CN105219883A - 一种对幽门螺杆菌同时进行分型和定量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制作可用于检测患者胃粘膜上皮中幽门螺杆菌方法，可以同时进行分型和定量，属于生物学检测的领域。涉及到利用MGB探针双重荧光定量PCR技术测定患者胃粘膜上皮中幽门螺杆菌含量的方法。还涉及到利用MGB探针双重荧光定量PCR技术制作幽门螺杆菌特异性毒力基因CagA和VacA双基因的标准曲线。本发明能大幅提高检测患者胃粘膜中幽门螺杆菌的效率，简化检测程序。
Description
技术领域
本发明涉及制作一种用于根据CagA和VacA双重毒力基因来对幽门螺杆菌同时进行分型和含量检测的方法，通过MGB探针双重荧光定量PCR技术检测不同浓度梯度的标准品中特异性基因CagA和VacA的拷贝数，来绘制基因拷贝数与Ct值关系的标准曲线，并利用此标准曲线来对患者胃粘膜上皮中幽门螺杆菌进行分型和含量测定。
背景技术
幽门螺杆菌（Helicobacterpylori,H.pylori）是危害人类健康的重要病原体之一，它是感染胃部的最常见的病原性细菌。全世界的感染率为50%-80%，高发地区集中在东亚，包括中国、日本和韩国。H.pylori持续性感染可诱发慢性胃炎和萎缩性胃炎，进而引起胃粘膜细胞DNA损伤，H.pylori参与了从正常胃粘膜到“慢性胃炎—胃黏膜萎缩—肠化生—异型增生—胃癌”这一演变模式中的整个过程。我国是胃癌发病率和病死率较高的地区，每年全球新发100余万胃癌患者中，我国占42%，约80万死亡胃癌患者中，我国占35%，发病率和病死率均超过世界平均水平两倍多，而胃癌是H.pylori长期感染与其他因素共同作用的结果。因此，快速、准确检测H.Pylori的含量，对H.Pylori感染的早期诊断、流行病学调查和公共卫生方面都具有重要意义。
TaqMan-MGB探针技术，是一种特异敏感的实时荧光定量PCR方法。与普通的Taqman探针比较，MGB探针具有两大特点：一是探针3'端标记了自身不发光的淬灭分子，使荧光本底降低，荧光光谱分辨率大大改善。二是探针3'端增加了一个MGB，可以稳定探针与模板的杂交，提高探针的退火温度。一方面缩短了探针长度，使荧光基团与淬灭基团的距离更近，淬灭效果更好。另一方面，也提高了探针的特异性，是结果更准确，分辨率更高。因此，用TaqMan-MGB探针荧光定量PCR技术，对H.Pylori进行定量分析，并将此技术应用于临床标本检测具有较高的公共卫生意义。
CagA是H.Pylori表达的主要毒力蛋白之一，为H.Pylori与宿主相互作用的重要效应蛋白，VacA基因几乎存在所有的H.Pylori菌株中，编码表达VacA蛋白，VacA蛋白为空泡毒素，能够引起靶细胞空泡样变。目前根据有无CagA蛋白将H.Pylori分为两型，I型菌：有CagA基因，表达CagA蛋白，具有VacA毒素活性，主要分布在东亚地区，如中、日、韩等国，有90%~95%的H.Pylori为CagA阳性；II型菌：无CagA基因，不表达CagA蛋白，无VacA毒素活性，主要分布在西方国家，如欧洲、美国、澳大利亚，H.Pylori大约40%为CagA阴性。因此，通过H.Pylori国际标准株26695的两个特异性毒力基因CagA和VacA的体外重组技术获得重组质粒，并将此高浓度重组质粒作为标准品，利用MGB探针二重荧光定量PCR技术形成标准曲线，再通过MGB探针二重荧光定量PCR技术同时检测患者胃粘膜上皮中CagA和VacA基因的表达情况，从而推测患者H.Pylori含量和类型，具有良好的临床样本检测的应用价值。
本发明中根据CagA和VacA基因序列设计的双重荧光定量PCR的引物和探针建立的标准曲线，具有良好的扩增效率，将此标准曲线用于临床样本的检测亦表现出了较高的特异性、灵敏性和稳定性，这不仅对H.Pylori临床样本检测提供和科学的理论依据和技术支持，而且对H.Pylori流行病调查和防控具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种用于针对幽门螺杆菌的检测方法，可同时进行分型和定量。通过MGB探针双重荧光定量PCR技术制作幽门螺杆菌特异性毒力基因CagA和VacA拷贝数与循环数的标准曲线，并利用此标准曲线来对临床胃炎患者胃粘膜上皮中的幽门螺杆菌进行同时分型和定量，来达简化检测步骤的目的。具体方法如下：
1、构建CagA和VacA重组质粒标准品
