CN110302178B - 一种负载药物的递送纳米平台及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种负载药物的递送纳米平台及其制备方法和应用。该平台组分为：G5‑CD/Ad‑G3纳米粒子和miRNA 21i；或G5‑CD/Ad‑G3纳米粒子、DOX和miRNA 21i。该平台制备过程容易操作，工艺简单，可以简单、高效的转染基因和负载抗癌药物，在基因治疗和化疗联合治疗中有良好的应用前景。

Description

一种负载药物的递送纳米平台及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因治疗和化疗纳米材料及其制备和应用领域，特别涉及一种负载药物的递送纳米平台及其制备方法和应用。
背景技术
目前，纳米医学通过各种新型纳米技术方法为诊断、预防、治疗和根除危及生命的疾病提供了新的手段。各种纳米平台，如脂质体、纳米颗粒(NPs)、树状大分子、聚合物胶束、纳米凝胶、碳纳米管和量子点已经被广泛用于癌症的成像和治疗。树状大分子是一类高度支化的、三维立体结构的单分散大分子，具有从核心以迭代方式向外延伸的树枝状楔形物。树状大分子独特的物理、化学和生物学特性为人类健康纳米医学的发展提供了重要手段。聚酰胺胺(PAMAM)树状大分子具有与蛋白质相似的结构，并且由于其良好水溶性、非免疫原性和易官能化等特点已被广泛应用于生物医学研究领域。研究表明，可以利用树状大分子为平台装载不同的治疗药物以构建具有治疗癌症功能的纳米***。
一般而言，和低代树状大分子相比，高代树状大分子具有更高的基因转染效率和药物上载率，但高代PAMAM树状大分子的合成耗时且繁琐，因而限制了其进一步的生物医学应用 (Hawker,C.J.et al.J.Am.Chem.Soc.1990,112,7638-7647)。Tomalia等人利用高代树状大分子作为核，在其表面化学偶联低代树状大分子为壳，得到的核壳结构树状大分子(core-shell tecto dendrimer,CSTD)显示出与高代树状大分子相似的结构(Freemantle,M.Chem.Eng.News 1999,77,27-36；Uppuluri,S.et al.Adv.Mater.2000,12,796-800)。但是这种CSTD一般是采用氨基末端的高代树状大分子为核，通过1-乙基-3(-3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC) 偶联化学与羧基封端的低代树状大分子反应。上述方法不能用于表面为氨基的低代树状大分子作为壳合成CSTD。尽管华东师范大学的程义云等人和国外Tsourkas课题组采用分子间连接制备成团簇型树状大分子，可以改善肿瘤的MR成像和基因转染效率，但是由树状分子间偶联形成的团簇型树状大分子的大小难以控制(Cheng,Z.L.Angew.Chem.,Int.Ed.2010,122, 356–360；Liu,H.M.et al.J.Am.Chem.Soc.2012,134,17680-17687)。因此，寻找合成结构精准的超结构树状大分子的新方法，特别是CSTDs的合成，对于其纳米药物应用至关重要。近年来，超分子***的研究得到了人们广泛的关注。其中，环糊精(CD)和金刚烷(Ad)之间的超分子主客体相互作用已被普遍用于构建超分子结构，如用于构建基于主客体的超分子自组装的 CSTD[1]。在前期的工作中，沈等人在第5代氨基封端的PAMAM树状大分子表面部分修饰β-CD，在第3代氨基封端的PAMAM树状大分子表面部分修饰Ad，通过β-CD和Ad的主客体识别，G5-CD/Ad-G3CSTD可以被成功合成出来。和单独的G5-CD或Ad-G3树状大分子相比，其基因传递效率分别提高了20倍和170倍(ChenF.et al.J.Mater.Chem.B,2017,5, 8459)。
发现用于整合不同治疗元素的新型纳米平台开展有效的肿瘤联合治疗，是当前肿瘤治疗的新策略。众所周知，microRNA(miRNA)控制生物过程，例如细胞增殖、分化、血管生成和细胞凋亡。miRNA在某些条件下可以作为致癌基因发挥作用，参与TNBC在内的多种癌症的发生。例如，miRNA-21在几种肿瘤中会出现高度过表达的现象。miR-21的异常表达可通过调节磷酸酶和张力蛋白同系物(PTEN)的表达以及参与介导细胞生长、迁移和侵袭的表型特征的PTEN依赖性途径，来促进肿瘤的生长和扩散。几种miRNA在TNBC生物学中起着至关重要的作用，为其潜在的治疗应用提供了实验基础(Carson,A.R.et al.Cancer Res.2012,72,6191-6199)。有意思的是miRNA-21通过靶向PTEN促进TNBC的增殖和侵袭。因此， miRNA-21抑制剂，即miRNA-21逆转录寡核苷酸(miRNA-21i)可特异性地降低肿瘤细胞如人乳腺癌MDA-MB-468细胞(TNBC模型)的增殖。因此，应用负载miRNA抑制剂和抗癌药物的共递送纳米平台对癌症(特别是TNBC)进行联合治疗是一种创新型的治疗方法。
检索国内外相关文献和专利结果表明：以超分子自组装形成的核壳树状大分子用于 microRNA 21抑制剂和多柔比星共递送的方法，尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种负载药物的递送纳米平台及其制备方法和应用，以填补现有技术的空白。
本发明提供一种负载药物的递送纳米平台，所述平台组分为：G5-CD/Ad-G3纳米粒子和 miRNA 21i，所述G5-CD/Ad-G3纳米粒子和所述miRNA 21i的N/P比为0.125:1～15:1。
