CN112359127A - 一种用于检测转基因大豆shzd32-1的rpa引物和探针组合及现场快速检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于检测转基因大豆SHZD32‑1的RPA引物和探针组合及现场快速检测方法。通过对转基因大豆SHZD32‑1的转化体特异性序列设计RPA引物和探针，结合DNA快速提取方法以及通过荧光灯的照射直接判别检测结果，可在30分种内完成对转基因大豆SHZD32‑1的现场快速可视化检测。本发明无需特殊仪器，可以实现在非实验条件下(例如大豆种植基地)对核酸的快速、特异性检测。

Description

一种用于检测转基因大豆SHZD32-1的RPA引物和探针组合及 现场快速检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，尤其是涉及一种用于检测转基因大豆SHZD32-1的RPA引物和探针组合及现场快速检测方法。
背景技术
目前，转基因大豆是全球种植面积最大的转基因作物。我国是世界上消费转基因大豆量最大的国家。我国的转基因大豆主要依靠进口。因此，研发拥有我国自主产权的转基因大豆具有重要的意义。SHZD32-1耐草甘膦大豆(即耐除草剂大豆SHZD32-1)是由我国上海交通大学自主研发的转基因大豆，是利用农杆菌介导法将优化的耐草甘膦基因G10-EPSPS导入了栽培大豆品种豆32中获得转G10-EPSPS基因的耐草甘膦大豆。现阶段，SHZD32-1耐草甘膦大豆已拿到安全证书。未来，SHZD32-1可能是我国第一个进行商业化种植的转基因大豆，由于转基因管理和监控的需要，迫切需要建立针对转基因大豆SHZD32-1的方便、快捷的现场快速检测方法。
目前，聚合酶链式反应(PCR)是转基因检测的金标准方法，其检测灵敏度高，结果稳定可靠，成为目前最常用的转基因检测方法。然而，PCR检测方法，需要大型仪器，对场地及操作人员要求较高，无法满足转基因成分的现场检测的需要。另一种转基因成分快速检测方法是蛋白质试纸条方法，该方法是将特异的抗体交联到试纸条上，根据抗原与抗体特异性结合从而达到对转基因作物的检测。该方法操作简单，且耗时短。但蛋白质试纸条需要依赖特异性的抗体，而特异性抗体的获得和制备比较繁杂。另外，蛋白质试纸条只能针对转基因作物表达的外源蛋白质进行检测，而无法对转基因作物中常用元件如启动子和终止子进行检测，同时也无法对转基因作物的特定转化体进行检测鉴定。
恒温扩增技术是近些年兴起的核酸检测技术，如环介导等温扩增技术、链替换扩增技术、依赖解旋酶的等温扩增技术、核酸序列依赖扩增和重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)等。其中RPA技术的扩增温度为37℃左右，其扩增效率高，一般20分钟能完成扩增，而且其对检测样品的纯度要求不高，具有一定抗抑制因子的能力。RPA技术的这些特性，展现了其在转基因成分现场快速检测方面的广阔前景。
然而，目前主要有两个问题制约恒温扩增技术在现场检测方面的应用，一是核酸的快速提取，二是快速扩增与结果判别。一方面，传统的核酸提取方法操作繁杂，耗时费力，即使是常用的核酸提取试剂盒，其提取的时间也在1个小时左右，而且还需要离心机等设备，不能满足现场快速检测的需要。另一方面，恒温扩增技术虽然保证了核酸的快速扩增，但其与后期结果判别不能很好连接，目前常在扩增后添加荧光染料，这一方面增加操作步骤，也增加了气溶胶污染的风险；还有就是利用荧光仪器对扩增信号进行检测。这些方法都不能完好的切合现场快速检测的需要。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测转基因大豆SHZD32-1的RPA引物和探针组合及现场快速检测方法。通过对转基因大豆SHZD32-1的转化体特异性序列设计RPA引物和探针，结合DNA快速提取方法以及通过荧光灯的照射直接判别检测结果，可在30分种内完成对转基因大豆SHZD32-1的现场快速可视化检测。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种用于检测转基因大豆SHZD32-1的RPA引物和探针组合，所述引物包括正向引物和反向引物；
所述正向引物和所述反向引物分别选自以下的任一组：
所述正向引物为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述反向引物为SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；
所述正向引物为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述反向引物为SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列；
所述正向引物为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述反向引物为SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；
所述正向引物为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，所述反向引物为SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；或