用菌环刮取含有CagA和VacA双毒力基因的标准菌株悬于盛有1mlPBS的离心管，涡旋震荡混匀，充分洗涤菌体，按照细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN）说明书提取H.pylori基因组DNA。通过PCR技术，使用基因特异性引物P1（5'-AAGCCACAACGCTCACCAA-3'）和P2（5'-AATGGGCTCTTCAGGGCTA-3'）扩增H.pyloriCagA片段，使用基因特异性引物P3（5'-ATGGAAATACAACAAACACAC-3'）和P4（5'-GCTAAGAAGCCCTGAGACC-3'）扩增VacA片段。反应条件为：首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。将扩增片段纯化回收，与pMD18-T载体连接。转化后筛选阳性克隆，提取质粒。用适当量程的移液器准确量取2μlDNA母液，加入适量的缓冲液和指示剂，于0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，判断其降解及污染情况。并结合核算标准分子量的亮度和质量，粗略确定提取DNA的浓度。
根据估测的浓度，取一定量DNA母液，稀释至100μl，利用紫外可见分光光度计检测OD260和OD280，计算两者的比值,若比值在1.6-1.8之间，则DNA纯度符合要求。根据公式计算：DNA浓度（ng·μl-1）＝OD260×50×样品稀释倍数。将CagA和VacA质粒DNA的浓度换算为拷贝数分别为：3.64×1010拷贝/μl和4.28×1010拷贝/μl。用EasyDilution将上述质粒依次稀释成1.0×108拷贝/μl-1.0×100拷贝/μl，共9个浓度梯度，备用。
绘制CagA和VacA的MGB探针双重荧光定量PCR标准曲线
根据CagA和VacA的基因序列各合成一段MGB探针TcagA:FAM-CCCATTTATGCTAAAGTT-MGBNFQ和TvacA:VIC-ACCGTGATCATTCCAG-MGBNFQ。以CagA和VacA质粒系列浓度梯度为模板（1.0×108拷贝/μl-1.0×100拷贝/μl），按照如下反应体系进行双重荧光定量PCR反应：引物P1、P2、P3、P4各0.2μl，探针TcagA和TvacA各0.4μl，Mix为10μl，H2O为6.4μl，模板2μl，总体积至20μl。反应条件为：首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性5秒，60℃退火20秒，共进行40个循环。以CagA和VacA质粒浓度梯度值为横坐标，以相应的Ct值为纵坐标，绘制CagA和VacA的MGB探针双重荧光定量PCR标准曲线。
探针双重荧光定量PCR技术检测临床样本幽门螺杆菌的分型和含量
秤取适量胃粘膜组织，加生理盐水在研钵中研磨成匀浆状，倒入离心弃上清，用PBS洗涤，离心沉淀，加裂解液，100℃静置10min，离心后得到的上清即为待测样品DNA模板。
按照上述MGB探针双重荧光定量PCR检测方法检测临床样本幽门螺杆菌的拷贝数，计算得到细菌含量，若样品中幽门螺杆菌含有两种毒力基因，得到两个循环数，对照标准曲线得到两个基因的拷贝数，取平均值。若其中一种基因的循环数显示为N/A，则表示样本中的幽门螺杆菌不含有此基因，为该基因阴性菌。
附图说明
图1：基因拷贝数lg值与Ct值关系的标准曲线。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
制备CagA和VacA重组质粒
幽门螺杆菌国际标准株26695基因组DNA的提取：用菌环刮取适量菌落悬于盛有1mlPBS的离心管中涡旋震荡混匀，充分洗涤菌体，按照细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN）说明书提取幽门螺杆菌基因组DNA。通过PCR技术，使用基因特异性引物P1（5'-AAGCCACAACGCTCACCAA-3'）和P2（5'-AATGGGCTCTTCAGGGCTA-3'）扩增CagA片段，使用基因特异性引物P3（5'-ATGGAAATACAACAAACACAC-3'）和P4（5'-GCTAAGAAGCCCTGAGACC-3'）扩增VacA片段。
PCR反应条件为：首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。将扩增片段纯化回收，与pMD18-T载体连接。转化后筛选阳性克隆，提取质粒。用适当量程的移液器准确量取2μlDNA母液，加入适量的缓冲液和指示剂，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，判断其降解及污染情况。并结合核算标准分子量的亮度和质量，粗略确定提取DNA的浓度。根据估测的浓度，取一定量DNA母液，稀释至100μl，利用紫外可见分光光度计检测OD260、OD280，计算两者的比值。根据DNA的计算公式：DNA浓度（ng·μl-1）＝OD260×50×样品稀释倍数。根据计算得到两种重组质粒的分子量，将CagA和VacA质粒DNA的浓度换算为拷贝数分别为：3.64×1010拷贝/μl和4.28×1010拷贝/μl。用EasyDilution将上述质粒依次稀释成1.0×108拷贝/μl-1.0×100拷贝/μl，共9个浓度梯度，备用。