本发明还提供一种负载药物的递送纳米平台，所述平台组分包括：G5-CD/Ad-G3纳米粒子、DOX和miRNA 21i，所述G5-CD/Ad-G3纳米粒子与所述DOX的摩尔比为1:8～11，所述G5-CD/Ad-G3纳米粒子与所述miRNA 21i的N/P比为0.125:1～15:1。
本发明还提供一种负载药物的递送纳米平台的制备方法，包括：
(1)将金刚烷乙酸Ad-COOH分散在DMSO中，加入EDC·HCl和NHS溶液活化，将得到的活化的Ad-COOH溶液加入到G3.NH2溶液中反应，透析、冻干处理，得到G3-Ad；
(2)将β-CD分散在DMSO中，逐滴加入CDI溶液反应，将得到的活化的CD溶液加入到G5.NH2溶液中，继续反应，透析、冻干处理，得到G5-CD；
(3)将步骤(1)中G3-Ad和步骤(2)中G5-CD分别用超纯水溶解后混合，反应，透析、冻干处理，得到G5-CD/Ad-G3，其中G5-CD与Ad-G3的摩尔比为1:8～11；
(4)将步骤(3)中G5-CD/Ad-G3与miRNA 21i进行孵育，得到G5-CD/Ad-G3/miRNA21i 复合物；
或者将步骤(3)中G5-CD/Ad-G3溶于水中，与去质子化的DOX.HCl溶液混合，敞口反应，离心处理，取上清液进行冻干处理，将得到的G5-CD/Ad-G3/DOX复合物与miRNA 21i进行孵育，得到G5-CD/Ad-G3/DOX/miRNA 21i复合物；
其中G5-CD/Ad-G3或G5-CD/Ad-G3/DOX复合物与miRNA 21i的N/P比为0.125～15:1， G5-CD/Ad-G3与DOX.HCl的摩尔比为1:8～11。
所述步骤(1)中EDC·HCl和NHS溶液的溶剂为DMSO。
所述步骤(1)中Ad-COOH、EDC·HCl、NHS和G3.NH2的摩尔比为1～1.5:10:10:1。
所述步骤(1)中G3.NH2溶液的溶剂为DMSO。
所述步骤(1)中活化温度为室温，活化时间为2～4h。
所述步骤(1)中反应温度为室温，反应时间为2～4d。
所述步骤(1)中G3-Ad于-20℃保存备用。
所述步骤(2)中β-CD、CDI和G5.NH2的摩尔比为25～30:250:1。
所述步骤(2)中G5.NH2溶液的溶剂为DMSO。
所述步骤(2)中反应温度为室温，反应时间为5～7h。
所述步骤(2)中继续反应温度为室温，继续反应时间为58～62h。
所述步骤(2)中G5-CD于-20℃保存备用。
所述步骤(3)中反应温度为室温，反应时间为20～25h。
所述步骤(3)中G5-CD/Ad-G3于-20℃保存备用。
所述步骤(1)、(2)、(3)中透析为：用去离子水透析3d，每天3次，每次4L去离子水，透析袋截留分子量为1000～14000。
所述步骤(4)中G5-CD/Ad-G3与miRNA 21i进行孵育为：将G5-CD/Ad-G3用无菌水稀释，然后用焦碳酸二乙酯DEPC水稀释miRNA 21i，再将稀释后的两种溶液混合均匀后于35～40℃孵育28～32min，即可。
所述步骤(4)中敞口反应为：敞口室温搅拌过夜。
所述步骤(4)中去质子化的DOX.HCl溶液溶剂为甲醇。
所述步骤(4)中将得到的G5-CD/Ad-G3/DOX复合物与miRNA 21i进行孵育为：将G5-CD/Ad-G3/DOX复合物用无菌水稀释，然后用焦碳酸二乙酯DEPC水稀释miRNA 21i，将稀释后的G5-CD/Ad-G3/DOX复合物和miRNA 21i混合均匀后于35～40℃孵育28～32min，即可。
所述步骤(4)中N/P比为G5-CD/Ad-G3或G5-CD/Ad-G3/DOX上的伯氨基与miRNA 21i骨架上磷酸基团摩尔比。
所述步骤(4)中miRNA 21i的规格为10OD。
所述步骤(4)中离心处理时间为10min，转速为7000rpm。
本发明还提供一种上述递送纳米平台在制备治疗癌症药物中的应用。例如制备抑制特异性癌基因和癌细泡化疗药物。
本发明以第五代PAMAM树状大分子(G5.NH2)为核，以第三代PAMAM树状大分子(G3.NH2)为壳，通过β-CD和Ad之间的主客体识别作用，超分子自组装形成CSTD。合成的CSTD将作为纳米平台在其内部包封抗癌药物多柔比星(阿霉素，doxorubicin,DOX)，同时利用静电相互作用缩miRNA-21i。以期达到超分子自组装形成的核壳树状大分子用于microRNA 21抑制剂和多柔比星共递送的目的，药物上载效率高，转染条件简单，转染效率高等优点，在肿瘤的化疗和基因联合治疗中有良好的应用前景。
本发明以G5-CD/Ad-G3作为纳米平台负载基因miRNA 21i和抗癌药物DOX，以 MDA-MB-231细胞(人源三阴性乳腺癌细胞)作为治疗细胞，实现对癌细胞的化疗和基因治疗。本发明通过核磁共振(1H NMR)、Zeta电势及动态光散射(DLS)、2D NOESY、定氮实验等方法表征制备的G5-CD/Ad-G3纳米材料；采用凝胶阻滞实验确定合适的N/P比；利用 CCK-8法来评价纳米材料的细胞毒性；利用流式细胞仪、共聚焦显微镜来评价该纳米材料的基因转染效率和胞内定位情况；并采用RT-PCR和Western Blot来评价miRNA 21i抑制的基因表达效果和相关靶基因表达情况；紫外可见吸收光谱(UV-Vis)确定抗癌药物上载率和体外药物动力学释放效率；流式细胞仪、共聚焦显微镜来评价该纳米材料的药物吞噬效果和胞内定位，IC50评价修饰了基因和抗癌药物的纳米材料对癌细胞的治疗效果。实验结果分别如下：
(1)1H NMR测试结果