所述正向引物为SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述反向引物为SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；
所述探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列；其中用连接有荧光基团的T代替探针第29个碱基T，用连接有淬灭基团的T代替第34个碱基T，用四氢呋喃残基THF代替第31个碱基A。
在一个具体的实施方案中，所述荧光基团可以选自：FAM、FITC、HEX、JOE、ROX、TAMRA等中的任一种；所述淬灭基团可以选自DABCYL、TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2或BHQ3等中的任一种；优选地，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ1。
在一个实施方案中，所述正向引物为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述反向引物为SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
一种用于检测转基因大豆SHZD32-1的试剂盒，包含前述RPA引物和探针组合。
一种用于转基因大豆SHZD32-1的现场快速检测方法，包括以下步骤：
(A)提取待测样品中的DNA；
(B)以步骤(A)中提取的DNA为模板，用权利要求1或2所述的RPA引物和探针进行RPA扩增反应；
(C)分析RPA扩增产物。
在一个实施方案中，所述步骤(A)包括：样品快速研磨、过滤、吸附以及回收DNA的步骤；优选的，所述过滤、吸附以及回收DNA的步骤采用DNA提取装置进行。
在一个实施方案中，所述DNA提取装置包括过滤管、吸附管、螺口接头和注射器；
其中，所述过滤管和所述吸附管为下端带有连接管的螺口管，其上端能够与所述螺口接头连接；
所述螺口接头的上端带有连接管，能够与所述过滤管和吸附管的下端连接管以及所述注射器连接。
在一个实施方案中，所述吸附管内部设置有吸附膜用于吸附DNA；优选地，所述吸附膜为二氧化硅硅胶膜；更优选地，所述吸附膜为4-8层。
在一个实施方案中，所述步骤(C)中，通过荧光灯照射直接判别检测结果。
在一个具体实施方案中，所述步骤(A)包括：
(1)将研磨后的DNA匀浆倒入过滤管中，所述过滤管与螺口接头密封连接，用注射器经螺口接头上端的连接管施加压力对匀浆进行过滤，滤液压入吸附管中；
(2)将所述吸附管与螺口接头密封连接，用注射器经螺口接头上端的连接管施加压力使滤液进行过滤吸附，向吸附管中添加缓冲液后再次用注射器施加压力进行过滤吸附，弃滤液；
(3)将吸附有DNA的吸附管转移到离心管上，向所述吸附管中添加洗脱缓冲液，将所述吸附管与螺口接头密封连接，用注射器经螺口接头上端的连接管施加压力过滤洗脱，滤液为所提取的DNA。
在一个实施方案中，RPA扩增反应的条件为温度为37℃-39℃，扩增反应的时间为15-20min，优选地，RPA扩增反应的条件为39℃扩增20min。
本发明还提供了前述RPA引物和探针组合或试剂盒在检测在检测转基因大豆SHZD32-1中的应用。
有益效果：
本发明提供的用于检测转基因大豆SHZD32-1的RPA引物和探针组合灵敏度高、特异性强。
本发明提供的用于转基因大豆SHZD32-1的现场快速检测方法，将DNA快速提取方法和RPA荧光探针检测方法相结合，可在30分种内完成对转基因大豆SHZD32-1的现场快速可视化检测。其中，DNA提取方法简单便捷快速，无需离心机等仪器，提取过程为3-5分钟，能满足现场快速提取DNA的需要。建立的SHZD32-1的RPA荧光终端检测方法可以在20分钟完成扩增与结果分析。而传统基于PCR的转基因作物检测方法，提取DNA一般需要1个小时，普通PCR和荧光PCR的扩增也需要2个小时左右。
本发明提供的方法无需特殊仪器，可以在非实验条件下(例如大豆种植基地)实现对核酸的快速、特异性检测，具有良好的操作性，具有广阔的应用前景。
本发明方法中RPA扩增的产物可以达到直接显色的要求，无需大型仪器，可以直接在荧光灯下观察，简化了结果判别的步骤和程序，提高了效率，使得反应结果的判别可视化、迅速且及时。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明转基因大豆SHZD32-1的现场快速检测方法的示意图，其中A为样品快速提取过程，B为RPA扩增与结果判别过程，C为exo探针原理示意图；
图2为DNA快速提取与验证结果；其中，A为DNA提取装置示意图，B为使用QIAGEN和不同层吸附膜提取的DNA浓度，C为使用QIAGEN和不同层吸附膜提取的DNA纯度，D为利用普通PCR对获得的DNA进行植物内源基因18S的扩增的结果图，E为利用普通RPA对获得的DNA进行植物内源基因18S的扩增的结果图；M:Maker 1～3：QIAGEN获得的DNA的扩增结果，4～6：4层吸附膜获得的DNA的扩增结果7～9：6层吸附膜获得的DNA的扩增结果，10～12：8层吸附膜获得的DNA的扩增结果；
图3为RPA引物筛选结果，其中A为正向引物F1分别与4条反向引物R1、R2、R4、R4组合进行RPA荧光实验的结果，B为选取反向引物R2与4条正向引物F1、F2、F3、F4组合进行RPA荧光实验的结果；
