CN105199979A

CN105199979A - 苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis YLX-4及其应用

Info

Publication number: CN105199979A
Application number: CN201510547403.2A
Authority: CN
Inventors: 袁林喜
Original assignee: Suzhou Setek Co Ltd
Current assignee: Ningxia selenium Industry Development Co.,Ltd.
Priority date: 2015-08-31
Filing date: 2015-08-31
Publication date: 2015-12-30
Anticipated expiration: 2035-08-31
Also published as: CN105199979B

Abstract

本发明公开了一种分离自中国湖北恩施硒矿区的渗滤水***中的菌席沉积物的苏云金芽孢杆菌Bacillus？thuringiensis？YLX-4及其应用，该菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC？No:M2013674。该菌种具有嗜硒微生物特征，可在微生物有机硒转化、微生物纳米硒合成、含硒矿石微生物活化、富硒微生物肥料以及硒污染环境修复中具有潜在的应用价值。

Description

苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis YLX-4及其应用

技术领域

本发明涉及一种嗜硒微生物及其应用，尤其涉及一株苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisYLX-4及其在微生物转化合成有机硒、微生物合成纳米硒、微生物活化硒矿石、富硒微生物肥料及硒污染环境修复中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

极端微生物是指适合在极端环境中生活的微生物种属，包括嗜热菌、嗜盐菌、嗜碱菌、嗜酸菌、嗜压菌、嗜冷菌以及抗辐射、耐干燥、抗高浓度金属离子和极端厌氧的微生物(Rothschild&Mancinelli,2001；陈骏等，2006)，目前极端微生物的研究主要在大洋中脊、热泉、盐湖、矿坑排水等区域。在深海洋中脊的热液环境中生活着大量嗜热、嗜压细菌，其在洋中脊的Fe、S、Zn、Cu循环及成矿中扮演着重要的角色(Taylor&Wirsen,1997；Labrenzetal.,2000；Kasama&Murakami,2001；Emerson&Mayer,2002；Kennedyetal.,2003；彭晓彤等，2007；陈顺等，2010)。地质微生物学家对美国黄石公园(Susanetal.,1994,1996)、冰岛(Marteinssonetal.,2001；Thomasetal.,2007)、意大利(Kvistetal.,2005)、中国云南(宋兆齐等，2008；黄秋媛等，2010)等地的众多热泉进行研究，揭示在这些高达70摄氏度以上，有些甚至超过100摄氏度的热泉里面，活跃着大量嗜热微生物——泉古菌，拓展了我们之前对微生物生存极限的想象。而美国犹他大盐湖(盐度2.2％)、死海(盐度2.5％)、里海(盐度(1.7％)等高盐环境中生活着许多抗高渗透压微生物(Antonioetal.,1998；Vreelandetal.,1998；Orenetal.,2001)。位于青海省东北部的中国境内最大的内陆高原咸水湖泊，更由于其独特的沉积环境，成为地质微生物学研究的天然实验室(妥进才等，2005)。酸性矿坑排水中大量存在嗜酸铁氧化菌，如氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)，大量参与Fe、Mn、S等的循环(Baker&Banfield,2003；Fortin&Langley,2005；陆建军等，2005；蒋磊等，2006)，一方面造成广泛的生态问题，另一方面为矿坑排水的治理提供了新的思路(Johnson&Kevin,2003)。即使对于遥远南极的厚厚冰层下封存几百万年之久的冰下湖生命***，我们依然保存着浓厚的兴趣(Bulatetal.,2009,2011)。