1H NMR图谱用于表征Ad对G3表面的修饰、β-CD对G5表面的修饰以及Ad-G3对G5-CD表面的修饰。参见说明书附图2a：在化学位移1.48-1.9ppm处有Ad的质子峰，在化学位移2.2-3.4ppm处有G3的特征亚甲基质子峰，根据积分面积可以计算出G3表面连接了1.1个 Ad分子。参见说明书附图2b：在化学位移3.5-4.1以及5.0ppm处有CD的质子峰，在化学位移2.2-3.4ppm处有G5的亚甲基质子峰，根据积分面积可以计算出G5表面连接了7.55个 CD分子。参见说明书附图2 c：根据CD和Ad的质子峰所对应的积分面积可以计算出G5-CD 表面连接了4.2个Ad-G3分子。
(2)2D NOESY测试结果
2D NOESY用于表征G5-CD/Ad-G3超分子结构的形成，参见说明书附图3：化学位移3.5-4.1ppm处β-CD的内部质子基团与化学位移1.48-1.9ppm处的Ad基团出现了明显的相关交叉信号(灰色区域)，由此可以说明Ad基团与β-CD发生了相互作用，紧密结合。同时证明了主体单元G5-CD与客体单元G3-Ad通过金刚烷与环糊精的主客体作用成功构建出了表面氨基的核-壳结构树状大分子G5-CD/Ad-G3。
(3)凝胶阻滞实验结果：
凝胶阻滞实验用于表征G5-CD/Ad-G3对miRNA 21i的包裹能力，结果如说明书附图4 所示。结果表明，在N/P比大于等于1的时候，G5-CD/Ad-G3能够完全的将miRNA 21i压缩，阻滞miRNA 21i的迁移。
(4)复合物材料水动力学直径和表面电势测定结果
粒径和表面电势测试用于表征G5-CD/Ad-G3/miRNA 21i复合物进细胞的能力，结果如说明书附图5所示。结果表明，在不同的N/P比条件下，复合物的水动力学粒径都大致在200～ 270nm左右，而复合物的表面电势都在25～35mV之间。这说明，尽管高N/P比理论上会消耗更多G5-CD/Ad-G3形成更大的复合物，但一定范围内的N/P比的改变并不能明显改变复合物的粒径和电势，总体粒径和电势呈现稳定状态，这些参数说明材料有利于细胞的吸附和内吞，也就有利于载体对目的基因的传递。
(5)G5-CD/Ad-G3和G5-CD/Ad-G3/miRNA 21i复合物的细胞毒性试验结果
细胞毒性试验用于表征G5-CD/Ad-G3和G5-CD/Ad-G3/miRNA 21i复合物对细胞的毒性，结果如说明书附图6所示，随着材料浓度的增加，细胞存活率下降，但是即使在浓度高达 3000nM的情况下，细胞的存活率依然有60％以上，说明了材料良好的生物相容性。与此同时，材料与miRNA 21i复合后的毒性在一定程度上还有所降低，进而也验证了复合物良好的生物相容性。
(6)miRNA 21i基因转染结果
miRNA 21i基因转染实验用于研究G5-CD/Ad-G3负载miRNA 21i后对MDA-MB-231细胞的转染能力，采用带有Cy3标记的miRNA 21i(Cy3-miRNA 21i)，采用流式细胞仪对结果进行观察，结果见说明书附图7，对照组和单独的miRNA 21i组都未见明显荧光，对于材料组，胞内的荧光强度随着N/P比的增加而增强，在N/P比为10的时候，荧光强度最强，后随着N/P增加到15，荧光强度反而有所降低，这可能是由于随着N/P比增加到一定程度，材料的毒性也随之增加，从而降低了基因的转染效率。
(7)G5-CD/Ad-G3/miRNA 21i复合物胞内定位实验结果
胞内定位实验用于研究G5-CD/Ad-G3负载miRNA 21i后在MDA-MB-231细胞内的分布情况，采用带有Cy3标记的miRNA 21i(Cy3-miRNA 21i)，采用共聚焦显微镜对结果进行观察，结果见说明书附图8，对照组和单独的miRNA 21i组都未见明显红色荧光，对于材料组，胞内的荧光强度随着N/P比的增加而增强，在N/P比为10和15的时候，红色荧光强度明显强于N/P比为2.5和5的时候。而且部分荧光强度在细胞核内也得到检测，说明G5-CD/Ad-G3 成功将基因传递到了细胞质和细胞核中，从而实现后续的基因治疗，这与流式结果保持一致。
(8)G5-CD/Ad-G3/miRNA 21i复合物RT-PCR结果
RT-PCR用于研究G5-CD/Ad-G3负载miRNA 21i后在肿瘤细胞内抑制特异性基因表达及其调控靶基因表达的效果。结果见说明书附图9。结果显示，和未转染的细胞组和单独siRNA 细胞组的细胞相比，G5-CD/Ad-G3/miRNA 21i复合物组中的miRNA 21基因的表达量明显的降低，与对照组相比具有显著性的差异，其对应的四个靶基因PDCD4、p53、Caspase-3、PTEN 的表达均有不同程度的上升，说明G5-CD/Ad-G3是一种优秀的基因载体，能够有效的负载 miRNA 21i抑制MDA-MB-231细胞特异性的基因miRNA 21表达，并调控相关靶基因的表达。
(9)G5-CD/Ad-G3/miRNA 21i复合物Western blot结果
Western blot用于研究G5-CD/Ad-G3负载miRNA 21i后在肿瘤细胞内抑制特异性基因表达后调控其靶基因蛋白表达的效果。结果见说明书附图10，和未转染的细胞组和单独siRNA 细胞组的细胞相比，其对应的四个靶基因PDCD4、p53、Caspase-3、PTEN蛋白的表达均有不同程度的上升，说明G5-CD/Ad-G3是一种优秀的基因载体，能够有效的负载miRNA21i 并调控相关靶基因蛋白的表达。
(10)G5-CD/Ad-G3/DOX复合物体外药物释放实验结果
体外药物释放实验用于研究G5-CD/Ad-G3负载DOX后在pH为5.5和7.4时的释放速率。结果见说明书附图11，结果显示，与单独的DOX相比，G5-CD/Ad-G3/DOX中的DOX释放速率明显减缓，这证明了载体优良的药物缓释特性。而且pH＝5.5时，G5-CD/Ad-G3/DOX中的DOX释放速度比pH＝7.4要快，这说明了酸性微环境中更利于药物的释放。
