CN115704024A - 植物单倍体诱导系的创制方法及mtl基因的等位型突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明通过靶向诱变策略，创建MTL新的等位型，并不是直接使MTL的功能丧失，而是在不同程度上调控了MTL的表达，或者使其个别序列发生变化等，进而提高了结实率和单倍体诱导率。

Description

植物单倍体诱导系的创制方法及MTL基因的等位型突变体及 其应用

技术领域

本发明属于基因工程和作物育种领域，具体涉及植物单倍体诱导系的创制方法及MTL基因的等位型突变体及其应用，其可以提高单倍体诱导系的结实率和诱导率。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)品种的高效选育是提高水稻产量、品质和抗性的关键环节。传统育种中需要6～8个世代连续自交和不断选择才能获得相对稳定的材料,周期较长,难以满足水稻育种需求。双单倍体育种(double haploid,DH)技术只需2个世代就能获得纯系,大大缩短了育种进程,是纯系选育的一次技术革命。单倍体的产生是双单倍体育种的第一步,自然发生单倍体的频率很低,仅为0.1％,无法满足育种的大量需求(Chase SS.Production of homozygous diploids of maize from monoploids.Agron J,1952,44:263–267.)。

在水稻中,利用花药进行离体培养，诱导花药产生愈伤组织再分化成单倍体植株，是产生水稻单倍体的主要方法。但是,水稻的花药培养具有严格的基因型依赖且操作复杂,如籼稻的花药培养能力显著弱于粳稻(胡建林,周黎,郑兴飞,董华林,费震江,查中萍,游艾青,徐得泽.水稻花药离体培养的研究现状与展望.农业科技通讯,2019,(12):57–61)。因此,水稻单倍体的产生一直是制约着水稻双单倍体育种的瓶颈。近年来,在玉米中以生物诱导为基础的DH技术已被国内外种业公司及育种单位广泛应用,成为了与分子标记辅助育种和转基因技术并称的现代玉米三大育种技术。生物诱导产生孤雌生殖单倍体是利用单倍体诱导系作父本,与目标选系基础材料进行杂交,在杂交当代的籽粒上就能获得一定比例的母本血缘单倍体。利用诱导系产生单倍体具有不受基因型依赖、诱导过程简单、成本低廉等优势。在玉米中,诱导单倍体产生的性状受主效QTL控制,其中qhir1(MTL基因)能够解释66％遗传变异(陈绍江.作物育种工程化与工程化育种思考.作物杂志，2013，(6):1–4.)。

在玉米单倍体诱导系中，MTL基因在第4外显子1572～1573之间有个4bp(CGAG)***,造成20个氨基酸移码突变,导致翻译提前终止,产生单倍体诱导功能。MTL在作物中高度保守,利用基因编辑技术已成功在玉米、水稻和小麦中实现以敲除基因MTL为基础的单倍体诱导。先正达公司对籼稻IR58025B中MTL同源基因MTL(Os03g0393900)第1外显子和第4外显子进行编辑，突变体可诱导产生2％～6％的单倍体。王春等对籼粳杂交稻春优84中MTL第4外显子进行编辑后单倍体诱导率为4.44％(Wang C,Liu Q,Shen Y,Hua Y F,Wang J J,LinJ R,Wu M G,Sun T T,Cheng Z K,Mercier R,Wang K J.Clonal seeds from hybrid riceby simultaneous genome engineering of meiosis and fertilization gen es.NatBiotechnol,2019,37:283–286)。水稻中MTL基因不同位点的突变是否会影响单倍体诱导率还有待探索。此外,水稻材料的不同遗传背景对单倍体诱导率的影响也未知,因此获得一个高诱导率的水稻单倍体诱导系对水稻双单倍体育种有着重要的意义。文钦等(水稻单倍体诱导基因MTL突变体的创制与分析，作物学报，2021，47(5):827-836)以粳稻日本晴和籼稻华航48为研究材料,利用CRISPR/Cas9技术对MTL基因启动子区和编码区的多个靶点进行编辑,获得了籼粳背景下不同类型的MTL突变体,进一步分析了不同位点的突变效应,为深入研究水稻孤雌生殖单倍体诱导的机制提供了基础材料。该在文献中是使用CRISPR/Cas9对MTL的启动子区域和编码区进行敲除，启动子区域大片段的缺失突变体无单倍体诱导能力，编码区多个位置敲除突变体均使MTL功能丧失。

