CN103087932A - 分泌生产谷胱甘肽的重组菌株及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分泌产谷胱甘肽重组菌株，其谷胱甘肽胞外向胞内运输蛋白基因失活，并且表达外源谷胱甘肽胞内向胞外运输蛋白基因。本发明提供的重组菌株改变了谷胱甘肽运输通路，使合成的谷胱甘肽向胞外分泌，大大提高了谷胱甘肽产量，其细胞外谷胱甘肽的浓度是细胞内谷胱甘肽浓度2倍以上。本发明提供的重组菌株，GSH总产量可达到10g/L以上，运输到胞外的GSH的产量也可到7g/L以上。

Description

分泌生产谷胱甘肽的重组菌株及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物生物技术领域，涉及发酵产谷胱甘肽的重组菌株及其制备方法。

背景技术

谷胱甘肽(GSH)是生物体内一种重要的非蛋白巯基化合物，在医学和化妆品，食品加工，蛋白纯化等领域有着广泛的应用[Sies H.(1999)Free Rad Biol Med.27，916-921；Henry Jay Forman et，al，(2009)Molecular Aspects of Medicine 30，1-12；郑云朗(1995)生物学通报30，22-24；Castro，VM.et，al(1993)，Biochem J 292，371-377]。

自上世纪70年代日本协和公司(Kyowa Hakko Kogyo Co.)使用发酵法生产谷胱甘肽工业化以后，发酵法生产GSH就成为其工业生产研究的主要方法[Sakato，K.and Tanaka H.1992，Biotechnol.Bioeng.40，904-912]。为此，上世纪七十年代后，各国开始对生物法合成GSH进行了大量研究，发表了大量文章和申请并公布了一系列相关专利[Kimura A.(1986)Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.，33，1-51，Nanjo，H.，Yamashita，K.，et.，al(1986)公开特许公报61-52299；Tezuka，H.，Otake，Y.，Yabushi，et.，al(1987)公开特许公报62-275685；Christine，L.，Ulf，S.(1989)Eur.Pat.Appl.EP 300168；王绍校，(2005).中国学位论文全文数据库；饶志明等(2007).应用与环境生物学报，13：257-260；饶志明等(2007).食品与发酵工业.33：1-4；蔡宇杰等，食品与机械，23，16-19；US Patent6902912；US Patent 4598046；US Patent 4582801；JP19890032584；WO2004/003217 A1；EP1539982；US Patent20050239164，CN200810019761.6]。其中，发酵菌株的选育主要集中在酵母(如Saccharomyces cervisiae、Pichia pastoris、Candida utilis)和大肠杆菌等微生物，通常的方法是在育种中利用基因重组技术使微生物细胞表达GSH相关合成相关基因谷氨酰半胱氨酸合成酶gsh1和谷胱甘肽合成酶gsh2基因，打破转录调控，使细胞内GSH合成酶活增加，从而提高GSH产量。

谷胱甘肽作为细胞内重要的多功能因子，其合成与调控等机理复杂。

Alfafara等人研究表明，胞内半胱氨酸的浓度是GSH合成产量的限制因素[Alfafara et，al.1992，Appl.microbiol.biotechol.36，358-540]。发酵添加半胱氨酸可以直接提高GSH的产量[Wen，S.et，al.2004，Enzyme Microbial.tech.35，501-507]。

细胞内高浓度GSH对谷胱甘肽合成酶1(gsh1)的竞争抑制以及谷胱甘肽积累后胞内毒性是提高发酵法谷胱甘肽含量以及产业化最大瓶颈[P G Richman，et，al.1975，J.Biol.Chem.250：1422-1426；Srikanth，C.V.et，al.2005，Curr Genet.47，345-358]。

为了解决胞内GSH对gsh1合成酶的竞争抑制和GSH高浓度胞内毒性，李华钟等人构建了带有GSH I和GSH II基因的质粒转化后的大肠杆菌，通过发酵处理使得生产GSH分泌到细胞外，发酵产量高达7g/L[李华钟等(2001)微生物学报，41：16-23]。虽然他们构建的工程菌发酵生产GSH是目前报道最高的产量，但发酵过程还需要添加甲苯等有毒化合物，不利于工业化。2004年Perone G.G.等人通过表达gshI和gshII基因和突变相关基因使得酵母菌发酵生产GSH分泌到细胞外，但专利报道摇瓶产量仅为胞内0.06um/L，胞外0.03umol/L左右[WO2004/003217 A1]。