(11)G5-CD/Ad-G3/DOX/miRNA 21i复合物的细胞毒性试验结果
细胞毒性试验用于表征G5-CD/Ad-G3/DOX/miRNA 21i复合物对细胞的毒性，结果如说明书附图12所示，与单独的DOX相比，复合物的细胞毒性比单独DOX组要小；而与 G5-CD/Ad-G3/DOX组相比，G5-CD/Ad-G3/DOX/miRNA 21i复合物抑制癌细胞增殖的效果较好。
(12)G5-CD/Ad-G3/DOX/miRNA 21i复合物细胞吞噬实验结果
细胞吞噬实验用于研究MDA-MB-231细胞对G5-CD/Ad-G3负载DOX和miRNA 21i后的吞噬能力。DOX自身带有红色荧光，采用流式细胞仪进行观察，结果见说明书附图13，对照组未见明显荧光，对于材料组，随着DOX浓度的增加，荧光强度也随之增加，这说明细胞对G5-CD/Ad-G3/DOX/miRNA 21i材料具有一定的吞噬能力。
(13)G5-CD/Ad-G3/DOX/miRNA 21i复合物胞内定位实验结果
胞内定位实验用于研究G5-CD/Ad-G3负载DOX和miRNA 21i后在MDA-MB-231细胞内的分布情况，DOX自身带有红色荧光，采用共聚焦显微镜对结果进行观察，结果见说明书附图14，对照组未见明显红色荧光，对于材料组，随着DOX浓度的增加，荧光强度在细胞内得到检测，说明G5-CD/Ad-G3成功将DOX传递到了细胞中，从而实现后续的化疗与基因治疗联合治疗。
有益效果
(1)本发明制备了G5-CD、Ad-G3，通过主客体识别超分子自组装合成G5-CD/Ad-G3，通过物理包裹制备了G5-CD/Ad-G3/DOX，并将其与治疗性的miRNA 21i共同孵育。本发明工艺简单，易操作，易于合成纯化，对环境和生物友好。
(2)本发明制备的超分子自组装的核壳结构的G5-CD/Ad-G3具有良好的分散性和生物相容性。体外实验证实G5-CD/Ad-G3/miRNA 21i复合物具有较高的基因转染效率， G5-CD/Ad-G3/DOX/miRNA 21i复合物具有抑制细胞增殖的效果，这说明了制备的 G5-CD/Ad-G3修饰的DOX和miRNA 21i在肿瘤化疗和基因联合治疗中具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为本发明G5-CD/Ad-G3/DOX/miRNA 21i复合物和G5-CD/Ad-G3/miRNA 21i复合物的制备示意图。
图2为本发明实施例1制备的Ad-G3(a)、G5-CD(b)、G5-CD/Ad-G3(c)的一维核磁共振氢谱图；
图3为本发明实施例1制备的G5-CD/Ad-G3的二维核奥弗豪泽增强谱；
图4为本发明实施例1制备的G5-CD/Ad-G3/miRNA 21i的凝胶阻滞实验电泳图谱；
图5为本发明实施例1制备的G5-CD/Ad-G3/miRNA 21i的水动力学直径和电势图；
图6为实施例5通过CCK-8法测试在MDA-MB-231细胞中经过PBS缓冲液(对照)和不同浓度的G5-CD/Ad-G3和G5-CD/Ad-G3/miRNA 21i复合物([G5-CD/Ad-G3]＝0～3000nM, 1μg miRNA 21i)处理24小时后的细胞活力；
图7为实施例6中G5-CD/Ad-G3/Cy3-miRNA 21i复合物在不同N/P下对MDA-MB-231细胞的基因转染图；
图8为实施例7中G5-CD/Ad-G3/Cy3-miRNA 21i复合物在不同N/P下对MDA-MB-231细胞的激光共聚焦显微镜图；
图9为实施例8中G5-CD/Ad-G3/Cy3-miRNA 21i复合物在N/P＝10时RT-PCR图；
图10为实施例9中G5-CD/Ad-G3/Cy3-miRNA 21i复合物在N/P＝10时蛋白印迹分析图；
图11为实施例11中G5-CD/Ad-G3/DOX体外药物释放图；
图12为实施例12通过CCK-8法测试在MDA-MB-231细胞中经过PBS缓冲液(对照) 和不同浓度的DOX.HCl、G5-CD/Ad-G3/DOX复合物和G5-CD/Ad-G3/DOX/miRNA 21i复合物([DOX]＝0.5～50μg/mL)处理24小时后的细胞活力；
图13为实施例13通过流式细胞仪测试MDA-MB-231细胞对本发明制备的G5-CD/Ad-G3 /DOX/miRNA 21i复合物的吞噬能力的评价；
图14为实施例14通过激光共聚焦显微镜图测试MDA-MB-231细胞对本发明制备的G5-CD/Ad-G3/DOX/miRNA 21i复合物的吞噬能力的评价。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)分别称取4.22mg Ad-COOH,41.62mg EDC·HCl，21.98mg NHS，分别溶于5mL的DMSO溶液中，然后将EDC·HCl和NHS溶液逐滴加入到Ad-COOH溶液中，室温搅拌3h。然后称取100mg G3.NH2溶于5mL的DMSO溶液，将得到的活化的Ad-COOH溶液逐滴加入 G3.NH2溶液中，继续反应3天，将得到的产物转移至截留分子量为1000的透析袋中、在蒸馏水中透析三天(4L×3)，然后进行冷冻干燥处理，最后得到干燥的Ad-G3，-20℃保存备用。
(2)分别称取43.64mgβ-CD,62.34mg CDI，分别溶于5mL的DMSO溶液中，然后将CDI溶液逐滴加入到β-CD溶液中，室温搅拌6h。称取40mg G5.NH2溶于5mL的DMSO溶液，将得到的活化的β-CD溶液逐滴加入G5.NH2溶液中，继续反应60h，将得到的产物转移至截留分子量为5000的透析袋中、在蒸馏水中透析三天(4L×3)，然后进行冷冻干燥处理，最后得到干燥的G5-CD，-20℃保存备用。