杂种优势是生物界一种普遍的现象，被广泛地运用到农作物的品种培育和生产实践中。对于杂种优势在农业生产中的应用，最重要的环节之一是进行杂交种的高效制备。在玉米等雌雄异花的作物中，可以通过人工(或利用机械)去除母本自交系的雄花，以另一自交系(父本)的花粉进行授粉获得杂父种子，其操作相对简单易行，故玉米的杂种优势利用得早，且体系成熟，应用广泛。但也存在有些亲本开花时期不一致，导致在田间无法进行大规模杂交制种的问题。而雌雄同花作物(如水稻小麦等)无法通过去除母本的花粉途径实现大规模制备杂交种子。以水稻为例:目前，在水稻中解决这个问题的途径是利用具有花粉不育特性的植株作为母本，以另一品种为父本提供花粉杂交，即以雄性不育为技术核心的杂种优势利用体系。其中水稻杂种优势的利用又可分为两个技术途径，是以核质互作花粉不有为技术核心的“三系法”杂交技术，二是以受自然光周期、温度调控的光温敏核不育为技术核心的“两系法”杂交技术。

CN109943585B公开了以水稻为例，利用基因突变的方法将杂交种的生殖细胞的减数分列转变为类似有丝***主从而得到与杂交种基因型和染色体倍性一致的配子；再敲除MTL基因，诱导单性生殖，最终获得克隆种子。但是通过敲除MTL基因诱导单倍体存在着两个问题，一是影响结实率，只有10％左右；二是单倍体诱导率不高，只有5％左右。因此，仍然需要进一步探索如何提高单倍体诱导系的结实率和诱导率的方法。

发明内容

之前采取的策略是利用CRISPR/Cas9技术敲除MTL基因使之失活，获得了MTL功能丧失的水稻单倍体诱导系，但发现其结实率和单倍体诱导率均很低。本发明人研究发现通过单碱基编辑器，创建的MTL新的等位型，并不是直接使MTL的功能丧失，而是在不同程度上调控了MTL的表达，或者使其空间结构发生变化等，进而提高了结实率和单倍体诱导率。

本发明人分析了水稻MTL基因的功能结构域，发现其只包含一个磷脂酶结构域(aa32-aa381)。因此，编辑MTL的功能结构域，以期可以提高单倍体诱导系的结实率和诱导率。对此设计了一系列sgRNA靶向整个磷脂酶结构域，获得了一系列基因突变的MTL等位型，实现MTL基因的定向进化，在后代中筛选出可提高结实率和单倍体诱导率的突变类型(相较于MTL的功能缺失突变体)。

本发明提供一种植物单倍体诱导系的创制方法，其特征在于，包括下述步骤：

1)靶向诱变MTL的蛋白结构域区域，优选地是aa32-aa381的磷脂酶结构域区域，使得植物中的MTL的基因发生氨基酸替换突变；

2)获得突变后的MTL等位型的植株；

3)统计获取的MTL等位型的植株的结实率并检测其单倍体诱导率。

具体实施方式中，所述对MTL基因进行突变是利用单碱基编辑器(利用CBE单碱基编辑器、腺嘌呤碱基编辑器ABE)、引导编辑、HDR介导的同源替换突变或者利用物理化学诱变后筛选获得的。

所述对MTL基因进行突变是通过构建含有针对MTL基因上的靶序列而设计的sgRNA的单碱基编辑器载体，转化受体植株。

优选地，所述转受体植株采用基因枪法或农杆菌感染法；更优选地，所述单碱基编辑器载体是农杆菌双元转化载体，进而通过农杆菌感染转化受体植株。进一步地，所述农杆菌感染转化受体植株通过感染受体植株的愈伤组织，再生获得转基因植株而实现。

第2)步获得突变后的MTL等位型的植株具体是，对获得突变后的MTL等位型的植株进行种植即T₀代植株，成熟后收获种子，发苗得到T₁代植株，筛选包含氨基酸突变类型的株系；优选地，进一步包括下述步骤：选取单倍体诱导率提高的突变株，通过筛选获得突变系，以作为后续使用。

