CN105199400A

CN105199400A - 一种β-环糊精修饰的聚酰胺-树状大分子及其纳米金颗粒复合物的制备方法

Info

Publication number: CN105199400A
Application number: CN201510621945.XA
Authority: CN
Inventors: 史向阳; 邱洁茹; 孔令丹; 曹雪雁
Original assignee: Donghua University
Current assignee: Donghua University; National Dong Hwa University
Priority date: 2015-09-25
Filing date: 2015-09-25
Publication date: 2015-12-30

Abstract

本发明涉及一种β-环糊精修饰的聚酰胺-树状大分子及其纳米金颗粒复合物的制备方法。制备方法包括：将分别溶有β-CD和CDI的DMSO溶液混合，反应后加入G5PAMAM的DMSO溶液，室温搅拌3d，透析，冷冻干燥，得到G5.NH₂-β-CD；在得到的G5.NH₂-β-CD溶液中加入HAuCl₄·4H₂O溶液，搅拌后加入NaBH₄溶液，搅拌2-4h，透析，冷冻干燥，即得目的复合物{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-β-CD}。本发明制备的复合物是一种良好的基因载体，能成功负载pDNA转染人胚肾细胞并进行表达，转染条件温和，易于操作，转染效率高，在基因治疗等生物医学方面具有良好的应用前景。

Description

一种β-环糊精修饰的聚酰胺-树状大分子及其纳米金颗粒复合物的制备方法

技术领域

本发明属于聚酰胺-树状大分子及其纳米金颗粒复合物的制备方法领域，特别涉及一种β-环糊精修饰的聚酰胺-树状大分子及其纳米金颗粒复合物的制备方法。

背景技术

基因治疗是一种将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿由基因缺失或异常引起的疾病，从而达到治疗某种疾病目的的一种结合了现代医学与分子生物学的新技术。而目前基因治疗应用方面最缺乏的就是能将目的基因运载至各种细胞、组织和器官中的安全有效的载体，当前用作基因治疗的载体主要有病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体转染效率高，但其免疫原性高、毒性大、目的基因容量小、靶向性差、制备过程复杂和成本较高等限制了其的临床应用。而非病毒载体由于其制备简单、成本低、安全性高、无免疫原性及低细胞毒性等优点，受到越来越多的关注。

常用的非病毒载体主要有阳离子脂质体、阳离子聚合物、壳聚糖聚合物载体和无机纳米粒子载体等。其中，阳离子聚合物中的树状大分子由于其独特的高度支化三维立体结构，如其表面拥有丰富的氨基基团可供多功能修饰、结构内部空腔可包裹药物分子或其他纳米颗粒使其更易进入细胞等优点，令其成为一种新型的高分子载体被广泛应用于基因传递中。

目前的报道显示，树状大分子的高毒性限制了其在基因转染领域的应用，前期研究以第五代PAMAM树状大分子为模板，按不同的摩尔比包裹纳米金颗粒构建基因载体，实验结果证明这种包裹了纳米金颗粒的树状大分子是一种比较理想的高效且低毒性基因载体[Shan,Y.,Luo,T.,etal.,Genedeliveryusingdendrimer-entrappedgoldnanoparticlesasnonviralvectors.Biomaterials,2012,33(10):p.3025-3035]。

而树状大分子表面存在的大量氨基使其能进行各种表面化修饰以达到降低树状大分子毒性的同时并增加树状大分子基因转染效率的目的，如：聚乙二醇化[史向阳，侯文秀，郭睿，孔令丹.包裹纳米金颗粒的PEG功能化的PAMAM树状大分子载体的基因转染方法[P].中国专利：201310728846.2，2014-04-09]、乙酰化和烷基化等。Wang等[Wang,H.,N.Shao,etal.,Host-GuestChemistryofDendrimer-CyclodextrinConjugates:SelectiveEncapsulationsofGuestswithinDendrimerorCyclodextrinCavitiesRevealedbyNOENMRTechniques.JournalofPhysicalChemistryB,2012,116(36):p.11217-11224.]实验证明，将环糊精分子共价连接到树状大分子表面，既可以改善阳离子树状大分子的生物相容性，又能增加其水溶性，同时可以增强树状大分子-环糊精复合物的细胞摄入。

