CN104056468B - 无需两性电解质的分离两性物质的电聚焦方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种无需两性电解质的分离两性物质的电聚焦方法；该方法包括如下步骤：在色谱柱中填充抗对流介质；沿纵向填充色谱柱制作pH逐渐变化的缓冲液，使在色谱柱中形成从入口到出口pH值逐渐变化；将样品加到入口处，外加与色谱柱内流体流动方向平行的电场，发生电聚焦；不断加入终止pH值缓冲液，使pH梯度随缓冲液逐渐向柱出口迁移，并将聚焦在不同pH处的样品洗脱出色谱柱；流出色谱柱的缓冲液进入在线检测及收集器，实现在线收集。本发明利用小分子有机酸、有机碱制作不同的pH缓冲液，并在色谱柱中制作pH梯度缓冲液带，通过外加电场实现两性物质的聚焦分离，为具有两性的极性小分子物质提供了同时实现分离和浓缩的半制备技术。

Description

无需两性电解质的分离两性物质的电聚焦方法

技术领域

本发明涉及两性物质的高效分离技术，具体涉及一种无需两性电解质的分离两性物质的电聚焦方法。

背景技术

IEF是20世纪60年代中期问世的一种利用pH梯度介质分离PI不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达0.01个pH单位，特别适合于分离分子量相近而pI不同的蛋白质组分。IEF需要在一定抗对流介质(如凝胶)中加入特殊两性电解质，同时在正极端吸入酸液，如硫酸、磷酸或乙酸等，在负极端引入碱液，如NaOH溶液、氨水等。当外加电场时，电解质和两性样品开始移动，混合物中pH最低的两性电解质分子，带负电荷最多，向正极移动速度最快，当移动到正极附近的酸液界面时，pH突然下降，这一分子不再向前移动而停留在此区域内。这类方法必需使用两性电解质，因为两性电解质具有一定的缓冲能力，使其周围一定的区域内的pH保持在其等电点范围。pH稍高的第二种两性电解质，也移向正极，定位于第一种两性电解质之后。这样，经过一定时间后，具有不同pI的两性电解质按各自的pI依次排列，形成了从正极到负极pH值逐步上升的梯度，两性样品也被富集在与其pI相等的区域，从而按照pI分离。这一技术的分辨率高，且有浓缩效应，用于许多蛋白质样品的纯度分析或分离纯化。但不能进行样品的在线收集，需要将含有样品的凝胶带切割后再洗脱，操作繁琐，耗时长，而且两性电解质价格较贵，因此该法没有得到广泛应用，目前主要用于分离pI接近且价值较高的蛋白质样品。通过对现有文献的检索发现，中国发明专利CN103235026A公开了一种蛋白质等电聚焦电泳的方法及其装置；是关于蛋白质、核酸等大分子样品的等电聚焦装置和方法，该方法需要两性电解质构建pH变化的区带，从而实现等电聚焦；样品最终聚焦在抗对流介质中，同样不能实现样品的在线收集。

开发高效、稳定、自动化、样品覆盖范围广的制备型分离技术，是生物医药产品低成本、高效产业化之关键。越来越多的活性小分子极性物质被发现，例如，活性小肽、寡糖、小分子核苷酸、有机酸。然而，这些物质的制备分离存在技术难点，这些物质因不能在反相色谱柱上有效保留而不能被常规液相色谱分离纯化[StregeMA.Hydrophilicinteractionchromatography-electrospraymassspectrometryanalysisofpolarcompoundsfornaturalproductdrugdiscovery[J].AnalChem1998，70(13)：2439-2445.]；[JiangZ，SmithNW，FergusonPD，etal.Hydrophilicinteractionchromatographyusingmethacrylate-basedmonolithiccapillarycolumnfortheseparationofpolaranalytes[J].AnalChem2007，79：1243-1250.]；[StregeMA，StevensonS，LawrenceSM.Mixed-modeanion-cationexchange/hydrophilicinteractionliquidchromatography-electrospraymassspectrometryasanalternativetoreversedphaseforsmallmoleculedrugdiscovery[J].AnalChem2000，72：4629-4633]。虽然离子交换色谱可以满足离子型化合物的分离，但不能同时分离非极性化合物，高盐洗脱液还增加除盐负担[JonesIL，CartaG.Ionexchangeofaminoacidsanddipeptidesoncationresinswithvaryingdegreeofcrosslinking.1.Equilibrium[J].IndEngChemRes1993，32：107-117]。

