CN105112325B - 高效降解烯酰吗啉的蜡状芽孢杆菌菌株wl08及其应用及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种公开了一种高效降解烯酰吗啉的蜡状芽孢杆菌菌株WL08及其应用及使用方法，涉及蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)WL08的分离、筛选及用其发酵制备的菌剂及应用。所述菌株已于2015年6月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号是CCTCC NO：M 2015399。以所述菌株发酵制备得到的菌剂，具有生产成本低，使用方便，去除效果好等优点。使用所述菌株WL08发酵生产的烯酰吗啉农药残留降解菌剂可广泛用于水体、土壤中烯酰吗啉残留污染的修复，也可用于农业生产中直接喷洒于土壤或植物表面，可有效降解去除烯酰吗啉农药残留，解决农产品生产中农药残留超标问题及环境污染问题，保护生态环境和人类健康。

Description

高效降解烯酰吗啉的蜡状芽孢杆菌菌株WL08及其应用及使用 方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其是一种高效降解烯酰吗啉的蜡状芽孢杆菌菌株WL08及其应用及使用方法。

背景技术

烯酰吗啉（Dimethomorph）化学名称为 (E,Z)-4-[3-(4-氯苯基)3-(3,4-二甲氧基苯基)丙烯酰]吗啉。烯酰吗啉属于吗啉类广谱性杀菌剂，是专一杀卵菌纲真菌杀菌剂，其作用特点是破坏细胞壁膜的形成，对卵菌生活史的各个阶段都有作用，在孢子囊梗和卵孢子的形成阶段尤为敏感，在极低浓度下(<0.25μg/ml)即受到抑制，并且对苯酰胺类杀菌剂的抗性和敏感菌株都有较高的活性。在实际应用中，烯酰吗啉(DMM)是继甲霜灵之后防治卵菌病害的又一种理想的杀菌荆，特别适合于苯酰胺类杀菌剂抗性病原个体占优势的田间进行抗药性治理，对农作物发生的霜霉病和疫霉病有特效，是我国当前广泛使用的杀菌剂之一，可用十字花科蔬菜于葡萄、黄瓜和番茄等作物，有着较广阔的应用前景。

随着农药使用量的增加及加入WTO后日益森严的检测制度，我国农药残留问题显得日益突出。就作物种类而言，我国单位面积农药用量最大的是占农作物播种面积10％的蔬菜，因而蔬菜中农药残留问题最为严重。近年来由于烯酰吗啉及其复配农药品种和使用量不断增长，其在农产品和环境中的残留问题已引起越来越多的关注。烯酰吗啉可通过叶面喷雾和土壤灌药进入土壤，烯酰吗啉还可以通过各种途径进入地表水或地下水，对水体质量构成威胁。此外，由于烯酰吗啉进对水生生物有毒，可能对水体环境产生长期不良影响。因此，消除环境中烯酰吗啉的残留污染引起科研工作者的高度重视，已成为一个重要的研究课题。

生物修复(Bioremediation)技术因其操作简便、经济实用、环境友好等优点，已成为处理环境中有机污染物的有效措施。国际上已有利用生物修复技术成功治理石油污染的先例。近年来，研究利用生物修复技术治理农药残留污染已成为研究热点。目前许多发达国家和大公司都投入巨资以从事农药残留生物降解制剂的研究和开发，如美国 BCI 公司、美国工程服务生物修复公司已经将降解制剂产品规模化生产，国内的北京佳农新贸易发展有限公司已成功生产“比亚”生物降解制剂可用于去除有机磷类农药残留。但是，由于农药结构多样性，而微生物降解农药往往具有很强的针对性，导致现有降解菌资源库远不能满足农药残留污染生物修复的实际需求。目前市场上还没有可以工业化生产和大面积使用的烯酰吗啉残留降解剂产品问世。因此，有针对性地筛选高效降解菌株，制备微生物修复剂，通过人工接种加速环境中农药的降解，消除残留药害是一项十分必要的工作和切实可行的途径。