具体实施方式中，所述植物是单子叶植物和双子叶植物。更具体地，所述植物选自水稻、玉米、高粱、谷子、大麦、小麦、黑麦、燕麦、荞麦、薏仁、甘蔗、芦笋、竹笋、韭菜、山药、大豆、土豆、豌豆、绿豆、小豆、蚕豆、豇豆、菜豆、小扁豆、蔓豆、鹰嘴豆、木薯、甘薯、油菜、棉花、甜菜、茄子、花生、茶叶、薄荷、咖啡、芝麻、向日葵、蓖麻、苏子、红花、番茄、辣椒、黄瓜、青菜、生菜、菠菜、大蒜、甘蓝、芥菜、茭白、大葱、冬瓜、西葫芦、丝瓜、白菜、萝卜、洋葱、西瓜、葡萄、胡萝卜、花菜、南瓜、烟草、牧草、象草、狼尾草、苏丹草、兰花、百合、郁金香和苜蓿。实施例中虽然提供的水稻，但由于MTL基因在其他作物中具有保守性，因此也可以预期在上述植物中也能适用。

进一步还包括下述步骤，选取单倍体诱导率提高的突变株，通过筛选获得纯合系，以作为后续使用。

本发明还提供MTL基因的等位型突变体，其特征在于，相对于SEQ ID No.1所示的野生型MTL基因存在下述突变之一：

R109C

N108K

R109W

N108K,R109W

R148K

P166F

L54F

A92V

A93V

G231N

V232I

A92V,A93V

V232L

V232I

D65N

G66S

D65N,G66S

R109C

N108K

R109W

N108K,R109W

A129V

R359Q

A360T

R359Q,A360T

R99H。

其中，水稻野生型MTL蛋白氨基酸序列SEQ ID No.7如下：

MAASYSCRRTCEACSTRAMAGCVVGEPASAPGQRVTLLAIDGGGIRGLIPGTILAFLEARLQELDGPDARLADYFDCIAGTSTGGLITAMLAAPGDHGRPLFAASDINRFYLDNGPLIFPQKRCGMAAAMAALTRPRYNGKYLQGKIRKMLGETRVRDTLTNVVIPTFDVRLLQPTIFSTYDAKSMPLKNALLSDICISTSAAPTYLPAHCFQTTDDATGKVREFDLIDGGVAANNPTMVAMTQITKKIMVKDKEELYPVKPSDCGKFLVLSVGTGSTSDQGMYTARQCSRWGIVRWLR。

本发明进一步提供所述的植物单倍体诱导系的创制方法在植物单倍体诱导或植物育种中的应用。以及还提供所述的MTL基因的等位型突变体在植物育种中的应用。

优选地，应用步骤如下：

1)以所述的植物单倍体诱导系的创制方法获得的高诱导率的单倍体诱导系或所述的MTL基因的等位型突变体作父本，优良杂交种作为母本进行杂交，获得单倍体，并进一步进行单倍体加倍，快速选育出纯合自交系，进而用于优良杂交种的组配；进一步地，

2)所述单倍体诱导系结合MiMe技术，获得克隆种子，实现杂种优势固定；或者

3)所述单倍体诱导系与Hi-Edit技术结合，更具体地是，将一个改良目标农艺性状的CRISPR/Cas9载体通过农杆菌介导的转化方法导入到所述的单倍体诱导系中，创制出携带有CRISPR/Cas9载体的单倍体诱导系；之后用携带有CRISPR/Cas9载体的单倍体诱导系做父本与任意品种杂交，筛选出单倍体；然后再依据CRISPR/Cas9的靶位点的测序分析筛选出靶位点被编辑的单倍体；单倍体通过人工或自然染色体加倍成为纯合的经过基因编辑的二倍体植株，从而实现在两代内创制性状改良的商业化水稻品种双单倍体。