(3)按摩尔比为10:1的比例分别称取步骤(1)和步骤(2)得到的产物，随后分别用5mL超纯水溶解后混合，磁力搅拌室温反应24h，将得到的产物转移至截留分子量为14000的透析袋中、在蒸馏水中透析三天(4L×3)，然后进行冷冻干燥处理，最后得到干燥的 G5-CD/Ad-G3，-20℃保存备用。
(4)将步骤(3)得到的G5-CD/Ad-G3纳米粒子用无菌水稀释，配制成2mg/mL的水溶液,然后用焦碳酸二乙酯DEPC水稀释miRNA 21i，配制成264μg/mL的溶液，按照不同的N/P比(0.125，0.5，1，2，5，10，15)将G5-CD/Ad-G3水溶液与1μg miRNA 21i进行混合后放入37℃培养箱进行孵育，30min后得到G5-CD/Ad-G3/miRNA 21i复合物。
(5)按摩尔比为10:1的比例分别称取抗癌药物DOX·HCl和步骤(3)得到的G5-CD/Ad-G3纳米粒子。随后G5-CD/Ad-G3溶解于2mL超纯水中，DOX·HCl溶解于300μL甲醇中并加入5μL三乙胺以得到去质子化的DOX。随后将DOX溶液和G5-CD/Ad-G3溶液混合，混合溶液经过敞口过夜搅拌以蒸发掉其中的甲醇溶液，形成的G5-CD/Ad-G3/DOX混合溶液通过离心(7000rpm,10min)以去除未络合上的去质子的DOX沉淀，之后冻干上清液以获得 G5-CD/Ad-G3/DOX复合物。
(6)将步骤(5)得到的G5-CD/Ad-G3/DOX复合物用无菌水稀释，配制成2mg/mL的水溶液,然后用焦碳酸二乙酯DEPC水稀释miRNA 21i，配制成264μg/mL的溶液，按照N/P＝10将G5-CD/Ad-G3水溶液与miRNA 21i进行混合后放入37℃培养箱进行孵育，30min后得到G5-CD/Ad-G3/DOX/miRNA 21i复合物。
实施例2
对实施例1步骤(1)，步骤(2)，步骤(3)制备的Ad-G3，G5-CD，G5-CD/Ad-G3进行核磁表征，1H NMR表征结果如说明书附图2a所示，在化学位移1.48～1.9ppm处有质子峰，它是Ad分子结构中的特征基团质子峰，根据和G3.NH2之间的积分面积比，可以计算得出每个G3.NH2上连接了1.1个Ad分子。说明书附图2b所示，在化学位移3.5-4.1以及5.0ppm 处有CD的质子峰，在化学位移2.2-3.4ppm处有G5的亚甲基质子峰，根据积分面积可以计算出G5表面连接了7.55个CD分子。参见说明书附图2c：根据CD和Ad的质子峰所对应的积分面积可以最终计算出G5-CD表面连接了4.2个Ad-G3分子。2D NOESY用于表征 G5-CD/Ad-G3超分子结构的形成，参见说明书附图3：化学位移3.5-4.1ppm处β-CD的内部质子基团与化学位移1.48-1.9ppm处的Ad基团出现了明显的相关交叉信号(灰色区域)，由此可以说明Ad基团与β-CD发生了相互作用，紧密结合。同时证明了主体单元G5-CD与客体单元G3-Ad通过金刚烷与环糊精的主客体作用成功构建出了表面氨基的核-壳结构树状大分子G5-CD/Ad-G3。
实施例3
将实施例1步骤(4)中制备的G5-CD/Ad-G3/miRNA 21i复合物进行凝胶阻滞实验。配制8孔含有溴化乙锭(1mg/mL)的琼脂糖凝胶(1.0％w/v)，室温放置待琼脂糖凝胶凝固。siRNA量为1μg/孔，按照不同N/P比0、0.125、0.25、0.5、1、2和5分别配制G5-CD/Ad-G3 /miRNA 21i复合物，孵育30min，并以裸miRNA 21i为对照。然后将对应的G5-CD/Ad-G3 /miRNA 21i复合物分别加到琼脂糖凝胶的孔中，电压80V，时间30min。使用凝胶成像仪对miRNA 21i在凝胶中的迁移进行分析。结果如说明书附图4所示。结果表明，在N/P比大于等于1的时候，G5-CD/Ad-G3/miRNA 21i能够完全的将miRNA 21i压缩，阻止miRNA 21i 电迁移。
实施例4
将实施例1步骤(4)的方法制备的G5-CD/Ad-G3/miRNA 21i复合物用超纯水进行稀释，得到浓度为1mg/1mL的溶液，通过马尔文激光粒度仪(Malvern,ΜK，633nm激光)进行水动力学直径和表面电势表征。结果如说明书附图5所示，在不同的N/P比条件下，复合物的水动力学粒径都大致在200～270nm左右，而复合物的表面电势都在25～35mV之间，这说明，尽管高N/P比理论上会消耗更多G5-CD/Ad-G3形成更大的复合物，但一定范围内的N/P 比的改变并不能明显改变复合物的粒径和电势，总体粒径和电势呈现稳定状态，这些参数说明材料有利于细胞的吸附和内吞，也就有利于载体对目的基因的传递。
实施例5
以MDA-MB-231细胞作为模型细胞来检验实施例1中G5-CD/Ad-G3和G5-CD/Ad-G3/miRNA 21i复合物在不同条件下的细胞毒性，以8×103/孔的密度将种于96孔板中，培养于添加100U/mL青霉素，100U/mL链霉素和10％FBS的100μL DMEM培养液中，37℃， 5％二氧化碳浓度下培养24h。随后将培养基换成10μL G5-CD/Ad-G3浓度分别为0、100、 200、500、1000、2000和3000nM的溶液，并且G5-CD/Ad-G3/miRNA 21i复合物溶液中 miRNA 21i添加量均为1μg，随后加入90μL培养基，与细胞共培养24h。将培养液倒掉，加入含10μL CCK-8的100μL DMEM培养基溶液，继续培养4h。用多功能酶标仪测试吸光值，测试波长450nm，结果如说明书附图6所示。结果表明，随着材料浓度的增加，细胞活力下降，但是即使在浓度高达3000nM的情况下，细胞的活力依然有60％以上，而且材料与miRNA 21i复合后的毒性在一定程度上还有所降低，这些都说明了材料良好的生物相容性。