发明内容

本发明首先提供一种分泌生产谷胱甘肽的重组菌株。

本发明还提供所述重组菌株的制备方法。

本发明还提供所述重组菌株在发酵生产谷胱甘肽中的应用。

本发明提供的生产谷胱甘肽的重组菌株，其谷胱甘肽胞外向胞内运输蛋白基因失活，并且表达外源谷胱甘肽胞内向胞外运输蛋白基因。

在本发明具体的实施方案中，通过改变谷胱甘肽运输通路，即突变或敲除突变谷胱甘肽胞外向胞内运输蛋白基因，使之失活，并在上述基础上表达外源谷胱甘肽胞内向胞外运输蛋白基因，从而改变谷胱甘肽运输通路，使重组菌株具备某些高等生物细胞可以分泌谷胱甘肽的功能。具体的方法如，以酵母细胞为例，敲除或基因突变失活外源谷胱甘肽胞内向胞外运输蛋白Hgt1，表达来源于人或动植物的多种抗药性(MRP)蛋白基因或其具有相同功能的突变体或CFTR或OATP等蛋白基因或它们的具有相同功能的突变体。优选的，外源谷胱甘肽胞内向胞外运输蛋白基因为人MRP2或其突变体。

在本发明的重组菌株的优选实施方案中，所述菌株的谷胱甘肽合成转录调控失调，并且其半胱氨酸向高半胱氨酸循环途径上的基因被失活或敲除。

本发明中谷胱甘肽合成转录调控失调，可以采用组成型或诱导型启动子表达谷胱甘肽相关合成酶，也可以表达谷胱甘肽相关合成酶正调控蛋白。谷胱甘肽相关合成酶可以选择来源各种生物的谷氨酰半胱氨酸合成酶gsh1(或突变体)和谷胱甘肽合成酶gsh2(或突变体)，如：酵母、大肠杆菌、高等动植物等；也可以选择双功能酶gshF或其突变体，如：多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)的gshF基因。本发明中谷胱甘肽合成转录调控失调，也可以表达谷胱甘肽相关合成酶基因转录正调节蛋白(如Yap1p、Met4)启动谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶基因转录。

在本发明重组菌株的一个优选实施方案中，其内源的半胱氨酸向高半胱氨酸循环途径上的基因Str3和/或Str2被失活或敲除，更优选的，Str3基因被失活或敲除。

本发明中，所述的重组菌株为任何能生产谷胱甘肽的真菌，特别优选酵母菌，最优选为毕赤酵母。

本发明提供的所述重组菌株的制备方法，其包括如下步骤：

1)将大肠杆菌gsh1和gsh2的表达盒转化到毕赤酵母中，获得表达大肠杆菌gsh1和gsh2基因的毕赤酵母。

2)将步骤1)获得的毕赤酵母通过同源重组失活内源的Str3基因，从而获得表达谷胱甘肽合成失调，半胱氨酸向高半胱氨酸的循环途径被切断的毕赤酵母。

3)将人MRP2突变体的表达盒转化到步骤2)获得的毕赤酵母，并过同源重组-反筛选基因修饰技术失活内源的Hgt1基因，从而获得表达谷胱甘肽合成失调，半胱氨酸向高半胱氨酸的循环途径被切断，以及谷胱甘肽运输通路被改变的毕赤酵母新菌株。

本发明中基因表达可以采用商业化表达***，也可以采用改造表达***；表达载体可以选择游离质粒，也可以选择整合基因组。本发明中基因表达启动子可以选择诱导型启动子，也可以选择组成型启动子或其突变体，优选为GAP，YPT1，PGK，ADH1，TEF，HXK2等中的几种或一种。