其中，所述植物是单子叶植物或双子叶植物，更具体地是水稻、玉米、高粱、谷子、大麦、小麦、黑麦、燕麦、荞麦、薏仁、甘蔗、芦笋、竹笋、韭菜、山药、大豆、土豆、豌豆、绿豆、小豆、蚕豆、豇豆、菜豆、小扁豆、蔓豆、鹰嘴豆、木薯、甘薯、油菜、棉花、甜菜、茄子、花生、茶叶、薄荷、咖啡、芝麻、向日葵、蓖麻、苏子、红花、番茄、辣椒、黄瓜、青菜、生菜、菠菜、大蒜、甘蓝、芥菜、茭白、大葱、冬瓜、西葫芦、丝瓜、白菜、萝卜、洋葱、西瓜、葡萄、胡萝卜、花菜、南瓜、烟草、牧草、象草、狼尾草、苏丹草、兰花、百合、郁金香和苜蓿。

本发明验证植物单倍体诱导系的创制方法的可靠性。发明人通过实验，利用单碱基编辑技术创建了一系列新的MTL基因的等位型，携带这些等位型的水稻结实率和单倍体诱导率发生了不同程度的变化。相较于MTL功能丧失的水稻植株，其中某些携带新的等位型的水稻植株结实率和单倍体诱导率获得了极大地提高。例如，相较于MTL功能丧失突变体，目前已检测的携带MTL等位型的单倍体诱导系的结实率或者诱导率均获得一定的提高，结实率最大提高约10.49倍，单倍体诱导率最大提高约4.67倍。并且这些MTL新的等位型均分布于MTL，因此整个磷脂酶结构域发生氨基酸突变均会提高单倍体诱导系的结实率或诱导率。

附图说明

图1MTL结构域。

图2MTL^1I，MTL^N108K,R109W及MTL^R109C突变体植株的株型图。

图3MTL^R99H突变植株的株型图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的阐述，以期对本发明有更好的理解，但并不构成对本发明的限制。其中未特别指明的具体操作，均是本领域的常规操作方法。

实施例一

1.载体构建

以构建MTL蛋白N108,R109氨基酸位点突变为例详细描述构建过程。

1)A3A-PBE-g1^MTL载体的构建

按照A3A-PBE***(Zong et al.,Nature Biotechnology.2018)对靶序列的要求：前间隔序列邻近基序PAM(Protospacer Adjacent Motif)为NGG，序列长度为22bp，在水稻染色体序列上选择下述特异靶序列，下划线为PAM：

并根据sgRNA引物设计原则，在F向引物和R向引物两端加上酶切连接碱基，设计好的引物命名为g1-F/R。序列如下：

g1-F：ggcgACCGCTTCTACCTCGACAA

g1-R：aaacTTGTCGAGGTAGAAGCGGT

将设计好的g1-F/R在100℃条件下退火5分钟，自然冷却，将退火产物与经BsaI酶切的载体A3A-PBE连接，得到连接产物，将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子。提取转化子的质粒，经测序证明正确，得到载体，命名为A3A-PBE-g1^MTL。

2)pC1300-UBI-Cas9-g0^MTL载体的构建

构建MTL基因敲除植株作为对照。按照CRISPR-Cas9***对靶序列的要求(PAM为NGG，序列长度为22bp，具体方法可参考中国专利ZL201510485573.2)，在水稻染色体序列上选择下述特异靶序列作为敲除MTL的靶位点：

根据sgRNA引物设计原则，在F向引物和R向引物两端加上酶切连接碱基，设计好的引物命名为g0-F/R。序列如下：

g0-F：ggcaGGTCAACGTCGAGACCGGC

g0-R：aaacGCCGGTCTCGACGTTGACC

将设计好的g0-F/R引物在100℃条件下退火5分钟，自然冷却，将退火产物与经过AarI酶切的载体pC1300-UBI-Cas9-gRNA连接，得到连接产物，将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子。提取转化子的质粒，经测序证明正确，得到载体，命名为pC1300-UBI-Cas9-g0^MTL。

2.植株转化：转基因植株的获得

将上述获得的A3A-PBE-g1^MTL以及对照组pC1300-UBI-Cas9-g0^MTL双元载体分别转入根癌农杆菌EHA105中，再通过重组菌分别转入到受体植株-盐稻8号的愈伤组织中，在黑暗处25℃培养3天后，在含有50mg/L潮霉素的选择培养基上筛选抗性转基因植株。筛选抗性愈伤在含有50mg/L潮霉素预分化培养基上培养10天左右。将预分化的愈伤组织转至分化培养基上在光照条件下培养。一个月左右得到抗性转基因植株。转基因植株大田种植(即T₀代植株)，成熟后收获种子，发苗得到T₁代水稻植株。