检索国内外相关文献和专利结果表明：以β-CD修饰的树状大分子及其纳米金颗粒为载体，用于人胚肾细胞(293T)基因转染的方法，尚未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种β-环糊精修饰的聚酰胺-树状大分子及其纳米金颗粒复合物的制备方法，该方法制备过程简单，实验条件温和，易操作。该方法得到的复合物具有良好的基因转染表达结果，在基因治疗等生物医学方面中有良好的应用前景。

本发明的一种β-环糊精修饰的聚酰胺-树状大分子及其纳米金颗粒复合物的制备方法，包括：

(1)将分别含有β-环糊精β-CD和N,N’-羰基二咪唑CDI的DMSO溶液混合，反应6h，逐滴加入第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH₂(命名为Q0)的DMSO溶液，室温搅拌3d，得到G5.NH₂-β-CD溶液，透析，冷冻干燥，得到G5.NH₂-β-CD；其中，CDI与β-CD的摩尔比为10:1，β-CD与树状大分子的摩尔比为25:1；

(2)在步骤(1)得到的G5.NH₂-β-CD溶液中加入HAuCl₄·4H₂O溶液，搅拌20-30min，加入NaBH4溶液，搅拌2-4h，得到{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-β-CD}溶液，透析，冷冻干燥，得到{(Au⁰)₂₅-G5.NH2-β-CD}，命名为Q2；其中HAuCl₄·4H₂O与树状大分子的摩尔比为25:1，NaBH₄与HAuCl₄·4H₂O的摩尔比为5:1。

所述步骤(1)中β-CD溶液的浓度为14.5mmol/mL；CDI溶液的浓度为145mmol/mL；第五代聚酰胺-胺树状大分子溶液的浓度为0.58mmol/mL。

所述步骤(2)中HAuCl₄·4H₂O溶液的浓度为30mg/mL，NaBH4溶液的浓度为10mg/mL。

所述步骤(1)和步骤(2)中的透析为透析袋截留分子量为14000；用去离子水透析2-3d，每天3次，每次2L去离子水。

在G5.NH₂溶液中，按照步骤(2)的过程，制备得到{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂}，命名为Q1。

所述步骤(2)中{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-β-CD}作为载体应用于人胚肾细胞293T基因转染。

所述{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-β-CD}作为载体应用于人胚肾细胞293T基因转染的方法包括：

按照不同的树状大分子的伯氨基与pDNA骨架上磷酸基团摩尔比，即N/P比，取β-环糊精修饰的聚酰胺-树状大分子及其纳米金颗粒复合物用无菌水稀释，并用无菌水稀释相应质粒，然后混合均匀，37℃孵育30min，得到不同N/P比的功能化聚酰胺-胺树状大分子及其内部包裹纳米金颗粒的载体/pDNA复合物；其中，N/P比分别为1:1、2.5:1、5:1和10:1；将293T细胞于37℃、5％CO2培养24h，更换无血清的DMEM培养基，加入不同N/P比的功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米金颗粒载体/pDNA复合物溶液，37℃培养，4h后更换含10％FBS的DMEM培养基，继续培养24-48h。

所述相应质粒为带有荧光素酶基因Luc的质粒或带有增强的绿色荧光蛋白EGFP基因的质粒。

本发明将β-CD接枝到末端为氨基的第五代聚酰胺-胺树状大分子表面，可以中和部分表面氨基以降低材料对细胞的毒性，从而提高材料的生物相容性。

本发明将HAuCl₄·4H₂O加入到聚酰胺-胺树状大分子溶液中后，快速搅拌20-30min，能够使HAuCl₄·4H₂O与树状大分子充分混合，再快速加入NaBH₄还原得到金纳米颗粒，避免了金纳米颗粒的聚集。

