CN105137067B - 一种检测装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测装置,包括:支持液体流动的载体,在载体上包括:一个被分析物结合区,一个反应试剂区;一个封闭试剂区;所述的被分析物结合区包括一种特异性的结合分子;所述的封闭试剂区上包括一种或几种封闭试剂;所述的反应试剂区上包括一种或几种完成反应的反应试剂;其中,所述的封闭试剂比其中的一种反应试剂提前接触所述被分析物结合区上的特异结合分子;其中,反应试剂区位于被分析物结合区的上游,封闭试剂区与反应试剂区和被分析物结合区排列的方向垂直。本发明的装置可以减少检测的假阳性,提高检测的准确性。
Description
技术领域
本发明是关于检测装置,更具体的讲,是关于一种分析液体样品中是否存分析物质的检测装置。
背景技术
利用横向流动免疫试剂条来检测样品中被分析物的装置越来越普及,但是,检测的准确性仍然需要改进和提高。特别地,当检测样品中的一些细菌或病毒抗原或抗体的时候,需要准确的获得检测结果更为重要。例如,利用双抗体原理来检测血液样品中链球菌(Strep A)抗原的免疫检测装置中,通常需要把一种结合抗原的抗体固定在载体上,例如硝酸纤维素膜上,然后再在载体上处理一些封闭试剂,例如牛血清蛋白(BSA)或酪蛋白(Casein),然后再把载体干燥,最后制备成干的载体或试剂条。这样处理虽然可以提高检测的准确性,当大量规模化生产时,这样处理的过程过于烦琐,另外,这样的处理对某些被分析物的检测并不能明显提高检测的准确性,还是容易出现假阳性的结果,例如丙型肝炎病毒(HCV)抗原。
发明内容
为了解决以上问题,本发明提供一种检测装置和检测方法,可以明显提高检测结果的准确性,同时简化了生产工艺。
一方面,本发明提供一种检测装置,包括:支持液体流动的载体,在载体上包括:一个被分析物结合区,一个反应试剂区;一个封闭试剂区;所述的被分析物结合区包括一种特异性的结合分子;所述的封闭试剂区上包括一种或几种封闭试剂;所述的反应试剂区上包括一种或几种完成反应的反应试剂;其中,所述的封闭试剂比其中的一种反应试剂提前接触所述被分析物结合区上的特异结合分子。在一个优选的方式中,在没有施加液体样品到检测装置前,载体上各个区都以干的状态存在,在被液体湿润后,封闭试剂和反应试剂被液体向被分析物结合区移动。
在一些具体的方式中,为了让封闭试剂提前接触被分析物结合分子的方式可以是,让封闭试剂与被分析物结合区上的特异结合分子之间的距离小于反应试剂与被分析物结合区上的特异结合分子之间的距离。更具体的一个方式中,让封闭试剂区位于分析物结合区的上游并且位于反应试剂区的下游。另外,也可以让封闭试剂区位于被分析物结合区的下游,反应试剂区位于的被分析物结合区的上游。还可以是,反应试剂区位于被分析物结合区的上游,封闭试剂区与反应试剂区和被分析物结合区排列的方向垂直。
在一些优选的方式中,反应试剂包括带有颜色颗粒的特异结合被分析物的分子;封闭试剂比带有颜色颗粒的特异结合被分析物的分子提前接触所述的被分析物结合区上的特异结合分子。更为具体的方式中,带有颜色的颗粒标记物为金颗粒或乳胶颗粒。更为具体的方式中,被分析物结合区上的特异结合分子为被分析物(被分析物为抗原)的第一抗体,带有颜色颗粒的特异结合被分析物的分子为被分析物的第二抗体。
在一些具体方案中,特异结合被分析物的结合分子被固定在载体上。在另外的一些方式中,封闭区上的封闭试剂和反应试剂可以随液体移动。这里所说的“固定”是指那些试剂被处理在载体上而不能随液体一起移动,最优的是90-100%的试剂不能被移动,也可能是80-95%的试剂不能随液体在载体上移动;也可能是60-90%。这里所说的“移动“是指那些被处理在载体上的试剂能够被液体移动,最优的是80-100%的试剂被液体在载体上移动;也可能是60-95%的试剂被液体移动,还可能是1-60%的试剂被液体移动。
在一些具体的方式中,封闭试剂可以结合被分析物结合区上的特异结合分子上的非特异性结合位点.
