CN105002124B - 高效降解仲丁灵的蜡状芽孢杆菌ly05及其应用及使用方法 - Google Patents

高效降解仲丁灵的蜡状芽孢杆菌ly05及其应用及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种公开了一种高效降解仲丁灵的蜡状芽孢杆菌LY05及其应用及使用方法，所述菌株已于2015年6月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号是CCTCC NO：M 2015397。所述菌株可在短时间内有效降解仲丁灵农药残留。以所述菌株制备得到的菌剂，具有生产成本低，使用方便，去除效果好等优点。使用本菌剂可有效修复嘧菌酯仲丁灵污染的水体和土壤，解决农业生产中农药残留超标问题及环境污染问题，保护生态环境和人类健康。

Description

高效降解仲丁灵的蜡状芽孢杆菌LY05及其应用及使用方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其是一种高效降解仲丁灵的蜡状芽孢杆菌LY05及其应用及使用方法。
背景技术
仲丁灵（Butralin）化学名称为N-仲丁基-4-特丁基-2,6-二硝基苯胺，又名止芽素，基本理化性质如式1所示。仲丁灵属于二硝基苯胺类除草剂，可被杂草根系或芽鞘吸收，药剂进入植物体后，主要抑制分生组织的细胞***，从而抑制杂草幼芽及幼根生长，可用于棉花、大豆、豌豆、油菜、花生、土豆、冬小麦、大麦、蓖麻、向日葵、甘蔗、蔬菜、果树等，主要用于防除单子叶杂草和一年生阔叶杂草，也可防除小粒种子的双子叶杂草。亦可作植物生长调节剂使用，控制烟草腋芽生长。
随着仲丁灵使用的日益广泛和使用时间的延长，加之耐光、热的特点，其在土壤中的持效期较长，使用不当会对后茬作物产生药害，如果残留超过最大限量，则会对人畜产生不良影响或通过食物链对生态***中的生物造成毒害。因此，消除环境中仲丁灵的残留污染引起科研工作者的高度重视，已成为一个重要的研究课题。
生物修复(Bioremediation)技术因其操作简便、经济实用、环境友好等优点，已成为处理环境中有机污染物的有效措施。国际上已有利用生物修复技术成功治理石油污染的先例。近年来，研究利用生物修复技术治理农药残留污染已成为研究热点。目前许多发达国家和大公司都投入巨资以从事农药残留生物降解制剂的研究和开发，如美国 BCI 公司、美国工程服务生物修复公司已经将降解制剂产品规模化生产，国内的北京佳农新贸易发展有限公司已成功生产“比亚”生物降解制剂可用于去除有机磷类农药残留。但是，由于农药结构多样性，而微生物降解农药往往具有很强的针对性，导致现有降解菌资源库远不能满足农药残留污染生物修复的实际需求。目前还没有专门针对仲丁灵的降解微生物及其相关降解制剂产品。因此，有针对性地筛选高效降解菌株，研制微生物修复剂，通过人工接种加速土壤中除草剂的降解，消除残留药害是一项十分必要的工作和切实可行的途径。
发明内容
本发明的目的是：提供一种高效降解仲丁灵的蜡状芽孢杆菌LY05。
本发明的另一目的是提供该菌株在降解仲丁灵农药残留中的应用。
本发明的另一目的是提供所述菌株在制备降解仲丁灵制剂中的应用。
本发明的另一目的是提供一种降解仲丁灵的制剂。
本发明是这样实现的：高效降解仲丁灵的蜡状芽孢杆菌LY05，其保藏号为CCTCCNO：M 2015397。
该菌株16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
高效降解仲丁灵的蜡状芽孢杆菌LY05的菌株在降解仲丁灵农药残留中的应用。
采用高效降解仲丁灵的蜡状芽孢杆菌LY05的菌株生产降解仲丁灵制剂的方法，包括如下步骤：
1）将蜡状芽孢杆菌LY05的菌株于无机盐培养基中，30～35℃，150～200 rpm下振荡培养至对数生长期，获得菌种；
2）将上述菌种按无机盐培养基的体积比的10%的接种量接种入种子瓶，30～35℃，150～200 rpm下振荡培养至对数生长期，获得种子液；
3）将获得的种子液按照10%的体积比的接种量接种入发酵培养基中，在30～35℃、150～200 rpm下发酵培养45-50h，获得发酵液，发酵液的菌数大于3.0×109 cfu/mL，将发酵液直接稀释5-20倍作为液体菌剂。
在种子发酵罐和生产发酵罐的培养过程中，无菌空气的通气量为0.40～0.60 m3/min，搅拌速度为150～200 r/min，温度30～35℃，种子罐的培养时间及生产发酵罐的培养时间均为45-50h，发酵结束后菌体数量大于3.0×109 cfu/mL。
步骤2）中所述的发酵培养基与步骤3）中所述的发酵培养基相同，其组成按质量百分比比计算，包括酵母膏0.5%，蛋白胨1%，葡萄糖0.5%，NaCl 1%，其余为水，pH 7。