图4为本发明选用引物组合F1/R2进行实时荧光RPA的结果和终端荧光检测结果，其中A为实时荧光分析结果，B为终端荧光分析结果，B中第一排从左到右依次为转基因大豆SHZD32-1，市售非转基因大豆，转基因大豆A2704-12、A5547-127、356043、GTS40-3-2、FG72以及转基因玉米NK603，第二排从左到右依次为转基因玉米BT176、T25，棉花LLcotton25、MON15985、GHB119，油菜MS1×RF1、MS1×RF2、OXY235样品；
图5为含SHZD32-1不同拷贝数的DNA在普通PCR(A)，荧光PCR(B)及荧光RPA(C)中的测定结果；其中，普通PCR，B荧光PCR，C荧光RPA终端法；M：Maker，N：空的对照，1-9：2560，1280，640，320，160，80，40，20和10拷贝；
图6为利用本发明的DNA现场快速提取方法并结合荧光RPA终端方法，对转基因基地的实际转基因大豆SHZD32-1进行检测的结果图，同时用普通PCR和荧光PCR方法进行验证的结果图；其中A为普通PCR实际检测结果，B为荧光RPA实际检测结果，C为qPCR实际检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
图1为本发明转基因大豆SHZD32-1的现场快速检测方法的示意图，其中A为样品快速提取过程，B为RPA扩增与结果判别过程，C为exo探针原理示意图。
1.1材料与试剂
1.1.1材料
供试材料：转基因大豆SHZD32-1叶片取自浙江省农科院实验室转基因基地，其他5种转基因大豆(A2704-12、A5547-127、356043、GTS40-3-2、FG72)、市售非转基因大豆、转基因玉米(NK603、BT176、T25)、转基因棉花(LLcotton25、MON15985、GHB119)、转基因油菜(MS1×RF1、MS1×RF2、OXY235)，均由本实验室保存。
过滤膜和吸附膜均购于杭州莱枫生物科技有限公司。
1.1.2试剂
RPA恒温快速扩增试剂盒(基础型、荧光型)均购之潍坊安普未来生物科技有限公司；植物基因组DNA提取试剂盒DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen，德国)，其它生化试剂均购于上海生工生物有限公司。
1.2.DNA快速提取
1.2.1溶液配制：
配制提取缓冲液500ml(5M胍硫氰酸酯，50mM Tris，20mM EDTA，21.3mM Triton X-100，pH 6.4)；
缓冲液Ⅰ500ml(5M硫氰酸胍，50mM Tris，pH 6.4)；
缓冲液Ⅱ500ml(10mM Tris，100mM NaCl，pH 8.0)；
DNA洗脱缓冲液200ml(10mM Tris HCl，pH 8.0；1mM EDTA，pH8.0)。
本发明DNA的快速提取方法，采用DNA提取装置，其主要有3个部分组成，分别为过滤管、吸附管和注射器。过滤管和吸附管含有螺纹，可以用螺帽(即螺口接头)相连接，螺帽的上端可以与注射器相结合。过滤管和吸附管的下端均匀一段连接管，可以与螺帽的上端连接。其中过滤管主要用来过滤大豆叶片研磨后的组织残留，内置10μM聚乙烯过滤膜。吸附管用来吸附DNA，为了比较不同厚度的吸附的吸附效果，本发明分别比较了4层吸附膜、6层吸附膜和8层吸附膜的吸附效果(吸附膜二氧化硅硅胶膜，孔径1μm)。图2为DNA快速提取与验证结果；其中，A为DNA提取装置示意图。
DNA快速提取过程：
(1)样品快速研磨。将80mg左右的新鲜叶片放入1.5mL离心管内，加入800μL DNA提取缓冲液，用一次性塑料研磨棒研磨1min。
(2)过滤。将研磨后的匀浆倒入过滤管(内置10μM过滤膜)，过滤管扣上螺口接头，将注射器与螺口接头上端的连接管结合，对匀浆施加气压压力进行过滤，滤液直接压进吸附管内。
(3)吸附。用注射器施加气压压力过滤滤液，再向吸附管中加入400μL缓冲液Ⅰ，用注射器施加气压压力过滤吸附；再向吸附管中加入200μL缓冲液Ⅱ，用注射器施加气压压力过滤吸附，弃滤液。
(4)回收DNA。擦干吸附管外残留液体，移到新的1.5mL离心管上。向吸附柱内加入100μL DNA洗脱缓冲液，用注射器过滤，滤液为所提取的DNA。
同时为了比较和验证本发明的快速DNA提取的效果，相同材料也用植物DNA提取试剂盒DNeasy Plant Mini Kit提取DNA，用作后续的验证与比较。
1.2.2引物和探针的设计与合成
根据转基因大豆SHZD32-1左边界侧翼序列信息，利用Primer Premier5.0软件分析侧翼序列的GC含量，分别在***位点的两侧即分别在大豆基因组和外源***片段的不同区域各设计4条引物，引物长度为30～35bp。探针序列包含大豆基因组及外源***序列，用FAM-dT代替探针第29个碱基T，用BHQ1-dT代替第34个碱基T，用四氢呋喃(THF)碱基类似物代替第31个碱基A。
同时设计通用植物内源18S的普通RPA和普通PCR引物，转基因大豆SHZD32-1的普通PCR引物和荧光定量PCR引物引用国家标准，各引物和探针配置为10μmol/L。引物和探针由上海生工生物工程有限公司合成。引物与探针信息如下。
(1)本发明设计的RPA与探针
Figure BDA0002777591380000091
Figure BDA0002777591380000101