另一方面,本发明还提供一种分析液体样品中被分析物质的方法,包括:提供一种支持液体流动的载体,该载体上包括:一个被分析物结合区,所述的结合区上包括一种特异结合分子;一种或几种完成反应的反应试剂;和一种或几种与被分析物结合区上特异性结合分子上的位点结合的封闭试剂;让检测试剂和封闭试剂随着液体向被分析物结合区上的特异结合分子移动;让封闭试剂比反应试剂提前接触所述的被分析物结合区上的特异结合分子。
在一个具体的方式中,被分析物结合区上特异性结合分子包括特异结合被分析物的一种抗体或抗体片段,反应试剂包括特异结合被分析物质的另一种抗体或片段。
在以上所有的实施方式中,被分析物质结合区可以位于硝酸纤维素膜上。另外,封闭试剂可以为血清蛋白或酪蛋白中的一种或两种。反应试剂还可以包括带颜色的颗粒标记物。被分析物可以包括丙肝病毒、乙肝病毒、乙肝表面抗原或艾滋病毒。封闭试剂可以带有正电荷。另外,在以上所有的实施方式中,载体和载体上的各个区在未进行检测前都可以为干的状态,当进行检测的时候,样品湿润载体以及载体上个各个区,其中反应试剂和封闭试剂能够被液体移动。
有益效果:
利用本发明的装置,可以明显提高检测结果的准确性,同时简化了生产该装置的生产工艺,降低了成本。
附图说明
图1为利用三明志双抗体夹心法检测样品中抗原的传统装置中试剂条的俯视结构示意图,图1A为未施加液体样品前的检测装置的俯视结构示意图;1B为施加液体样品后的检测装置的俯视结构示意图。在检测装置中,包括一个载体100,在100上包括被分析物结合区105,在105上包括一种特异被分析物质的结合分子101,例如被分析物的第一抗体;和一个反应试剂区106,在106上包括带有标记物质的特异结合被分析物的另一个特异结合分子,被分析物的第二抗体;被分析物结合区和反应试剂区被布置在同一个液体流动方向的上下游。
在进行检测的时候,把液体样品施加到载体100上,让其从反应试剂区域向被分析物结合区移动,在湿润的情况下,液体带着试剂区域上的试剂到达特异结合区105,如果样品中存在被分析物质,在被分析物结合区域上累积标记物质,从而通过计算标记物质累积的多少来判断被分析物的多少。
图2为本发明的一个具体实施方式,图2A为未施加液体样品前的检测装置的俯视结构示意图;图2B为施加液体样品后的检测装置的俯视结构示意图。在检测装置中,包括一个单一的载体100,在100上包括被分析物结合区105,在105上包括一种特异性的结合分子101,和一个反应试剂区106,在106上包括带有标记物质的特异结合被分析物的另一个特异结合分子;和一个封闭区域104,104包括封闭试剂103;被分析物结合区和反应试剂区被布置在同一个液体流动方向的上下游,而封闭区104被设置成与被分析物结合区垂直(图2A),同时让反应试剂区106与被分析物结合区105的距离大于封闭试剂区104与被分析物结合区105的距离,这样让流体在两个区间的流动时间不同,从而表现出达到结合区105的时间有先后。在进行检测的时候,把液体样品施加到载体100上,让其从反应试剂区域向被分析物结合区移动,另外把液体样品施加到载体104上,让液体沿着载体104向被分析物结合区移动,这样封闭试剂被液体带到被分析物结合区域先结合特异结合分子101上的一些位点,在湿润的情况下,液体带着试剂区域上的试剂随后到达特异结合区105,如果样品中存在被分析物质,在被分析物结合区域上累积标记物质,从而通过计算标记物质累积的多少来判断被分析物的多少。
图3为本发明的一个具体实施方式,图3A为未施加液体样品前的检测装置的俯视结构示意图;图3B为施加液体样品后的检测装置的俯视结构示意图。在检测装置中,包括一个载体100,在100上包括被分析物结合区105,在105上包括一种特异结合被析物质的第一抗体101,和一个反应试剂区106,在106上包括带有标记物质的特异结合被分析物的另另一个抗体;和一个封闭区域104,104包括封闭试剂103;被分析物结合区和反应试剂区被布置在同一个液体流动方向的上下游,而封闭区域被设置在反应试剂区和被分析物结合区之间。
在进行检测的时候,把液体样品施加到载体100上的反应试剂区106上,让其从反应试剂区域向被分析物结合区105移动,由于位置的不同,液体中的水分子运动的速度比较快,先行到达封闭区,这样封闭试剂先行通过载体到达被分析物结合区先结合第一抗体101上的一些位点,同时,也可以先行封闭载体上的一些大的孔,减少这些大孔对反应试剂的截获;在湿润的情况下,液体带着被标记的第二抗体随后到达特异结合区105,如果样品中不存在被分析物质,在被分析物结合区域上就不会发生非特异性的结合,不累积标记物质,从而通过计算标记物质累积的多少来判断被分析物的多少。
图4描绘了本发明的另一个优选的具体实施方式。图4A为试剂条结构的立体结构示意图,图4B为试剂条结构的俯视结构示意图。在检测装置中,构成样品垫18的载体材料为玻璃纤维;构成标记垫的材料为聚脂膜12,在标记垫上处理有带有乳胶颗粒的抗丙型肝炎病毒的第一种单克窿抗体;构成封闭垫的材料为聚脂膜14,在该膜上处理有酪蛋白(Casein);构成被分析结合垫15的材料为硝酸纤维素膜,在该膜上固定了特异结合丙型肝炎病毒的另一种单克窿抗体11;和构成吸水垫17的滤纸,他们首尾相连,让液体样品能够从样品垫18流到吸水垫17上。