步骤1）及步骤2）中所述的无机盐培养基，KH2PO4 0.4 g，K2HPO4 0.4 g，NH4Cl 1 g，MgCl2 0.1 g，Na2SO4 1.425 g，FeSO4·7H2O 0.025 g，微量元素液10 mL，加蒸馏水定容至1100 mL，pH 7.0，高压蒸汽灭菌（121℃，20 min）；其中微量元素液组成如下：ZnSO4·7H2O1.1 g，MgSO4·H2O 0.58 g，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.18 g，CoSO4·7H2O 0.024 g，CuSO4·5H2O0.077 g，H3BO3 0.029 g，NaNO3·4H2O 0.074 g，蒸馏水1 L。
一株降解仲丁灵的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus ) LY05，所述菌种保存在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2015397，保藏日期为2015年6月19日。
所述菌株经形态学特征、生理生化特性、16S rDNA序列分析鉴定为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus )，该菌株在在牛肉膏蛋白胨固体平板上生长很快，呈圆形或近似圆形、质地软、稍有光泽的白色菌落，生长较快。菌体细胞杆状，成短或长链，芽孢中生，无荚膜。电子显微镜下观察杆状细胞长直径>1 μm。通过生理生化特性测定，显示该菌株革兰氏阳性，接触酶阳性，氧化酶阴性，VP试验阳性，甲基红试验阳性。该菌可利用葡萄糖、柠檬酸盐；不利用木糖、L-***糖、甘露醇。
本发明筛选获得一株蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus )LY05，该菌株可在短时间内有效降解仲丁灵农药残留，保护生态环境和人类健康，且使用方便，成本低，去除率达到80%以上，可用于修复仲丁灵污染的水体、土壤等自然环境，解决农业生产中农药残留超标问题及环境污染问题，保护生态环境和人类健康。使用蜡状蜡状芽孢杆菌LY05生产制备得到的液体菌剂，具有生产成本低，使用方便，去除效果好等优点，适合治理水体和土壤等环境中仲丁灵造成的污染，具有非常重要的理论和应用价值。
附图说明
附图1为仲丁灵标准品色谱图；
附图2为降解菌剂对无机盐培养基中仲丁灵（50 mg/L）的降解率；
附图3为降解菌剂对土壤中仲丁灵（50 mg/L）的降解率。
具体实施方式
本发明的实施例1：仲丁灵降解菌 LY05的分离与鉴定
1）仲丁灵降解菌LY05的分离与筛选
称取长期受仲丁灵污染土壤10 g于250 mL三角锥形瓶中，加入100 mL无机盐培养基，添加仲丁灵至浓度为100 mg/L，三角锥形瓶置于摇床（30℃，200 rpm的上培养7 d，取5mL培养液接种至新鲜基础培养基（仲丁灵100 mg/L）中，然后在30℃摇瓶培养7 d，依次类推，按仲丁灵100 mg/L的浓度梯度增长，使最终富集培养液仲丁灵的浓度达到1000 mg/L，得到富集降解菌株。
降解菌富集分离过程中，每2次转接后，将菌悬液制备成10-2～10-6系列稀释液，用涂布法分别在固体分离纯化培养基上进行分离，28℃培养两天，根据其不同的外观形态和特征挑取单菌落，反复划线纯化，并根据菌落外观形态特征和显微形态观察的菌体形态特征合并相同的菌株，并将所得的菌株接种于固体分离纯化培养基斜面，保存、备用。
经过大量的富集培养，分离到能够在含仲丁灵1000 mg/L的分离培养基上生长的菌株20余株，并使用高效液相色谱法(HPLC)验证其降解效果。进一步筛选后，获得一个编号为LY05的菌株，命名为降解菌LY05，该菌株能够在纯培养条件下，将初始浓度50.0 mg/L的仲丁灵在7 d内降解85%以上。
HPLC测定条件：Waters 600E高效液相色谱仪 (美国Waters) ；检测器：Waters2487紫外检测器(美国Waters) ；色谱柱：C18反相柱 (SunFireTM, 150 nm×4.60mm, 5 μm)；流动相为乙腈∶水(80∶20，V/V), 流速1.2 mL/min；柱温35℃；检测波长：240nm；进样量：5 μL。在上述条件下，仲丁灵的峰形由一个峰组成，且峰尖锐、稳定，保留时间约为13.1 min（见图1）。
2）仲丁灵降解菌LY05的鉴定
（1）降解菌LY05的形态学鉴定 将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤一分离并纯化得到的降解菌LY05进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态、菌落边缘状态。对于处于对数生长期的所述降解菌LY05，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。
结果表明，上述步骤一分离并纯化得到的降解菌LY05在牛肉膏蛋白胨固体平板上生长很快，呈圆形或近似圆形、质地软、稍有光泽的白色菌落，生长较快。菌体细胞杆状，成短或长链，芽孢中生，无荚膜。电子显微镜下观察杆状细胞长直径>1μm。。
（2）生理生化特征分析