在本发明中菌株的相关基因突变或修饰可以通过同源重组-反筛选基因修饰技术，也可以转座技术来构建多基因突变或修饰。

本发明的微生物菌株用于本领域已知的方法在发酵罐内制备谷胱甘肽。举例言之，所用的碳源可以是葡萄糖、淀粉糖、糖蜜或其他糖类，而所用氮源可以是铵或蛋白水解物。举例言之，所用的硫源可以是硫酸盐和含硫氨基酸等。

需要说明的是，在本发明中谷胱甘肽制备可以采用胞内制备，也可以胞外制备。

在本发明中胞内谷胱甘肽由于细胞谷胱甘肽还原酶的存在，细胞还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽比例可以达90％以上，因此可以直接提取还原型谷胱甘肽。

在本发明中改变谷胱甘肽运输通路重组菌株具备向细胞外连续分泌还原型谷胱甘肽的能力。分泌胞外还原型谷胱甘肽在发酵液中，在一定pH环境下可能部分被氧化，产生还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽混合物。

在本发明中还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽混合物制备还原型谷胱甘肽的方法可以采用电解还原方法，也可以采用小分子巯基化合物还原氧化型谷胱甘肽方法。

在本发明发现，表达gsh1和gsh2基因的重组菌株，在添加外源半胱氨酸的情况下合成谷胱甘肽，虽然可以达到一定产量，但是存在半胱氨酸转化效率低下。当切断半胱氨酸向高半胱氨酸循环，在添加外源半胱氨酸的情况下合成谷胱甘肽，同表达gsh1和gsh2基因的对照菌株相比达到相同产量时，可以大大提高外源半胱氨酸转化效率和缩短发酵时间。本发明提供的菌株改变了谷胱甘肽运输通路，使合成的谷胱甘肽向胞外分泌，其细胞外谷胱甘肽的浓度是细胞内谷胱甘肽浓度2倍以上。本发明解决胞内高浓度GSH对gsh1合成酶的竞争抑制和GSH高浓度胞内毒性问题，大大提高了还原型谷胱甘肽工业化的可能性，使用本发明的方法构建的微生物菌株发酵培养，其谷胱甘肽的产量显著高于目前报道的谷胱甘肽发酵生产的最高水平，提高了原料利用效率，降低了生产成本，可用于工业化生产。

附图说明

图1为p Pic G1G2的质粒图谱。

图2所示为失活Str3切断半胱氨酸向高半胱氨酸循环。

图3所示为str3基因失活突变过程示意图。

图4所示为改变谷胱甘肽运输通路对发酵生产GSH的影响。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

在下实施例中未注明的具体的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验手册》、《pichia protocols》(Humana Press)中所说的方法或厂商提供的方案进行。

本发明实施例中，选择的毕赤酵母表达***(包括：Pichia pastorisX33、pPIC3.5K、pGAPZB、pGAPZC等)、合成引物等购于Invitrogen公司，其中Pichia pastoris X33为出发菌株。KOD聚合酶、PCR纯化试剂盒、胶回收纯化试剂盒、DNA抽提试剂盒、碱性磷酸酶、部分限制性内切酶、DH5α、人的cDNA文库、G418、zecoin、氨苄等购于上海悦克生物科技有限公司；T4连接酶、部分限制性内切酶、质粒PMD-18T、PMD-18T simple，质粒PUC18、Taq酶等购于Takara公司；同源重组-反筛选***质粒pPicZ mazF(AOX1-mazF-Zeocin，图3)是本实验室按照文献[Yunjie Y.et al.，2009，TEMS Yeast Res.9，600-609]方法构建。试剂除特殊要求外，均为国产试剂。电转参照pichia expression Kit手册中提供方法进行。

实施例1 谷胱甘肽合成转录调控失调菌株X33(gsh1，gsh2)的构建

1)引物：

gsh1-1：tgaaGGTACCTTGATCCCGGACGTATCACAGGC(SEQID No.1)

gsh 1-2：atgaTCTAGAATCAGGCGTGTTTTTCCAGCCAC(SEQID No.2)

gsh2-1：atcaGAATTCATGATCAAGCTCGGCATCGTGA(SEQ IDNo.3)

gsh 2-2：attaCTCGAGTTACTGCTGCTGTAAACGTGCTTCxho1(SEQ ID No.4)