图5为本发明的一个具体实施方式,图5A为未施加液体样品前的检测装置的俯视结构示意图;图5B为施加液体样品后的检测装置的俯视结构示意图。在检测装置中,包括一个载体100,在100上包括被分析物结合区105,在105上包括一种特异结合带有标记物质的结合分子101,和一个反应试剂区106,在106上包括带有标记物质的特异结合被分析物的特异结合分子;和一个封闭试剂区104,104包括封闭试剂103;反应试剂区106位于被分析物结合区的上游;封闭试剂区位于被分析物结合区的下游,封闭试剂区与特异结合分子的距离小于反应试剂区与特异结合分子的距离。
在进行检测的时候,把液体样品同时施加到载体100上的反应试剂区106上和封闭区上,这样封闭试剂先行通过载体到达被分析物结合区先结合特异结合分子101上的一些位点,在湿润的情况下,液体带着试剂区域上的试剂随后到达特异结合区105,如果样品中存在被分析物质,在被分析物结合区域上累积标记物质,从而通过计算标记物质累积的多少来判断被分析物的多少。
图6描绘了本发明的另一些优选的具体实施方式。图6A为试剂条结构的立体结构示意图,图6B为试剂条结构的剖面结构示意图。在检测装置中,构成样品垫18的载体材料为玻璃纤维;构成标记垫的材料为聚脂膜12,标记垫位于样品接收垫之上,在垫18的一端14靠近纤维素薄膜上处理封闭试剂;标记垫上处理带有颜色颗粒的抗被分析物质的一种抗体;构成被分析结合垫15的材料为硝酸纤维素膜,在该膜上固定了特异结合被分析物质的另一种抗体;和构成吸水垫17的滤纸。
标记说明:载体100;特异结合分子101,反应试剂区106,反应试剂102;封闭试剂103;封闭区域104;样品施加垫18;构成标记垫12;封闭垫14;被分析结合垫15;被分析物质的特异结合分子带或检测线(T线)11;吸水垫17。
具体实施方式
下面对本发明涉及的结构或这些所使用的技术术语做进一步的说明。
检测
检测表示化验、分析或测试一种物质或材料是否存在,比如,但并不限于此,化学物质、有机化合物、无机化合物、新陈代谢产物、药物或者药物代谢物、有机组织或有机组织的代谢物、核酸、蛋白质或聚合物。另外,检测表示测试物质或材料的数量。进一步说,检测还表示免疫检测,化学检测、酶检测等。
载体
支持液体流动的载体是指液体可以在载体上从一个区流动到另一个区。在一个具体的方式中,液体可以从反应试剂区或封闭试剂区流到到被分析物结合区,处理在反应试剂区或封闭试剂区上的试剂可以被液体移动到被分析结合区上。
一方面,这种液体的流动可以是载体本身材质的不同而让液体主动的被移动。在一个具体方案中,装置包含一种吸水材料,提供了支持液体流动的载体材料。“载体材料”是指支持液体流动和运输的一种材料。在一个具体方案中,载体材料是一种吸水材料。液体流过本装置是借助于毛细管运动作用实现的。在不同的具体方案中,载体材料可以是单一材料构成的条状物(图2),也可以是由多种在液体中相互作用的吸水材料组成,如图4或6所示,载体包括玻璃纤维组成的样品应用垫18、聚脂材料组成的标记垫12、聚脂材料组成的封闭垫14、硝酸纤维膜组成的被分析物结合垫15和滤纸组成的吸水垫17。”吸水的”材料是指那些可以稳定地吸收水分并使水分在其中通过毛细管运动作用运输的物质。吸水材料的例子包括硝化纤维,滤纸,玻璃纤维,聚酯和其它合适的物质。同时,这种载体材料还包括只提供一个或几个单独的毛细管的载体,液体通过这些单独的毛细管作用进行移动。
另一个方面,这种液体的流动也包括通过机械或外力的作用进行被动移动,例如当液体被施加在载体上时,例如由塑料,玻璃等非吸水材料组成的载体,让载体通过外力倾斜,液体在重力的作用下从一个区移动到另一个区。
在一个优选的方式中,处理在载体上的试剂以干的状态存在,当液体被施加到在载体上的时候,载体被液体湿润。
样品施加区
检测装置可以包括一个样品施加区。样品施加区可能包括一种缓冲液以溶解样品,也可能仅仅是一个载体上的加入样品的部位,但是也可能包含进行试验的其它试剂。例如,在那些可以结合样品中干扰反应的物质的“清道夫”抗体有用的具体方案中,“清道夫”抗体可以放在样品应用区,试剂区或者载体的其它区上。因此样品施加区也成了反应试剂区。进行试验时液体样品使用较方便,但是它也可能在试验条上变干,只能加水、缓冲液和其它试剂以溶解样品开始试验。样品本身可能是液体样品,也可能是被溶解的或者被制备成液体状的固体样品。样品应用区也可以包括样品应用垫18,在检测的时候,把液体样品施加到样品应用垫18上。
反应试剂
包含在试剂区中的完成反应的试剂是可以移动的。在一个具体的实施例子中,一些试剂能够附带在标记物质上,并与样品中的目标被分析物结合,形成带标记的被分析物。样品应用区和/或反应试剂区也可能包含特殊试验中需要的溶解样品和调节PH值的缓冲液。在一个具体方案中,试剂区包含一种特异性的结合分子(例如:一种抗体或抗体片断)和标记物质相连接。标记物质可以是任何合适的标记,例如金溶胶、荧光染料或者水溶性染料。特异性的结合分子能够特异性地结合目标被分析物的一个或者多个抗原决定基,从而标记被分析物。