实施例6
以带有Cy3标记的miRNA 21i并以MDA-MB-231细胞为模型细胞来研究G5-CD/Ad-G3负载Cy3标记的miRNA 21i后的基因转染效率。以1×105/孔的密度将MDA-MB-231种于12 孔板中，培养于添加100U/mL青霉素，100U/mL链霉素和10％FBS的1mL DMEM培养液中，37℃，5％二氧化碳浓度下培养24h。随后根据实施例1按照N/P比为1:1、2:1、5:1、 10:1和15:1，制备G5-CD/Ad-G3/miRNA 21i复合物，其中每个孔的miRNA 21i的量为1μg。将培养基换成不含FBS的DMEM培养基，再加入上述复合物与细胞共培养4h。采用流式细胞仪对结果进行观察，结果见说明书附图7。结果显示，对照组和单独的siRNA组都未见明显荧光，对于材料组，胞内的荧光强度随着N/P比的增加而增强，在N/P比为10的时候，荧光强度最强，后随着N/P增加到15，荧光强度反而有所降低，这可能是由于随着N/P比增加到一定程度，材料的毒性也随之增加，从而降低了基因的转染效率。
实施例7
以带有Cy3标记的miRNA 21i并以MDA-MB-231细胞为模型细胞来研究G5-CD/Ad-G3负载Cy3标记的miRNA 21i后的基因转染效率。以1×105/孔的密度将MDA-MB-231种于12 孔板中，培养于添加100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的1mL DMEM培养液中，37℃、5％二氧化碳浓度下培养24h。随后根据实施例1按照N/P比为1:1、2:1、5:1、 10:1和15:1，制备G5-CD/Ad-G3/miRNA 21i复合物，其中每个孔的miRNA 21i的量为1μg。将培养基换成不含FBS的DMEM培养基，再加入上述复合物与细胞共培养4h。采用共聚焦显微镜对结果进行观察，结果见说明书附图8。结果显示，对照组和单独的siRNA组都未见明显红色荧光，对于材料组，胞内的荧光强度随着N/P比的增加而增强，在N/P比为10和 15的时候，红色荧光强度明显强于N/P比为1、2和5的时候。而且部分荧光强度在细胞核内也得到检测，说明G5-CD/Ad-G3成功将基因传递到了细胞质和细胞核中，从而实现后续的基因治疗，这与流式结果保持一致。
实施例8
以带有Cy3标记的miRNA 21i并以MDA-MB-231细胞为模型细胞来研究G5-CD/Ad-G3负载Cy3标记的miRNA 21i后对目的基因及对应靶基因的调控情况。以1×105/孔的密度将MDA-MB-231种于12孔板中，培养于添加100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS 的1mLDMEM培养液中，37℃、5％二氧化碳浓度下培养24h。随后根据实施例1按照N/P 比为10:1，制备G5-CD/Ad-G3/miRNA 21i复合物，其中每个孔的miRNA 21i的量为1μg。将培养基换成不含FBS的DMEM培养基，再加入上述复合物与细胞共培养4h，然后再更换含 10％FBS的新鲜DMEM培养基，继续培养48h，用细胞裂解液裂解细胞，提取细胞内总RNA，通过反转录和荧光定量PCR来检测细胞内miRNA 21以及PDCD4、PTEN、Caspase-3和p53 基因的表达水平。结果见说明书附图9，未转染的细胞组和单独miRNA 21i细胞组的细胞都有较高的miRNA 21基因的表达，而G5-CD/Ad-G3/miRNA 21i复合物组中的miRNA 21基因的表达量明显的降低，与对照组相比具有显著性的差异，并且对应的靶基因PDCD4、PTEN、 Caspase-3和p53基因均有一定程度的升高，这说明G5-CD/Ad-G3是一种优秀的基因载体，能够有效负载miRNA 21i抑制MDA-MB-231细胞特异性的基因表达，进而调控其它靶基因表达。
实施例9
以带有Cy3标记的miRNA 21i并以MDA-MB-231细胞为模型细胞来研究G5-CD/Ad-G3负载Cy3标记的miRNA 21i后对目的基因及对应靶基因的调控情况。以1×105/孔的密度将MDA-MB-231种于12孔板中，培养于添加100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS 的1mLDMEM培养液中，37℃、5％二氧化碳浓度下培养24h。随后根据实施例1按照N/P 比为10:1，制备G5-CD/Ad-G3/miRNA 21i复合物，其中每个孔的miRNA 21i的量为1μg。将培养基换成不含FBS的DMEM培养基，再加入上述复合物与细胞共培养4h，然后再更换含 10％FBS的新鲜DMEM培养基，继续培养48h，用细胞裂解液裂解细胞，提取细胞内总蛋白，通过western blot来检测细胞内PDCD4、PTEN、Caspase-3和p53蛋白的表达水平。结果见说明书附图10。结果显示，以未转染的细胞组为对照，G5-CD/Ad-G3/miRNA 21i复合物组中PDCD4、PTEN、Caspase-3和p53蛋白表达均有一定程度的升高，这说明G5-CD/Ad-G3 是一种优秀的基因载体，能够有效的负载miRNA 21i调控MDA-MB-231细胞一些靶基因的蛋白表达。
实施例10