GAPG1G2-1：CGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAAC(SEQ ID No.5)

GAPG1G2-2：GTAACCATGGAGTAGAAACATTTTGAAGCTATGGTGT(SEQ ID No.6)

2)方法：本例采用组成型启动子GAP表达来源大肠杆菌的gsh1和gsh2基因来解除GSH转录调控。具体方法如下：

用引物gsh1-1和gsh 1-2PCR扩增大肠杆菌DH5a的gsh 1基因。经过KpnI、XbaI双酶切后连接相同酶切的质粒pGAPZB，得到pGAPG1；

用引物gsh2-1和gsh 2-2PCR扩增大肠杆菌DH5a的gsh 2基因，经过EcoR1、xho1双酶切后连接相同酶切的质粒pGAPZB，得到pGAPG2。pGAPG2用Bgl II、BamH I双酶切后连接到BamH I酶切并经过碱性磷酸酶处理的pGAPG1，得到pGAPG1G2。

以pGAPG1G2为模板，GAPG1G2-1和GAPG1G2-2为引物的PCR产物经Bgl II、Nco I酶切连接到Nco I/BamH I酶切的pPIC3.5K得到质粒pPicG1G2(图1)。pPicG1G2经过Sac I酶切线性化后电转Pichia pastoris X33，G418平板筛选得菌株X33(gsh1，gsh2)。挑取克隆菌落，摇瓶发酵培养，其阳性克隆菌株命名为ZX067。

实施例2 切断半胱氨酸向高半胱氨酸循环

切断半胱氨酸向高半胱氨酸循环的示意图如图2所示。

1)引物

Pst3-1-1：5’TACCAGCAGCAACAGTATGAATGAGATCTC(SEQID No.7)

Pst3-1-2：5’GCGTTCCCGCTCAATAATTACTC(1653-1675)(SEQID No.8)

Pst3-3-1：5’GTCCTGCCTAAACGTTGCAGTC(2724-2745)(SEQID No.9)

Pst3-3-2：5’actactgca GGGGCATCACAGCTCCCTTCTTG(SEQID No.10)

Pst3-1-3-1-3’：GACTGCAACGTTTAGGCAGGACGCGTTCCCGCTCAATAATTACTCTGAT(SEQ ID No.11)

str3-1-1’：TGCCCAGTTCCACCCTTTCC(SEQ ID No.12)

P5Aox-1：AGATCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTG(SEQ IDNo.13)

Pzeo-2：TGGCCTTTTGCTCACATGTTGGTCTCC(SEQ IDNo.14)

2)方法(如图3，Str3基因突变经过a、b、c、d四个步骤)

①Str3基因克隆

X33基因组为模板，Pst3-1-1和Pst3-3-2为引物的PCR产物用Bgl II、Pst I酶切后，经胶回收试剂盒回收产物连接到BamH I、Pst I酶切的pUC18得pUCstr3。

②Str3基因突变体反筛选盒(图3a)

将以pPicZ mazF为模板，以P5Aox-1和Pzeo-2为引物的PCR产物AOX1-mazF-Zeocin反筛选盒***经SnaBI酶切并经过碱性磷酸酯酶处理后的质粒pUCstr3中得质粒pUCstr3::(AOX1-mazF-Zeocin)。

③Str3基因体外突变构建(图3b)

以pUCstr3为模板，以Pst3-1-1和Pst3-1-2为引物扩增得到PCR产物Pst3-1；

以pUCstr3为模板，以Pst3-3-1和Pst3-3-2为引物扩增得到PCR产物Pst3-3；

以Pst3-1为模板，以Pst3-1-1和Pst3-1-3-1-3’为引物扩增得到PCR产物Pst3-1-3-5’，其3’端带有Pst3-3的部分5’碱基序列；

以Pst3-1-3-5’和Pst3-3为模板，以Pst3-1-1和Pst3-3-2为引物扩增得到PCR产物Pst3-1-3，其为去除部分碱基序列的Str3基因的Δstr3(SEQ ID No.15)