发明内容

本发明的目的是：提供一种高效降解烯酰吗啉的蜡状芽孢杆菌菌株WL08。

本发明的另一目的是提供该菌株在降解烯酰吗啉农药残留中的应用。

本发明的另一目的是提供所述菌株在制备降解烯酰吗啉菌剂中的应用。

本发明的另一目的是提供一种降解烯酰吗啉的制剂。

本发明是这样实现的：高效降解烯酰吗啉的蜡状芽孢杆菌菌株WL08，其保藏号为CCTCC NO：M 2015399。

该菌株16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

高效降解烯酰吗啉的蜡状芽孢杆菌菌株WL08在降解烯酰吗啉农药残留中的应用。

生产烯酰吗啉残留降解菌剂的方法，包括如下步骤：

1）将蜡状芽孢杆菌菌株WL08斜面保存试管种子，接种至无机盐培养基中，振荡培养至对数生长期，获得菌液；

2）将获得的菌液以10%的体积百分比的接种量接种至含有无机盐培养基的种子发酵罐中，培养至对数生长期，获得种子液；

3）将获得的种子液按照10%的体积比的接种量接种入发酵培养基中，在30～35℃、150～200 rpm下发酵培养45-50h，获得发酵液，发酵液的菌数大于3.0×10⁹ cfu/mL，将发酵液直接稀释5-20倍作为液体菌剂；或将发酵液用生物碳或硅藻土吸附，形成固体菌剂，调整菌数为1.5×10⁸-2.8×10⁹ cfu/g，然后分装为袋装产品。

在种子发酵罐和生产发酵罐的培养过程中，无菌空气的通气量为0.40～0.60 m³/min，搅拌速度为150～200 r/min，温度30～35℃，种子罐的培养时间及生产发酵罐的培养时间均为45-50h，发酵结束后菌体数量大于3.0×10⁹ cfu/mL。

步骤2）中所述的发酵培养基与步骤3）中所述的发酵培养基相同，其组成按质量百分比比计算，包括酵母膏0.5%，蛋白胨1%，葡萄糖0.5%，NaCl 1%，其余为水，pH 7。

步骤1）及步骤2）中所述的无机盐培养基，KH₂PO₄ 0.4 g，K₂HPO₄ 0.4 g，NH₄Cl 1 g，MgCl₂ 0.1 g，Na₂SO₄ 1.425 g，FeSO₄·7H₂O 0.025 g，微量元素液10 mL，加蒸馏水定容至1100 mL，pH 7.0，高压蒸汽灭菌（121℃，20 min）；其中微量元素液组成如下：ZnSO₄·7H₂O1.1 g，MgSO₄·H₂O 0.58 g，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.18 g，CoSO₄·7H₂O 0.024 g，CuSO₄·5H₂O0.077 g，H₃BO₃ 0.029 g，NaNO₃·4H₂O 0.074 g，蒸馏水1 L。

蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus) WL08，该菌种保存在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M 2015399，保藏日期为2015年6月19日。

所述菌株经形态学特征、生理生化特性、16S rDNA序列分析鉴定为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，该菌株在在牛肉膏蛋白胨固体平板上生长很快，呈圆形或近似圆形、质地软、稍有光泽的白色菌落，生长较快。菌体细胞杆状，成短或长链，芽孢中生，无荚膜。电子显微镜下观察杆状细胞长直径>1 μm。通过生理生化特性测定，显示该菌株革兰氏阳性，接触酶阳性，氧化酶阴性，VP试验阳性，甲基红试验阳性。该菌可利用葡萄糖、柠檬酸盐；不利用木糖、L-***糖、甘露醇。

附图说明

附图1为烯酰吗啉标准品色谱图；

附图2为降解菌剂对无机盐培养基中烯酰吗啉（50 mg/L）的降解率；

附图3降解菌剂对土壤中烯酰吗啉（50 mg/L）的降解动态。

由于采用了上述技术方案，本发明筛选获得获得一种蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus) WL08，通过该菌种所制备的烯酰吗啉降解菌剂对烯酰吗啉残留的降解率达到85%以上，可广泛用于土壤、水体中烯酰吗啉残留污染的修复，也可以在农业生产中直接喷洒于土壤或植物表面，可在短时间内有效降解去除烯酰吗啉农药残留，保护生态环境和人类健康，且使用方便，成本低，去除率达到80%以上。

