JP3638967B2 - ネフローゼ症候群及び肝障害症状の寛解剤 - Google Patents
ネフローゼ症候群及び肝障害症状の寛解剤 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、老人はもとより近年若年層で増加傾向にある腎臓疾患、とりわけ慢性腎不全に至る前段階であるネフローゼ症候群と診断された患者に対し、あるいはウイルス性及び薬物性肝炎等の肝障害の症状を有する患者に対し、通院可能で安全な経口及び筋肉内投与治療剤を提供する発明に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微小変化型ネフローゼの内科的な治療薬として、合成薬であるステロイド剤或いは抗血小板薬であるジピリダモールが用いられているが、長期間使用しなくてはならず、若年層に投薬する際には特に満月様顔貌，月経不順，めまい，頭痛，悪心，嘔吐など、重篤な場合には感染症，消化管出血，代謝異常，骨粗症，血栓症，副腎不全，精神障害などの副作用が懸念されている。
【０００３】
また、肝炎にはウイルス性、薬物性のものもあるがウイルス性のものが大半を占めており、それらの治療薬としてはインターフェロン、インターロイキン２のようなバイオロジカル・レスポンス・モディファイアー（ＢＲＭ）、グリチルリチンの静注用注射剤であるネオミノファーゲンＣなどが用いられている。しかしながらＢＲＭには発熱等の副作用が見られることにより長期投与には問題がある。またグリチルリチンは基本的には抗炎症剤であり、長期に使用する場合は血圧、電解質濃度の管理が必要となる。この他にも生薬成分であるサイコサポニン、サポニン、ゴミシンなどが知られているが、いずれも臨床応用されるには至っていない。
【０００４】
一方、ポリＤ−ガラクツロン酸
【化１】
〔式中のカルボキシル基はメチルエステル化されていてもよい〕
を構成成分とする水溶性多糖類としては、たとえば水溶性ペクチン質（ｐｅｃｔｉｃ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）が知られている。これは柑橘類の果皮などを酸性水溶液で抽出し、必要に応じてさらに酸、アリカリ、酵素で脱メチル化し、アルコール等の有機溶媒を加えて沈澱させて得られる水溶性多糖類で、ポリＤ−ガラクツロン酸を主な構成成分とする。そしてポリＤ−ガラクツロン酸の構造式中のカルボキシル基のメチルエステル化率の大小により水溶性ペクチン質はペクチンとペクチニン酸に別けられ、また実際上メチルエステルが残っていないものはペクチン酸と呼ばれている。
【０００５】
水溶性ペクチン質はゼリー等の材料として主として食品工業に用いられるが、医薬としては粘膜被覆に供される程度でほとんど用いられていない。
【０００６】
本発明の一部においては、丹参の抽出成分が用いられるが、丹参は中国では、血液循環，血行停止の改善に良いとされ伝統的に使用されている薬草である。近年、血管拡張作用（大浦彦吉：和漢医薬学会誌．，５：２２７−２３７．，１９８８．）、降圧作用（中山医学院論：医歯薬出版，東京．，２５７−２５８．，１９８０．）、抗凝血作用（羅厚蔚ら：Ａｃｔａ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａＳｉｎｉｃａ．，２３（１１）：８３０−８３４．，１９８８．）、細胞内コレステロールの合成抑制作用（Ｓｕｎ Ｘｉ−ｍｉｎｇ；中草薬．，２２（１）：２０−２３．，１９９１．）、肝細胞保護（戚心広ら：中西医結合雑誌．，１１（２）：１０２−１０４．，１９９１．）及びラジカル消去作用（胡 天喜：上海中医薬雑誌，９：２８−３０．，１９８８．）などの多彩な生理活性作用があること、また腎機能の改善（大浦彦吉：第二回和漢薬の医学薬学的研究に関する日中シンポジウムｐｐ．１４８−１５７，１９８８．）、慢性腎疾患及び***の患者に対して有効（張 鏡人：上海中医薬雑誌．，１．１７−１８．，１９８１．）であることが内外において報告されているが、その本質については何等言及されていないか、言及されていても本願発明とは全く異なる低分子物質である。
【０００７】
また、丹参を原料とする腎疾患への治療薬の研究も盛んに行われていて、低分子のフェナントレンキノン類であるタンシノン類似物並びにカフェイン酸４量体であるマグネシウムリトスペルミン酸Ｂ等が単離されているが（Ｔ．Ｙｏｏｚａｗａ，Ｈ．Ｙ．Ｃｈｕｎｇ，Ｈ．Ｏｕｒａ，Ｇ．Ｎｏｎａｋａ，ａｎｄ Ｉ．Ｎｉｓｈｉｏｋａ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３６，３１６（１９８８））、何れも有機溶媒含有下で抽出される脂溶性の高い物質だけであり、まだ臨床応用には至っていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
腎疾患は大別して、糸球体由来の原発性とそれ以外の疾患に由来する続発性に分類され、前者が約８０％以上を占め、しかも低年齢層ほど多くて約９０％に達する。病理組織所見からは微小変化群，単状糸球体硬化症，膜性腎症，メサンギゥム増殖性腎症（ＩｇＡ腎症，非ＩｇＡ腎症），膜性増殖糸球体腎炎，半月体形成糸球体腎炎などに分類される。蛋白尿は臨床所見の特徴として、いずれの組織学的病型にも共通して認められ、重篤な場合にはネフローゼ症候群として診断されている。また近年腎臓疾患、特に腎臓の器質的な衰えにより誘発される疾患は老人にとどまらず若年層に増加しつつあるため、器質を改善して疾患を治療する副作用発現の少ない植物成分で水溶性のある経口或いは筋肉内に投薬し治療する薬剤の開発が望まれている。
【０００９】
また、肝炎は大別して、ウイルス性のものとアルコール等の薬物によるものがあるが、Ｂ型及びＣ型肝炎ウイルスによるものが圧倒的に多い。近年治療薬として特にインターフェロンがＣ型肝炎に対して有効であることが報告されており、使用頻度も高まってきている（飯野司郎ら：基礎と臨床．２６：３３９，１９９２；鈴木宏ら：肝・胆・膵・２３：１０６５，１９９１）。しかしながら、短期投与で発熱等のインフルエンザ様症状が表れ、長期投与でも体重減少、下痢、嘔吐、不整脈、脱毛、自己免疫異常等の副作用が見られる。またこれらの薬剤はすべて注射剤であることからより簡便に使用できる新たな治療薬あるいはインターフェロン等との併用補助薬として副作用発現の少ない生薬、漢方薬成分で水溶性のある経口或いは筋肉内に投与し治療する薬剤の開発が望まれている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、広く繁用されている蛋白尿***を顕著に起こし、さらに腎臓の器質変化を示すことで良く知られるピューロマイシンで惹起したラットのネフローゼ症候群モデルを利用して鋭意検討した結果、丹参の水抽出物より上記モデルに対して有効な多糖類が存在すること、その多糖類がポリＤ−ガラクツロン酸を主要構成成分とすることを見い出した。
【００１１】