④Str3基因突变(图3c和d)

以pUCstr3::(AOX1-mazF-Zeocin)为模板，以str3-1-1’和Pst3-3-2为引物扩增得到PCR产物str3::(AOX1-mazF-Zeocin)。将str3::(AOX1-mazF-Zeocin)PCR产物电转X33(gsh1，gsh2)经Zeocin筛选阳性克隆菌落得X33(gsh1，gsh2，str3::(AOX1-mazF-Zeocin))。将PCR产物Pst3-1-3(SEQ ID No.15)电转导入X33(gsh1，gsh2，str3::(AOX1-mazF-Zeocin))，在含甲醇为唯一碳源的培养基筛选阳性克隆菌落得X33(gsh1，gsh2，Δstr3)。挑取克隆菌落，摇瓶发酵培养，将其阳性克隆菌株命名为ZX068。

实施例3 改变谷胱甘肽运输通路

Hgt1基因(GeneID：8200532)编码的蛋白为甲醇酵母的细胞膜上转运GSH向胞内运输蛋白。失活该蛋白甲醇酵母就可能丧失从细胞外吸收GSH的功能。本实施例采用表达来源于人的肝细胞的向外分泌GSH的运输蛋白MRP2基因突变体，其MRP2突变去除最后三氨基酸TKF，解除锚定顶端膜功能。MRP2基因突变体***基因组位点为Hgt1基因Hind III酶切位点处，使Hgt1基因失活。

1)引物：

hgt1-1：ATGTCTAGACTGAGTCAGCAG(SEQ ID No.16)

hgt1-2：TTACCACCATTTATCAGGAC(SEQ ID No.17)

MRP2-1：AATATTCGAATGCTGGAGAAGTTCTGCAACTC(SEQ ID No.18)

MRP2-2：ATGTACGTATTAGCTGTTCACATTCTCAATGCCAGC(SEQ ID No.19)

GAP2-1：CGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACG(SEQ ID No.20)

Pzeo-2：TGGCCTTTTGCTCACATGTTGGTCTCC(SEQ IDNo.21)

2)Hgt1基因克隆

以X33基因组为模板，以hgt1-1和hgt1-2为引物的PCR产物直接连接到EcoR V酶切的PMD-18 T simple质粒得PMDHgt1，Hgt1序列如SEQ ID No.22所示。

3)MRP2基因突变体的整合表达框的构建

以人的cDNA文库为模板，以MRP2-1和MRP2-2为引物的PCR产物经Sfu I、SnaB I酶切连接经相同酶切的质粒pGAPZC得pGAPMRP2，MRP2的基因突变体序列如SEQ ID No.23所示。

4)Hgt1基因突变

以步骤3)获得的pGAP MRP2为模板，以GAP 2-1和Pzeo-2为引物的PCR产物***经过Hind III酶切并通过KOD聚合酶补平的以及再经过碱性磷酸酯酶处理的步骤1)的质粒PMDHgt1中，经过T4连接酶连接，氨苄抗性平板筛选阳性克隆得PMDHgt1::(pGAPMRP2)。

以质粒pPicZ mazF为模板，以P5Aox-1和Pzeo-2为引物的PCR产物AOX1-mazF-Zeocin反筛选盒***经Hind III酶切并通过KOD聚合酶补平的以及再经过碱性磷酸酯酶处理的质粒PMDHgt1中并在氨苄抗性平板筛选阳性克隆得质粒PMDHgt1::(AOX1-mazF-Zeocin)。

以质粒PMDHgt1::(AOX1-mazF-Zeocin)为模板，以hgt1-1和hgt1-2为引物的PCR产物导入X33、ZX067(X33(gsh1，gsh2))和ZX068(X33(gsh1，gsh2，Δstr3))中，经Zeocin筛选阳性克隆菌落得X33(Hgt1::(AOX1-mazF-Zeocin))、X33(gsh1，gsh2，Hgt1::(AOX1-mazF-Zeocin))和X33(gsh1，gsh2，Δstr3，Hgt1::(AOX1-mazF-Zeocin))。