可是，很少有人关注富硒极端环境中的微生物组成。这主要是因为硒是地壳中的微量元素，难以成矿或形成极端富硒的环境，极大限制了对嗜硒微生物的研究。

湖北恩施渔塘坝具有世界上唯一的硒矿床，是典型和独特的极端富硒环境，在硒矿区的渗滤水***和硒矿尾矿的渗滤水***中具有高浓度的硒含量，其中水体中的硒含量高达40.0-94.1μg/L，平均值为58.4±16.8μg/L(Zhu&Zheng,2001；Zhuetal.,2008)，是克山病区水体硒含量的330倍(Fordyceetal.,2000)，是世界卫生组织(WHO)推荐饮用水硒含量上限的10倍(Presser,1994)；沉积物中的硒含量高达8.28-82.9mg/kgDW，平均值为26.6±26.8mg/kgDW(Zhu&Zheng,2001；Zhuetal.,2008)，是美国西部沉积物硒含量上限值(1.4mg/kgDW)的19倍(Presser,1994)。目前，仅有朱建明小组对湖北恩施渔塘坝高硒碳质泥岩中的微生物多样性特征进行了初步研究(雷磊等，2009)，并分离了两株具有***盐还原能力的细菌(王明义等，2006)。在发明专利方面，仅有《一种利用微生物发酵生产活化硒矿粉的方法》(ZL201210166664.4)和《一种利用超耐硒微生物制备红色单质硒的方法》(申请号201210167650.6)中利用湖北恩施硒矿物的硒矿渣、土壤进行分离相关耐硒微生物，进而接种到硒矿粉或其他含硒介质中，制备活化硒矿粉或红色单质硒。但发明专利中并未分离纯化相关耐硒微生物，也未鉴定微生物种属和特征。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一株苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisYLX-4及其应用。

本发明的技术方案是：

本发明提供了一株苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisYLX-4，该苏云金芽孢杆菌是从中国湖北恩施硒矿区渗滤水***的菌席沉积物中分离纯化的、具有嗜硒微生物特征的细菌菌株，该苏云金芽孢杆菌的保藏名称为苏云金芽孢杆菌YLX-4(BacillusthuringiensisYLX-4)，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为2013年12月18日，保藏编号为CCTCCNO:M2013674。

该苏云金芽孢杆菌的菌种菌学特征描述如下：

【形态特征】该苏云金芽孢杆菌在28摄氏度的TSA培养基中培养24小时观察到的菌落为红色平滑的圆形，并具有全缘凸面(附图1)；菌株为杆状，大小为3～5×10～15μm(附图2)；并具有伴孢晶体，大小为1×1μm的菱形(附图3)；对该菌株进行革兰氏染色，显示为革兰氏阳性菌。

【嗜硒特征】将该苏云金芽孢杆菌依次分别接入到含硒(以***钠配置)0、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000mg/kg的TSB培养液中，结果显示：在硒浓度≤20mg/kg情况下，细菌生长不受抑制，培养液颜色不呈现明显的红色。在硒浓度≥200mg/kg情况下，培养液颜色开始呈现明显的红色，在2000mg/kg条件下，培养液中的红色依然明显，表明该菌种代谢正常。必须指出的是即使在硒含量高达2000mg/kg的极端条件下，菌种依然能生长，体现出了极端耐硒能力，但是培养液红色已经明显减弱。超过2000mg/kg浓度下，该菌种不能生长。

【16SrRNA基因序列分析】从本发明所述菌株的纯培养物中提取基因组DNA，利用通用引物27f和1492r进行PCR扩增和测序，进一步通过CLUSTALX软件和Mega4.0软件以Neighbour-joining方法构建***进化树(附图4)，进行***发育分析。结果显示菌株属于苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)，命名为苏云金芽孢杆菌YLX-4(BacillusthuringiensisYLX-4)，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为2013年12月18日，保藏编号为CCTCCNO:M2013674。

【生理生化反应特征】该菌株的运动性特征检测显示其运动性良好，菌落颜色呈白色，菌落直径达2～5mm，适宜生长温度为10℃，在温度为4℃或42℃均不能生长，且具有伴孢晶体产生(表1)。

表1菌株运动性及菌落特征

编号

生理特性检测

结果

1	细菌运动性	运动
			2	菌落颜色	白色
3	菌落直径	2-5mm
			4	4℃生长情况	不生长
5	10℃生长情况	生长
			6	42℃生长情况	不生长
7	伴孢晶体	有

本发明还公开了苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisYLX-4在制备微生物转化有机硒的应用。本发明所述苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisYLX-4具有嗜硒微生物特征，在培养液中的可溶态无机硒(Se⁴⁺、Se⁶⁺)含量不超过20mg/L的条件下，可以将无机硒高效转化为含硒氨基酸(如硒甲基硒代半胱氨酸)，进一步可利用这些有机硒作为硒缺乏人群的补硒来源。

本发明还公开了苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisYLX-4在制备微生物转化纳米硒中的应用。本发明所述苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisYLX-4具有嗜硒微生物特征，在培养液中的可溶态无机硒(Se⁴⁺、Se⁶⁺)含量在200mg/kg～2000mg/kg的条件下，可以将无机硒高效转化为纳米硒，该纳米硒的尺寸为100～200nm，进一步可以利用这些具有生物活性的纳米硒作为硒缺乏人群的补硒来源。