按摩尔比为10:1的比例分别称取实施例1步骤(3)得到的G5-CD/Ad-G3纳米粒子和抗癌药物DOX·HCl。随后G5-CD/Ad-G3溶解于2mL超纯水中，DOX·HCl溶解于300μL 甲醇中并加入5μL三乙胺以得到去质子化的DOX。随后将DOX溶液和G5-CD/Ad-G3溶液混合，混合溶液经过敞口过夜搅拌以蒸发掉其中的甲醇溶液，形成的G5-CD/Ad-G3/DOX混合溶液通过离心(7000rpm、10min)以去除未络合上的去质子的DOX沉淀，之后冻干上清液以获得G5-CD/Ad-G3/DOX。将沉淀收集起来并溶解在甲醇中做UV-vis测试以得到其在 490nm处的吸光值。并相应测出DOX在甲醇中的标准曲线，进而计算出DOX的量，然后用反应中的DOX的加入量减去DOX沉淀量得到G5-CD/Ad-G3/DOX复合物中DOX的载入量。结果显示，材料对DOX的包封率为53.88％，进一步计算可知，平均1个G5-CD/Ad-G3中包裹了5.4个DOX。
实施例11
将实施例1中G5-CD/Ad-G3/DOX复合物溶解在水(2mg，1mL)中，分别置于分子量为14000的纤维素透析膜中，扎紧后悬浮于9mL的PBS(pH＝7.4)或醋酸缓冲液(pH＝5.5) 中，然后将其置于37℃恒温摇床中振荡。在每个时间点下将1mL的缓冲外液取出并用UV-vis 测试。与此同时，将1mL对应pH值的新鲜缓冲液加入其中。作为对比，对应浓度的DOX·HCl 溶解在水中并置于PBS(pH＝7.4)的外液中，测试其缓释效果。与此同时，利用UV-vis得到 DOX在pH＝5.0和pH＝7.4条件下的标准曲线，并将取得的不同pH条件下(pH＝5.5和pH＝7.4)的缓冲外液经UV-vis测试得到吸光值，由标准曲线计算得到缓释出的DOX的浓度，从而统计出G5-CD/Ad-G3/DOX复合物在不同pH条件下(pH＝5.5和pH＝7.4)的缓释曲线。结果见说明书附图11，与单独的DOX相比，G5-CD/Ad-G3/DOX中的DOX释放速率明显减缓，这证明了载体优良的药物缓释特性。而且pH＝5.5时，G5-CD/Ad-G3/DOX中的DOX释放速度比pH＝7.4要快，这说明了酸性微环境中更利于药物的释放。
实施例12
以MDA-MB-231细胞作为模型细胞来检验实施例1中G5-CD/Ad-G3/DOX和G5-CD /Ad-G3/DOX/miRNA 21i复合物在不同条件下的细胞毒性，以8×103/孔的密度将种于96孔板中，培养于添加100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的100μL DMEM培养液中，37℃、5％二氧化碳浓度下培养24h。随后将培养基换成10μL所含DOX浓度分别为0、0.5、2.5、5、10、25和50μg/mL的相应复合物溶液，并且G5-CD/Ad-G3/DOX/miRNA 21i复合物溶液中以N/P＝10的比例添加miRNA 21i，随后加入90μL培养基，与细胞共培养 24h。将培养液倒掉，加入含10μL CCK-8的100μL DMEM培养基溶液，继续培养4h。用多功能酶标仪测试吸光值，测试波长450nm，结果如说明书附图12所示。结果表明，随着材料浓度的增加，细胞活力下降，这说明负载了DOX的G5-CD/Ad-G3材料具有抑制癌细胞增殖的效果。
实施例13
由于DOX自身带有红色荧光，因此利用流式细胞仪以MDA-MB-231细胞为模型细胞来研究评价G5-CD/Ad-G3负载DOX后细胞吞噬效率。以1×105/孔的密度将MDA-MB-231种于12孔板中，培养于添加100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的1mL DMEM 培养液中，37℃、5％二氧化碳浓度下培养24h。随后根据实施例1制备G5-CD/Ad-G3/DOX 复合物和以N/P比为10:1制备G5-CD/Ad-G3/DOX/miRNA 21i复合物，其中所含DOX浓度分别为0.5、1和2μg/mL。将培养基换成不含FBS的DMEM培养基，再加入上述复合物与细胞共培养4h。采用流式细胞仪对结果进行观察，结果见说明书附图13，对照组未见明显荧光，对于材料组，胞内的荧光强度随着DOX浓度的增加而增强，这说明制备的G5-CD/Ad-G3/ DOX复合物和G5-CD/Ad-G3/DOX/miRNA 21i复合物能被细胞吞噬。
实施例14
由于DOX自身带有红色荧光，因此利用共聚焦显微镜以MDA-MB-231细胞为模型细胞来研究评价G5-CD/Ad-G3负载DOX后细胞吞噬效果。以1×105/孔的密度将MDA-MB-231 种于12孔板中，培养于添加100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的1mL DMEM 培养液中，37℃、5％二氧化碳浓度下培养24h。随后根据实施例1制备G5-CD/Ad-G3/DOX 复合物和以N/P比为10:1制备G5-CD/Ad-G3/DOX/miRNA 21i复合物，其中所含DOX浓度均为0.5、1和2μg/mL。将培养基换成不含FBS的DMEM培养基，再加入上述复合物与细胞共培养4h。采用激光共聚焦显微镜对结果进行观察，结果见说明书附图14，对照组未见明显荧光，对于材料组，胞内的荧光强度随着DOX浓度的增加而增强，这说明制备的 G5-CD/Ad-G3/DOX复合物和G5-CD/Ad-G3/DOX/miRNA 21i复合物能被细胞吞噬。
本发明涉及的参考文献如下：
[1]Tomalia,D.A.Birth of a new macromolecular architecture:Dendrimersas quantized building blocks for nanoscale synthetic polymerchemistry.Prog.Polym.Sci.2005,30,294-324.