3.基因型及表型鉴定

利用基因突变检测技术Hi-TOM检测A3A-PBE-g1^MTL以及pC1300-UBI-Cas9-g0^MTL抗性转基因植株的突变类型，筛选纯合氨基酸突变类型的株系MTL^R109C和MTL^N108K,R109W，以及MTL基因突变体MTL^1I(即转化pC1300-UBI-Cas9-g0^MTL的基因编辑株系筛选到的突变体，其中MTL^1I表示在MTL基因组上1425bp位置***了一个T)。进行种植并进行表型观察，统计其自交结实率(图2显示MTL^1I，MT L^N108K,R109W及MTL^R109C突变体植株的株型图)。

将MTL^R109C花粉授予水稻三系不育系中广A进行杂交，进一步在获得的杂交后代中通过流式细胞术筛选单倍体，统计单倍体诱导率；将MTL^N108K,R109W花粉授予水稻三系不育系中广A进行杂交，进一步在获得的杂交后代中通过流式细胞术筛选单倍体，统计单倍体诱导率；作为对照，将MTL^1I花粉授予水稻三系不育系中广A进行杂交，进一步在获得的杂交后代中通过流式细胞术筛选单倍体，统计单倍体诱导率。

其中，流式细胞术鉴定植株倍性的方法和操作如下：裂解缓冲液LB01：Tris363.4mg，Na₂EDTA 148.9mg，Spermine tetrahydrochloride 34.8mg，KCl 1.193g，NaCl 233.8mg，Triton X-100 200μL，定容至200mL，用1M HCl调pH至7.5，在通风橱中加入220μLβ-mercaptoethanol。在超净工作台中用0.22μm的滤头抽滤除菌和分装，在-20℃保存。

碘化丙啶(Propidium iodide,PI)母液(1mg/ml)：称取50mg粉末溶于50mL ddH₂O中；在超净工作台中用0.22μm的滤头抽滤除菌和分装，-20℃保存。

RNase母液(1mg/ml)：称取25mg RNase(IIA Sigma)溶于25mL ddH₂O；在超净工作台中用0.22μm的滤头抽滤除菌和分装；90℃加热15min使其中DNase失活；-20℃保存。

具体操作如下：剪取生长10天大小4-5cm长的新鲜水稻叶片放入玻璃皿中，加入1mL植物裂解缓冲液LB01，用刀片垂直向下快速切碎组织(此操作始终在冰上进行)。吸取培养皿内的裂解液，用50μm尼龙网过滤至离心管中，在管盖上做好样品标记。台式冷冻离心机中，4℃下1,200rpm离心5min。轻轻取出离心管，缓慢吸去上清，加入450μL的LB01、25μL预冷的PI和25μL RNase A(可提前配好混合液)。4℃避光染色10min。BD Accuri C6上机检测。

结实率统计：野生型盐稻8号的结实率为83.73±3.31％，单倍体诱导率为0％；对照MTL^1I的结实率为6.93±2.03％，单倍体诱导率为4.35％；MTL^R109C的结实率为54.88±15.33％，单倍体诱导率为19.44％；MTL^N108K,R109W的结实率为63.26±0.96％，单倍体诱导率为18.07％。相较于对照MTL^1I而言，MTL^R109C和MTL^{N108K，R109W}在结实率和诱导率上有了大的提升。因此，通过突变MTL基因能够提高结实率和单倍体诱导率。

按上述同样的策略和方法，获得其他各种位点单碱基突变(见表1)。同样，根据将构建好的载体通过农杆菌介导的转化法进行转化水稻愈伤组织，随后利用Hi-TOM技术对获得的转基因阳性株系进行突变检测，鉴定并筛选了多种纯合突变的基因编辑株系，统计其结实率。同时，挑选了三系不育系作为母本，纯合突变的基因编辑株系作为父本进行杂交，统计其单倍体诱导率(结果见表1)。