反应试剂区、被分析物结合区
结合目标被分析物的标记提供产生了被分析物结合区的可以观察到的检测信号,当样品中含有被分析物时,被分析结合区域上出现标记物质。被分析物的特异性结合分子携带有试剂区的标记。当被分析物结合去上的特异性的结合分子捕获被分析物而且被标记了的被分析物在被分析物结合区被结合的时候,由于标记物质在这里积聚这个区就可以观察到。被分析物的特异性的结合分子也可以和表明样品中被分析物的存在或者与被分析物的存在相关联的分子相结合。牢固结合是指结合达到改变试验结果或者使试验结果不明显的程度。在一些具体方案中,特异性的结合分子可能是一种抗体或者一种抗体片段(例如,一种抗体的Fab区),一种抗原,一种结合配体的受体或者受体的片段,或者生物素-链霉菌抗生物素蛋白结合对的一个成分或者其它类型的结合对。
这样试剂区就可以提供标记物质,当样品流过试剂区的时候,被分析物结合了可以产生可检测信号的标记物质。“标记物质区块”是指载体上含有可以结合样品中可能存在的被分析物的物质的部位。因此一个试剂区就是一个标记区块。“标记”可以是产生可检测信号的任何合适的标记物质。例如,标记可以是可溶性颗粒,荧光颗粒,化学发光颗粒,金属或者合金(例如,胶体金),或者囊,特别是包含可见染料的脂质体。疏水溶胶也是有用的,疏水的有机染料或者色素在水中不可溶或者只有很有限的一小部分可溶。标记物质还可以是聚合体颗粒,例如有色的聚苯乙烯颗粒(例如,球状的)。其它有用的颗粒状的标记包括铁蛋白,藻红蛋白,藻胆素-蛋白,沉淀的或者可溶性的金属或者合金,真菌,海藻,或者细菌的色素或衍生物,例如细菌的叶绿素或者其它的植物原料。在某些具体方案中,标记是有色颗粒,例如右旋糖苷颗粒。
在其它的具体方案中,标记可能是被分析物的一种带有标记物质的特异性结合分子(例如,一种抗体)。例如,在一个具体方案中,目标被分析物是血液样品中的丙肝病毒(HCV),结合HCV的是带有金溶胶标记的抗HCV抗体。当样品到达试剂区(或者标记区块)时,样品中的HCV被金溶胶标记的抗HCV抗体结合。标记抗体并不干扰被分析物结合区上被固定的另一种特异结合分子(捕获分子)和标记的HCV相结合。例如,标记可以结合被分析物的一个部分,而捕获分子可以结合被分析物的另一个部分或者结合标记。HCV-抗-HCV抗体-金复合物移动到载体的下游。当复合物到达被分析物结合区时和捕获分子相结合形成金-抗HCV抗体-HCV-抗HCV抗体。捕获分子可能是HCV的另一种特异性结合分子,或者是结合HCV被分析物的半体的特异性结合分子。当金-抗-HCV特异性结合分子-HCV-抗-HCV特异性结合分子复合物结合到被分析物结合区时,被分析物结合区被复合物上的金标记着色并且在被分析物结合区金标记变得肉眼可见。在一个具体方案中,特异性的结合分子是抗体或者抗体片段。标记和捕获结合分子能够结合被分析物上不同的抗原决定部位,在一个具体方案中,标记的特异性结合分子结合了β-hCG,而捕获结合分子结合了α-hCG。
“抗体”是指免疫球蛋白,无论是天然的还是部分或者全部合成的。这个术语还包括其中保持结合能力的抗体的衍生物,也包括任何含有与免疫球蛋白的结合域同源的或者很大程度上同源的结合域的蛋白质。这些蛋白质可能是源自天然物质,也可能是部分或者全部合成的。一种抗体可能是单克隆的或者是多克隆的。一种抗体可能是任何免疫球蛋白类型中的一员,包括任何人类的免疫球蛋白类型:IgG,IgM,IgA,IgD,IgG和IgE。“抗体片段”是抗体的衍生物或者抗体的小于全长的一个部分。抗体片段能够保留至少一个全长抗体的结合能力的显著位点。抗体片断的例子包括Fab,Fab',F(ab')2,scFv,Fv,dsFv二聚体,和Fd碎片,但是不仅仅包括以上这些。
抗体片段可以由任何方式生成。例如,抗体片段可以通过酶解或者化学裂解一个完整的抗体来生成,或者也可以通过从编码部分抗体序列的基因重组。换句话说,抗体片段可以部分地或者全部地重组产生。抗体片段可以是任意的单链抗体片段。换句话说,抗体片段可以包含多条相互联结的肽链,例如,通过二硫键相联结。抗体片段也可以是任意的一种多分子复合物。一个有功能的抗体片段通常包含至少大约50个氨基酸,而更多的抗体片段通常包含至少大约200个氨基酸。
单链Fvs(scFvs)是重组的抗体片段,它仅由可变轻链(VL)和可变重链(VH)相互以多肽链共价结合。VL和VH中一方具有胺基端区域。多肽链长度和组成是可变的,其长度可以使两个可变域相互桥联并且对原子的排列没有严重影响。多肽链通常主要由甘氨酸和丝氨酸残基延伸构成,其中有一些谷氨酸和赖氨酸残基散在分布以增加其溶解度。“二聚体”是指单链Fvs的二聚物。二聚体的单体包含的肽链通常比大多数单链Fvs的短,并且它们显示出形成二聚物的倾向。
“Fv”片段由一个VH和一个VL域以非共价相互连接组成。术语“dsFv”在这里是指包含一个稳定VH-VL对的分子间二硫键的Fv。“F(ab')2”片段是抗体的一个片段,本质上和用胃蛋白酶在pH 4.0-4.5时消化免疫球蛋白(通常是IgG)得到的片段相同。这个片段也可以重组合成。“Fab'”片段是一种抗体片段,本质上和通过减少F(ab')2片段上的两条重链相互连接的双硫键得到的片段相同。Fab'片段也可以重组合成。“Fab”片段是一种本质上和用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白(通常IgG)得到的片段相同的抗体片段。Fab片段也可以重组合成。Fab片段上的重链片段是Fd碎片。