本发明还公开了苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisYLX-4在活化含硒矿石中的应用。本发明所述苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisYLX-4具有嗜硒微生物特征，可以对含硒矿石进行微生物活化，产生游离态硒/生物纳米硒，进而使含硒矿石中的不可生物利用硒活化为生物可利用硒，可将天然含硒矿石中生物可利用硒含量提高5～6倍，进一步可以将活化之后的含硒矿石加工为土壤硒改良剂，施用于缺硒土壤中种植富硒农作物。

本发明还公开了苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisYLX-4在制备富硒微生物肥料中的应用。本发明所述苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisYLX-4具有嗜硒微生物特征，可以直接制作为微生物冻干粉，施用到土壤中后复水复活，活化土壤中的硒，提高土壤硒的生物可利用性，从而提高作物对硒的累积效率；也可以与有机肥复合发酵，制成微生物有机肥，施用于土壤中种植富硒农作物。

本发明还公开了苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisYLX-4在硒污染环境修复中的应用。本发明所述苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisYLX-4具有嗜硒微生物特征，当污染水体中硒含量不超过500μg/L时，可以对硒污染环境中的硒进行微生物转化、累积，进一步可以收集这些微生物，一方面大大降低环境中的硒含量，达到修复环境的目的，另一方面可以利用转化、累积的微生物硒，作为微生物有机硒或微生物纳米硒的来源，用于缺硒人群的硒补充来源，其对硒污染水体中硒的清除效率可达50～60％。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：本发明所述苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisYLX-4具有嗜硒微生物特性，可在微生物有机硒转化、微生物纳米硒合成、含硒矿石微生物活化、富硒微生物肥料以及硒污染环境修复中具有潜在的应用价值。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1为本发明所述菌株的形态特征；

图2为本发明所述菌株在显微镜下的形态特征；

图3为本发明所述菌株的伴孢晶体的形态特征；

图4为本发明所述菌株的16SrRNA基因序列的***发育树示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

按照下述步骤进行菌种的筛选分离：

(1)初筛：无菌采集中国湖北恩施渔塘坝硒矿区渗滤水***中的菌席沉积物样品约20g于灭菌处理的25mL的封口瓶中，平行采集3份，带回实验室4℃低温保存。然后在实验室无菌操作台内将3份平行样品进行混合均匀，取5g置于50mL灭菌蒸馏水的锥形瓶中，常温条件下150r/min震荡15min，静置30秒后取1mL菌液梯队稀释到10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，然后接种0.05mL均匀涂布于分离培养基上(分离培养基组成：含硒200μg/kg的TSA，硒源为***钠)，每一处理设置4组重复。常温下培养2-3天，挑取形态典型的单一菌落进行点接纯化2-3次得到纯培养物。

(2)复筛：将(1)中得到的纯培养物依次接入含硒(以***钠配置)0、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000mg/kg的TSB培养液中，在硒浓度≤2000mg/kg条件下，该菌株均能正常生长，表明该纯培养物具有耐硒能力，是需要的嗜硒微生物，将该纯培养物命名为YLX-4，保藏于保藏培养基中。

对上述经复筛得到的苏云金芽孢杆菌进行形态特征观察、分子生物学鉴定和生理生化反应特征测试。

形态特征观察：该苏云金芽孢杆菌在28摄氏度的TSA培养基中培养24小时观察到的菌落为红色平滑的圆形，并具有全缘凸面(附图1)；透射电子显微镜下观察到的菌株为杆状，大小为3～5×10～15μm(附图2)；并具有伴孢晶体，大小为1×1μm的菱形(附图3)；对该菌株进行革兰氏染色，显示为革兰氏阳性菌。

分子生物学鉴定：从本发明所述菌株的纯培养物中提取基因组DNA，利用通用引物27f和1492r进行PCR扩增和测序，进一步通过CLUSTALX软件和Mega4.0软件以Neighbour-joining方法构建***进化树(附图4)，进行***发育分析。结果显示菌株属于苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)，命名为苏云金芽孢杆菌YLX-4(BacillusthuringiensisYLX-4)，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为2013年12月18日，保藏编号为CCTCCNO:M2013674。