表1纯合突变株系自交结实率和杂交单倍体诱导率统计

由表1可以看出，这些携带MTL新等位型的单倍体诱导系的自交结实率或者杂交单倍体诱导率均较MTL功能丧失突变体较高。而其中以MTL^{N108K，R109W}为例，其自交结实率最大提高约9.13倍，以MTL^R109C为例，其单倍体诱导率最大提高约4.47倍。注意，显示诱导率为0的情况，其突变可能只是影响了MTL的空间结构，但仍然没有使其具备单倍体诱导能力。

实施例二

1.获取诱变材料

利用EMS诱变处理常规水稻品种盐稻8号，将经过EMS诱变的M₀代盐稻8号进行播种。

2.基因型及表型鉴定

选取M₀叶片单株提取DNA，利用Hi-TOM高通量测序分析技术筛选MTL突变植株，筛选到了携带MTL^R99H的突变植株。将该植株进行种植，成熟后收获种子，获得子代M₁。种植M1植株，获得MTL^R99H位点纯合突变植株，进行表型观察，统计其自交结实率(图3显示MTL^R99H突变植株的株型图)。

将MTL^R99H花粉授予水稻三系不育系中广A进行杂交，进一步在获得的杂交后代中通过遗传分子标记(检测到只有母本中广A标记的即为单倍体或双单倍体)筛选单倍体及双单倍体，并进一步用流式细胞术及全基因组测序来确定，统计单倍体诱导率。

流式细胞术鉴定植株倍性的方法和操作与实施例一相同。

结实率统计：野生型盐稻8号的结实率为85.21±3.28％，单倍体诱导率为0；MTL^R99H的结实率为40.93±8.33％，单倍体诱导率为11.2％；相较于实施例一中的对照MTL^1I而言，MTL^R99H在结实率上有了大的提升，在单倍体诱导率上也有大的提高。该实验进一步证明了通过突变MTL基因能够提高结实率和单倍体诱导率，不管用基因编辑还是其他诱变方法都能实现上述目的。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国水稻研究所

<120> 植物单倍体诱导系的创制方法及MTL基因的等位型突变体及其应用

<160> 7

<170> Patent-In 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

accgcttctacctcgacaacgg 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggcgaccgcttctacctcgacaa 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaacttgtcgaggtagaagcggt 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggcaggtcaacgtcgagaccggc 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aaacgccggtctcgacgttgacc 23

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggtcaacgtcgagaccggcagg 22

<210> 7

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

MAASYSCRRTCEACSTRAMAGCVVGEPASAPGQRVTLLAIDGGGIRGLIPGTILAFLEARLQELDGPDARLADYFDCIAGTSTGGLITAMLAAPGDHGRPLFAASDINRFYLDNGPLIFPQKRCGMAAAMAALTRPRYNGKYLQGKIRKMLGETRVRDTLTNVVIPTFDVRLLQPTIFSTYDAKSMPLKNALLSDICISTSAAPTYLPAHCFQTTDDATGKVREFDLIDGGVAANNPTMVAMTQITKKIMVKDKEELYPVKPSDCGKFLVLSVGTGSTSDQGMYTARQCSRWGIVRWLR299

Claims (10)

1.一种植物单倍体诱导系的创制方法，其特征在于，包括下述步骤：

1)靶向诱变MTL的蛋白结构域区域，优选地是aa32-aa381的磷脂酶结构域区域，使得植物中的MTL的基因发生氨基酸替换突变；

2)获得突变后的MTL等位型的植株；

3)统计获取的MTL等位型的植株的结实率并检测其单倍体诱导率。

2.如权利要求1所述的创制方法，其特征在于，所述对MTL基因的突变是通过利用单碱基编辑器、引导编辑、HDR介导的同源替换突变或者利用物理化学诱变后筛选获得的。

3.如权利要求2所述的创制方法，特征在于，所述单碱基编辑对MTL基因的突变是通过构建含有针对MTL基因上的靶序列的单碱基编辑器载体，转化受体植株。

4.如权利要求3所述的创制方法，其特征在于，所述转化受体植株采用基因枪法或农杆菌感染法；优选地所述单碱基编辑器载体是农杆菌双元转化载体，进而通过农杆菌感染转化受体植株；优选地，所述农杆菌感染转化受体植株通过感染受体植株的愈伤组织，再生获得转基因植株而实现。