封闭试剂 封闭试剂区
包括在封闭试剂区的封闭试剂是可移动的。任何不会实质影响特异结合分子之间的结合反应的试剂都可以作为封闭试剂,例如一些惰性蛋白,包括酪蛋白或白蛋白,例如牛血清白蛋白。把封闭试剂处理在载体上的技术也是本领域常见的技术手段,例如把封闭试剂配置成溶液然后浸泡载体,然后把载体干燥。当然,也可以在封闭试剂中添加其他的试剂来改善封闭试剂的溶解性能或结合载体的性能,例如把酪蛋白溶解在PH值为7-9.5Tris缓冲溶液中。当液体经过封闭试剂区的时候,被处理在该区上的封闭试剂被液体湿润然后随液体一起向被分析物结合区域移动。在一个具体的例子中,在湿润的情况下,封闭试剂先于反应试剂接触被分析物结合区上的特异结合分子。在另一个具体的例子中,检测装置中的各个区为干的时候,当需要检测的时候,向载体上施加液体样品让装置中的各个区顺次湿润,然后完成检测。在这种湿润的情况下,我们惊讶的发现封闭试剂对载体上的孔或者特异结合分子上的位点具有良好的封闭效果。
让封闭试剂先于反应试剂接触被分析物结合区上的特异结合分子的方式有多种。
在一个具体的方式中,例如图5所示,让封闭区104和反应试剂区106位于被分析物结合区105的两侧,让封闭区上的封闭试剂103与特异结合分子101的距离小于反应试剂与特异结合分子的距离,这里,反应试剂102包括目的被分析物的一种抗体,被分析物结合区105上的特异结合分子101包括目的被分析物的另一种抗体,该抗体被固定在结合区105上。反应试剂和封闭试剂也被处理在载体上,他们可以随液体样品移动。在检测的时候,向反应试剂区106上施加液体样品,让反应试剂随液体样品向特异结合分子101移动,同时,向封闭区104施加液体样品,让封闭试剂随液体样品向特异结合分子101移动,当载体的材质一样的时候,封闭试剂会先于反应试剂到达被分析物结合区域105并与特异结合分子101上的一些位点结合。被封闭的位点可能是特异结合分子上的一些非特异位点。随后,反应试剂到达被分析物特异结合分子101上,由于一些非特异的位点被结合后,如果样品中不存在目的被分析物质,反应试剂就不会和特异结合分子发生特异结合,让检测结果为准确的阴性结果。除了以上方式外,还可以改变施加样品的先后顺序让封闭试剂先于反应试剂接触被分析物结合区上的特异结合分子。例如,先施加样品到封闭区103上,然后再施加样品到反应试剂区106上;或者直接在被分析物结合区域上施加微量的封闭试剂溶液,例如1-10微升,然后再在反应试剂取上施加液体样品。
在另一个具体的方式中,让封闭试剂区105和反应试剂区106都位于被分析结合区105的上游,同时,让封闭试剂区位于反应试剂区和被分析结合区之间,如图3所示。在进行测试前,载体为干的状态;当把液体样品施加到反应试剂区上,液体样品首先和反应试剂接触并带动反应试剂向被分析物结合区移动,由于反应试剂事先以干的状态存在于反应试剂区上,需要大约一小段时间,大约5-20秒钟,让这些干的试剂被液体样品溶解或湿润。在此过程中,由于液体样品中的部分水分子运动速度较快,可以提前接触位于下游的封闭区域并湿润其上的封闭试剂,让封闭试剂快于反应试剂向被分析物结合区域移动。提前移动的部分封闭试剂提前经过被分析物结合区域,一方面可能对位于封闭试剂和被分析物结合区域之间的载体,例如硝酸纤维素膜,进行预先的处理,另一方面也可能提前封闭该区域上特异结合分子上一些非特意性结合位点,另外,还可能中和被分析结合区上特异结合分子的电荷等。这样,让随后的反应试剂,例如带有标记物质的特异结合被分析物质的抗体或片段与被分析物特异结合区域上的特异结合分子,如特异结合被分析物的另一抗体或片段进行特异性的结合,减少了非特异性的结合,提高了检测的准确性。
在另一个方式中,组成检测装置的是硝酸纤维素膜试剂条,包括液体样品施加垫18,在样品垫上设置一个标记垫12并让标记垫远离封闭试剂;在样品施加垫的一端14处理有封闭试剂。和一个硝酸纤维素膜15,在薄膜上处理特异结合分子带16和与薄膜15连接的滤纸17,图6B表示试剂条的剖面示意图;图6A表示试剂条的立体结构示意图。当把液体样品施加到施加垫上,部分液体样品沿着箭头方向直接流到封闭试剂区域14上,而另一部分液体样品需要先湿润标记垫14,湿润标记垫上预先被处理的干的带有颜色颗粒的特异结合分子;由于液体流向的路径不同而让封闭试剂在湿润的条件下先于标记垫14上的试剂接触被分析结合区域上的特异结合分子。