生理生化反应特征测试：该菌株的运动性特征检测显示其运动性良好，菌落颜色呈白色，菌落直径达2～5mm，适宜生长温度为10℃，在温度为4℃或42℃均不能生长，且具有伴孢晶体产生(表1)。

实施例1

本发明所述微生物在合成有机硒中的应用。

将本发明所述微生物YLX-4菌株接种到含硒(***钠配置)10mg/L的TSB培养液中，常温下200r/min培养48小时，离心收集菌体和上清液。然后利用液相色谱-原子荧光光谱联用仪(LC-GA-AFS)分别检测上清液和菌体中的硒含量与形态，结果显示上清液中几乎均为Se⁴⁺，而菌体中绝大部分为硒甲基硒代半胱氨酸(SeMeCys)和硒代胱氨酸(SeCys₂)(表2)。这表明YLX-4菌株能在10mgSe/L条件下，将培养液中的无机硒(Se⁴⁺)转化为有机硒(SeMeCys和SeCys₂)，并累积到菌体内。进一步收集菌体可作为动物饲料等的有机硒添加，也可以做进一步的硒代氨基酸纯化原料，作为缺硒人群的有机硒补硒来源。

表2反应体系中上清液和菌体的硒形态特征

注：“-”表示没有检出；“*”表示没有样品。

实施例2

本发明所述微生物在合成有机硒中的应用。

将本发明所述微生物YLX-4菌株接种到含硒(***钠配置)20mg/L的TSB培养液中，常温下200r/min培养72小时，离心收集菌体和上清液。然后利用液相色谱-原子荧光光谱联用仪(LC-GA-AFS)分别检测上清液和菌体中的硒含量与形态，结果显示上清液中几乎均为Se⁴⁺，而菌体中绝大部分为甲基硒代半胱氨酸(SeMeCys)和硒代胱氨酸(SeCys₂)，在菌株的生长平稳期有少部分Se⁴⁺(表3)。这表明YLX-4菌株能在20mgSe/L条件下，将培养液中的无机硒(Se⁴⁺)转化为有机硒(SeCys₂、SeMeCys)，并累积到菌体内。进一步收集菌体可作为动物饲料等的有机硒添加，也可以做进一步的硒代氨基酸纯化原料，作为缺硒人群的有机硒补硒来源。

表3反应体系中上清液和菌体的硒形态特征

注：“-”表示没有检出；“*”表示没有样品。

实施例3

本发明所述微生物在合成纳米硒中的应用。

将本发明所述微生物YLX-4菌株接种到含硒(***钠配置)200mg/L的TSB培养液中，常温下200r/min培养24小时，溶液出现明显的红色、浑浊。培养48小时，离心收集菌体和上清液，发现收集得到的沉淀为红色悬浮物。然后利用液相色谱-原子荧光光谱联用仪(LC-GA-AFS)和原子荧光光谱仪，利用差减法鉴定红色悬浮物的成分几乎为单质硒。此微生物合成的纳米硒可以作为缺硒人群的补硒来源，也可以作为硒肥或动物饲料添加剂。

实施例4

本发明所述微生物在合成纳米硒中的应用。

将本发明所述微生物YLX-4菌株接种到含硒(***钠配置)2000mg/L的TSB培养液中，常温下200r/min培养12小时，溶液出现明显的红色、浑浊。培养48小时，离心收集菌体和上清液，发现收集得到的沉淀为红色悬浮物。然后利用液相色谱-原子荧光光谱联用仪(LC-GA-AFS)和原子荧光光谱仪，利用差减法鉴定红色悬浮物的成分几乎为单质硒。此微生物合成的纳米硒可以作为缺硒人群的补硒来源，也可以作为硒肥或动物饲料添加剂。

实施例5

本发明所述微生物在活化硒矿石中的应用。

将采自湖北恩施硒矿区的硒矿石粉碎到100目，然后测定其总硒含量约为3000mg/kg，进一步通过连续提取方法，测定硒矿石中的水溶态硒约占比1％，可交换态硒约占比3％，铁锰氧化态硒约占比5％，有机结合态硒约占比10％，残留态硒占比约81％。以此硒矿粉为硒源，添加100g该硒矿粉到300mL的TSB培养液中，一组不接种YLX-4(8个平行样)，另一组接种YLX-4(8个平行样)。在室温条件下200r/min培养90天，并按照一定的时间间隔取样检测上清液中的总硒含量(表4)，结果显示接种YLX-4菌株组中明显较对照组有更多可溶态硒进入溶液中，其硒含量是对照组的5～6倍左右。这表明YLX-4菌株可以将硒矿石中不可生物利用硒(如交换态硒、铁锰氧化态硒)转化为生物可利用硒，且效率较高。进一步可利用YLX-4的这个特性对天然硒矿石进行活化，产物可作为土壤硒改良剂，用于缺硒土壤的改良。