5.如权利要求1所述的创制方法，其特征在于，第2)步获得突变后的MTL等位型的植株具体是，对获得突变后的MTL等位型的植株或后代进行种植，筛选包含氨基酸突变类型的株系；优选地，进一步包括下述步骤：选取单倍体诱导率和/或结实率提高的突变株，通过筛选获得突变系，以作为后续使用。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物是单子叶植物和双子叶植物。

7.如权利要求1至6任一项所述的创制方法，其特征在于，所述植物选自水稻、玉米、高粱、谷子、大麦、小麦、黑麦、燕麦、荞麦、薏仁、甘蔗、芦笋、竹笋、韭菜、山药、大豆、土豆、豌豆、绿豆、小豆、蚕豆、豇豆、菜豆、小扁豆、蔓豆、鹰嘴豆、木薯、甘薯、油菜、棉花、甜菜、茄子、花生、茶叶、薄荷、咖啡、芝麻、向日葵、蓖麻、苏子、红花、番茄、辣椒、黄瓜、青菜、生菜、菠菜、大蒜、甘蓝、芥菜、茭白、大葱、冬瓜、西葫芦、丝瓜、白菜、萝卜、洋葱、西瓜、葡萄、胡萝卜、花菜、南瓜、烟草、牧草、象草、狼尾草、苏丹草、兰花、百合、郁金香和苜蓿。

8.一种MTL基因的等位型突变体，其特征在于，相对于SEQ ID No.1所示的野生型MTL基因存在下述突变之一：

R109C

N108K

R109W

N108K，R109W

R148K

P166F

L54F

A92V

A93V

G231N

V232I

A92V，A93V

V232L

V232I

D65N

G66S

D65N，G66S

R109C

N108K

R109W

N108K，R109W

A129V

R359Q

A360T

R359Q，A360T

R99H。

9.如权利要求1至7任一项所述的植物单倍体诱导系的创制方法或如权利要求8所述的MTL基因的等位型突变体在植物单倍体诱导或植物育种中的应用，优选地，应用步骤如下：

1)以所述的植物单倍体诱导系的创制方法获得的高诱导率的单倍体诱导系或如权利要求5所述的MTL基因的等位型突变体作父本，优良杂交种作为母本进行杂交，获得单倍体，并进一步进行单倍体加倍，快速选育出纯合自交系，进而用于优良杂交种的组配；

进一步地，

2)所述单倍体诱导系结合MiMe技术，获得克隆种子，实现杂种优势固定；或者3)所述单倍体诱导系与Hi-Edit技术结合，更具体地是，将一个改良目标农艺性状的基因编辑***导入到所述的单倍体诱导系中，创制出携带有改良目标农艺性状的基因编辑***的单倍体诱导系；之后用携带有改良目标农艺性状的基因编辑***的单倍体诱导系做父本与任意品种杂交，筛选出单倍体；然后再依据基因编辑靶位点的测序分析筛选出靶位点被编辑的单倍体；单倍体通过人工或自然染色体加倍成为纯合的经过基因编辑的二倍体植株，从而在遗传转化困难的植物背景中实现目标性状改良。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述植物是单子叶植物和双子叶植物；优选的是：水稻、玉米、高粱、谷子、大麦、小麦、黑麦、燕麦、荞麦、薏仁、甘蔗、芦笋、竹笋、韭菜、山药、大豆、土豆、豌豆、绿豆、小豆、蚕豆、豇豆、菜豆、小扁豆、蔓豆、鹰嘴豆、木薯、甘薯、油菜、棉花、甜菜、茄子、花生、茶叶、薄荷、咖啡、芝麻、向日葵、蓖麻、苏子、红花、番茄、辣椒、黄瓜、青菜、生菜、菠菜、大蒜、甘蓝、芥菜、茭白、大葱、冬瓜、西葫芦、丝瓜、白菜、萝卜、洋葱、西瓜、葡萄、胡萝卜、花菜、南瓜、烟草、牧草、象草、狼尾草、苏丹草、兰花、百合、郁金香和苜蓿。

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