CN105624238A

CN105624238A - 一种理性设计的酶用于再生atp的方法

Info

Publication number: CN105624238A
Application number: CN201610019298.XA
Authority: CN
Inventors: 刘珞; 李成成; 曹浩
Original assignee: Beijing University of Chemical Technology
Current assignee: Beijing University of Chemical Technology
Priority date: 2016-01-12
Filing date: 2016-01-12
Publication date: 2016-06-01
Anticipated expiration: 2036-01-12
Also published as: CN105624238B

Abstract

本发明涉及一种理性设计的酶用于再生ATP的方法。通过序列对比后的理性设计，突变并异源表达出了苜蓿中华根瘤菌来源的多聚磷酸激酶并在其催化下，实现以低聚合度的多聚磷酸盐为磷酸供体再生ATP。与现有的ATP再生的方法相比，本发明中应用的多聚磷酸激酶为常温酶，能与多种酶促反应耦合，该酶能以四聚磷酸盐为磷酸供体，与高聚合度聚磷酸相比，四聚磷酸更常见易得，在简化ATP再生过程的基础上增加了ATP再生的可行性，也降低了ATP再生的成本。PPK酶的活性不受聚磷酸盐浓度的抑制，为工业大规模生产提供了可能性。

Description

一种理性设计的酶用于再生ATP的方法

技术领域

本发明属于生物化工领域，特别涉及一种理性设计的酶用于再生ATP的方法。

背景技术

ATP是生物体内最重要的高能磷酸化合物，在医学上被广泛用作肌肉萎缩、心肌梗塞、肝炎和各种急救病症中的治疗或重要辅助治疗药物。工业上也有许多重要的生物活性物质或生化药物的生物合成过程，也都是需要ATP参加的酶促反应。所以，ATP的生产以及工业上ATP的循环再生成为酶工程发展的一个重要问题，是决定工业生产是否经济节约的关键因素。

近年来，对ATP再生的研究主要在多聚磷酸激酶催化法，即以ADP和多聚磷酸为底物，由多聚磷酸激酶催化产生ATP。对于不同来源的多聚磷酸激酶，催化特点各不相同。如Thermotogamaritima来源的多聚磷酸激酶TePpk是一种嗜热酶，它的最适温度为70度，适合参与温度较高的反应，但在多数常温酶的最适温度(30～37度)条件下酶活较低，不能与常温酶的耦合反应，因此不能广泛的满足工业生产需求。还有一些多聚磷酸激酶，虽然最适温度在30度左右，但是利用的多聚磷酸盐聚合度较高，这种聚合度高的聚磷酸盐在当前在市场上不易得到而且价格昂，这就提高了生产难度和生产成本。另一方面，就工业大量生产ATP而言，一些多聚磷酸激酶会受到多聚磷酸盐的抑制，所以大规模生产时不得不采用流加多聚磷酸盐的方法来减少抑制，使生产过程变得繁琐。所以现在亟需找到一种合适的多聚磷酸激酶，使它既能与许多常温酶耦合参与工业生产，又能够使用比较常见且价格低廉的多聚磷酸盐为磷酸供体，使ATP再生过程方便、廉价、高效。

与公知技术相比，本发明具有以下优点：

1)反应最适温度为30～37度，符合工业生产上多数常温酶的温度要求，应用范围广泛。

2)磷酸供体为低聚合度的多聚磷酸盐，相比聚合度为65或者更高聚合度的多聚磷酸盐，这些低聚合度的多磷酸盐价格低廉且常见易得，使ATP再生过程经济、方便。

3)没有聚磷酸盐抑制现象，能在较高浓度的多聚磷酸底物作用下高效生产ATP。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于蛋白理性设计人工构建的聚磷酸激酶，以低聚合度的多聚磷酸盐为磷酸供体，在聚磷酸激酶的催化条件下生成ATP，为多种消耗ATP的酶促反应源源不断的提供能量。

本发明首先基于一种来自苜蓿中华根瘤菌的多聚磷酸激酶和来自谷氨酸棒状杆菌的多聚磷酸激酶的基因序列比对结果，通过基因突变手段理性改造并异源表达了改造后的来自苜蓿中华根瘤菌的聚磷酸激酶。构建基因工程菌即将改造后的基因ppk(ket)克隆至原核表达载体pET22b中得到多聚磷酸激酶基因表达载体pET22b-ppk(ket)。然后将表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导表达，即可在胞内获得多聚磷酸激酶。

蛋白表达后，通过超声破碎将大肠杆菌中的多聚磷酸激酶释放出来，获得粗酶液。在四聚磷酸或其钠盐为磷酸供体的条件下，以ADP为底物粗酶液催化产生ATP。

本发明提供的方法，以ADP为底物，利用价格低廉的四聚磷酸为磷酸供体，理性设计并异源表达多聚磷酸激酶催化产生ATP，为经济高效生产ATP并在此基础上降低多种酶促反应的成本提供了一种创造性的方法。