本发明以β-CD修饰聚酰胺-胺树状大分子及其纳米金颗粒复合物为载体，负载pDNA，转染293T细胞并进行表达。本发明通过核磁共振(¹HNMR)对修饰在树状大分子表面的β-CD数量进行了表征；通过紫外可见光谱(UV-Vis)对包裹在功能化的树状大分子内部的纳米金颗粒进行了表征；通过透射电镜图(TEM)对基因转染载体的大小和形态进行表征；通过凝胶阻滞实验对载体与pDNA形成复合物的能力进行表征；通过水动力学粒径与表面电势对载体/pDNA复合物的粒径和电势进行了分析；通过MTT法测试材料对细胞的毒性；通过同时带有荧光素酶报告基因(Luc)和增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)的pDNA对载体的基因转染能力进行测定。

有益效果

(1)本发明制备的β-CD修饰的聚酰胺-胺树状大分子及其纳米金颗粒复合物具有良好的基因转染效果；

(2)本发明的材料具有制备过程简单，实验条件温和，易操作，在基因传递等生物医学方面有良好的应用前景。

附图说明

图1为实施例1中制备的Q2的核磁共振氢谱图；

图2为实施例1中制备的Q2和对比例1中的Q1的紫外吸收光谱图；

图3为实施例1中制备的Q2的透射电镜图(a)和粒径分布直方图(b)；

图4为实施例2中的载体/pDNA复合物的凝胶阻滞实验电泳图谱；

图5为实施例3中的载体/pDNA复合物的水动力学粒径(a)和电势(b)图；

图6为实施例4中的Q0、Q1和Q2对293T的细胞毒性结果图；

图7为实施例5中的载体/pDNA复合物在不同N/P下对293T的荧光素酶基因转染效率比较图；

图8为实施例6中载体/pDNA复合物在不同N/P下对293T的绿色荧光蛋白基因转染的荧光显微镜图；

图9为本发明中β-环糊精修饰聚酰胺-树状大分子及其纳米金颗粒复合物的制备示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

称取16.46mgβ-CD和23.51mgCDI，分别溶于5mLDMSO中，充分搅拌反应6h。称取第五代聚酰胺-胺树状大分子(G5.NH₂)15.06mg，溶于5mLDMSO中。将上述活化好的β-CD溶液逐滴加入到G5.NH₂溶液中，室温下磁力搅拌，反应3d，得到G5.NH₂-β-CD。将G5.NH₂-β-CD转移至截留分子量为14000的透析袋中，在蒸馏水中透析三天(2L×3)，然后进行冷冻干燥处理，最后将得到的G5.NH₂-β-CD溶于5mL水中，再逐滴加入322.7μLHAuCl₄水溶液(30mg/mL)混合搅拌30min，然后快速的加入445μL的10mg/mL的NaBH₄溶液，反应3h，得到{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-β-CD}溶液。反应结束后，将反应产物{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-β-CD}转移至截留分子量为14000的透析袋中，在蒸馏水中透析三天(2L×3)。然后进行冷冻干燥处理，得到最终干燥产物{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-β-CD}，即Q2。

¹HNMR表征结果如图1所示，在化学位移5ppm左右有一个小的质子峰，它是β-CD分子结构中特征基团的质子峰，根据积分面积可以求出每个{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-β-CD}表面连接了8.4个β-CD分子。UV-Vis结果如图2所示，{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-β-CD}的表面等离子体共振(SPR)峰位于528nm，可知本发明中制备得到了纳米金颗粒。TEM结果如图3所示，{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-β-CD}的形状接近球形并且单分散性较好，平均直径在2.9nm。

实施例2

将G5.NH₂，对比例1和实施例1的方法制备得到的{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂}，{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-β-CD}与pDNA形成复合物，并进行凝胶阻滞实验。配制8孔含有溴化乙锭(0.1μg/mL)的琼脂糖凝胶(1.0％w/v)，室温放置待琼脂糖凝胶凝固。以1μgpDNA为例，分别按照不同N/P(0.25，0.5，1，2，3，4，5)配制载体/pDNA复合物，并以DNAmarker为阳性对照对照。然后将对应的载体/pDNA复合物分别加到琼脂糖凝胶的孔中，电压80V，时间30min。使用凝胶成像仪对DNA在凝胶中的迁移进行分析。结果如图4所示。结果表明，{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂}和{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-β-CD}均可以在较低N/P(N/P＝1)下与DNA很好复合，将DNA阻滞。其中，图4中1为DNAmarker条带即为阳性对照组，其余2-8依次为与不同N/P(0.25，0.5，1，2，3，4，5)配制载体/pDNA复合物；Q0是G5.NH₂。