Claims (10)

1.一种负载药物的递送纳米平台，其特征在于，所述平台组分为：G5-CD/Ad-G3纳米粒子和miRNA 21i，所述G5-CD/Ad-G3纳米粒子和所述miRNA 21i的N/P比为0.125:1～15:1。
2.一种负载药物的递送纳米平台，其特征在于，所述平台组分包括：G5-CD/Ad-G3纳米粒子、DOX和miRNA 21i，所述G5-CD/Ad-G3纳米粒子与所述DOX的摩尔比为1:8～11，所述G5-CD/Ad-G3纳米粒子与所述miRNA 21i的N/P比为0.125～15:1。
3.一种负载药物的递送纳米平台的制备方法，包括：
(1)将金刚烷乙酸Ad-COOH分散在DMSO中，加入EDC·HCl和NHS溶液活化，将得到的活化的Ad-COOH溶液加入到G3.NH2溶液中反应，透析、冻干处理，得到G3-Ad；
(2)将β-CD分散在DMSO中，逐滴加入CDI溶液反应，将得到的活化的CD溶液加入到G5.NH2溶液中，继续反应，透析、冻干处理，得到G5-CD；
(3)将步骤(1)中G3-Ad和步骤(2)中G5-CD分别用超纯水溶解后混合，反应，透析、冻干处理，得到G5-CD/Ad-G3，其中G5-CD与Ad-G3的摩尔比为1:8～11；
(4)将步骤(3)中G5-CD/Ad-G3与miRNA 21i进行孵育，得到G5-CD/Ad-G3/miRNA 21i复合物；
或者将步骤(3)中G5-CD/Ad-G3溶于水中，与去质子化的DOX·HCl溶液混合，敞口反应，离心处理，取上清液进行冻干处理，将得到的G5-CD/Ad-G3/DOX复合物与miRNA 21i进行孵育，得到G5-CD/Ad-G3/DOX/miRNA 21i复合物；
其中G5-CD/Ad-G3或G5-CD/Ad-G3/DOX复合物与miRNA 21i的N/P比为0.125～15:1，G5-CD/Ad-G3与DOX·HCl的摩尔比为1:8～11。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中Ad-COOH、EDC·HCl、NHS和G3.NH2的摩尔比为1～1.5:10:10:1；活化温度为室温，活化时间为2～4h；反应温度为室温，反应时间为2～4d。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(2)中β-CD、CDI和G5.NH2的摩尔比为25～30:250:1；反应温度为室温，反应时间为5～7h；继续反应温度为室温，继续反应时间为58～62h。
6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(3)中反应温度为室温，反应时间为20～25h。
7.据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(4)中G5-CD/Ad-G3与miRNA 21i进行孵育为：将G5-CD/Ad-G3用无菌水稀释，然后用焦碳酸二乙酯DEPC水稀释miRNA 21i，再将稀释后的两种溶液混合均匀后于35～40℃孵育28～32min，即可。
8.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(4)中敞口反应为：敞口室温搅拌过夜。
9.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(4)中将得到的G5-CD/Ad-G3/DOX复合物与miRNA 21i进行孵育为：将G5-CD/Ad-G3/DOX复合物用无菌水稀释，然后用焦碳酸二乙酯DEPC水稀释miRNA 21i，将稀释后的G5-CD/Ad-G3/DOX复合物和miRNA 21i混合均匀后于35～40℃孵育28～32min，即可。
10.一种如权利要求2所述递送纳米平台在制备治疗人源三阴性乳腺癌药物中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103435815A (zh) * 2013-07-11 2013-12-11 东华大学 一种功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物用于基因转染的方法
CN105199400A (zh) * 2015-09-25 2015-12-30 东华大学 一种β-环糊精修饰的聚酰胺-树状大分子及其纳米金颗粒复合物的制备方法
CN107353408A (zh) * 2017-07-04 2017-11-17 东华大学 一种主客体自组装作用构建表面氨基的核‑壳超结构树状大分子的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010099466A2 (en) * 2009-02-26 2010-09-02 The Regents Of The University Of California A supramolecular approach for preparation of size controllable nanoparticles

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103435815A (zh) * 2013-07-11 2013-12-11 东华大学 一种功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物用于基因转染的方法
CN105199400A (zh) * 2015-09-25 2015-12-30 东华大学 一种β-环糊精修饰的聚酰胺-树状大分子及其纳米金颗粒复合物的制备方法
CN107353408A (zh) * 2017-07-04 2017-11-17 东华大学 一种主客体自组装作用构建表面氨基的核‑壳超结构树状大分子的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Efficient co-delivery of microRNA 21 inhibitor and doxorubicin to cancer cells using core-shell tecto dendrimers formed via supramolecular host-guest assembly;Cong Song等;《Journal of Materials Chemistry B》;20200414;第8卷(第14期);第2768—2774页 *
MicroRNA-21 Modulates Chemosensitivity of Breast Cancer Cells to Doxorubicin by Targeting PTEN;Zhao-Xia Wang等;《Archives of Medical Research》;20111231;第42卷;第281-290页 *
PAMAM树形大分子介导miR-21抑制剂联合化疗抑制脑胶质瘤研究;任玉;《天津大学硕士学位论文》;20100830;第13页第2-3段，第16页第1段，第33页第3-4段，第35页最后一段，第37页第2段 *
基于超分子主客体自组装的核-壳结构树状大分子的构建及基因传递应用研究;陈锋;《东华大学硕士学位论文》;20181219;第16页第1段，第17页，第25页最后一段 *

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