜色不被视为是美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号(FD&CBlueNo.1)的颜色的可接受匹配。
Claims (18)
1.一种从含花青素苷的蔬菜或水果的汁或提取物或它们的组合中分离花青素苷的级分的方法，所述方法包括：
a)将含花青素苷的蔬菜或水果的汁或提取物或它们的组合上样至离子交换柱上；
b)基于所述花青素苷分子的电荷和极性的差异，使用选择pH的溶剂，在所述离子交换柱上选择性地分离花青素苷；以及
c)选择包含分离的花青素苷的一个级分或多个级分的组合，以使当在pH8.0的水性溶液中时，所述一个级分或所述多个级分的组合中的所述分离的花青素苷具有615nm至635nm的最大吸光度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中与由水性溶液中5ppm和10ppm美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号的L*a*b*值限定的分段线所定义的颜色特征相比，pH8.0的水性溶液中的至少一个浓度的所述一个级分或所述多个级分的组合中的所述分离的花青素苷提供了具有12或更小的ΔE值的颜色特征。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述含花青素苷的蔬菜或水果的汁或提取物的来源选自由红卷心菜、紫甘薯、蓝马铃薯、黑胡萝卜、紫胡萝卜及它们的组合所组成的组。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述含花青素苷的蔬菜或水果的汁或提取物的来源是红卷心菜。
5.根据权利要求1所述的方法，其中用选择的pH为约4至约9的溶剂从所述含花青素苷的蔬菜或水果的汁或提取物或它们的组合中分离所选择的含花青素苷的级分。
6.根据权利要求5所述的方法，其中用选择的pH为约4至约9的溶剂从所述含花青素苷的蔬菜或水果的汁或提取物或它们的组合中分离所选择的含花青素苷的级分。
7.根据权利要求6所述的方法，其中用pH8的25％v/v甲醇溶液洗脱第一含花青素苷的级分，并用pH8的70％v/v甲醇溶液洗脱后续的含花青素苷的级分，所述后续的含花青素苷的级分是一个级分或作为多个级分的组合的多个后续级分。
8.根据权利要求7所述的方法，所述方法还包含纯化所述一个级分或所述多个级分的组合的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其中与由水性溶液中5ppm和10ppm美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号的L*a*b*值限定的分段线所定义的颜色特征相比，pH8.0的水性溶液中的至少一个浓度的所述一个级分或所述多个级分的组合的所述分离的花青素苷提供了具有12或更小的ΔE值的颜色特征。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述离子交换柱是阳离子交换柱。
11.根据权利要求1所述的方法，其中基于花青素苷分子的电荷和极性的差异在所述离子交换柱上选择性分离所述花青素苷的步骤包括以下步骤：(i)首先使用所选择的pH的溶剂得到第一级分，以及(ii)使用第二选择的pH的第二溶剂，其中所述第二溶剂的pH值与所述第一溶剂的pH值不同，以得到作为所述一个级分的后续级分或得到作为所述多个级分的组合的多个后续级分的组合，其中当所述一个级分或多个级分的组合中的所述分离的花青素苷处于pH8.0的水性溶液中的至少一个浓度时，与由水性溶液中5ppm和10ppm美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号的L*a*b*值限定的分段线所定义的颜色特征相比，所述分离的花青素苷提供了具有12或更小的ΔE值的颜色特征。
12.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包含以下步骤：
d)将所选择的包含分离的花青素苷的一个级分或多个级分的组合上样至离子交换柱上；
e)基于所述花青素苷分子的电荷和极性的差异，使用选择的pH的溶剂，选择性地分离步骤d)中上样至所述离子交换柱上的所述花青素苷；以及
f)选择在步骤e)中分离的包含分离的花青素苷的一个级分或多个级分的组合，以使当在pH8.0的水性溶液中时，在步骤f)中选择的所分离的花青素苷提供620nm至635nm的最大吸光度。
13.根据权利要求12所述的方法，其中与由水性溶液中5ppm和10ppm美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号的L*a*b*值限定的分段线所定义的颜色特征相比，pH8.0的水性溶液中的步骤f)中选择的所述分离的花青素苷提供了具有12或更小的ΔE值的颜色特征。
14.根据权利要求1所述的方法，其中基于花青素苷分子的电荷和极性的差异在所述离子交换柱上选择性分离所述花青素苷的步骤包括以下步骤：(i)首先使用所选择的pH的溶剂得到第一级分，所述溶剂是第一洗脱溶剂，以及(ii)使用一个或多个选择的pH的后续洗脱溶剂来得到所述一个级分或多个级分的组合，其中各洗脱溶剂是有差异的，并且所述差异可独立地选自由pH、溶剂组成及它们的组合所组成的组。
15.根据权利要求14所述的方法，其中当所述一个级分或所述多个级分的组合中的所述分离的花青素苷处于pH8.0的水性溶液中的至少一个浓度时，与由水性溶液中5ppm和10ppm美国联邦食品、药品和化妆品法案蓝1号的L*a*b*值限定的分段线所定义的颜色特征相比，所述分离的花青素苷提供了具有12或更小的ΔE值的颜色特征。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一洗脱溶剂是有机溶剂与水在有机溶剂的第一浓度下的混合物，并且使用的后续洗脱溶剂是具有有机溶剂的第二浓度的有机溶剂与水的第二混合物，其中所述第一浓度与所述第二浓度不同。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一洗脱溶剂具有与所述后续洗脱溶剂所选择的pH不同的选择的pH。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一洗脱溶剂的所选择的pH低于所述后续洗脱溶剂的所选择的pH。
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