(SEQ ID NO.9经修饰后序列为：tgttgctaagcacatgcattttaacgaa/FAM-dT/t/THF/at/BHQ1-dT/cgggggatctgg-C3 Spacer)
(2)本发明设计的通用植物内源18S的普通RPA和普通PCR引物
引物名称 序列(5’～3’) 编号
RPA-18S-F TCCTATTGTGTTGGCCTTCGGGATCGGAGTA SEQ ID NO.10
RPA-18S-R GATCCCTGGTCGGCATCGTTTATGGTTGAGA SEQ ID NO.11
PCR-18S-F CGGGATCGGAGTAATGATTAA SEQ ID NO.12
PCR-18S-F CCTGGTGGTGCCCTTCCGTCA SEQ ID NO.13
(3)转基因大豆SHZD32-1的普通PCR引物和荧光定量PCR引物(国家标准)
引物名称 序列(5’～3’) 编号
SHZD32-1-pF GAGCAGCTTGAGCTTGGA SEQ ID NO.14
SHZD32-1-pR CGAATTTCACCAAAACACTAA SEQ ID NO.15
SHZD32-1-qF TCGTTTCCCGCCATAAGG SEQ ID NO.16
SHZD32-1-qR CATCAACCAAGAGCAACAGCAT SEQ ID NO.17
SHZD32-1-qP FAM-TCCGACCACCACGAGACCGTAGTACA-TAMRA SEQ ID NO.18
1.2.3 RPA反应
参照RPA试剂盒说明书，荧光型RPA反应体系为：
50μL体系：A Buffer 29.4μL；正向、反向引物各2μL；探针0.6μL；DNA模板2μL；ddH2O 11.5μL；充分混匀后加入B buffer 2.5μL。
普通型RPA不需要探针，其他体系与荧光型RPA反应体系一样。
RPA反应条件：所有RPA的反应条件均为39℃扩增20min。
RPA结果判别：荧光RPA分别用两种方法分析，一是利用荧光仪(CFX Connect荧光定量仪，Bio-Rad，美国)在每30s进行一次荧光信号收集，进行实时荧光分析，反应结束使用Bio-Rad CFX Manager 3.1进行数据分析。另一种也本发明中应用的方法，利用荧光灯在扩增结束后照射，进行终端结果直接判别。普通RPA利用凝胶电泳进行结果分析。
普通PCR反应总体积为25μL：10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/L MgCl2 1.5μL，dNTP2.0μL，正向、反向引物各0.2μmol/L，Taq酶0.025U/μL。
普通PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸7min。
荧光PCR反应总体积为25μL：2×qPCR Master Mix 12.5μL，正向、反向引物各0.4μmol/L，探针0.2μmol/L。
荧光PCR反应条件：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环，在60℃退火阶段进行荧光信号收集(CFX Connect荧光定量PCR仪，Bio-Rad，美国)，反应结束使用Bio-Rad CFX Manager 3.1进行数据分析。
1.2.4引物筛查
为获得最佳的引物组合，首先用正向引物F1分别与反向引物R1、R2、R3和R4组合，结合探针对转基因大豆SHZD32-1进行实时荧光RPA检测，再将筛选到的扩增效率最高的反向引物，分别与正向引物F1、F2、F3和F4组合，进行RPA实时荧光检测，选择扩增效率最高的一组引物对作为最终的检测引物组合。
1.2.5 RPA特异性
使用筛选出的引物，分别以转基因大豆SHZD32-1，非转基因大豆，以及转基因大豆A2704-12、A5547-127、356043、GTS40-3-2、FG72，转基因玉米NK603、BT176、T25，棉花LLcotton25、MON15985、GHB119，油菜MS1×RF1、MS1×RF2、OXY235作为模板，进行荧光RPA的扩增，分别进行实时荧光和终端结果分析，验证引物的特异性。
1.2.6 RPA灵敏度
以9个梯度(拷贝数2560，1280，640，320，160，80，40，20和10)的转基因大豆SHZD32-1的DNA做为模板，水作为空白对照。分析荧光型SHZD32-1的灵敏度，同时与普通PCR和荧光PCR的结果比较。
1.2.7实际样品检测
利用建立好的SHZD32-1荧光RPA检测方法，并结合本发明开发的现场DNA快速提取方法。对实际样品(S1～S8)进行检测分析，检测结果与普通PCR和荧光定量PCR的检测结果相比较。
2.结果与分析：
2.1 DNA快速提取结果
利用本发明开发的现场快速提取方法对转基因大豆SHZD32-1的叶片进行快速提取，同时与商业化DNA提取试剂盒(Qiagen)作比较。
提取的DNA的产量和纯度见图2中B、C。
从结果可以看出，本发明中现场快速提取方法获得的DNA的量，无论是4层膜，6层膜还是8层膜，都比Qiagen的试剂盒获得的量多，其中，4层膜获得的DNA量最多。在纯度方面，Qiagen的方法与6层膜和8层膜获得的DNA纯度相当，而4层膜的A260/A280的值大于2.0，可能其中含量盐离子及其它杂质。