以质粒PMDHgt1::(pGAP MRP2)为模板，以hgt1-1和hgt1-2为引物的PCR产物导入X33(Hgt1::(AOX1-mazF-Zeocin))、X33(gsh1，gsh2，Hgt1::(AOX1-mazF-Zeocin))和X33(gsh1，gsh2，Δstr3，Hgt1::(AOX1-mazF-Zeocin))中，在在含甲醇为唯一碳源的培养基筛选阳性克隆菌落得X33(Hgt1::pGAP MRP2)、X33(gsh1，gsh2，Hgt1::pGAP MRP2)和X33(gsh1，gsh2，Δstr3，Hgt1::pGAP MRP2)。挑取阳性单克隆菌落，摇瓶发酵培养保种，其X33(Hgt1::pGAPMRP2)命名为ZX069、X33(gsh1，gsh2，Hgt1::pGAP MRP2)命名为ZX070、X33(gsh1，gsh2，Δstr3，Hgt1::pGAP MRP2)命名为ZX071。

实施例4 发酵生产GSH培养基

1.发酵生产GSH的培养基

1)发酵生产GSH摇瓶种子培养基采用YPD培养基：

葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L。

2)摇瓶培养基：

葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，KH₂PO₄ 2.82g/L，K₂HPO₄ 9.12g/L，MgSO₄ 1g/L，(NH4)₂SO₄ 2g/L，Nacl 0.2g/L，Cacl 0.2g/L，FeSO₄7H₂O 0.1g/L，生物素0.4mg/l，泛酸钙0.8mg/l，肌醇4mg/l，烟酸0.8mg/l，对甲苯磺酸0.4mg/l，VB₆ 0.6mg/l，VB₂ 0.4mg/l，硫胺素0.6mg/l，硼酸1mg/l，CuSO₄ 0.6mg/l，KI 0.2mg/l，MnSO₄ 0.8mg/l，Na₂MoO₄ 0.4mg/l，ZnSO₄ 0.8mg/l。

3)发酵罐发酵生产GSH培养基：

葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，KH₂PO₄ 30g/L，MgSO₄ 2g/L，(NH4)₂SO₄ 5g/L，Nacl 0.4g/L，Cacl 0.5g/L，FeSO₄7H₂O 0.2g/L，生物素0.8mg/l，泛酸钙1.6mg/l，肌醇8mg/l，烟酸1.6mg/l，对甲苯磺酸0.8mg/l，VB₆ 1.6mg/l，V B₂ 0.8mg/l，硫胺素1.6mg/l，硼酸2mg/l，CuSO₄ 1.6mg/l，KI 0.4mg/l，MnSO₄ 1.6mg/l，Na₂MoO₄ 0.8mg/l，ZnSO₄ 1.6mg/l，聚醚泡敌少许。

4)流加培养基1：葡萄糖700g/L，酵母膏40g/L。

5)流加培养基2：L-半胱氨酸盐酸盐120g/L。

实施例5 发酵生产谷胱甘肽的含量检测

1)待测样品的制备：

发酵液谷胱甘肽的含量检测(包括胞内、胞外含量)：取一定量的发酵液按照一定倍数稀释，沸水5分钟后冷却，12000g离心20分钟后上清液过滤，过滤液待上样。

胞内谷胱甘肽的含量检测：胞内谷胱甘肽的含量采用以下方法处理：取一定量的发酵液离心，去上清，加一定倍数稀释，沸水5分钟后冷却，12000g离心20分钟后上清液过滤，过滤液待上样。

2)色谱检测

色谱条件：色谱柱：C18(4.6X250mm)，磷酸盐溶液(取磷酸二氢钾6.8克，庚烷磺酸钠2.2克，加水溶解使成1000ml，用磷酸调节pH值至3.0)-甲醇(97∶3体积比)流速：1ml/min，检测波长210nm。进样量为20微升。以还原型谷胱甘肽纯品和氧化型谷胱甘肽纯品为标准制备标准曲线，根据检测样品峰面积计算待测样品谷胱甘肽总含量。