实施例3

将G5.NH₂，对比例1和实施例1的方法制备得到的{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂}，{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-β-CD}在不同的N/P比条件下(1:1，2.5:1，5:1，10:1)分别与5μgpDNA通过静电作用形成载体/pDNA复合物，使终体积固定在100μL，室温下孵育20min，然后加入1mL去离子水。通过马尔文激光粒度仪(Malvern,ΜK，633nm激光)对其水动力学粒径和表面电势进行了表征，结果如图5所示。结果表明，随着N/P的增加，所有复合物的尺寸及电势均先减少而后稍有增大；在相同N/P下，包裹纳米金颗粒的材料电势比未包裹纳米金颗粒的材料电势要低，而修饰了β-CD的材料电势比未修饰β-CD的材料略高，但所有功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物/pDNA的水动力学粒径和表面电势都在合适的转染范围内，这些说明材料有利于细胞的吸附和内吞，也就有利于载体对目的基因的传递。

实施例4

以人胚肾细胞(293T)为模型细胞来检验G5.NH₂，对比例1和实施例1的方法制备得到的{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂}，{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-β-CD}的细胞毒性。以1.5×10⁴/孔的密度将293T种于96孔板中，培养于添加100U/mL青霉素，100U/mL链霉素和10％FBS的1mLDMEM培养液中，37℃，5％二氧化碳浓度下培养24h。然后将培养基更换为浓度为0nM、100nM、500nM、1000nM、1500nM和2000nM的含G5.NH_2，{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂}和{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-β-CD}的不含血清细胞培养基与细胞共培养4h，后更换培养基继续培养24h，随后加入20μLMTT(5.0mg/ml)溶液，继续培养4h。去除孔中的培养液，每孔加入200μLDMSO，摇床振荡30min，用多功能酶标仪测试吸光值，测试波长570nm。结果如图6所示。结果表明，随着材料浓度的增加，细胞存活率下降，而在同样的浓度下，修饰了β-CD的材料比未修饰β-CD的材料的毒性有所降低，说明β-CD修饰在聚酰胺-胺树状大分子表面后，中和了载体表面部分的氨基，从而降低了其生物学毒性。

实施例5

以携带荧光素酶报告基因的质粒并以人胚肾细胞(293T)为模型细胞来检验G5.NH₂，对比例1和实施例1的方法制备得到的{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂}，{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-β-CD}材料作为载体的基因转染效果。以3×10⁴/孔的密度将293T种于24孔板中，培养于添加100U/mL青霉素，100U/mL链霉素和10％FBS的1mLDMEM培养液中，37℃，5％二氧化碳浓度下培养24h。随后按照N/P比＝1:1,2.5:1,5:1和10:1，制备载体/pDNA复合物，其中每个孔的pDNA的量为1μL。将培养基换成不含FBS的DMEM培养基，再加入上述复合物与细胞共培养4h。然后更换含10％FBS的新鲜DMEM培养基，继续培养24h。将细胞裂解，并通过Promega公司的luciferaseassay来检测荧光素酶活性，结果见图7。结果显示，材料的转染效率均与N/P比有关，当N/P为2.5时，G5.NH₂与{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂}均达到最高转染效率，而当N/P为5时，{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-β-CD}达到最高转染效率且高于G5.NH₂、{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂}最高转染效率，说明亲水分子β-CD的修饰和纳米金颗粒的包裹有效的提高了材料的转染效率。

实施例6

以带有增强的绿色荧光蛋白(EGFP)基因的质粒并以人胚肾细胞(293T)为模型细胞来检验G5.NH₂，对比例1和实施例1的方法制备得到的{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂}，{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-β-CD}材料作为载体的基因转染效果。细胞的培养方法和复合物的制备方法如实施例5所示，采用了携带加强绿色荧光蛋白基因的质粒对细胞进行转染，在转染24h后，采用荧光显微镜观察结果，结果见图8。结果显示，在N/P比为10的时候，{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-β-CD}负载质粒后所表达的绿色荧光蛋白强度最强，这一结果亦表明修饰了β-CD的材料和包裹了金纳米颗粒的材料比没有修饰β-CD的材料和没有包裹金纳米颗粒的材料转染效率高。