图1：DNA琼脂糖凝胶电泳。左侧为多聚磷酸激酶基因ppk(ket)的PCR产物，右侧为DNA大小标准品。

图2：诱导表达改造后的来自苜蓿中华根瘤菌的多聚磷酸激酶PPK蛋白电泳图。泳道1为pET22b空质粒表达后破胞上清，泳道2为PPK酶表达后破胞上清。

图3：基因改造后的来自苜蓿中华根瘤菌多聚磷酸激酶动力学参数曲线1

图4：基因改造后的来自苜蓿中华根瘤菌多聚磷酸激酶动力学参数曲线2

图5：苜蓿中华根瘤菌来源的谷胱甘肽合成双功能酶以PPK催化生成的ATP为能源酶促产生谷胱甘肽的反应体系。50mM反应体系中添加20mMADP时，每隔2h取样检测得到的GSH生成曲线。

具体实施方式

1.利用Swiss-model程序搜索并比对了一种来自苜蓿中华根瘤菌的多聚磷酸激酶和来自谷氨酸棒状杆菌的多聚磷酸激酶的基因序列。

2.突变并克隆理性设计后的来自苜蓿中华根瘤菌的多聚磷酸激酶基因。

3.诱导表达多聚磷酸激酶PPK。将构建好的重组表达载体质粒pET22b-ppk(ket)转入大肠杆菌感受态细胞E.coliBL21(DE3)，在IPTG作用下诱导表达。

4.超声破碎表达菌体，提取粗酶液进行反应。合成反应中的酶添加量采用考马斯亮蓝测蛋白法进行标定。

5.酶法合成ATP。在Tris-HCl缓冲盐体系和辅因子Mg²⁺存在下，以ADP为底物，四聚磷酸盐为磷酸供体，通过多聚磷酸激酶PPK合成ATP。

6.酶法合成谷胱甘肽。在Tris-HCl缓冲盐体系和辅因子Mg²⁺存在下，以谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸为底物，四聚磷酸盐盐为磷酸供体，通过嗜热链球菌来源的谷胱甘肽合成双功能酶(GS)和改造后的苜蓿中华根瘤菌来源的多聚磷酸激酶(PPK)合成谷胱甘肽。

7.谷胱甘肽的检测。采用四氧嘧啶法测定反应液中GSH的含量，在pH7.2的缓冲条件下，反应产物与四氧嘧啶结合，20min后测定结合物在305nm下的吸光度值。由GSH标准曲线计算出样品中GSH的含量。

下面结合实施例对本发明具体方法进一步说明：

实施例1

突变并克隆理性设计后的来自苜蓿中华根瘤菌的多聚磷酸激酶基因

利用定点突变的方法把来自苜蓿中华根瘤菌的聚磷酸激酶基因ppk进行突变成ppk(ket)。以该菌株原始基因重组载体为模板，根据GenBank序列设计引物，按照TaKaRaMutanBESTkit试剂盒说明操作。

定点突变所用引物如下：

F1:GCGATCAAAGCGACGACGGAAAATATGAACCCCCGCTC

R1:ACCACCCTTGCCGGCAGCGT

F2:GCGCGCACCGTCGCACTGACGAAACCGA

R2:GGAGCGGGGGTTCATATT

突变后的重组载体片段大小约为6000bp，核酸电泳图见图1。

实施例2

将构建好表达载体即pET22b-ppk(ket)质粒化转于BL21(DE3)大肠杆菌中，挑菌后使用LB培养基，37℃培养生长至OD600约为0.4～1.0后，以0.1mM～1mM的IPTG诱导，在30℃培养下进行胞内表达。将载体pET22b化转于BL21(DE3)大肠杆菌中，与上述相同条件进行诱导表达，将表达后的粗酶液进行蛋白电泳验证表达结果，其蛋白电泳如图2所示，考马斯亮蓝法测得蛋白含量为8.4g/L。

实施例3

测四聚磷酸为底物时PPK酶动力学参数。设置编号为1，2，3，4，5，6六组实验体系1，体系中的的四聚磷酸盐浓度分别为2mM，4mM，8mM，10mM，15mM，20mM。加入对应六偏磷酸盐两倍浓度的ADP，30mMMgCl₂，PPK粗酶液200ul(含蛋白0.12mg)，加入不同量的3MpH8.0的Tris-HCl调节体系PH为8.0，体系1在37度反应5min后放置60度水浴加热20min使PPK酶失活。取对应上清加入NADPH反应体系2，标记为1，2，3，4，5，6。体系2中各组对应的葡萄糖浓度分别为1mM，2mM，3mM，4mM，5mM，7mM的葡萄糖和NADP，己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶在对应编号的实验体系中加入量分别为100ul(1U)，200ul(2U)，300ul(3U)，400ul(4U)，500ul(5U)，700ul(7U)。体系2在30度反应30min后在340nm处测NADPH的吸光度，根据摩尔吸光系数计算生成的NADPH的量。处理数据并根据米氏方程，作1/v对1/[s]的Lineweaver-Burk曲线如图3动力学曲线1所示，由方程y＝1.1733x+0.0611计算得K_m＝19.23mM/L，V_max＝16.39umol/min/ml，Kcat＝16.37。