具体实施方式

本发明的实施例1：高效降解烯酰吗啉的蜡状芽孢杆菌菌株WL08的分离与鉴定：

1）蜡状芽孢杆菌菌株WL08的分离

称取长期受烯酰吗啉污染土壤10 g于250 mL三角锥形瓶中，加入100 mL无机盐培养基，添加烯酰吗啉至浓度为100 mg/L，三角锥形瓶置于摇床（30℃，200 rpm的上培养7 d，取5 mL培养液接种至新鲜基础培养基（烯酰吗啉100 mg/L）中，然后在30℃摇瓶培养7 d，依次类推，按烯酰吗啉100 mg/L的浓度梯度增长，使最终富集培养液除草剂的浓度达到1000mg/L，得到富集的降解菌株。

降解菌株富集分离过程中，每2次转接后，将菌悬液制备成10^-2～10^-6系列稀释液，用涂布法分别在固体分离纯化培养基上进行分离，30℃培养两天，根据其不同的外观形态和特征挑取单菌落，反复划线纯化，并根据菌落外观形态特征和显微形态观察的菌体形态特征合并相同的菌株，并将所得的菌株接种于固体分离纯化培养基斜面，保存、备用。

经过大量的富集培养，分离到能够在含烯酰吗啉1000 mg/L的分离培养基上生长的菌株10余株，并使用气相色谱法(GC)验证其降解效果。进一步筛选后，获得一个编号为WL08的菌株，命名为降解菌WL08，该菌株能够在纯培养条件下，将初始浓度50.0 mg/L的烯酰吗啉在7 d内降解80%以上。

GC测定条件：气相色谱仪GC-2010plus（日本岛津公司）；RTX-5毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25μm）；进样口温度290℃；检测器温度300℃；柱温升温程序：120℃保持2.0min，30℃/min升至290℃，保持15 min；载气(N₂)流速： 30 mL/min，氢气流速：40 mL/min，空气流速：400 mL/min；不分流进样，进样量1 μL；保留时间：烯酰吗啉Z式约为16.1 min、E式约16.7 min，典型色谱图见图1。

2）蜡状芽孢杆菌菌株WL08的鉴定

（1）降解菌WL08的形态学鉴定：将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤一分离并纯化得到的蜡状芽孢杆菌菌株WL08进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态、菌落边缘状态。对于处于对数生长期的所述降解菌WL08，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。

结果表明，上述步骤一分离并纯化得到的降解菌WL08在牛肉膏蛋白胨固体平板上生长很快，呈圆形或近似圆形、质地软、稍有光泽的白色菌落，生长较快。菌体细胞杆状，成短或长链，芽孢中生，无荚膜。电子显微镜下观察杆状细胞长直径>1μm。

（2）生理生化特征分析

参考《微生物学实验》(沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验(第三版).北京：高等教育出版社，1999.) 和《常见细菌***鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.常见细菌***鉴定手册.北京：科学出版社，2011.)测定降解菌WL08的生理生化特征。

测定结果显示该菌株菌株革兰氏阳性，接触酶阳性，氧化酶阴性，VP试验阳性，甲基红试验阳性。该菌可利用葡萄糖、柠檬酸盐；不利用木糖、L-***糖、甘露醇。所述降解菌WL08的生理生化特征测定结果如表1所示。

（3）降解菌16S rDNA的同源性分析

DNA测序由中国科学院微生物研究所完成，测序结果用Blast软件Genbank中的16SrDNA序列进行同源性比较。

获得的降解菌WL08的16S rDNA如SEQ ID NO.1所示。

该菌株的16S rDNA序列已经提交到GenBank数据库（GenBank登录号：KT207941），发现该序列与Bacillus cereus KF500919.1等菌株的基因序列同源性达99%。

3）生长特性分析

进行了菌株最适温度和最适pH生长实验。采用无机盐培养基，分别在20℃、25℃、30℃、35℃和40℃培养、观察、记录菌株的温度适应性，每个处理3次重复。调整酸度分别为pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9，每个处理3次重复，培养、观察、记录菌株生长的最适pH。结果表明，所述降解菌WL08的最适生长温度为30～35℃，最适生长pH为6～7。

鉴于降解菌WL08的形态、生理生化特性和16S rDNA序列分析结果，将降解菌WL08鉴定为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。所属菌株蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)WL08于2015年6月19日保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M 2015399。