实施例6 改变谷胱甘肽运输通路对发酵生产GSH的影响

选取ZX068、ZX069、ZX070、ZX071菌株，经摇瓶种子培养基YPD中，30℃、280rpm培养24小时后，按照10％接种量接种到15L发酵培养基中(30L发酵罐)，30℃发酵，流加氨水控制pH3.0，调节转速、温度、罐压、通风量等控制溶氧DO30％。发酵过程流加“流加培养基1”，控制葡萄糖含量为20g/L，以满足细胞生长。待细胞生长到OD₆₀₀150时，开始添加“流加培养基2”，继续发酵至GSH含量不积累为止(50-70小时)。发酵开始添加“流加培养基2”每4时取样检测培养液中GSH产量，结果如图4。

从图4中可以看出，改变谷胱甘肽运输通路，使合成的谷胱甘肽向胞外分泌，大大提高了还原型谷胱甘肽产量，其细胞外谷胱甘肽的浓度是细胞内谷胱甘肽浓度2倍以上。本发明实施例3构建的重组菌株ZX071，GSH总产量可达到10g/L以上，运输到胞外的GSH的产量也可到7g/L以上。

在本发明的实施例中，所用的菌株、启动子等仅用作说明之用，不能用来限制本发明。对于本领域技术人员而言，可对微生物，谷胱甘肽相关合成酶或突变体、启动子或突变体用来同本实施例结果进行比较优化(对发酵生产谷胱甘肽的产量影响)，这种优化是显而易见的。因此，选择实施例以外的其他微生物、其他谷胱甘肽相关合成酶或突变体、启动子或突变体以及选择不同向胞外分泌GSH的运输蛋白或突变体和采用切断半胱氨酸向高半胱氨酸循环或改变谷胱甘肽运输通路同样适用本发明范围。

Claims (10)

1.一种分泌产谷胱甘肽重组菌株，其特征在于，其谷胱甘肽胞外向胞内运输蛋白基因失活，并且表达外源谷胱甘肽胞内向胞外运输蛋白基因。

2.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征在于，所述的谷胱甘肽胞外向胞内运输蛋白基因为Hgt1基因。

3.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征在于，所述的外源谷胱甘肽胞内向胞外运输蛋白基因为高等生物谷胱甘肽胞内向胞外运输蛋白基因或其突变体。

4.根据权利要求3所述的重组菌株，其特征在于，所述的外源谷胱甘肽胞内向胞外运输蛋白基因为人MRP2突变体，其核苷酸序列如SEQ ID No.23所示。

5.根据权利要求1～4所述的重组菌株，其特征在于，其谷胱甘肽合成转录调控失调，并且其半胱氨酸向高半胱氨酸循环途径上的基因被失活或敲除。

6.根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，采用组成型或诱导型启动子表达谷胱甘肽相关合成酶基因gsh1和gsh2基因或表达谷胱甘肽双功能合成酶gshF基因，使谷胱甘肽合成转录调控失调。

7.根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，内源的半胱氨酸向高半胱氨酸循环途径上的基因Str3被失活或敲除。

8.根据权利要求6或7所述的重组菌株，其为真菌，优选酵母菌，最优选毕赤酵母。

9.制备权利要求1～8任一项所述的重组菌株的方法，其包括如下步骤：

1)将大肠杆菌gsh1和gsh2的表达盒转化到毕赤酵母中，获得表达大肠杆菌gsh1和gsh2基因的毕赤酵母。

2)将步骤1)获得的毕赤酵母通过同源重组-反筛选基因修饰技术失活内源的Str3基因，从而获得表达谷胱甘肽合成失调，半胱氨酸向高半胱氨酸的循环途径被切断的毕赤酵母。

3)将人MRP2突变体的表达盒转化到步骤2)获得的毕赤酵母，并通过同源重组-反筛选基因修饰技术失活内源的Hgt1基因，从而获得表达谷胱甘肽合成失调，半胱氨酸向高半胱氨酸的循环途径被切断，以及谷胱甘肽运输通路被改变的毕赤酵母新菌株。

10.权利要求1～8任一项所述的重组菌株在发酵生产谷胱甘肽中的应用。

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