实施例4

测以ADP为底物时PPK酶动力学参数。设置编号为1，2，3，4，5，6，7七组实验体系1，体系中的的ADP浓度分别为0.02mM，0.04mM，0.08mM，0.12mM，0.24mM，0.5mM，1mM。加入四聚磷酸盐2mM，30mMMgCl₂，200ulPPK粗酶液(含蛋白0.12mg)，加入不同量的3MpH8.0的Tris-HCl调节体系PH为8.0，体系1在37度反应5min后放置60度水浴加热20min使PPK酶失活。取对应上清加入NADPH反应体系2，标记为1，2，3，4，5，6，7。体系2中各组加入1mM的葡萄糖和NADP，己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶在实验体系中加入量均为100ul(1U)。体系2在30度反应30min后在340nm处测NADPH的吸光度，根据摩尔吸光系数计算生成的NADPH的量。处理数据并根据米氏方程，作1/v对1/[s]的Lineweaver-Burk曲线如图4动力学曲线2所示，由方程y＝3.9197x+1.7797计算得K_m＝0.5618mM/L，V_max＝2.2024umol/min/ml，Kcat＝2.8。

实施例5

采用四氧嘧啶法测定反应液中GSH的含量，具体操作如下：在96孔板中加入175ul浓度为0.24mM,PH为7.2的磷酸盐缓冲液，25ul浓度为7.5g/L的甘氨酸溶液，1g/L的四氧嘧啶25ul，稀释后的样品25ul，空白孔加入25ul去离子水。振荡混合并精确计时20min后测样品在305nm下的吸光度值。由GSH标准曲线计算出样品中GSH的含量，并算出转化率。

实施例6

在螺口瓶中配制50mM反应体系，体系均包括100mM的谷氨酸，50mM的半胱氨酸，100mM的甘氨酸，3mlGS酶粗酶液(含蛋白9.76mg)，5mlPPK酶粗酶液(含蛋白3mg)，50mM的四聚磷酸盐，50mM的MgCl₂，20mM的ADP。加入pH8.0的Tris-HCl调节体系PH为8.0。反应体系总体积为10ml，30℃无氧振荡反应，每隔2h取样，样品稀释40倍后检测样品中GSH在305nm波长处的吸光度值。换算后的GSH生成曲线如图5所示，反应10h后GSH浓度达到38Mm/L,对应转化率为76％，相当于在GSH反应中PPK催化ATP循环再生4次。

Claims

1.一种通过理性突变一种来自苜蓿中华根瘤菌的多聚磷酸激酶用于再生ATP的方法，其特征在于，包括：

步骤1、定点突变苜蓿中华根瘤菌来源的多聚磷酸激酶基因，得到重组质粒，经IPTG诱导表达。

步骤2、将细胞破碎后得到的多聚磷酸激酶，在Tris-HCl缓冲盐体系和辅因子Mg²⁺存在下，以多聚磷酸盐和ADP为底物，多聚磷酸激酶催化生成ATP。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于用于序列对比的苜蓿中华根瘤菌来源的多聚磷酸激酶PPK的如序列1所示的核酸序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于用于序列对比的苜蓿中华根瘤菌来源的多聚磷酸激酶PPK的如序列2所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于突变后的苜蓿中华根瘤菌来源的多聚磷酸激酶PPK的如序3所示的核酸序列。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于突变后的苜蓿中华根瘤菌来源的多聚磷酸激酶PPK的如序列4所示的氨基酸序列。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于反应体系用改造后的苜蓿中华根瘤菌来源的多聚磷酸激酶PPK催化再生ATP。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于反应体系由常见的四聚磷酸作为多聚磷酸激酶的底物和磷酸供体。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于反应温度范围为25～37摄氏度。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于反应中添加的多聚磷酸盐对多聚磷酸激酶没有明显的底物抑制，多聚磷酸浓度范围为10～500mM。

10.根据权利要求1所述方法，其特征在于ATP(ADP)浓度范围为1～50mM。

11.根据权利要求1所述方法，其特征在于反应pH范围为6～9。

12.根据权利要求1所述方法，其特征在于ATP可再生2～100个循环。