本发明的实施例2：烯酰吗啉农药残留降解菌剂的制备：

1）将蜡状芽孢杆菌菌株WL08斜面保存试管种子，接种至无机盐培养基中，振荡培养至对数生长期，获得菌液；

2）将获得的菌液以10%的体积百分比的接种量接种至含有无机盐培养基的种子发酵罐中，培养至对数生长期，获得种子液；

3）将获得的种子液按照10%的体积比的接种量接种入发酵培养基中，在30～35℃、150～200 rpm下发酵培养45-50h，获得发酵液，发酵液的菌数大于3.0×10⁹ cfu/mL，将发酵液直接稀释为液体菌剂，液体菌剂中的菌数为2.0×10⁸ cfu/mL。

步骤2）中所述的发酵培养基与步骤3）中所述的发酵培养基相同，其组成按质量百分比比计算，包括酵母膏0.5%，蛋白胨1%，葡萄糖0.5%，NaCl 1%，余量为水，pH 7。

本发明的实施例3：烯酰吗啉农药残留降解菌剂的制备：

1）将蜡状芽孢杆菌菌株WL08斜面保存试管种子，接种至无机盐培养基中，振荡培养至对数生长期，获得菌液；

2）将获得的菌液以10%的体积百分比的接种量接种至含有无机盐培养基的种子发酵罐中，培养至对数生长期，获得种子液；

3）将获得的种子液按照10%的体积比的接种量接种入发酵培养基中，在30～35℃、150～200 rpm下发酵培养45-50h，获得发酵液，发酵液的菌数大于3.0×10⁹ cfu/mL，将发酵液用生物碳或硅藻土吸附，形成固体菌剂，调整菌数为2.0×10⁸ cfu/g，然后分装为袋装产品。

步骤2）中所述的发酵培养基与步骤3）中所述的发酵培养基相同，其组成按质量百分比比计算，包括酵母膏0.5%，蛋白胨1%，葡萄糖0.5%，NaCl 1%，余量为水，pH 7。

本发明的实施例4：蜡状芽孢杆菌菌株WL08对烯酰吗啉的生物降解效果：

在无机盐培养基（同实施例1）中加入烯酰吗啉，使其终浓度为50.0 mg/L；接种浓度为2.0×10⁸ cfu/mL的菌剂，并设不接菌的培养基为对照，30℃(200 rpm) 黑暗培养0～7d，定期取样。应用上述GC法测定烯酰吗啉的残留量并计算降解率。降解率=(对照样品残留量-处理样品残留量)/对照样品残留量×100%，结果如图2所示。结果表明，降解菌WL08在短时间内可有效降解烯酰吗啉，3 d内对烯酰吗啉的降解率达到65.95%，5 d内对烯酰吗啉的降解率达到70.46%，7 d内对烯酰吗啉的降解率分别达到82.35%，具有较好的生物降解效果。在不加菌的对照中，烯酰吗啉的降解率均小于6%。试验结果表明，降解菌WL08对50.0mg/L的烯酰吗啉具有很好的降解能力。这一结果表明，本发明所提供的降解菌WL08可高效降解烯酰吗啉，在修复烯酰吗啉污染的水体和土壤方面具有广阔的应用前景。

实施例:4：降解菌剂对土壤中烯酰吗啉农药残留的降解效果：

取蔬菜地土壤，自然风干，过20目筛，进行灭菌处理。灭菌及未灭菌的土壤按50mg/kg干土的量加入烯酰吗啉，搅拌均匀，过夜。花盆消毒后，每盆装入1000 g土样，未灭菌土壤也同样装盆，作为模拟试验污染土壤。然后按3.0×10⁹个细胞/g干土的量加入降解菌剂，保持土壤的含水量在40%左右，温室培养。分别于0、1、5、10、15、和20 d取土层同等深度的样品，进行测定。以不接菌的土壤作为对照。试验期间每3 d称量1次，加水补足水分含量。