对比例1

称取第五代聚酰胺-胺树状大分子(G5.NH₂)15.06mg，溶于5mL水中，再逐滴加入199μLHAuCl₄水溶液(30mg/mL)混合搅拌30min，然后快速的加入274.6μL的10mg/mL的NaBH₄溶液，反应3h，得到{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂}溶液。反应结束后，将反应产物{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂}转移至截留分子量为14000的透析袋中，在蒸馏水中透析三天(2L×3)。然后进行冷冻干燥处理，得到最终产物{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂}，即Q1。

Claims

1.一种β-环糊精修饰的聚酰胺-树状大分子及其纳米金颗粒复合物的制备方法，包括：

(1)将分别含有β-环糊精β-CD和N,N’-羰基二咪唑CDI的DMSO溶液混合，反应6h，逐滴加入第五代聚酰胺-胺树状大分子G5PAMAM的DMSO溶液，室温搅拌3d，得到G5.NH₂-β-CD溶液，透析，冷冻干燥，得到G5.NH₂-β-CD；其中，CDI与β-CD的摩尔比为10:1，β-CD与树状大分子的摩尔比为25:1；

(2)在步骤(1)得到的G5.NH₂-β-CD溶液中加入HAuCl₄·4H₂O溶液，搅拌20-30min，加入NaBH₄溶液，搅拌2-4h，得到{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-β-CD}溶液，透析，冷冻干燥，得到{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-β-CD}；其中HAuCl₄·4H₂O与树状大分子的摩尔比为25:1，NaBH₄与HAuCl₄·4H₂O的摩尔比为5:1。

2.根据权利要求1所述的一种β-环糊精修饰的聚酰胺-树状大分子及其纳米金颗粒复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中β-CD溶液的浓度为14.5mmol/mL；CDI溶液的浓度为145mmol/mL；第五代聚酰胺-胺树状大分子溶液的浓度为0.58mmol/mL。

3.根据权利要求1所述的一种β-环糊精修饰的聚酰胺-树状大分子及其纳米金颗粒复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中HAuCl₄·4H₂O溶液的浓度为30mg/mL，NaBH₄溶液的浓度为10mg/mL。

4.根据权利要求1所述的一种β-环糊精修饰的聚酰胺-树状大分子及其纳米金颗粒复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(2)中的透析为透析袋截留分子量为14000；用去离子水透析2-3d，每天3次，每次2L去离子水。

5.根据权利要求1所述的一种β-环糊精修饰的聚酰胺-树状大分子及其纳米金颗粒复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-β-CD}作为载体应用于人胚肾细胞293T基因转染。

6.根据权利要求5所述的一种β-环糊精修饰的聚酰胺-树状大分子及其纳米金颗粒复合物的制备方法，其特征在于，所述{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-β-CD}作为载体应用于人胚肾细胞293T基因转染的方法包括：

按照不同的树状大分子的伯氨基与pDNA骨架上磷酸基团摩尔比，即N/P比，取β-环糊精修饰的聚酰胺-树状大分子及其纳米金颗粒复合物用无菌水稀释，并用无菌水稀释相应质粒，然后混合均匀，37℃孵育30min，得到不同N/P比的功能化聚酰胺-胺树状大分子及其内部包裹纳米金颗粒的载体/pDNA复合物；其中，N/P比分别为1:1、2.5:1、5:1和10:1；将293T细胞于37℃、5％CO₂培养24h，更换无血清的DMEM培养基，加入不同N/P比的功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米金颗粒载体/pDNA复合物溶液，37℃培养，4h后更换含10％FBS的DMEM培养基，继续培养24-48h。

7.根据权利要求6所述的一种β-环糊精修饰的聚酰胺-树状大分子及其纳米金颗粒复合物的制备方法，其特征在于，所述相应质粒为带有荧光素酶基因Luc的质粒或带有增强的绿色荧光蛋白EGFP基因的质粒。