表4反应体系上清液中硒含量特征

实施例6

本发明所述微生物在富硒微生物肥料制备中的应用。

将本发明所述微生物YLX-4菌株在TSB培养液中进行50L规模化发酵培养3-5天，进一步采用冻干技术制备微生物冻干粉。该冻干粉可以直接施用到生菜作物根部土壤中，随后浇水可使冻干微生物复水复活。正常栽培30天后收获，检测显示其生菜叶中的硒含量是未施用该微生物冻干粉的生菜叶样品的8-10倍。

实施例7

本发明所述微生物在富硒微生物肥料制备中的应用。

将本发明所述微生物YLX-4菌株接种到有机肥原料中，随后进行正常的有机肥堆肥发酵，获得微生物有机肥。该微生物有机肥施用到生菜根部，正常培养30天后收获，检测显示其生菜叶中的硒含量是未施用该微生物冻干粉的生菜叶样品的5-6倍。

实施例8

本发明所述微生物在硒污染环境修复中的应用。

测定湖北恩施硒矿区渗滤水中总硒含量约为85μg/L，并将其作为硒污染环境水体的代表，将YLX-4菌种接入300mL该水体中(8个平行样)，并加入葡萄糖作为碳源，同时设置对照组，在室温条件下200r/min培养10天，并按照一定的时间间隔取样检测上清液中的总硒含量(表5)，结果显示未接种YLX-4菌株的对照组中溶液中的硒含量基本不变，而接种YLX-4菌株处理组在菌株生长过程中明显将溶液中的硒吸收、利用了，大大降低了溶液中的硒含量，清除率达到50～60％左右。因此，进一步可利用YLX-4的这个特性对天然硒污染地区(如恩施)或人工硒污染环境(如锰冶炼区域)中的水体进行修复处理。

表5反应体系上清液中硒含量特征

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisYLX-4，其特征在于：该苏云金芽孢杆菌的保藏名称为苏云金芽孢杆菌YLX-4(BacillusthuringiensisYLX-4)，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年12月18日，保藏编号为CCTCCNO:M2013674。

2.根据权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisYLX-4，其特征在于：所述苏云金芽孢杆菌的菌株为杆状，菌株大小为3～5×10～15μm，并具有伴孢晶体，该伴孢晶体大小为1×1μm的菱形，菌落为红色平滑的圆形，并具有全缘凸面，革兰氏染色阳性。

3.根据权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisYLX-4，其特征在于：当可溶态硒含量低于20mg/L时，所述苏云金芽孢杆菌能够将该可溶态无机硒吸收转化为有机硒；当可溶态硒含量为200～2000mg/L时，所述苏云金芽孢杆菌能够将该可溶态无机硒转化为具有生物活性的纳米硒，且该纳米硒尺寸为100～200nm。

4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisYLX-4的应用，其特征在于：所述苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisYLX-4在制备微生物转化有机硒的应用。

5.根据权利要求4所述的苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisYLX-4的应用，其特征在于：所述苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisYLX-4在可溶态硒含量低于20mg/L时，能够将该可溶态无机硒吸收转化为有机硒。

6.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisYLX-4的应用，其特征在于：所述苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisYLX-4在制备微生物转化纳米硒中的应用。

7.根据权利要求6所述的苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisYLX-4的应用，其特征在于：所述苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisYLX-4在可溶态硒含量为200～2000mg/L时，能够将该可溶态无机硒转化为具有生物活性的纳米硒。

8.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisYLX-4的应用，其特征在于：所述苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisYLX-4在活化含硒矿石中的应用。

9.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisYLX-4的应用，其特征在于：所述嗜硒微生物在制备富硒微生物肥料中的应用。

10.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisYLX-4的应用，其特征在于：所述苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisYLX-4在硒污染环境修复中的应用。