参考《微生物学实验》(沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验(第三版).北京：高等教育出版社，1999.) 和《常见细菌***鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.常见细菌***鉴定手册.北京：科学出版社，2011.)测定降解菌LY05的生理生化特征。
测定结果显示，该菌株革兰氏反应阳性，接触酶反应阳性，氧化酶反应阴性。所述降解菌LY05的生理生化特征测定结果如表2所示。
（3）仲丁灵降解菌16S rDNA的同源性分析
DNA测序由中国科学院微生物研究所完成，测序结果用Blast软件Genbank中的16SrDNA序列进行同源性比较。
LY05的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示：该菌株的16S rDNA序列已经提交到GenBank数据库（GenBank登录号：KT207940），发现该序列与Bacillus cereus JN052922.1等菌株的基因序列同源性达99%。
3）生长特性分析
进行了菌株最适温度和最适pH生长实验。采用无机盐培养基，分别在20℃、25℃、30℃、35℃和40℃培养、观察、记录菌株的温度适应性，每个处理3次重复。调整酸度分别为pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9，每个处理3次重复，培养、观察、记录菌株生长的最适pH。结果表明，所述降解菌LY05的最适生长温度为30-35℃，最适生长pH为7。
鉴于上述菌株LY05的形态、生理生化特性和16S rDNA序列分析结果，将降解菌LY05鉴定为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus )。所述蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus )LY05于2015年6月19日保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M 2015397。
本发明的实施例2：仲丁灵农药残留降解菌剂的制备：
采用高效降解仲丁灵的蜡状芽孢杆菌LY05的菌株生产降解仲丁灵制剂的方法，包括如下步骤：
1）将蜡状芽孢杆菌LY05的菌株于无机盐培养基中，30～35℃，150～200 rpm下振荡培养至对数生长期，获得菌种；
2）将上述菌种按无机盐培养基的体积比的10%的接种量接种入种子瓶，30～35℃，150～200 rpm下振荡培养至对数生长期，获得种子液；
3）将获得的种子液按照10%的体积比的接种量接种入发酵培养基中，在30～35℃、150～200 rpm下发酵培养45-50h，获得发酵液，发酵液的菌数大于3.0×109 cfu/mL，将发酵液直接稀释为液体菌剂，液体菌剂中的菌数为2.0×108 cfu/mL。
其中，步骤2）中所述的发酵培养基与步骤3）中所述的发酵培养基相同，其组成按质量百分比比计算，包括酵母膏0.5%，蛋白胨1%，葡萄糖0.5%，NaCl 1%，，其余为水，pH 7。
本发明的实施例3：降解菌 LY05对仲丁灵的降解效能：
在无机盐培养基（同实施例1）中加入仲丁灵，使其终浓度为50.0 mg/L；接种浓度为2.0×108 cfu/mL的菌剂，并设不接菌的培养基为对照，30℃(200 rpm) 黑暗培养0～7d，定期取样。应用上述HPLC法测定仲丁灵的残留量并计算降解率。降解率=(对照样品残留量-处理样品残留量)/对照样品残留量×100%。结果见图2所示。结果表明，降解菌LGY06在短时间内可有效降解仲丁灵，3 d内对仲丁灵的降解率分别达到69.88%，5 d内对仲丁灵的降解率分别达到85.84%，7 d内对仲丁灵的降解率分别达到89.94%，具有较好的生物降解效果。在不加菌的对照中，仲丁灵的降解率均小于6%。试验结果表明，降解菌LGY06对50.0 mg/L的仲丁灵具有很好的降解能力。这一结果表明，本发明所提供的降解菌LGY06可高效降解烯仲丁灵，在修复仲丁灵污染的水体和土壤方面具有广阔的应用前景。
实施例:4：降解菌剂对土壤中仲丁灵农药残留的降解效果：
取蔬菜地土壤，自然风干，过20目筛，进行灭菌处理。灭菌及未灭菌的土壤按50mg/kg干土的量加入仲丁灵，搅拌均匀，过夜。花盆消毒后，每盆装入1000 g土样，未灭菌土壤也同样装盆，作为模拟试验污染土壤。然后按3.0×109个细胞/g干土的量加入降解菌剂，保持土壤的含水量在40%左右，温室培养。分别于0、1、5、10、15、和20 d取土层同等深度的样品，进行测定。以不接菌的土壤作为对照。每个处理三个重复。降解率=（对照样品残留量-样品样品残留量）/对照样品残留量×100%。试验期间每3 d称量1次，加水补足水分含量。