为了验证快速提取获得的DNA是否适合后续的分子检测分析，分别利用普通PCR和普通RPA对获得的DNA进行植物内源基因18S的扩增。扩增结果见图2中D、E。从扩增结果来看，本发明开发的DNA现场快速提取方法与商业化试剂盒Qiagen获得的DNA一样，都适合后续PCR和RPA的扩增分析。
2.2荧光RPA引物筛选
图3为RPA引物筛选结果，其中，A为正向引物F1分别与4条反向引物R1、R2、R3、R4组合进行RPA荧光实验的结果，F1/R2组合扩增的效率最高。B为选取下游引物中扩增效果最好的R2与4条上游引物F1、F2、F3、F4组合进行RPA荧光实验，发现依然是F1/R2组合的扩增效率最高，最后选用F1/R2一对引物进行后续试验。
2.3特异性实验结果
图4为本发明选用引物组合F1/R2进行实时荧光RPA的结果和终端荧光检测结果，其中A为实时荧光分析结果，B为终端荧光分析结果。由图4所示，荧光RPA的实时和终端检测结果都表明，只有SHZD32-1的样品有典型的扩增曲线和明显的绿色荧光(B中第一排左起第1个样品)，而其他转基因玉米、油菜、大豆和棉花样品，及非转基因大豆中，均未有扩增，表明SHZD32-1引物和探针具有良好的特异性，可以用于SHZD32-1的检测。
2.4灵敏度实验结果
图5为含SHZD32-1不同拷贝数的DNA在普通PCR(A)，荧光PCR(B)及荧光RPA(C)中的测定结果。从实验结果来看，9个不同浓度的样本都得到扩增，说明了本发明建立的荧光终端RPA检测方法对SHZD32-1的检测灵敏度与普通PCR和荧光PCR的结果相当，都可以达到10拷贝。
2.5实际检测结果
利用本发明开发的DNA现场快速提取方法并结合荧光RPA终端方法，对转基因基地的实际转基因大豆SHZD32-1进行检测，同时用普通PCR和荧光PCR方法进行验证。检测结果如图6所示。结果显示本发明开发的方法能够将4个(2，4，6，8)阳性样品很好的检测出来，检测结果与国家标准的普通PCR和荧光PCR方法一致。
3结论
本发明针对目前缺少转基因大豆现场快速检测方法，开发了一种将DNA现场快速提取和RPA荧光终端检测方法相结合现场快速检测转基因大豆的方法。本方法开发的DNA现场快速提取方法，提取DNA的时间大概在3-5分钟。而建立的SHZD32-1的RPA荧光终端检测方法可以在20分钟完成扩增与结果分析，而且特异强，灵敏度高。整个检测过程可以在30分钟内完成。而传统基于PCR的转基因作物检测方法，提取DNA一般需要1个小时，普通PCR和荧光PCR的扩增也需要2个小时左右。本发明建立转基因大豆SHZD32-1现场快速检测方法有广阔的应用前景。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江省农业科学院
<120> 一种用于检测转基因大豆SHZD32-1的RPA引物和探针组合及现场快速检测方
法
<130> PA20025423
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
caaagtcact cattattgga accctacaca tc 32
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccttcgctgt tgcaactcat tgcacaaaga cc 32
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctacacatcc ccttccccct tcgctgttgc 30
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgtctatttc attaacttta ggatgttgct aa 32
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cttagtatgt atttgtattt gtaaaatact tc 32
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cttctatcaa taaaatttct aattcctaaa ac 32
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
taaaatttct aattcctaaa accaaaatcc ag 32
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
agggttccta tagggtttcg ctcatgtgtt ga 32
<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgttgctaag cacatgcatt ttaacgaatt aattcggggg atctgg 46
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tcctattgtg ttggccttcg ggatcggagt a 31
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gatccctggt cggcatcgtt tatggttgag a 31
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cgggatcgga gtaatgatta a 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cctggtggtg cccttccgtc a 21