图2为本发明的一个具体实施方式,图2A为未施加液体样品前的检测装置的俯视结构示意图;图2B为施加液体样品后的检测装置的俯视结构示意图。在检测装置中,包括一个单一的载体100,在100上包括被分析物结合区105,在105上包括一种特异性的结合分子101,和一个反应试剂区106,在106上包括带有标记物质的特异结合被分析物的另一个特异结合分子;和一个封闭区域104,104包括封闭试剂103;被分析物结合区和反应试剂区被布置在同一个液体流动方向的上下游,而封闭区104被设置成与被分析物结合区垂直(图2A),同时让反应试剂区106与被分析物结合区105的距离大于封闭试剂区104与被分析物结合区105的距离,这样让流体在两个区间的流动时间不同,从而表现出达到结合区105的时间有先后。在进行检测的时候,把液体样品施加到载体100上,让其从反应试剂区域向被分析物结合区移动,另外把液体样品施加到载体104上,让液体沿着载体104向被分析物结合区移动,这样封闭试剂被液体带到被分析物结合区域先结合特异结合分子101上的一些位点,在湿润的情况下,液体带着试剂区域上的试剂随后到达特异结合区105,如果样品中存在被分析物质,在被分析物结合区域上累积标记物质,从而通过计算标记物质累积的多少来判断被分析物的多少。
图4描绘了本发明的另一个优选的具体实施方式。图4A为试剂条结构的立体结构示意图,图4B为试剂条结构的俯视结构示意图。在检测装置中,构成样品施加垫18的载体材料为玻璃纤维;构成标记垫的材料为聚脂膜12,在标记垫上处理有带有乳胶颗粒的抗丙型肝炎病毒的第一种单克窿抗体;构成封闭垫的材料为聚脂膜14,在该膜上处理有酪蛋白;构成被分析结合垫15的材料为硝酸纤维素膜,在该膜上固定了特异结合丙型肝炎病毒的另一种单克窿抗体11;和构成吸水垫17的滤纸,他们首尾相连,让液体样品能够从样品垫18流到吸水垫17上。
封闭试剂“先于”反应试剂接触被分析物结合区上的特异结合分子中的“先于”在本发明可以表示为提前,提早,早于。可能有1-99%的封闭试剂先于1-99%的反应试剂接触被分析物结合区上的1-99%的特异结合分子;也可能有10-99%的封闭试剂先于10-90%的反应试剂接触被分析物结合区上的20-99%的特异结合分子;还可能有50-99%的封闭试剂先于30-80%的反应试剂接触被分析物结合区上的10-80%的特异结合分子。
图1为传统装置中试剂条的俯视结构示意图,图1A为未施加液体样品前的检测装置的俯视结构示意图;1B为施加液体样品后的检测装置的俯视结构示意图。在检测装置中,包括一个载体100,在100上包括被分析物结合区105,在105上包括一种特异被分析物质的结合分子101,通常,在检测前,事先在被分析物质结合区10上处理有封闭试剂并且被干燥;和一个反应试剂区106,在106上包括带有标记物质的特异结合被分析物的另一个特异结合分子;被分析物结合区和反应试剂区被布置在同一个液体流动方向的上下游;这种试剂条为干的试剂条。在进行检测的时候,把液体样品施加到载体100上,让其从反应试剂区域向被分析物结合区移动,在湿润的情况下,液体带着试剂区域上的试剂到达特异结合区105,如果样品中存在被分析物质,在被分析物结合区域上累积标记物质,从而通过计算标记物质累积的多少来判断被分析物的多少。
检测方法
另一方面,本发明还提供一种分析液体样品中被分析物质的方法,包括:提供一种支持液体流动的载体100,该载体上包括:一个被分析物结合区105,所述的结合区上包括一种特异结合分子101;一种或几种完成反应的反应试剂102;和一种或几种封闭试剂103;让检测试剂和封闭试剂随着液体向被分析物结合区上的特异结合分子移动;让封闭试剂比反应试剂提前接触所述的被分析物结合区上的特异结合分子。在一个具体的方式中,被分析物结合区上特异性结合分子包括特异结合被分析物的一种抗体或抗体片段,反应试剂包括特异结合被分析物质的另一种抗体或片段。在一个具体方式中,封闭试剂包括与被分析物结合区上特异性结合分子上的位点结合的试剂。
与传统的技术相比,本发明的这种装置或方法可以很好地提高检测的准确性,其原因可能是:在湿润情况下,封闭试剂对一些分子上的位点或载体上的孔具有更好的封闭作用,同时又不对载体本身产生一些不利的影响。因为在传统的封闭技术中,需要先把载体浸泡在封闭溶液中,然后再对载体进行干燥,在这样的处理过程中,可能让载体上的一些表面活性试剂被封闭溶液洗脱掉,从而影响了载体的性能。另外,本发明装置中的封闭试剂可以在湿润的情况下带负电荷,可以提前接触被分析结合区上带有正电荷的特异结合分子,中和了特异分子上的正电荷,减少特异结合分子和反应试剂的非特异性的结合。特别地,当反应试剂中包括有金颗粒标记的抗体的时候,它常带有负电荷,被分析物结合区上的特异结合分子的电荷被封闭试剂中和后减少了对金颗粒抗体的结合,从而提高了检测的准确性。
样品的类型
任何类型的样品都能够用本发明的装置进行试验,包括体液(例如,尿液和其它体液,以及临床样品)。液体样品可能源自固体的或者半固体的样品,包括粪,生物组织和食物样品。这些固体的和半固体的样品可以通过任何适合的方法转变成液体样品,例如在一种适当的液体中混合,跺碎,浸软,孵育,溶解或者酶解固体样品(例如,水,磷酸盐缓冲液或者其它缓冲液)。“生物样品”包括源自活的动物、植物和食物的样品,也包括尿液、唾液、血液和血液成分、脑脊液、***拭子,***、粪便、汗液、分泌物、组织、器官、肿瘤、组织和器官的培养物,细胞培养物和那里的条件介质,不管是人的还是动物的。食物样品包括加工过的食物成分和最后的产品,肉,奶酪,酒,牛奶和饮用水。植物样品包括源自任何植物、植物组织、植物细胞培养物和那里的条件介质的样品。“环境样品”是那些源自环境的样品(例如,湖水样品或者其它水体的样品,污水样品,土壤样品,地下水样品,海水样品,废物废水的样品)。污水和相关的废物也可以包含在环境样品中。