绘制CagA和VacA的MGB探针双重荧光定量PCR标准曲线
首先，根据CagA和VacA的基因序列各合成一段MGB探针TcagA:FAM-CCCATTTATGCTAAAGTT-MGBNFQ和TvacA:VIC-ACCGTGATCATTCCAG-MGBNFQ。以CagA和VacA质粒系列浓度梯度为模板（1.0×108拷贝/μl-1.0×100拷贝/μl），
按照如下反应体系进行双重荧光定量PCR反应：
引物P1、P2、P3、P4各0.2μl，
探针TcagA和TvacA各0.4μl，
Mix为10μl，
H2O为6.4μl，
模板2μl，
总体积至20μl；
反应条件为：首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：
94℃变性5秒，60℃退火20秒，共进行40个循环；
以CagA和VacA质粒浓度的lg值为横坐标，以相应的Ct值为纵坐标，绘制CagA和VacA的MGB探针双重荧光定量PCR标准曲线。得到图1标准曲线。
探针双重荧光定量PCR技术检测临床样本幽门螺杆菌含量
患者样品编号1作为待测品，秤取20mg胃粘膜组织，加2ml生理盐水在研钵中研磨成匀浆状，倒入1.5ml离心管中，13000rpm离心5min,弃上清，用PBS洗涤三次后13000rpm离心沉淀，加入50μL裂解液，100℃静置10min，13000rpm离心，上清即为待测样品DNA模板。
按照上述MGB探针双重荧光定量PCR检测方法检测临床样本幽门螺杆菌的拷贝数为20，对照步骤2中得到的标准曲线CagA和VacA两种基因的拷贝数分别为1.6×106拷贝/μl和1×107拷贝/μl，取平均值为5.8×106拷贝/μl，由此可得知细菌含量。
实施例2
本实施例与实施例1的不同点是：
在步骤3中，以患者样品编号2作为待测品，按照实施案例1中的方法处理后，使用MGB探针双重荧光定量PCR检测方法检测临床样本幽门螺杆菌的循环数为25，其中VacA的循环数显示为N/A,表明样品中幽门螺杆菌只含有CagA一种毒力基因，呈VacA阴性幽门螺杆菌。对照标准曲线得到拷贝数约为1×105拷贝/μl，由此可得知细菌含量。
Claims (8)
1.一种对幽门螺杆菌同时进行分型和定量的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
A用试剂盒提取幽门螺杆菌的国际标准株基因组DNA，合成目的基因的特异性引物，制备分别含有CagA和VacA的重组质粒；
B将重组质粒测浓度后梯度稀释，根据CagA和VacA的基因序列各合成一段MGB探针，进行双重荧光定量PCR反应，绘制基因循环数和拷贝数的关系，获得标准曲线；
C取患者胃粘膜上皮，经适当处理后提取DNA，按照上述MGB探针双重荧光定量PCR检测方法检测临床样本幽门螺杆菌，根据Ct值可进行细菌分型，拷贝数可反映细菌含量。
2.根据权利要求1所述的一种对幽门螺杆菌同时进行分型和定量的方法，其特征在于：幽门螺杆菌的国际标准菌株编号为26695，含有CagA和VacA双重毒力基因。
3.根据权利要求1所述的一种对幽门螺杆菌同时进行分型和定量的方法，其特征在于：由MGB探针双重荧光定量PCR得到的标准曲线为CagA和VacA双基因的标准曲线。
4.根据权利要求1所述的一种对幽门螺杆菌同时进行分型和定量的方法，其特征在于：所述重组质粒所使用的载体是pMD18-T载体。
5.根据权利要求1所述的一种对幽门螺杆菌同时进行分型和定量的方法，其特征在于：CagA的特异性引物为：（5'-AAGCCACAACGCTCACCAA-3'）和P2（5'-AATGGGCTCTTCAGGGCTA-3'）；VacA的特异性引物为：P3（5'-ATGGAAATACAACAAACACAC-3'）和P4（5'-GCTAAGAAGCCCTGAGACC-3'）。
6.根据权利要求1所述的一种对幽门螺杆菌同时进行分型和定量的方法，其特征在于：特异性MGB探针为TcagA:FAM-CCCATTTATGCTAAAGTT-MGBNFQ和TvacA:VIC-ACCGTGATCATTCCAG-MGBNFQ。
7.根据权利要求6所述的一种对幽门螺杆菌同时进行分型和定量的方法，其特征在于：FAM,VIC为荧光基团，MGBNFQ为非荧光淬灭基团。
8.根据权利要求1所述的一种对幽门螺杆菌同时进行分型和定量的方法，其特征在于：PCR反应条件为：首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性5秒，60℃退火20秒，共进行40个循环。
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