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gagcagcttg agcttgga 18
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cgaatttcac caaaacacta a 21
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tcgtttcccg ccataagg 18
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
catcaaccaa gagcaacagc at 22
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tccgaccacc acgagaccgt agtaca 26

Claims (10)

1.一种用于检测转基因大豆SHZD32-1的RPA引物和探针组合，其特征在于，所述引物包括正向引物和反向引物；
所述正向引物和所述反向引物分别选自以下的任一组：
所述正向引物为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述反向引物为SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；
所述正向引物为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述反向引物为SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列；
所述正向引物为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述反向引物为SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；
所述正向引物为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，所述反向引物为SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；或
所述正向引物为SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述反向引物为SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；
所述探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列；其中用连接有荧光基团的T代替探针第29个碱基T，用连接有淬灭基团的T代替第34个碱基T，用四氢呋喃残基THF代替第31个碱基A。
2.根据权利要求1所述的RPA引物和探针组合，其特征在于，所述正向引物为SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列，所述反向引物为SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
3.一种用于检测转基因大豆SHZD32-1的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1或2所述的RPA引物和探针组合。
4.一种用于转基因大豆SHZD32-1的现场快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(A)提取待测样品中的DNA；
(B)以步骤(A)中提取的DNA为模板，用权利要求1或2所述的RPA引物和探针进行RPA扩增反应；
(C)分析RPA扩增产物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(A)包括：样品快速研磨、过滤、吸附以及回收DNA的步骤；优选的，所述过滤、吸附以及回收DNA的步骤采用DNA提取装置进行。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述DNA提取装置包括过滤管、吸附管、螺口接头和注射器；
其中，所述过滤管和所述吸附管为下端带有连接管的螺口管，其上端能够与所述螺口接头连接；
所述螺口接头的上端带有连接管，能够与所述过滤管和吸附管的下端连接管以及所述注射器连接。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述吸附管内部设置有吸附膜用于吸附DNA；优选地，所述吸附膜为二氧化硅硅胶膜；更优选地，所述吸附膜为4-8层。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(C)中，通过荧光灯照射直接判别检测结果。
9.根据权利要求4-8中任一项所述的方法，其特征在于，RPA扩增反应的条件为温度为37℃-39℃，扩增反应的时间为15-20min。
10.权利要求1或2所述的RPA引物和探针组合或权利要求3所述的试剂盒在检测在检测转基因大豆SHZD32-1中的应用。
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