被分析物的类型
用本发明可以分析任何被分析物质。能够用本发明稳定检测的被分析物的例子包括(但是不仅仅包括)人绒毛膜***(hCG),***(LH),卵巢刺激素(FSH),丙肝病毒(HCV),乙肝病毒(HBV),乙肝表面抗原,艾滋病病毒和任何滥用的药物。被分析物能够在任何的液体或者液化样品中检测到,例如尿液,唾液,口水,血液,血浆,或者血清。其它的被分析物的例子还有肌氨酐酸,胆红素,亚硝酸盐,蛋白质(非特异性的),血液,白细胞,血糖,重金属和毒素,细菌成分(例如,特定类型的细菌的特殊的蛋白质和糖分,例如大肠杆菌0157:H7,金黄色葡萄球菌,沙门氏菌,产气荚膜梭菌,弯曲杆菌,单核增生李斯特菌,肠炎弧菌,或者腊状芽孢杆菌)。任何其它的适合侧流试验形式的被分析物都可以用本装置检测。
试验
封闭试剂在胶体金侧向层析诊断试纸条中的应用
下面的实施例将进一步说明本发明,但无论如何不应理解为对本发明范围的限制。结合说明书附图4来说明本试验所使用的试剂条的结构和相关材料和试剂的准备。
1.试验材料
1.1蛋白原料和材料
材料 | 批号 | 过期日期 |
HCV抗原C66(金标标记) | F090609HCV-1 | 2009.10.15 |
HCV抗原C55 | 090527 | 2009.10.27 |
Tris盐缓冲溶液 | 9T91JA | 2011.07.07 |
酪蛋白Casein | 048K0067 | 2011.10.14 |
Borax盐缓冲溶液 | 048K0009 | 2013.02.21 |
表面活性剂S19 | F20080110 | 2010.01.10 |
NaCl | 108K0051 | 2014.09.30 |
Na2PH4 | 097K0022 | 2010.08.21 |
BSA | BAH62-900 | 2014.02.28 |
玻璃纤维 | 4072402 | 2011.06.03 |
Millipore NC(硝酸纤维膜) | R6MN95421 | 2009.12.10 |
1.2供试阳性血清和阴性血清
2.实验方法
2.1处理封闭垫14溶液的配制:
Tris: 2.5mg/ml
Casein: 2.5mg/ml
PH=8.0
2.2处理金标垫12溶液的配制:
Tris: 2.5mg/ml
BSA: 10.0mg/ml
PH=8.0
2.3处理样品垫18溶液的配制:
Borax: 2.5mg/ml
Casein: 2.5mg/ml
S19: 0.5%
PH=8.0
2.4处理NC膜15上T线11溶液的配制:
NaCl: 8.8mg/ml
Na2PH4: 2.1mg/ml
PH=7.4
2.5金标垫12的处理
用金标垫溶液稀释用金颗粒标记过的HCV抗原C66(为本公司自行标记,抗原从深圳菲鹏公司购买),让终浓度至OD3.5。稀释好的金标处理液1.5毫升均匀的喷涂到玻璃纤维(长×宽=0.8cm×30.1cm)上,并置于37℃干燥箱中过夜烘干,然后切割成长×宽=0.8cm×0.6cm的小片,作为标记垫g。
2.6样品垫18和封闭垫14的处理
分别用等体积的样品垫或封闭垫溶液直接喷涂到玻璃纤维上,溶液中的试剂如表1所列的进行处理(样品垫的长×宽=1.8cm×0.6cm,封闭垫的长×宽=0.5cm×0.6cm),处理后并置于37℃干燥箱中过夜烘干。
表1样品垫和封闭垫的处理
处理 | Tris | Casein | S19 | PH |
样品垫a | 2.5mg/ml | 2.5mg/ml | 0.5% | 8.0 |
样品垫b | 2.5mg/ml | 无 | 0.5% | 8.0 |
封闭垫c | 2.5mg/ml | 无 | 0.5% | 8.0 |
封闭垫d | 2.55mg/ml | 2.5mg/ml | 0.5% | 8.0 |
2.7T线的处理
T线溶液稀释HCV抗原C55溶液(抗原为公司自行生产),并以1.0ul/cm,的喷量喷涂于NC膜15上(宽为2.5厘米),记为NC膜e。并放在37℃干燥箱中过夜烘干。
2.8传统膜封闭
用封闭垫处理溶液1ml均匀喷涂到处理过T线的NC膜(宽为2.5厘米)上,然后放到37℃干燥箱中过夜烘干,作为NC膜f。
3.试剂条的组装
按照图4所示的结构和顺序,对样品垫18,标记垫12,封闭垫14(如果有)和NC膜15,以及滤纸垫17进行组装,让样品垫18叠加在标记垫12上,让标记垫12叠加在封闭垫14上,让封闭垫14叠加在NC膜15上,让滤纸17叠加在NC膜上,让试剂条的宽度为0.6厘米;如果没有封闭垫的试剂条,在组装的时候,让标记垫12直接叠加在NC膜15上。
4.操作方法
在试剂条的样品垫上滴加2滴供试阳性血清或阴性血清,然后在5分钟内用肉眼观察T线上的颜色深浅,并与标准的色卡进行比较来判读检测结果(“+”表示阳性,“-”表示阴性)。
表2色卡标准与检测结果