从图3可以看出，无论是灭菌土、还是自然土壤，接入降解菌剂后，土壤中的烯酰吗啉降解很快，降解菌剂对烯酰吗啉的降解均有显著的促进作用。接入降解菌剂后自然土壤中第5天降解率就达到64.43%，第10天达到77.36%，第15天达到84.65%，以后降解速率减慢，因为土壤中的烯酰吗啉量已经很低，降解菌与农药之间的接触机会下降。整个降解过程中，烯酰吗啉在自然土中的降解率高于灭菌土中的降解率，因为自然土中存在的微生物起到了加速降解的作用；而不接降解菌剂的对照土壤中，烯酰吗啉的降解效率较低，20天后的降解率低于为15.0%。

上述实施例中所用的培养基如下：

无机盐培养基：KH₂PO₄ 0.4 g，K₂HPO₄ 0.4 g，NH₄Cl 1 g，MgCl₂ 0.1 g，Na₂SO₄ 1.425g，FeSO₄·7H₂O 0.025 g，微量元素液10 mL，加蒸馏水定容至1100 mL，pH 7.0，高压蒸汽灭菌（121℃，20 min）。其中微量元素液组成如下：ZnSO₄·7H₂O 1.1 g，MgSO₄·H₂O 0.58 g，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.18 g，CoSO₄·7H₂O 0.024 g，CuSO₄·5H₂O 0.077 g，H₃BO₃ 0.029 g，NaNO₃·4H₂O 0.074 g，蒸馏水1 L。

分离培养基：无机盐培养基中按实验设计要求添加不同浓度烯酰吗啉唯一碳源，pH 7.0（固体培养基添加20 g琼脂）。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 3.0 g，NaCl 5.0 g，蛋白胨 10.0 g，蒸馏水1000mL，琼脂20 g，pH 7.0。

以上培养基均在高压锅中121℃灭菌20～30分钟。

SEQUENCE LISTING

序列表

<110> 贵州大学

<120> 高效降解烯酰吗啉的蜡状芽孢杆菌菌株WL08及其应用及使用方法

<130> nm:

<160> 1

<170> PatentIn version

<210> SEQ ID NO： 1

<211> 1429

<212> DNA

<213> 蜡状芽孢杆菌菌株WL08

<220>

<221> rDNA

<400> 1

CTTAG GCGGC TGGCT CCATA AAGGT TACCC CACCG ACTTC GGGTG TTACA AACTC TCGTG 60

GTGTG ACGGG CGGTG TGTAC AAGGC CCGGG AACGT ATTCA CCGCG GCATG CTGAT CCGCG 120

ATTAC TAGCG ATTCC AGCTT CATGT AGGCG AGTTG CAGCC TACAA TCCGA ACTGA GAACG 180

GTTTT ATGAG ATTAG CTCCA CCTCG CGGTC TTGCA GCTCT TTGTA CCGTC CATTG TAGCA 240

CGTGT GTAGC CCAGG TCATA AGGGG CATGA TGATT TGACG TCATC CCCAC CTTCC TCCGG 300

TTTGT CACCG GCAGT CACCT TAGAG TGCCC AACTT AATGA TGGCA ACTAA GATCA AGGGT 360

TGCGC TCGTT GCGGG ACTTA ACCCA ACATC TCACG ACACG AGCTG ACGAC AACCA TGCAC 420

CACCT GTCAC TCTGC TCCCG AAGGA GAAGC CCTAT CTCTA GGGTT TTCAG AGGAT GTCAA 480

GACCT GGTAA GGTTC TTCGC GTTGC TTCGA ATTAA ACCAC ATGCT CCACC GCTTG TGCGG 540

GCCCC CGTCA ATTCC TTTGA GTTTC AGCCT TGCGG CCGTA CTCCC CAGGC GGAGT GCTTA 600

ATGCG TTAAC TTCAG CACTA AAGGG CGGAA ACCCT CTAAC ACTTA GCACT CATCG TTTAC 660

GGCGT GGACT ACCAG GGTAT CTAAT CCTGT TTGCT CCCCA CGCTT TCGCG CCTCA GTGTC 720

AGTTA CAGAC CAGAA AGTCG CCTTC GCCAC TGGTG TTCCT CCATA TCTCT ACGCA TTTCA 780

CCGCT ACACA TGGAA TTCCA CTTTC CTCTT CTGCA CTCAA GTCTC CCAGT TTCCA ATGAC 840

CCTCC ACGGT TGAGC CGTGG GCTTT CACAT CAGAC TTAAG AAACC ACCTG CGCGC GCTTT 900

ACGCC CAATA ATTCC GGATA ACGCT TGCCA CCTAC GTATT ACCGC GGCTG CTGGC ACGTA 960

GTTAG CCGTG GCTTT CTGGT TAGGT ACCGT CAAGG TGCCA GCTTA TTCAA CTAGC ACTTG 1020

TTCTT CCCTA ACAAC AGAGT TTTAC GACCC GAAAG CCTTC ATCAC TCACG CGGCG TTGCT 1080

CCGTC AGACT TTCGT CCATT GCGGA AGATT CCCTA CTGCT GCCTC CCGTA GGAGT CTGGG 1140

CCGTG TCTCA GTCCC AGTGT GGCCG ATCAC CCTCT CAGGT CGGCT ACGCA TCGTT GCCTT 1200

GGTGA GCCGT TACCT CACCA ACTAG CTAAT GCGAC GCGGG TCCAT CCATA AGTGA CAGCC 1260

GAAGC CGCCT TTCAA TTTCG AACCA TGCAG TTCAA AATGT TATCC GGTAT TAGCC CCGGT 1320

TTCCC GGAGT TATCC CAGTC TTATG GGCAG GTTAC CCACG TGTTA CTCAC CCGTC CGCCG 1380

CTAAC TTCTT GAGAG CAAGC TCTCA ATCCA TTCGC TCGAC TGCAT GATA 1429

Claims (7)

1.一种高效降解烯酰吗啉的蜡状芽孢杆菌菌株(Bacillus cereus)WL08，其特征在于：其保藏号为CCTCC NO：M 2015399。

2.根据权利要求1所述的高效降解烯酰吗啉的蜡状芽孢杆菌菌株(Bacillus cereus)WL08，其特征在于：该菌株16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种如权利要求1所述的菌株在降解烯酰吗啉农药残留中的应用。

4.一种采用如权利要求1所述的菌株生产烯酰吗啉残留降解菌剂的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)将蜡状芽孢杆菌菌株WL08斜面保存试管种子，接种至无机盐培养基中，振荡培养至对数生长期，获得菌液；

2)将获得的菌液以10％的体积百分比的接种量接种至含有无机盐培养基的种子发酵罐中，培养至对数生长期，获得种子液；

3)将获得的种子液按照10％的体积比的接种量接种入发酵培养基中，在30～35℃、150～200rpm下发酵培养45-50h，获得发酵液，发酵液的菌数大于3.0×10⁹cfu/mL，将发酵液直接稀释5-20倍作为液体菌剂；或将发酵液用生物碳或硅藻土吸附，形成固体菌剂，调整菌数为1.5×10⁸-2.8×10⁹cfu/g，然后分装为袋装产品。

5.根据权利要求4所述的生产烯酰吗啉残留降解菌剂的方法，其特征在于：在种子发酵罐的培养过程中，无菌空气的通气量为0.40～0.60m³/min，搅拌速度为150～200r/min，温度30～35℃，种子罐的培养时间的培养时间均为45-50h，发酵结束后菌体数量大于3.0×10⁹cfu/mL。

6.根据权利要求4所述的生产烯酰吗啉残留降解菌剂的方法，其特征在于：步骤2)中所述的无机盐培养基与步骤3)中所述的发酵培养基相同，其组成按质量百分比比计算，包括酵母膏0.5％，蛋白胨1％，葡萄糖0.5％，NaCl 1％，其余为水，pH 7。

7.根据权利要求4所述的生产烯酰吗啉残留降解菌剂的方法，其特征在于：步骤1)中所述的无机盐培养基，KH₂PO₄ 0.4g，K₂HPO₄ 0.4g，NH₄Cl 1g，MgCl₂ 0.1g，Na₂SO₄ 1.425g，FeSO₄·7H₂O 0.025g，微量元素液10mL，加蒸馏水定容至1100mL，pH 7.0，高压蒸汽灭菌，121℃，20min；其中微量元素液组成如下：ZnSO₄·7H₂O 1.1g，MgSO₄·H₂O 0.58g，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.18g，CoSO₄·7H₂O 0.024g，CuSO₄·5H₂O 0.077g，H₃BO₃ 0.029g，NaNO₃·4H₂O0.074g，蒸馏水1L。