通常，非常复杂的样品，尤其是生物样品在分析之前必须经过分离和浓缩。IEF可以同时实现样品的分离和浓缩，是非常有效的分离手段，目前主要用于蛋白质的分离中。然而，已有的成熟的IEF必需引入两性电解质制作pH梯度，从而混在被分离的样品收集管中，对分析造成基质干扰效应。IEF技术通常用于蛋白质、多肽样品的分离制备，然而，很多极性小分子药物，例如，头孢菌素类抗生素也具有两性的特点，如果将IEF用于相关新药开发领域，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的不足，提供一种无需两性电解质的分离两性物质的电聚焦方法。本发明利用简单的小分子有机酸、有机碱制作不同的pH缓冲液，并在常用的小分子制备色谱柱中人工制作pH梯度缓冲液带，通过外加电场实现两性物质的聚焦分离，为具有两性的极性小分子物质提供一种同时实现分离和浓缩的半制备技术；尤其可以用于这类样品的精制。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种无需两性电解质的分离两性物质的电聚焦方法，所述方法包括如下步骤：

A、在色谱柱中填充抗对流介质；

B、沿纵向填充色谱柱制作pH逐渐变化的缓冲液，使在色谱柱中形成从入口到出口pH值逐渐变化；

C、将样品加到色谱柱入口处，外加与色谱柱内流体流动方向平行的电场，使样品在柱内电聚焦；

D、不断加入pH值继续变化的缓冲液，使得pH梯度随着缓冲液流动逐渐向柱出口迁移；将聚焦在不同pH处的样品洗脱出色谱柱；

E、流出色谱柱的缓冲液进入在线检测及收集器，实现在线收集。

优选地，步骤A中，所述抗对流介质与样品间无吸附作用或吸附作用微弱。从而使样品主要受电场力作用。

优选地，所述抗对流介质为色谱填料；所述色谱填料包括葡聚糖凝胶颗粒或反相色谱填料。

优选地，步骤B中，所述pH逐渐变化是连续变化或阶段变化；所述pH范围根据被分离样品的等电点范围选取。

优选地，所述pH逐渐变化的缓冲液是由小分子弱酸和弱碱按照不同配比，制作不同pH值缓冲液，并依次加入色谱柱而形成的。

优选地，所述小分子弱酸为乙酸；所述小分子弱碱为氨水。

优选地，步骤C中，外加电场方向由从柱入口到出口的pH变化方向决定；如果柱入口的pH值高于柱出口，则入口处连接高压电源负极，出口处连接高压电源正极。反之亦然。从而使样品在色谱柱中随缓冲液缓慢移动的同时，能够受电场作用聚焦在pH与pI相当的缓冲液条带区域。

优选地，步骤D中，如果柱入口的缓冲液pH值高于柱出口，则所述pH值继续变化的缓冲液的pH值等于或高于柱入口的缓冲液pH值；如果柱入口的缓冲液pH值低于柱出口，则所述pH值继续变化的缓冲液的pH值等于或低于柱入口的缓冲液pH值。该pH值继续变化的缓冲液可以是pH逐渐变化的缓冲液，也可以是单一的终止缓冲液。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)可以使用低浓度的简单酸碱预先配置一系列的pH梯度变化的缓冲液(例如，一元弱酸和一元弱碱溶液)，代替了传统等电聚焦法中必需的两性电解质混合物。虽然增加了预先配制pH梯度的操作，但成本大大降低，还可减少后续分离两性电解质和样品的操作，使等电聚焦法可以普及。

(2)该法可以实现在线检测和收集，不需要分离结束后再切割和洗脱样品，操作过程简单，耗时短。

(3)该法可用于分离亲水性两性小分子物质，而传统方法一般只用于蛋白质等大分子物质的分离。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为等电聚焦电泳分离原理示意图；

图2为用pH梯度进行等电聚焦电泳分离头孢菌素混合物色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明中，两性物质：既含酸性基团，又含碱性基团的物质，具有等电点，在pH值与等电点相等的缓冲液中，样品所带静电荷为零。例如蛋白质、氨基酸、两性头孢菌素等。

等电聚焦(IEF)：是两性物质的高效分离技术，其原理是利用两性电解质在凝胶中创造一个pH梯度，同时利用蛋白质具有两性解离和等电点的特点，对样品进行分离分析。IEF具有分离效率高、在分离的同时实现样品的富集等优点。pH梯度的存在是等电聚焦的先决条件。

本发明的工作原理：首先沿纵向色谱柱(填充普通的抗对流介质)制作pH逐渐变化的缓冲液。利用被分离物质(既含酸性基团，又含碱性基团的两性物质)在pH＜pI和pH＞pI的环境下所受电场力的方向相反，将被分离物质反复牵引，最终聚焦在pH＝pI的区域，将不同pI的被分离物质分离并浓缩。由于聚焦分离在普通的色谱装置上完成，可以实现在线检测及收集各组分，完成快速制备，且收集的样品中没有高浓度两性电解质，利于后续的样品纯化。