试验1比较Casein在样品垫中的对消除假阳性的作用
处理
实验结果
H | M2 | N1 | N2 | N3 | N4 | N5 | N6 | N7 | |
试剂条1 | 6+ | +5 | +3.5 | +4 | +3.6 | +3.5 | +4 | +4 | +3.5 |
试剂条2 | 7+ | +6 | +6 | +6 | +6 | +6 | +7 | +6 | +6 |
从以上结果可以看出,当在样品垫上处理有酪蛋白试剂后,不会影响对阳性样本准确性的检测,而在检测阴性样本的时候,虽然可以减轻发生假阳性的程度,即在T线上的颜色深度显著降低,但是信号反应仍然为阳性。
实验2比较同浓度Casein在封闭垫和样品垫中消除假阳性的作用
处理
试验结果
H | M2 | N1 | N2 | N3 | N4 | N5 | N6 | N7 | |
试剂条1 | +6 | +5 | +3.5 | +4 | +3.6 | +3.5 | +4 | +4 | +3.5 |
试剂条3 | +6 | +5 | -1 | -1 | -2.5 | -1 | -2 | -1 | -1 |
试剂条4 | +6 | +5 | -1 | -1 | -2 | -1 | -2 | -1 | -1 |
从以上实验结果可以看出,无论样品垫里是否处理有酪蛋白,在封闭垫上处理有酪蛋白的试剂条都可以显著地消除阴性样本的假阳性结果,让检测结果更加准确;同时不影响阳性样本的检测准确性。
实验3验证无Casein的封闭垫是否同样具有消除假阳性的作用
处理
实验结果
H | M2 | N1 | N2 | N3 | N4 | N5 | N6 | N7 | |
试剂条5 | +6 | +5 | +4 | +4 | +5 | +4 | +4 | +4 | +4 |
试剂条1 | +6 | +5 | +3.5 | +4 | +3.6 | +3.5 | +4 | +4 | +3.5 |
试剂条4 | +6 | +5 | -1 | -1 | -2 | -1 | -2 | -1 | -1 |
从以上结果可以看出,当不存在封闭垫或者存在封闭垫但无封闭试剂的时候,仍然对降低HCV假阳性无显著影响;相反,当封闭垫上处理有封闭试剂酪蛋白的时候,可以消除阴性标本引起的假阳性检测结果。
实验4比较封闭垫封闭法和膜封闭法消除假阳效果。
处理
实验结果
H | M2 | N8 | N9 | N10 | N11 | N12 | |
试剂条3 | +5 | +4 | -2 | -1 | -2 | -1 | -2 |
试剂条6 | +7 | +5 | -2 | -1 | -2.5 | -1 | -1 |
试剂条7 | +9 | +6 | +6 | +6 | +6 | +7 | +6 |
从试验4的结果来看,封闭垫封闭法和喷涂膜封闭法对消除假阳性的效果,发现两者效果差不多,同时,还发现使用传统封闭的方法,对阳性灵敏度有较大的影响。但是利用封闭垫封闭法,对灵敏度的影响不大,并且能简化生产工艺,降低生产成本,提高生产效率。
Claims (12)
1.一种检测装置,包括:支持液体流动的载体,在载体上包括:一个被分析物结合区,一个反应试剂区;一个封闭试剂区;所述的被分析物结合区包括一种特异性的结合分子;所述的封闭试剂区上包括一种或几种封闭试剂;所述的反应试剂区上包括一种或几种完成反应的反应试剂;其中,所述反应试剂区与被分析物结合区的距离大于封闭试剂区与被分析物结合区的距离;其中,反应试剂区位于被分析物结合区的上游,封闭试剂区与反应试剂区和被分析物结合区排列的方向垂直。
2.如权利要求1所述的装置,其中,封闭试剂与被分析物结合区上的特异结合分子之间的距离小于反应试剂与被分析物结合区上的特异结合分子之间的距离。
3.如权利要求1所述的装置,其中,所述的反应试剂包括特异结合被分析物的分子;被分析物结合区上的特异性结合分子能够结合反应试剂区上的特异结合被分析物的分子。
4.如权利要求3所述的装置,其中,反应试剂还包括带有颜色的标记颗粒。
5.如权利要求3所述的装置,其中,被分析物质结合区位于硝酸纤维素膜上。
6.如权利要求3所述的装置,其中,所述的封闭试剂和反应试剂随液体向被分析物结合区移动。
7.如权利要求1所述的装置,其中,反应试剂包括与颜色颗粒连接的特异结合被分析物的分子;封闭试剂比带有颜色颗粒的特异结合被分析物的分子提前接触所述被分析物结合区上的特异性结合分子。
8.如权利要求7所述的装置,其中,被分析物结合区上的特异结合分子为被分析物的第一抗原,带有颜色颗粒的特异结合被分析物的分子为被分析物的第二抗原。
9.如权利要求8所述的装置,其中,被分析物结合区上的特异结合分子特异结合带有颜色颗粒的特异结合被分析物的分子。
10.如权利要求1-9之一所述的装置,其中,所述被分析物结合区上的特异性的结合分子固定在载体上。
11.如权利要求1-9之一所述的装置,其中,所述的封闭试剂为血清蛋白或酪蛋白中的一种或两种。
12.如权利要求1-9之一所述的装置,其中,所述的封闭试剂结合特异结合分子上的非特异性结合位点。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |