CN105169484A - 一种在体内形成骨组织的细胞移植培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种在体内形成骨组织的细胞移植培养方法，其特征在于通过使用一种降解性能较快的三维基质BD？Matrigel，提供成骨种子细胞在体内生长的三维结构，使得成骨种子细胞体内能够形成骨样组织结构。同时，BD？Matrigel具有一定溶解能力，可以在细胞移植的初期添加相应的生长因子或者小分子化合物等，在移植的细胞体内生长初期，提供适宜细胞分化和存活的微环境。本发明的方法也可用于组织工程各类细胞的移植。为基础研究带来便捷，为临床应用带来前景。
Description
技术领域
本发明一种在体内形成骨组织的细胞移植培养方法，特别是使用一种生物可吸收的基质接种移植的类成骨细胞,促进该细胞在体内自组织生长成为类似骨块组织。属细胞生物学与组织工程领域。
背景技术
骨组织工程技术通过将生物材料或者具备特定三维结构的人工材料和成骨种子细胞共培养,以期形成具有一定成骨可塑性和可降解的复合骨组织材料,用于修复骨组织缺损。一方面，成骨种子细胞的来源多种多样，包括分化晚期的成骨细胞、成骨细胞株、骨髓混合细胞或纯化的间充质干细胞等，也包括非成骨细胞如皮肤成纤维细胞转分化而来的类成骨细胞。随着技术的不断发展，种子细胞来源丰富并且可以在体外实现大量的扩增培养，为体内骨缺损的治疗提供了良好的生物材料。
另一方面，种子细胞在体内移植后，尚不能自组织生长成为骨样组织，需要依附一定的三维结构，才能获得类似骨样的组织块。目前，用于接种种子细胞的材料主要有珊瑚羟基磷灰石/磷酸三钙双相陶瓷，来源异体骨的支架材料，可注射性材料复合物Pluronic，脱钙骨基质材料，胶原纤维三维支架等。相关材料的使用，为种子细胞提供了生长的三维空间，具有一定的成骨性。但是目前很多使用的生物材料，因为其结构固定并且在生物体内降解较慢，移植细胞后，成骨组织块的结构可塑性差，伸展性和抗压等性能方面也远不如自身的骨组织；同时，降解性能差，也会对自身其它组织造成影响。
随着细胞培养技术的发展，目前也出现了很多新的生物基质用于细胞体外的三维培养。其中包括了Matrigel基质胶的使用。BDMatrigel是从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中提取出基底膜基质，其主要成分有层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。在室温条件下，根据不同的浓度，Matrigel聚合形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞的培养和分化，也可以为胚胎干细胞的培养提供无饲养层条件下的营养支持。BDMatrigel基底膜/基质胶形成的三维培养基质，可促进上皮细胞、肝细胞、Sertoli细胞、黑色素瘤细胞、血管内皮细胞的贴壁与分化。2013年JuergenA.Knoblich1报道，Matrigel形成的三维基质，接种神经干细胞后，可在体外的培养条件下培育出了一个模拟人脑的组织。另外，由于Matrigel是一种蛋白质复合物，在体内也容易降解。因此，提示Matrigel形成的三维基质，可以用于成骨种子细胞的成骨性培养。
本专利中选用了一种来源于生物体内的BDMatrigel基底膜/基质胶用于种子细胞的接种和体内成骨性的三维移植。
本套方法的优势是：①BDMatrigel基质的不同浓度，可形成不同强度和间隔大小的三维结构，利于细胞成骨性的塑造；②操作简单；③降解性能相对快速。
发明内容
本发明目的之一是通过使用一种降解性能较快的三维基质，提供成骨种子细胞在体内生长的三维结构，使得成骨种子细胞体内能够形成骨样组织结构。
本发明的另一个目的是通过这种具有一定溶解能力的三维基质，可以在细胞移植的初期添加相应的生长因子或者小分子化合物等，在移植的细胞体内生长初期，提供适宜细胞分化和存活的微环境。
为了完成本发明目的，本发明采用以下技术方案：
1）、准备BDMatrigel形成所需的三维培养基质：BDMartigel原液（浓度8mg/ml）,从-20°C取出后，经过4°C的过夜平衡后在冰上操作使用。按照移植细胞需要的生长条件，按照一定的比例添加所需的其它生长因子，蛋白质或者小分子化合物等。
2）、准备用于移植的成骨种子细胞：本次测试中，使用的成骨种子细胞来源于人的皮肤成纤维细胞来源的诱导性成骨细胞，该细胞适宜的培养液中主要包含9μM的CHIR99021，10μMForskolin和10nM***等化合物。准备的细胞总数是2.7x106，消化细胞离心后溶解于50μl含上述物质的培养液中；
3）、细胞和基质的三维复合物：在2-8°C的冰上操作，取平衡好后的液体状50μlBDMatrigel和已经准备好的50μl细胞悬液混合，形成约100μl的液滴，滴加在细胞培养低吸附皿上。倒扣后放置于37°C培养箱中，半个小时到一个小时平衡凝固成胶状物。
根据不同细胞的生长特性，可以按照此方法调整三维基质的浓度以提供相应的结构支撑。并且添加有利于移植细胞生长的蛋白，生长因子或者小分子化合物等。
4）、三维复合物的移植：将胶状物从培养皿上剥离，直接接种于小鼠背部皮下组织。该部位缺少自身骨组织，利于检测移植细胞三维复合物的成骨性。
移植物的成骨性和降解性的检测：经过至少四个星期后，在原来的皮下移植位点取出移植复合物，进行HE染色，观察复合物的生长情况，其降解效率大于80%。
本发明所使用的方法，除了提供成骨种子细胞的体内培养外，也可以为其它类型的细胞移植提供参考。
附图说明
图1为细胞和基质的三维复合物形成直径约0.2mm-0.5mm的胶状球形物的示意图。
图2为四星期后细胞三维复合物的移植情况（图中白圈内表示）剥离该移植物鉴定。
图３为三维复合物的HE切片染色，形成不规则的骨组织结构。图3中a是白光镜下HE成像；b是紫外下HE的成像，黄绿色显示新生骨的形成；c是偏光下显示骨头胶原纤维束。
具体实施方式
实施例1
1，准备BDMatrigel形成所需的三维培养基质
BDMartigel原液（浓度8mg/ml）,从-20°C取出后，经过4°C的过夜平衡后在冰上操作使用。按照移植细胞需要的生长条件，按照一定的比例添加所需的其它生长因子，蛋白质或者小分子化合物等。
2，准备用于移植的成骨种子细胞
本次实验中，使用的成骨种子细胞来源于人的皮肤成纤维细胞来源的诱导性成骨细胞，该细胞适宜的培养液中主要包含9μM的CHIR99021，10μMForskolin和10nM***等化合物。准备的细胞总数是2.7x106，消化细胞离心后溶解于50μl含上述物质的培养液中；
3，细胞和基质的三维复合物
在2-8°C的冰上操作，取平衡好后的液体状50μlBDMatrigel和已经准备好的50μl细胞悬液混合，形成约100μl的液滴，滴加在细胞培养低吸附皿上。倒扣后放置于37°C培养箱中，半个小时到一个小时平衡凝固成胶状物。
4，三维复合物的移植
将胶状物从培养皿上剥离，直接接种于小鼠背部皮下组织。
5，三维复合物的成骨性和降解性的检测
四星期后，在原来的皮下移植位点取出移植复合物，进行HE染色，观察复合物的生长情况。
本发明方法可用于组织工程各类细胞的移植，为基础研究带来便捷，为临床应用带来前景。
实施例2
1，准备BDMatrigel形成所需的三维培养基质
BDMartigel原液（浓度8mg/ml）,从-20°C取出后，经过4°C的过夜平衡后在冰上操作使用。按照移植细胞需要的生长条件，按照一定的比例添加所需的其它生长因子，蛋白质或者小分子化合物等。
2，准备用于移植的成骨种子细胞
本次实验中，使用的成骨种子细胞来源于人的皮肤成纤维细胞来源的诱导性成骨细胞，该细胞适宜的培养液中主要包含9μM的CHIR99021，10μMForskolin和10nM***等化合物。准备的细胞总数是2.7x106，消化细胞离心后溶解于75μl含上述物质的培养液中；
3，细胞和基质的三维复合物
在2-8°C的冰上操作，取平衡好后的液体状25μlBDMatrigel和已经准备好的50μl细胞悬液混合，形成约100μl的液滴，滴加在细胞培养低吸附皿上。倒扣后放置于37°C培养箱中，半个小时到一个小时平衡凝固成胶状物。
4，三维复合物的移植
将胶状物从培养皿上剥离，直接接种于小鼠背部皮下组织。
5，三维复合物的成骨性和降解性的检测
4星期后，在原来的皮下移植位点取出移植复合物，进行HE染色，观察复合物的生长情况。
实施例3
1，准备BDMatrigel形成所需的三维培养基质
BDMartigel原液（浓度8mg/ml）,从-20°C取出后，经过4°C的过夜平衡后在冰上操作使用。按照移植细胞需要的生长条件，按照一定的比例添加所需的其它生长因子，蛋白质或者小分子化合物等。
2，准备用于移植的成骨种子细胞
本次实验中，使用的成骨种子细胞来源于人的皮肤成纤维细胞来源的诱导性成骨细胞，该细胞适宜的培养液中主要包含9μM的CHIR99021，10μMForskolin和10nM***等化合物。准备的细胞总数是2.7x106，消化细胞离心后溶解于20μl含上述物质的培养液中；
3，细胞和基质的三维复合物
在2-8°C的冰上操作，取平衡好后的液体状80μlBDMatrigel和已经准备好的50μl细胞悬液混合，形成约100μl的液滴，滴加在细胞培养低吸附皿上。倒扣后放置于37°C培养箱中，半个小时到一个小时平衡凝固成胶状物。
4，三维复合物的移植
将胶状物从培养皿上剥离，直接接种于小鼠背部皮下组织。
5，三维复合物的成骨性和降解性的检测
4星期后，在原来的皮下移植位点取出移植复合物，进行HE染色，观察复合物的生长情况。
Claims (4)
1.一种在体内形成骨组织的细胞移植培养方法，其特征在于通过使用三维基质BDMatrigel材料，为成骨种子细胞在体内生长的三维结构，使得成骨种子细胞体内能够形成骨样组织结构。
2.根据权利要求1所述的在体内形成骨组织的细胞移植培养方法，其特征在于所述的三维基质结构可以稀释成不同的浓度，提供不同交联大小和强度的三维结构，根据细胞生长和分化特性进行调整。
3.根据权利要求1或2所述的在体内形成骨组织的细胞移植培养方法，其特征在于所述的三维基质结构，具有一定溶解能力的三维基质，可以在细胞移植的初期添加相应的生长因子或者小分子化合物等，在移植的细胞体内生长初期，提供适宜细胞分化和存活的微环境。
4.根据权利要求1和2所述的在体内形成骨组织的细胞移植培养方法，其特征在于所述的细胞-Matrigel复合物***具体步骤是：
A，准备BDMatrigel形成所需的三维培养基质，
BDMartigel原液（浓度8mg/ml）,从-20°C取出后，经过4°C的过夜平衡后在冰上操作使用,按照移植细胞需要的生长条件，按照一定的比例添加所需的其它生长因子，蛋白质或者小分子化合物等；
B,准备用于移植的成骨种子细胞，
本次测试中，使用的成骨种子细胞来源于人的皮肤成纤维细胞来源的诱导性成骨细胞，该细胞适宜的培养液中主要包含9μM的CHIR99021，10μMForskolin和10nM***等化合物,准备的细胞总数是2.7x106，消化细胞离心后溶解于50μl含上述物质的培养液中；
C,细胞和基质的三维复合物，
在2-8°C的冰上操作，取平衡好后的液体状50μlBDMatrigel和已经准备好的50μl细胞悬液混合，形成约100μl的液滴，滴加在细胞培养低吸附皿上,倒扣后放置于37°C培养箱中，半个小时到一个小时平衡凝固成胶状物；
根据不同细胞的生长特性，可以按照此方法调整三维基质的浓度以提供相应的结构支撑,并且添加有利于移植细胞生长的蛋白，生长因子或者小分子化合物等；
D,三维复合物的移植，
将胶状物从培养皿上剥离，直接接种于小鼠背部皮下组织,该部位缺少自身骨组织，利于检测移植细胞三维复合物的成骨性；
E，移植物的成骨性和降解性的检测，
至少4星期后，在原来的皮下移植位点取出移植复合物，进行HE染色，观察复合物的生长情况,降解效率大于80%。
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