上样前后的色谱柱中pH变化及分离原理的示意图如图1所示。

刚上样时(图1A)，样品在床层表面，pI小于所处环境pH的样品带负电荷，在电场力作用下快速向柱下部移动；当移动到与pI相同的pH带时(图1B)，移动逐渐减慢；若继续移动到低于pI的pH带时，带正电荷，受向上的电场力，向柱入口方向移动。如此往复，最终该样品将聚焦在与其pI相同的pH带上。上样时(图1A)pI大于所处环境pH的样品带正电荷，被电场保留在色谱柱床层表面；随着加入缓冲液pH值增大，样品受电场力逐渐减小，直到加入缓冲液pH等于或大于其pI时(图1B)，随流动相一起进入色谱柱。具体应用实施例如下：

实施例

配制头孢菌素样品混合物，即将2mg头孢唑啉钠、2mg头孢他啶、3mg头孢替安和4mg头孢拉定溶解在0.2mL纯水中，离心。将琼脂糖凝胶Sepharose6B装入电色谱柱中(40cm×1.2cmI.D.)。用0.01mol/L的乙酸和氨水配制成以下不同pH值的缓冲液，即pH＝3.4、4.4、5.4、6.4、7.4、8.4、9.4的缓冲液，并用pH3.4作为起始缓冲液平衡色谱柱，顺次加入各7.5mL配制好的pH逐渐增加的缓冲液，即pH4.4、5.4、6.4、7.4、8.4，然后上样，再加入pH9.4的终止缓冲液，加反向电场(柱入口设置负极，出口设置正极)60V/cm进行电聚焦实验，流动相流速控制在0.5mL/min，在线检测波长为254nm，流出液每5mL收集一管并进行HPLC检测分析。

分析结果如图2所示。结果表明，可以按照等电点依次增大的顺序分离并在线收集两性头孢菌素。结果在40cm×1.2cmI.D.的色谱柱上可以以1.1mg/mL的浓度上样11mg头孢菌素混合物样品，在200min内完成样品的分离，得到的各种头孢菌素的HPLC纯度都在92％以上，收率都在75％以上。因此，该缓冲体系可以用来分析等电点差异较大的物质。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (5)

1.一种无需两性电解质的分离两性物质的电聚焦方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

A、在色谱柱中填充抗对流介质；

B、制作pH逐渐变化的缓冲液，沿纵向填充色谱柱，使在色谱柱中形成从入口到出口pH值逐渐变化；

C、将样品加到色谱柱入口处，外加与色谱柱内流体流动方向平行的电场，使样品在柱内电聚焦；

D、不断加入pH值继续变化的缓冲液，使得pH梯度随着缓冲液流动逐渐向柱出口迁移；将聚焦在不同pH处的样品洗脱出色谱柱；

E、流出色谱柱的缓冲液进入在线检测及收集器，实现在线收集；

步骤C中，外加电场方向由从柱入口到出口的pH变化方向决定；如果柱入口的pH值高于柱出口，则入口处连接高压电源负极，出口处连接高压电源正极；如果柱入口的pH值低于柱出口，则入口处连接高压电源正极，出口处连接高压电源负极；

步骤D中，如果柱入口的缓冲液pH值高于柱出口，则所述pH值继续变化的缓冲液的pH值等于或高于柱入口的缓冲液pH值；如果柱入口的缓冲液pH值低于柱出口，则所述pH值继续变化的缓冲液的pH值等于或低于柱入口的缓冲液pH值。

2.如权利要求1所述的无需两性电解质的分离两性物质的电聚焦方法，其特征在于，步骤A中，所述抗对流介质与样品间无吸附作用或吸附作用微弱。

3.如权利要求2所述的无需两性电解质的分离两性物质的电聚焦方法，其特征在于，所述抗对流介质为色谱填料；所述色谱填料包括葡聚糖凝胶颗粒或反相色谱填料。

4.如权利要求1所述的无需两性电解质的分离两性物质的电聚焦方法，其特征在于，步骤B中，所述pH逐渐变化是连续变化或阶段变化；所述pH范围根据被分离样品的等电点范围选取。

5.如权利要求4所述的无需两性电解质的分离两性物质的电聚焦方法，其特征在于，所述pH逐渐变化的缓冲液是由小分子弱酸和弱碱按照不同配比，制作不同pH值缓冲液，并依次加入色谱柱而形成的；所述小分子弱酸为乙酸；所述小分子弱碱为氨水。