本発明はこの知見を発展させたもので、（Ｉ）ポリＤ−ガラクツロン酸を有効構成成分とする水溶性多糖類よりなるネフローゼ症候群及び肝障害症状の寛解剤、（II）丹参から水または水性溶媒で抽出されうる下記の特性を有する多糖類
（III)丹参を水または水性溶媒で抽出し、抽出液から残渣を除去した液を無極性多孔性ポリマー樹脂を通過させ、限外濾過で濃縮し、ついでゲル濾過クロマトグラフィーに付することを特徴とする上記の多糖類の製造法である。
【００１２】
ポリガラクツロン酸を有効構成成分とする水溶性多糖類としては、一般に植物から抽出される水溶性ペクチン質が用いられ、それはガラクツロン酸のカルボキシル基が約７．５％以上メチルエステル化されているペクチンでも、メチルエステル化率がそれよりも低いペクチニン酸でも、実際上メチルエステルがすべて加水分解されているペクチン酸でもよい。水溶性ペクチン質は一般に少量のアラバン、ガラクタン、ラムノースなどを伴う場合が多いが、そのまま用いることができる。
【００１３】
本発明の水溶性多糖類としては、たとえば丹参から抽出される水溶性ペクチン質も用いられる。
【００１４】
丹参は植物丹参（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅ）の根および根状の茎であるが、同属植物の南丹参（Ｓ．ｂｏｗｌｅｙａｎａ Ｄｕｎｎ）、甘粛丹参（Ｓ．ｐｒｚｅｗａｌｓｋｉｉ Ｍａｘｉｍ）、雲南丹参（Ｓ．ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ Ｃ．Ｈ．Ｗｒｉｇｈｔ）等の根も用いられ、本発明ではこれらを総称して丹参という。
【００１５】
本発明で用いられる丹参の産地は特に限定されるものではないが、好ましくは中国，四川地区産の丹参が本発明の多糖類を効率よく抽出精製することができる。
【００１６】
丹参はできるだけ小片にして抽出するのが望ましい。抽出溶媒として水または水性溶媒が用いられ、水性溶媒としてはリン酸緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液または食塩等の塩類水溶液を用いるのが好ましい。
【００１７】
抽出溶媒のｐＨは約２〜約９に調整するのが好ましい。抽出は約５０〜約１００℃で行うのが好ましく、さらに好ましくは７０〜９０℃である。たとえば、丹参を予め５０〜１００℃好ましくは７０〜９０℃にした温水或いはｐＨ２〜９の範囲にある緩衝液または塩類溶液に入れるか、入れたあと温浴中などで所定の温度になるまで加温して抽出する。
【００１８】
かくして、１〜８時間、好ましくは３〜５時間抽出すれば粗出液が得られる。抽出液中に混在する丹参の残渣は目の粗い濾布やヌッチェなどで濾去することができる。
【００１９】
残渣を除去した抽出液は水で平衡化した無極性の多孔性ポリマー樹脂を充填材とするカラムクロマトグラフィーによりさらに精製する。このポリマー樹脂としては、たとえばＨＰ−２０およびＭＣＩ−ゲル（三菱化成社製）やアンバーライトＸＡＤ−２（オルガノ社製）などが挙げられる。
【００２０】
丹参の活性成分についてＭＣＩ−ゲルの吸着分画で、５０％メタノール溶液で溶出される低分子物質であるマグネシウムリトスペルミン酸Ｂが報告されており、発明者らも、同様の分画に蛋白尿***を抑制する活性のあることを確認した。しかし、非吸着部分を含め溶出された全画分について、詳細に蛋白尿***を抑制する作用を試験した結果、当初の予想に反して、素通り画分にも上記作用を示す成分のあることが判明した。この時点で、この処理からの素通り画分は、極性が低いことが予想され、又、蛋白質に固有の紫外部吸収スペクトルを示さないから蛋白質以外の成分であろうと思われた。
【００２１】
素通り画分の一部を、次いで２枚の限外ろ過膜（カットオフ，分子量３００，０００及び５０，０００の）システムに通し、濃縮且つ精製ステップの検討を行った。実際には分子量３００，０００以上、５０，０００〜３００，０００及び５０，０００以下の各物質群に分け、各成分についてピューロマインシン惹起ラットモデルを用いて、蛋白尿***を抑制する活性を試験した。その結果、強い活性が分子量５０，０００〜３００，０００に範囲のある分画に見られ、５０，０００以下にも弱い活性が見られた。
【００２２】
そこで、先の素通り画分の濃縮に分子量３０００のカットオフ，限外ろ過膜を用いた。この工程での限外ろ過膜はカットオフのサイズが同じであれば何れの種類のものでも本発明の物質の濃縮に用いることが可能である。
【００２３】
次に濃縮液中の活性成分をより狭い分子量範囲に限定するために、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる精製を行った。一般に蛋白質などの場合には、ゲルろ過クロマトグラフィーの担体としては、セファデックス及びセファロース類（ファルマシア社製），セルロファイン（生化学工業社製），バイオゲル（バイオラッド社製）などが使用されており、本発明の物質のクロマトグラフィーにも上記のものが使用できるが、好ましくは合成手段によって調製された材質によるクロマト材、例えばバイオゲルが本発明の物質の精製に適している。クロマト材には編目サイズ、即ち排除限界により各種のものがあるが、分画範囲として１００００〜３００，０００のものであればいずれでも構わない。発明者らは、好んでバイオゲルＰ−３０，−６０，−１００、中でもバイオゲルＰ−６０を使用した。そこで、濃縮液を水で平衡化したバイオゲルＰ−６０を充填したカラムに通した。モニターは暫定的に２８０ｎｍの吸収で行い、吸収のある分画と吸収のない分画をカラム容量の２倍量まで数分画に分け、次いでピューロマイシン惹起ラットモデルでの蛋白尿***の抑制作用を試験したところ高分子領域に活性を有する多糖類が溶出されていることがわかった。
【００２４】
この多糖類は過ヨウ素酸酸化あるいは還元処理すると活性を失う。また本物質は血小板凝集抑制作用，赤血球膜保護作用を有することがｉｎ ｖｉｔｒｏの実験結果より明らかになった。さらにピューロマイシン惹起ネフローゼモデルラットまたは四塩化炭素誘発肝障害モデルラットにおいてはラジカルが関与することが知られているが、本物質には直接ラジカルを消去する作用はないことがＥＳＲを用いた実験により示された。
丹参の抽出液を無極性ポーラスポリマー樹脂及びゲルろ過クロマトグラフィーで精製（精製画分）した多糖類の特性を下記のように試験した。
【００２５】
（１）全糖含量：フェノール硫酸法（Ｈｏｄｇｅ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ Ｈｏｆｒｅｉｔｅｒ，Ｂ．Ｔ．（１９６２）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）．Ｖｏｌ．１，ｐ．３３８）
試験溶液０．５ｍｌを試験管にとり５％（ｗ／ｖ）フェノール液０．５ｍｌを加え、濃硫酸２．５ｍｌを速やかに液面に直接に加えよくまぜ、室温に２０分保った後、４８０ｎｍの吸光度を測定する。標準溶液にはグルコース（１０〜９０μｇ／ｍｌ）水溶液を用いた。
【００２６】
（２）ウロン酸含量：メタヒドロキシジフェニル法（Ｂｌｕｍｅｎｋｒａｎｔｚ，Ｎ．ａｎｄ Ａｓｂｏｅ Ｈａｎｓｅｎ，Ｇ．（１９７３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４，４８４−４８９．）
試料溶液０．２ｍｌに０．０１２５Ｍホウ酸ナトリウムの濃硫酸溶液１．２ｍｌを添加し、氷冷後攪はんする。１００℃で５分間処理した後氷冷し、０．１５％メタヒドロキシジフェニルの０．５％水酸化ナトリウム溶液２０μｌを加え、５２０ｎｍの吸光度を測定する。標準溶液にはガラクツロン酸溶液を用いた。
【００２７】
（３）中性糖含量（アルジトールアセテート−ＧＣ−ＭＳ法）（Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ，Ｌ．Ｇ．ａｎｄ Ｐｉｐｅｒ，Ｃ．Ｖ．（１９７０）Ｔａｐｐｉ．５３，２５７−２６０．）
丹参の精製画分５０ｍｇを７２％（ｖ／ｖ）硫酸３ｍｌに溶かし、３０℃，１時間処理したものに蒸留水８４ｍｌを加え、１２０℃で１時間オートクレープする。内部標準としてイノシトール４ｍｇを加え、その３０ｍｌを水酸化バリウムを加えてｐＨ５．５に調整した後、遠心分離して上清を得る。その２５ｍｌに水素化ホウ素ナトリウム８０ｍｇを添加し、室温で２時間処理後、酢酸で反応をとめる。濃縮乾燥後、蒸留水に溶かしＤＥＡＥセファデックスカラムにかけ素通り画分を集める。濃縮乾燥後、無水酢酸とピリジンによりアセチル化した後、ジクロルメタンと１Ｎ塩酸の混液で抽出する。有機層を蒸留水で洗った後、濃縮し、アセトンに溶かしてガスクロマトグラフィーマススペクトロメトリー（ＧＣ−ＭＳ）にて定量した（カラム：Ｓｕｐｅｌｃｏ糖分析用キャピラリーカラムを使用）。また標品は上記の還元操作により処理して同様に分析した。
【００２８】
（４）分子量の測定
トーソーＨＰＬＣシステム（トーソー社製）にアサヒパックＧＳ−５２０（旭化成社製）カラム（７．６ｍｍＩＤｘ５００ｍｍ）を接続し、ミリＱ水を用いて、本願物質試料溶液１０μｌをカラムに付加して分子量を測定（温度：室温、流速：０．５ｍｌ／分、検出：ＲＩＤ）した。分子量マーカーにはアミロースキット（中埜酢店社製）：分子量１０２００，３０１００，７５２００，１１１４００，３６４２００を用い、これらの溶出パターンから得た検量線より、本願物質の分子量を算出した。
【００２９】
（５）ピューロマイシン惹起ネフローゼ症候群モデルラットによる評価
１）ネフローゼ症候群モデルラットの作製：ウィスター系雌性ラット（約９週令、体重約１５０ｇ）にピューロマイシンアミノヌクレオシド（：以下ピューロマイシン、シグマ社製）６０ｍｇ／ｋｇを１回、頸静脈内投与してネフローゼ症候群モデルラットを作製した（東條静夫ら：ネフローゼ症候群 京極方久 編，ソフトサイエンス社出版，４７９−４８８，１９８４）。
【００３０】
２）試料溶液の投与：ピューロマイシン投与の開始の日から１日１回各試料溶液を胃カニューレを通じて２１日間経口或いは筋肉内投与した。陰性対照群には注射用水を、陽性対照群にはジピリダモール溶液を用いた。
【００３１】
３）尿蛋白質量の測定：尿蛋白質量は、ピューロマイシン投与終了後５日目から、２〜３日おきに２４時間尿をラット代謝ケージを用いて採尿し、尿量を計測した。次いで遠心分離（３０００ｒｐｍｘ１０分）して得た上清１ｍｌにスルホサリチル酸３ｍｌを加え、室温で１０分間放置した後、波長６６０ｎｍの吸収を測定し、検量線より尿中のタンパク質濃度を求め、更に尿容量を乗じて尿中への総蛋白質***量を算出した。検量線作成に当たっては牛血清アルブミン（シグマ社製）を標準タンパク質に用いた。
【００３２】
４）血清コレステロール，血清アルブミン，血清中の総蛋白質量及び血清過酸化脂質の測定：ピューロマイシン投与終了後７日目，１４日目，２１日目に各群のラットをエーテル麻酔を施した後、静脈より採血し、血清中のコレステロール，アルブミン，総蛋白質量及び過酸化脂質量を測定した（いずれも和光純薬工業社製）。
【００３３】
（６）四塩化炭素誘発肝障害モデルによる評価
１）肝障害モデルの作成：Ｗｉｓｔａｒ系雌性ラット（９−１１週令、体重１６０ｇ前後）に対し、オリーブ油に等量の割合で混合した四塩化炭素（和光純薬製）溶液１．５ｍｌ／ｋｇを腹空内に１回投与することにより作成した。（炎症学書：炎症炎症動物実験法、実験的肝繊維症．医学書院出版，２５３−２７７）
【００３４】
２）資料溶液の投与：四塩化炭素投与３日前から投与前日まで試料を１日１回筋肉内投与あるいは７日前から投与前日まで経口投与を行った。陰性対象群には注射用水を投与した。
【００３５】
３）血清生科学的検査：四塩化炭素投与２４時間御にエーテル麻酔下で回胸、心臓より２ｍｌの血液を採血し、常温に１時間放置後、遠心分離して血清を得た。血清トランスアミナーゼ（ＧＯＴ：ｇｌｕｔａｍｉｃ ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ，ＧＰＴ：ｇｌｕｔａｍｉｃ ｐｙｒｕｖｉｃｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）活性の測定は和光純薬製キットを用いて行った。
【００３６】
４）統計解析：それぞれの測定データはすべて平均±Ｓ．Ｅで示し、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓのｔ検定により統計解析した。
【００３７】
下記の実施例に示されるように、本発明の多糖類は動物実験でネフローゼ症候群の寛解や肝障害症状の改善に有効であり、ネフローゼ症候群の寛解剤または肝障害症状改善剤として、通常成人１人当たり１日量、経口的に約１０〜１５０ｍｇ、筋肉内注射として約０．５〜１０ｍｇ投与することができる。
【００３８】
【実施例】
以下に実施例および試験例を挙げて本発明をさらに説明する。
実施例１
中国，四川地区産の丹参の根部の小片１０ｋｇに水８０Ｌを加え、投げ込みヒーターを投じ８０℃にした後、３時間攪はんしながら抽出した。抽出液中の根部残渣はヌッチェでろ過して取り除き、回収した根部残渣に更に水８０Ｌを加えて１回目と同様に処理して再抽出液を得た。１回目と２回目の抽出液（１３０Ｌ）を合わせ、減圧下、４０℃でエバポレーターを用いて濃縮し濃縮液（１０Ｌ）を得た。
【００３９】
次に、濃縮液をＨＰ−２０（４Ｌ，三菱化成社製）を充填したカラム（１１×４５ｃｍ）に負荷した。平衡化液及び展開液には水を用い、室温下でクロマトグラフィーを行い、素通り分画及び水洗浄分画（非吸着）液を回収した。カラムは５０％メタノール及びアセトニトリルで洗浄した後、最後に水に完全に置換して再使用した。上記非吸着画分は繰り返し３回程同様に処理して完全に非吸着分画の液（５５Ｌ）を得た。この全非吸着液は分子量カットオフ３０００の限外ろ過膜を装備した限外ろ過装置ＳＥＰ−１０１３（旭化成）を用いて限外ろ過濃縮し、通過液（分子量 約３０００以下，ＳＥＰ−ＯＵＴ）と非通過液（分子量 約３０００以上，ＳＥＰ−ＩＮ）を得た。濃縮した非通過液（ＳＥＰ−ＩＮ）を水で平衡化したバイオゲルＰ−６０を充填したカラム（１．５×１００ｃｍ）に付加し、水を展開液として用いクロマトグラフィーを行った。モニターは暫定的に波長２８０ｎｍで吸収を測定し、横軸に分画番号を、縦軸に各分画液の吸収を記載したグラフを作成し、吸収を示さない分画を中心に全糖の測定を行い、その測定結果を同じグラフに記載した（図１）。
【００４０】
目的の多糖類成分は分画番号１１から２２の分画液（ＡＦ）に得られ、ついで凍結乾燥して粉末（３０ｇ，ロットＡ）を得た。
ここで得た精製多糖類の特性を前述した試験法により試験した結果、以下の持性を得た。
【００４１】
１）糖含量（フェノール硫酸法）：７９％
。
【００４２】
２）分子量：２５９０００（標準多糖：アミラーゼキット、分子量１００〜３６０Ｋ）
【００４３】
３）ネフローゼ症候群モデルラットによる評価
精製試料１０ｍｇ／ｋｇ，４０ｍｇ／ｋｇを経口投与、０．５ｍｇ／ｋｇ，２．５ｍｇ／ｋｇを筋肉内投与したところ、図２，図３に示したようにいずれの場合も尿蛋白***が有意に抑制された。また表１，表２に示したように血清コレステロール（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）値，血清アルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ）値及びＡ／Ｇ比，血清過酸化脂質（ＭＤＡ）値においても有意な改善効果が認められた。
【表１】
【表２】
【００４４】
４）四塩化炭素誘発肝障害モデルによる評価
製糖試料（ＡＦ）７ｍｇ／ｋｇ，３５ｍｇ／ｋｇを経口投与、０．３ｍｇ／ｋｇ，１．５ｍｇ／ｋｇを筋肉内投与したところ、表３に示したようにいずれの場合もＡＦ前投与群では血清ＧＯＴ，ＧＰＴ値の上昇が用量異存的に抑制された。
【００４５】
【表３】
【００４６】
実施例２
実施例１に記載の方法によりロットの異なる丹参原料より各々精製を行い、１に記載した以外に計３ロット（ロットＢ，Ｃ，Ｄ）の精製品を取得し、同様の特性評価を行った。
１）糖含量（フェノール硫酸）：ロットＢ（６５％），ロットＣ（８０％），ロットＤ（９３％）
（１）糖組成
【００４７】
【表４】
【００４８】
（２）中性糖組成（アルジトールアセテート−ＧＣ−ＭＳ法）
【表５】
【００４９】
（３）その他の糖：
ロットＢ，Ｃ，Ｄのいずれもアミノ糖、アルドヘキソース、２−デオキシ糖は含まない。
【００５０】
２）分子量：（標準多糖：アミロースキャット、分子量１００〜３６０Ｋ）
ロットＢ（１５０，０００），ロットＣ（２８０，０００），ロットＤ（２５０，０００）
【００５１】
３）ネフローゼ症候群モデルラットによる評価
薬効評価についてはいずれの精製品も実施例１で得られたものとほぼ同等の効果が得られた。
【００５２】
実施例３
活性の本体が糖であること及びウロン酸の薬効に対する関与について調べる目的で本精製品を以下の操作によって酸化及び還元し、それらの効果について調べた。投与量はネフローゼ症候群ラットにはそれぞれ４０ｍｇ／ｋｇを経口投与し、肝障害ラットにはそれぞれ１．５ｍｇ／ｋｇを筋肉内投与した。
（１）酸化（Ｎｏｂｌｅ，Ｄ．Ｗ．ａｎｄ Ｓｔｕｒｇｅｏｎ，Ｒ．Ｊ．（１９７０）Ｃａｒｂｏｈｙｄ，Ｒｅｓ．１２，４４８による）精製試料６００ｍｇを蒸留水１５０ｍｌに溶かし、０．２Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム溶液１５０ｍｌを加えて３７℃で２４０時間反応させる。エチレングリコール１５０ｍｌを加えて反応を止めた後、水素化ホウ素ナトリウム５００ｍｇを加えて室温２４時間処理する。酢酸で反応を止め、水に透析した後、凍結乾燥する。
【００５３】
（２）還元（Ｔａｙｌｏｒ，Ｒ．Ｌ．ａｎｄ Ｃｏｎｒａｄ，Ｈ．Ｅ．（１９７２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１１，１３８３−１３８８による）精製試料５０ｍｇを蒸留水に溶かし、ＥＤＣ（１−ｅｔｈｙｌ−３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）２４９ｍｇを加えた後、０．１Ｎ塩酸でｐＨ４．７５に保ちながら１９時間反応させる。その後、２Ｍ水素化ホウ素ナトリウム溶液１０ｍｌを１時間かけて滴下し、その間ｐＨ７に保つ。さらに１時間攪はんした後、水に透析し凍結乾燥する。
【００５４】
結果を図４ならびに表６、７に示したが、酸化及び還元した試料については全く効果が認められなかった。このことは精製試料中の活性物質は確かに多糖類であり、中でも特にウロン酸が薬効に大きく寄与していることが示された。また還元前後の中性糖含量の比較から本試料に含まれるウロン酸のほとんどはガラクツロン酸であることがわかった。
【００５５】
【図４】
【表６】
【表７】
【００５６】
実施例４
実施例３の結果より多糖中のＤ−ガラクツロン酸が活性に重要であることがわかったので次にポリＤ−ガラクツロン酸の構造を有する植物由来のペクチン酸を用いてピューロマイシン惹起ネフローゼ及び四塩化炭素誘発肝障害モデルに対する効果を調べた。
ネフローゼモデルに対しては１０，４０ｍｇ／ｋｇを経口投与、２．５ｍｇ／ｋｇを筋肉内投与し、尿蛋白***量及び血清コレステロール、アルブミン量を測定した。肝炎モデルに対しては１．５ｍｇ／ｋｇを筋肉内投与し、血清ＧＯＴ，ＧＰＴ値を測定した。
【００５７】
結果を表８，９，１０に示したが、ネフローゼにおける尿蛋白***はペクチン酸の筋肉内投与で有意に抑制され、経口投与でも改善傾向を示した。また血清パラメータについても経口、筋肉内投与で明きらかな改善が見られた。ただ経口投与の場合はいずれの指標においてもＡＦの方が高い有効性を示した。
肝炎に対してはペクチン酸はＡＦと同等の効果を示し、血清ＧＯＴ，ＧＰＴ値を有意に抑制した。
【００５８】
これらの結果から丹参由来の多糖類（ＡＦ）に限らず由来の異なるポリＤ−ガラクツロン酸の構造を有する多糖類でもＡＦとほぼ同様の効果を示すことがわかった。
【００５９】
【表８】
【００６０】
【表９】
【００６１】
【表１０】
【００６２】
【発明の効果】
本発明によれば、ポリＤ−ガラクツロン酸を有効構成成分とする水溶性多糖類がネフローゼ症候群及び肝障害症状の寛解剤として提供される。
【００６３】
【図面の簡単な説明】
図１は実施例１におけるゲルろ過クロマトグラフィーにより展開された分画の波長２８０ｎｍ（Ａ280 ）および４８０ｎｍ（Ａ480 ）の吸光度、図２および図３は実施例１においてネフローゼ症候群モデルラットに本発明の多糖類（ＡＦ）を種々の投与量で経口投与した場合の尿蛋白***量、図４はＡＦを酸化または還元して同様に投与した場合の尿蛋白***量、をそれぞれ示すグラフである。
【産業上の利用分野】
本発明は、老人はもとより近年若年層で増加傾向にある腎臓疾患、とりわけ慢性腎不全に至る前段階であるネフローゼ症候群と診断された患者に対し、あるいはウイルス性及び薬物性肝炎等の肝障害の症状を有する患者に対し、通院可能で安全な経口及び筋肉内投与治療剤を提供する発明に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微小変化型ネフローゼの内科的な治療薬として、合成薬であるステロイド剤或いは抗血小板薬であるジピリダモールが用いられているが、長期間使用しなくてはならず、若年層に投薬する際には特に満月様顔貌，月経不順，めまい，頭痛，悪心，嘔吐など、重篤な場合には感染症，消化管出血，代謝異常，骨粗症，血栓症，副腎不全，精神障害などの副作用が懸念されている。
【０００３】
また、肝炎にはウイルス性、薬物性のものもあるがウイルス性のものが大半を占めており、それらの治療薬としてはインターフェロン、インターロイキン２のようなバイオロジカル・レスポンス・モディファイアー（ＢＲＭ）、グリチルリチンの静注用注射剤であるネオミノファーゲンＣなどが用いられている。しかしながらＢＲＭには発熱等の副作用が見られることにより長期投与には問題がある。またグリチルリチンは基本的には抗炎症剤であり、長期に使用する場合は血圧、電解質濃度の管理が必要となる。この他にも生薬成分であるサイコサポニン、サポニン、ゴミシンなどが知られているが、いずれも臨床応用されるには至っていない。
【０００４】
一方、ポリＤ−ガラクツロン酸
【化１】
を構成成分とする水溶性多糖類としては、たとえば水溶性ペクチン質（ｐｅｃｔｉｃ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）が知られている。これは柑橘類の果皮などを酸性水溶液で抽出し、必要に応じてさらに酸、アリカリ、酵素で脱メチル化し、アルコール等の有機溶媒を加えて沈澱させて得られる水溶性多糖類で、ポリＤ−ガラクツロン酸を主な構成成分とする。そしてポリＤ−ガラクツロン酸の構造式中のカルボキシル基のメチルエステル化率の大小により水溶性ペクチン質はペクチンとペクチニン酸に別けられ、また実際上メチルエステルが残っていないものはペクチン酸と呼ばれている。
【０００５】
水溶性ペクチン質はゼリー等の材料として主として食品工業に用いられるが、医薬としては粘膜被覆に供される程度でほとんど用いられていない。
【０００６】
本発明の一部においては、丹参の抽出成分が用いられるが、丹参は中国では、血液循環，血行停止の改善に良いとされ伝統的に使用されている薬草である。近年、血管拡張作用（大浦彦吉：和漢医薬学会誌．，５：２２７−２３７．，１９８８．）、降圧作用（中山医学院論：医歯薬出版，東京．，２５７−２５８．，１９８０．）、抗凝血作用（羅厚蔚ら：Ａｃｔａ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａＳｉｎｉｃａ．，２３（１１）：８３０−８３４．，１９８８．）、細胞内コレステロールの合成抑制作用（Ｓｕｎ Ｘｉ−ｍｉｎｇ；中草薬．，２２（１）：２０−２３．，１９９１．）、肝細胞保護（戚心広ら：中西医結合雑誌．，１１（２）：１０２−１０４．，１９９１．）及びラジカル消去作用（胡 天喜：上海中医薬雑誌，９：２８−３０．，１９８８．）などの多彩な生理活性作用があること、また腎機能の改善（大浦彦吉：第二回和漢薬の医学薬学的研究に関する日中シンポジウムｐｐ．１４８−１５７，１９８８．）、慢性腎疾患及び***の患者に対して有効（張 鏡人：上海中医薬雑誌．，１．１７−１８．，１９８１．）であることが内外において報告されているが、その本質については何等言及されていないか、言及されていても本願発明とは全く異なる低分子物質である。
【０００７】
また、丹参を原料とする腎疾患への治療薬の研究も盛んに行われていて、低分子のフェナントレンキノン類であるタンシノン類似物並びにカフェイン酸４量体であるマグネシウムリトスペルミン酸Ｂ等が単離されているが（Ｔ．Ｙｏｏｚａｗａ，Ｈ．Ｙ．Ｃｈｕｎｇ，Ｈ．Ｏｕｒａ，Ｇ．Ｎｏｎａｋａ，ａｎｄ Ｉ．Ｎｉｓｈｉｏｋａ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３６，３１６（１９８８））、何れも有機溶媒含有下で抽出される脂溶性の高い物質だけであり、まだ臨床応用には至っていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
腎疾患は大別して、糸球体由来の原発性とそれ以外の疾患に由来する続発性に分類され、前者が約８０％以上を占め、しかも低年齢層ほど多くて約９０％に達する。病理組織所見からは微小変化群，単状糸球体硬化症，膜性腎症，メサンギゥム増殖性腎症（ＩｇＡ腎症，非ＩｇＡ腎症），膜性増殖糸球体腎炎，半月体形成糸球体腎炎などに分類される。蛋白尿は臨床所見の特徴として、いずれの組織学的病型にも共通して認められ、重篤な場合にはネフローゼ症候群として診断されている。また近年腎臓疾患、特に腎臓の器質的な衰えにより誘発される疾患は老人にとどまらず若年層に増加しつつあるため、器質を改善して疾患を治療する副作用発現の少ない植物成分で水溶性のある経口或いは筋肉内に投薬し治療する薬剤の開発が望まれている。
【０００９】
また、肝炎は大別して、ウイルス性のものとアルコール等の薬物によるものがあるが、Ｂ型及びＣ型肝炎ウイルスによるものが圧倒的に多い。近年治療薬として特にインターフェロンがＣ型肝炎に対して有効であることが報告されており、使用頻度も高まってきている（飯野司郎ら：基礎と臨床．２６：３３９，１９９２；鈴木宏ら：肝・胆・膵・２３：１０６５，１９９１）。しかしながら、短期投与で発熱等のインフルエンザ様症状が表れ、長期投与でも体重減少、下痢、嘔吐、不整脈、脱毛、自己免疫異常等の副作用が見られる。またこれらの薬剤はすべて注射剤であることからより簡便に使用できる新たな治療薬あるいはインターフェロン等との併用補助薬として副作用発現の少ない生薬、漢方薬成分で水溶性のある経口或いは筋肉内に投与し治療する薬剤の開発が望まれている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、広く繁用されている蛋白尿***を顕著に起こし、さらに腎臓の器質変化を示すことで良く知られるピューロマイシンで惹起したラットのネフローゼ症候群モデルを利用して鋭意検討した結果、丹参の水抽出物より上記モデルに対して有効な多糖類が存在すること、その多糖類がポリＤ−ガラクツロン酸を主要構成成分とすることを見い出した。
【００１１】
本発明はこの知見を発展させたもので、（Ｉ）ポリＤ−ガラクツロン酸を有効構成成分とする水溶性多糖類よりなるネフローゼ症候群及び肝障害症状の寛解剤、（II）丹参から水または水性溶媒で抽出されうる下記の特性を有する多糖類
【００１２】
ポリガラクツロン酸を有効構成成分とする水溶性多糖類としては、一般に植物から抽出される水溶性ペクチン質が用いられ、それはガラクツロン酸のカルボキシル基が約７．５％以上メチルエステル化されているペクチンでも、メチルエステル化率がそれよりも低いペクチニン酸でも、実際上メチルエステルがすべて加水分解されているペクチン酸でもよい。水溶性ペクチン質は一般に少量のアラバン、ガラクタン、ラムノースなどを伴う場合が多いが、そのまま用いることができる。
【００１３】
本発明の水溶性多糖類としては、たとえば丹参から抽出される水溶性ペクチン質も用いられる。
【００１４】
丹参は植物丹参（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅ）の根および根状の茎であるが、同属植物の南丹参（Ｓ．ｂｏｗｌｅｙａｎａ Ｄｕｎｎ）、甘粛丹参（Ｓ．ｐｒｚｅｗａｌｓｋｉｉ Ｍａｘｉｍ）、雲南丹参（Ｓ．ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ Ｃ．Ｈ．Ｗｒｉｇｈｔ）等の根も用いられ、本発明ではこれらを総称して丹参という。
【００１５】
本発明で用いられる丹参の産地は特に限定されるものではないが、好ましくは中国，四川地区産の丹参が本発明の多糖類を効率よく抽出精製することができる。
【００１６】
丹参はできるだけ小片にして抽出するのが望ましい。抽出溶媒として水または水性溶媒が用いられ、水性溶媒としてはリン酸緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液または食塩等の塩類水溶液を用いるのが好ましい。
【００１７】
抽出溶媒のｐＨは約２〜約９に調整するのが好ましい。抽出は約５０〜約１００℃で行うのが好ましく、さらに好ましくは７０〜９０℃である。たとえば、丹参を予め５０〜１００℃好ましくは７０〜９０℃にした温水或いはｐＨ２〜９の範囲にある緩衝液または塩類溶液に入れるか、入れたあと温浴中などで所定の温度になるまで加温して抽出する。
【００１８】
かくして、１〜８時間、好ましくは３〜５時間抽出すれば粗出液が得られる。抽出液中に混在する丹参の残渣は目の粗い濾布やヌッチェなどで濾去することができる。
【００１９】
残渣を除去した抽出液は水で平衡化した無極性の多孔性ポリマー樹脂を充填材とするカラムクロマトグラフィーによりさらに精製する。このポリマー樹脂としては、たとえばＨＰ−２０およびＭＣＩ−ゲル（三菱化成社製）やアンバーライトＸＡＤ−２（オルガノ社製）などが挙げられる。
【００２０】
丹参の活性成分についてＭＣＩ−ゲルの吸着分画で、５０％メタノール溶液で溶出される低分子物質であるマグネシウムリトスペルミン酸Ｂが報告されており、発明者らも、同様の分画に蛋白尿***を抑制する活性のあることを確認した。しかし、非吸着部分を含め溶出された全画分について、詳細に蛋白尿***を抑制する作用を試験した結果、当初の予想に反して、素通り画分にも上記作用を示す成分のあることが判明した。この時点で、この処理からの素通り画分は、極性が低いことが予想され、又、蛋白質に固有の紫外部吸収スペクトルを示さないから蛋白質以外の成分であろうと思われた。
【００２１】
素通り画分の一部を、次いで２枚の限外ろ過膜（カットオフ，分子量３００，０００及び５０，０００の）システムに通し、濃縮且つ精製ステップの検討を行った。実際には分子量３００，０００以上、５０，０００〜３００，０００及び５０，０００以下の各物質群に分け、各成分についてピューロマインシン惹起ラットモデルを用いて、蛋白尿***を抑制する活性を試験した。その結果、強い活性が分子量５０，０００〜３００，０００に範囲のある分画に見られ、５０，０００以下にも弱い活性が見られた。
【００２２】
そこで、先の素通り画分の濃縮に分子量３０００のカットオフ，限外ろ過膜を用いた。この工程での限外ろ過膜はカットオフのサイズが同じであれば何れの種類のものでも本発明の物質の濃縮に用いることが可能である。
【００２３】
次に濃縮液中の活性成分をより狭い分子量範囲に限定するために、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる精製を行った。一般に蛋白質などの場合には、ゲルろ過クロマトグラフィーの担体としては、セファデックス及びセファロース類（ファルマシア社製），セルロファイン（生化学工業社製），バイオゲル（バイオラッド社製）などが使用されており、本発明の物質のクロマトグラフィーにも上記のものが使用できるが、好ましくは合成手段によって調製された材質によるクロマト材、例えばバイオゲルが本発明の物質の精製に適している。クロマト材には編目サイズ、即ち排除限界により各種のものがあるが、分画範囲として１００００〜３００，０００のものであればいずれでも構わない。発明者らは、好んでバイオゲルＰ−３０，−６０，−１００、中でもバイオゲルＰ−６０を使用した。そこで、濃縮液を水で平衡化したバイオゲルＰ−６０を充填したカラムに通した。モニターは暫定的に２８０ｎｍの吸収で行い、吸収のある分画と吸収のない分画をカラム容量の２倍量まで数分画に分け、次いでピューロマイシン惹起ラットモデルでの蛋白尿***の抑制作用を試験したところ高分子領域に活性を有する多糖類が溶出されていることがわかった。
【００２４】
この多糖類は過ヨウ素酸酸化あるいは還元処理すると活性を失う。また本物質は血小板凝集抑制作用，赤血球膜保護作用を有することがｉｎ ｖｉｔｒｏの実験結果より明らかになった。さらにピューロマイシン惹起ネフローゼモデルラットまたは四塩化炭素誘発肝障害モデルラットにおいてはラジカルが関与することが知られているが、本物質には直接ラジカルを消去する作用はないことがＥＳＲを用いた実験により示された。
丹参の抽出液を無極性ポーラスポリマー樹脂及びゲルろ過クロマトグラフィーで精製（精製画分）した多糖類の特性を下記のように試験した。
【００２５】
（１）全糖含量：フェノール硫酸法（Ｈｏｄｇｅ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ Ｈｏｆｒｅｉｔｅｒ，Ｂ．Ｔ．（１９６２）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）．Ｖｏｌ．１，ｐ．３３８）
試験溶液０．５ｍｌを試験管にとり５％（ｗ／ｖ）フェノール液０．５ｍｌを加え、濃硫酸２．５ｍｌを速やかに液面に直接に加えよくまぜ、室温に２０分保った後、４８０ｎｍの吸光度を測定する。標準溶液にはグルコース（１０〜９０μｇ／ｍｌ）水溶液を用いた。
【００２６】
（２）ウロン酸含量：メタヒドロキシジフェニル法（Ｂｌｕｍｅｎｋｒａｎｔｚ，Ｎ．ａｎｄ Ａｓｂｏｅ Ｈａｎｓｅｎ，Ｇ．（１９７３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４，４８４−４８９．）
試料溶液０．２ｍｌに０．０１２５Ｍホウ酸ナトリウムの濃硫酸溶液１．２ｍｌを添加し、氷冷後攪はんする。１００℃で５分間処理した後氷冷し、０．１５％メタヒドロキシジフェニルの０．５％水酸化ナトリウム溶液２０μｌを加え、５２０ｎｍの吸光度を測定する。標準溶液にはガラクツロン酸溶液を用いた。
【００２７】
（３）中性糖含量（アルジトールアセテート−ＧＣ−ＭＳ法）（Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ，Ｌ．Ｇ．ａｎｄ Ｐｉｐｅｒ，Ｃ．Ｖ．（１９７０）Ｔａｐｐｉ．５３，２５７−２６０．）
丹参の精製画分５０ｍｇを７２％（ｖ／ｖ）硫酸３ｍｌに溶かし、３０℃，１時間処理したものに蒸留水８４ｍｌを加え、１２０℃で１時間オートクレープする。内部標準としてイノシトール４ｍｇを加え、その３０ｍｌを水酸化バリウムを加えてｐＨ５．５に調整した後、遠心分離して上清を得る。その２５ｍｌに水素化ホウ素ナトリウム８０ｍｇを添加し、室温で２時間処理後、酢酸で反応をとめる。濃縮乾燥後、蒸留水に溶かしＤＥＡＥセファデックスカラムにかけ素通り画分を集める。濃縮乾燥後、無水酢酸とピリジンによりアセチル化した後、ジクロルメタンと１Ｎ塩酸の混液で抽出する。有機層を蒸留水で洗った後、濃縮し、アセトンに溶かしてガスクロマトグラフィーマススペクトロメトリー（ＧＣ−ＭＳ）にて定量した（カラム：Ｓｕｐｅｌｃｏ糖分析用キャピラリーカラムを使用）。また標品は上記の還元操作により処理して同様に分析した。
【００２８】
（４）分子量の測定
トーソーＨＰＬＣシステム（トーソー社製）にアサヒパックＧＳ−５２０（旭化成社製）カラム（７．６ｍｍＩＤｘ５００ｍｍ）を接続し、ミリＱ水を用いて、本願物質試料溶液１０μｌをカラムに付加して分子量を測定（温度：室温、流速：０．５ｍｌ／分、検出：ＲＩＤ）した。分子量マーカーにはアミロースキット（中埜酢店社製）：分子量１０２００，３０１００，７５２００，１１１４００，３６４２００を用い、これらの溶出パターンから得た検量線より、本願物質の分子量を算出した。
【００２９】
（５）ピューロマイシン惹起ネフローゼ症候群モデルラットによる評価
１）ネフローゼ症候群モデルラットの作製：ウィスター系雌性ラット（約９週令、体重約１５０ｇ）にピューロマイシンアミノヌクレオシド（：以下ピューロマイシン、シグマ社製）６０ｍｇ／ｋｇを１回、頸静脈内投与してネフローゼ症候群モデルラットを作製した（東條静夫ら：ネフローゼ症候群 京極方久 編，ソフトサイエンス社出版，４７９−４８８，１９８４）。
【００３０】
２）試料溶液の投与：ピューロマイシン投与の開始の日から１日１回各試料溶液を胃カニューレを通じて２１日間経口或いは筋肉内投与した。陰性対照群には注射用水を、陽性対照群にはジピリダモール溶液を用いた。
【００３１】
３）尿蛋白質量の測定：尿蛋白質量は、ピューロマイシン投与終了後５日目から、２〜３日おきに２４時間尿をラット代謝ケージを用いて採尿し、尿量を計測した。次いで遠心分離（３０００ｒｐｍｘ１０分）して得た上清１ｍｌにスルホサリチル酸３ｍｌを加え、室温で１０分間放置した後、波長６６０ｎｍの吸収を測定し、検量線より尿中のタンパク質濃度を求め、更に尿容量を乗じて尿中への総蛋白質***量を算出した。検量線作成に当たっては牛血清アルブミン（シグマ社製）を標準タンパク質に用いた。
【００３２】
４）血清コレステロール，血清アルブミン，血清中の総蛋白質量及び血清過酸化脂質の測定：ピューロマイシン投与終了後７日目，１４日目，２１日目に各群のラットをエーテル麻酔を施した後、静脈より採血し、血清中のコレステロール，アルブミン，総蛋白質量及び過酸化脂質量を測定した（いずれも和光純薬工業社製）。
【００３３】
（６）四塩化炭素誘発肝障害モデルによる評価
１）肝障害モデルの作成：Ｗｉｓｔａｒ系雌性ラット（９−１１週令、体重１６０ｇ前後）に対し、オリーブ油に等量の割合で混合した四塩化炭素（和光純薬製）溶液１．５ｍｌ／ｋｇを腹空内に１回投与することにより作成した。（炎症学書：炎症炎症動物実験法、実験的肝繊維症．医学書院出版，２５３−２７７）
【００３４】
２）資料溶液の投与：四塩化炭素投与３日前から投与前日まで試料を１日１回筋肉内投与あるいは７日前から投与前日まで経口投与を行った。陰性対象群には注射用水を投与した。
【００３５】
３）血清生科学的検査：四塩化炭素投与２４時間御にエーテル麻酔下で回胸、心臓より２ｍｌの血液を採血し、常温に１時間放置後、遠心分離して血清を得た。血清トランスアミナーゼ（ＧＯＴ：ｇｌｕｔａｍｉｃ ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ，ＧＰＴ：ｇｌｕｔａｍｉｃ ｐｙｒｕｖｉｃｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）活性の測定は和光純薬製キットを用いて行った。
【００３６】
４）統計解析：それぞれの測定データはすべて平均±Ｓ．Ｅで示し、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓのｔ検定により統計解析した。
【００３７】
下記の実施例に示されるように、本発明の多糖類は動物実験でネフローゼ症候群の寛解や肝障害症状の改善に有効であり、ネフローゼ症候群の寛解剤または肝障害症状改善剤として、通常成人１人当たり１日量、経口的に約１０〜１５０ｍｇ、筋肉内注射として約０．５〜１０ｍｇ投与することができる。
【００３８】
【実施例】
以下に実施例および試験例を挙げて本発明をさらに説明する。
実施例１
中国，四川地区産の丹参の根部の小片１０ｋｇに水８０Ｌを加え、投げ込みヒーターを投じ８０℃にした後、３時間攪はんしながら抽出した。抽出液中の根部残渣はヌッチェでろ過して取り除き、回収した根部残渣に更に水８０Ｌを加えて１回目と同様に処理して再抽出液を得た。１回目と２回目の抽出液（１３０Ｌ）を合わせ、減圧下、４０℃でエバポレーターを用いて濃縮し濃縮液（１０Ｌ）を得た。
【００３９】
次に、濃縮液をＨＰ−２０（４Ｌ，三菱化成社製）を充填したカラム（１１×４５ｃｍ）に負荷した。平衡化液及び展開液には水を用い、室温下でクロマトグラフィーを行い、素通り分画及び水洗浄分画（非吸着）液を回収した。カラムは５０％メタノール及びアセトニトリルで洗浄した後、最後に水に完全に置換して再使用した。上記非吸着画分は繰り返し３回程同様に処理して完全に非吸着分画の液（５５Ｌ）を得た。この全非吸着液は分子量カットオフ３０００の限外ろ過膜を装備した限外ろ過装置ＳＥＰ−１０１３（旭化成）を用いて限外ろ過濃縮し、通過液（分子量 約３０００以下，ＳＥＰ−ＯＵＴ）と非通過液（分子量 約３０００以上，ＳＥＰ−ＩＮ）を得た。濃縮した非通過液（ＳＥＰ−ＩＮ）を水で平衡化したバイオゲルＰ−６０を充填したカラム（１．５×１００ｃｍ）に付加し、水を展開液として用いクロマトグラフィーを行った。モニターは暫定的に波長２８０ｎｍで吸収を測定し、横軸に分画番号を、縦軸に各分画液の吸収を記載したグラフを作成し、吸収を示さない分画を中心に全糖の測定を行い、その測定結果を同じグラフに記載した（図１）。
【００４０】
目的の多糖類成分は分画番号１１から２２の分画液（ＡＦ）に得られ、ついで凍結乾燥して粉末（３０ｇ，ロットＡ）を得た。
ここで得た精製多糖類の特性を前述した試験法により試験した結果、以下の持性を得た。
【００４１】
１）糖含量（フェノール硫酸法）：７９％
【００４２】
２）分子量：２５９０００（標準多糖：アミラーゼキット、分子量１００〜３６０Ｋ）
【００４３】
３）ネフローゼ症候群モデルラットによる評価
精製試料１０ｍｇ／ｋｇ，４０ｍｇ／ｋｇを経口投与、０．５ｍｇ／ｋｇ，２．５ｍｇ／ｋｇを筋肉内投与したところ、図２，図３に示したようにいずれの場合も尿蛋白***が有意に抑制された。また表１，表２に示したように血清コレステロール（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）値，血清アルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ）値及びＡ／Ｇ比，血清過酸化脂質（ＭＤＡ）値においても有意な改善効果が認められた。
【表１】
４）四塩化炭素誘発肝障害モデルによる評価
製糖試料（ＡＦ）７ｍｇ／ｋｇ，３５ｍｇ／ｋｇを経口投与、０．３ｍｇ／ｋｇ，１．５ｍｇ／ｋｇを筋肉内投与したところ、表３に示したようにいずれの場合もＡＦ前投与群では血清ＧＯＴ，ＧＰＴ値の上昇が用量異存的に抑制された。
【００４５】
【表３】
実施例２
実施例１に記載の方法によりロットの異なる丹参原料より各々精製を行い、１に記載した以外に計３ロット（ロットＢ，Ｃ，Ｄ）の精製品を取得し、同様の特性評価を行った。
１）糖含量（フェノール硫酸）：ロットＢ（６５％），ロットＣ（８０％），ロットＤ（９３％）
（１）糖組成
【００４７】
【表４】
（２）中性糖組成（アルジトールアセテート−ＧＣ−ＭＳ法）
【表５】
（３）その他の糖：
ロットＢ，Ｃ，Ｄのいずれもアミノ糖、アルドヘキソース、２−デオキシ糖は含まない。
【００５０】
２）分子量：（標準多糖：アミロースキャット、分子量１００〜３６０Ｋ）
ロットＢ（１５０，０００），ロットＣ（２８０，０００），ロットＤ（２５０，０００）
【００５１】
３）ネフローゼ症候群モデルラットによる評価
薬効評価についてはいずれの精製品も実施例１で得られたものとほぼ同等の効果が得られた。
【００５２】
実施例３
活性の本体が糖であること及びウロン酸の薬効に対する関与について調べる目的で本精製品を以下の操作によって酸化及び還元し、それらの効果について調べた。投与量はネフローゼ症候群ラットにはそれぞれ４０ｍｇ／ｋｇを経口投与し、肝障害ラットにはそれぞれ１．５ｍｇ／ｋｇを筋肉内投与した。
（１）酸化（Ｎｏｂｌｅ，Ｄ．Ｗ．ａｎｄ Ｓｔｕｒｇｅｏｎ，Ｒ．Ｊ．（１９７０）Ｃａｒｂｏｈｙｄ，Ｒｅｓ．１２，４４８による）精製試料６００ｍｇを蒸留水１５０ｍｌに溶かし、０．２Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム溶液１５０ｍｌを加えて３７℃で２４０時間反応させる。エチレングリコール１５０ｍｌを加えて反応を止めた後、水素化ホウ素ナトリウム５００ｍｇを加えて室温２４時間処理する。酢酸で反応を止め、水に透析した後、凍結乾燥する。
【００５３】
（２）還元（Ｔａｙｌｏｒ，Ｒ．Ｌ．ａｎｄ Ｃｏｎｒａｄ，Ｈ．Ｅ．（１９７２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１１，１３８３−１３８８による）精製試料５０ｍｇを蒸留水に溶かし、ＥＤＣ（１−ｅｔｈｙｌ−３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）２４９ｍｇを加えた後、０．１Ｎ塩酸でｐＨ４．７５に保ちながら１９時間反応させる。その後、２Ｍ水素化ホウ素ナトリウム溶液１０ｍｌを１時間かけて滴下し、その間ｐＨ７に保つ。さらに１時間攪はんした後、水に透析し凍結乾燥する。
【００５４】
結果を図４ならびに表６、７に示したが、酸化及び還元した試料については全く効果が認められなかった。このことは精製試料中の活性物質は確かに多糖類であり、中でも特にウロン酸が薬効に大きく寄与していることが示された。また還元前後の中性糖含量の比較から本試料に含まれるウロン酸のほとんどはガラクツロン酸であることがわかった。
【００５５】
【図４】
【表６】
実施例４
実施例３の結果より多糖中のＤ−ガラクツロン酸が活性に重要であることがわかったので次にポリＤ−ガラクツロン酸の構造を有する植物由来のペクチン酸を用いてピューロマイシン惹起ネフローゼ及び四塩化炭素誘発肝障害モデルに対する効果を調べた。
ネフローゼモデルに対しては１０，４０ｍｇ／ｋｇを経口投与、２．５ｍｇ／ｋｇを筋肉内投与し、尿蛋白***量及び血清コレステロール、アルブミン量を測定した。肝炎モデルに対しては１．５ｍｇ／ｋｇを筋肉内投与し、血清ＧＯＴ，ＧＰＴ値を測定した。
【００５７】
結果を表８，９，１０に示したが、ネフローゼにおける尿蛋白***はペクチン酸の筋肉内投与で有意に抑制され、経口投与でも改善傾向を示した。また血清パラメータについても経口、筋肉内投与で明きらかな改善が見られた。ただ経口投与の場合はいずれの指標においてもＡＦの方が高い有効性を示した。
肝炎に対してはペクチン酸はＡＦと同等の効果を示し、血清ＧＯＴ，ＧＰＴ値を有意に抑制した。
【００５８】
これらの結果から丹参由来の多糖類（ＡＦ）に限らず由来の異なるポリＤ−ガラクツロン酸の構造を有する多糖類でもＡＦとほぼ同様の効果を示すことがわかった。
【００５９】
【表８】
【表９】
【表１０】
【発明の効果】
本発明によれば、ポリＤ−ガラクツロン酸を有効構成成分とする水溶性多糖類がネフローゼ症候群及び肝障害症状の寛解剤として提供される。
【００６３】
【図面の簡単な説明】
図１は実施例１におけるゲルろ過クロマトグラフィーにより展開された分画の波長２８０ｎｍ（Ａ280 ）および４８０ｎｍ（Ａ480 ）の吸光度、図２および図３は実施例１においてネフローゼ症候群モデルラットに本発明の多糖類（ＡＦ）を種々の投与量で経口投与した場合の尿蛋白***量、図４はＡＦを酸化または還元して同様に投与した場合の尿蛋白***量、をそれぞれ示すグラフである。
Claims (8)
- 下記の特性：Ａ．糖含量：６０〜１００％
Ｂ．分子量 １５０，０００〜３００，０００を有する水溶性ペクチン質多糖類よりなるネフローゼ症候群及び肝障害症状の寛解剤。 - 多糖類が丹参から水又は水性溶媒で抽出されたものである請求項１記載の寛解剤。
- 筋肉内または経口投与される請求項１、または２記載の寛解剤。
- 丹参から水または水性溶媒で抽出されうる下記の特性を有するペクチン質多糖類。
Ａ．糖含量：６０〜１００％
Ｂ．分子量 １５０，０００〜３００，０００ - 丹参を水または水性溶媒で抽出し、抽出液から残渣を除去した液を無極性多孔性ポリマー樹脂を通過させ、限外濾過で濃縮し、ついでゲル濾過クロマトグラフィーに付することを特徴とする請求項４記載の多糖類の製造法。
- 丹参の抽出をｐＨ約２〜約８で行う請求項５記載の製造法。
- 水性溶媒が緩衝液または塩類水溶液である請求項５記載の製造法。
- 丹参の抽出を約４０〜約１００℃で行う請求項５、６または７記載の製造法。
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