降解菌剂对土壤中仲丁灵的降解率如图3所示。由图可知，无论是灭菌土、还是自然土壤，降解菌剂对仲丁灵的降解均有显著的促进作用。施用降解菌剂后自然土壤中第5天降解率就达到567.23%，第10天达到80.40%，第15天达到92.63%，以后降解速率减慢，因为土壤中的仲丁灵已经很低，降解菌与农药之间的接触机会下降。整个降解过程中，仲丁灵在自然土中的降解率高于灭菌土中的降解率，因为自然土中存在的微生物起到了加速降解的作用；而不接降解菌剂的对照土壤中，仲丁灵的降解效率较低，20天后的降解率低于为20.0%。
上述实施例中所用的培养基如下：
无机盐培养基：KH2PO4 0.4 g，K2HPO4 0.4 g，NH4Cl 1 g，MgCl2 0.1 g，Na2SO4 1.425g，FeSO4·7H2O 0.025 g，微量元素液10 mL，加蒸馏水定容至1100 mL，pH 7.0，高压蒸汽灭菌（121℃，20 min）。其中微量元素液组成如下：ZnSO4·7H2O 1.1 g，MgSO4·H2O 0.58 g，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.18 g，CoSO4·7H2O 0.024 g，CuSO4·5H2O 0.077 g，H3BO3 0.029 g，NaNO3·4H2O 0.074 g，蒸馏水1 L。
分离培养基：无机盐培养基中按实验设计要求添加不同浓度仲丁灵唯一碳源，pH7.0（固体培养基添加20 g琼脂）。
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 3.0 g，NaCl 5.0 g，蛋白胨 10.0 g，蒸馏水1000mL，琼脂20.0 g，pH 7.0。
pH 7.0缓冲溶液：取57.7 mL 1 mol/L的Na2HPO4+42.3 mL 1 mol/L的NaH2PO4，加蒸馏水定容至1000 mL。
以上培养基和缓冲溶液均在高压锅中121℃灭菌20～30分钟。
SEQUENCE LISTING
序列表
<110> 贵州大学
<120> 高效降解仲丁灵的蜡状芽孢杆菌LY05及其应用及使用方法
<130> nm:
<160> 1
<170> PatentIn version
<210> SEQ ID NO： 1
<211> 1422
<212> DNA
<213> 蜡状芽孢杆菌LY05
<220>
<221> rDNA
<400> 1
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AGTAA CACGT GGGTA ACCTG CCCAT AAGAC TGGGA TAACT CCGGG AAACC GGGGC TAATA 120
CCGGA TAATA TTTTG AACTG CATGG TTCGA AATTG AAAGG CGGCT TCGGC TGTCA CTTAT 180
GGATG GACCC GCGTC GCATT AGCTA GTTGG TGAGG TAACG GCTCA CCAAG GCAAC GATGC 240
GTAGC CGACC TGAGA GGGTG ATCGG CCACA CTGGG ACTGA GACAC GGCCC AGACT CCTAC 300
GGGAG GCAGC AGTAG GGAAT CTTCC GCAAT GGACG AAAGT CTGAC GGAGC AACGC CGCGT 360
GAGTG ATGAA GGCTT TCGGG TCGTA AAACT CTGTT GTTAG GGAAG AACAA GTGCT AGTTG 420
AATAA GCTGG CACCT TGACG GTACC TAACC AGAAA GCCAC GGCTA ACTAC GTGCC AGCAG 480
CCGCG GTAAT ACGTA GGTGG CAAGC GTTAT CCGGA ATTAT TGGGC GTAAA GCGCG CGCAG 540
GTGGT TTCTT AAGTC TGATG TGAAA GCCCA CGGCT CAACC GTGGA GGGTC ATTGG AAACT 600
GGGAG ACTTG AGTGC AGAAG AGGAA AGTGG AATTC CATGT GTAGC GGTGA AATGC GTAGA 660
GATAT GGAGG AACAC CAGTG GCGAA GGCGA CTTTC TGGTC TGTAA CTGAC ACTGA GGCGC 720
GAAAG CGTGG GGAGC AAAAC AGGAT TAGAT ACCCT GGTAG TCCAC GCCGT AAACG ATGAG 780
TGCTA AGTGT TAGAG GGTTT CCGCC CTTTA GTGCT GAAGT TAACG CATTA AGCAC TCCGC 840
CTGGG GAGTA CGGCC GCAAG GCTGA AACTC AAAGG AATTG ACGGG GGCCC GCACA AGCGG 900
TGGAG CATGT GGTTT AATTC GAAGC AACGC GAAGA ACCTT ACCAG GTCTT GACAT CCTCT 960
GAAAA CCCTA GAGAT AGGGC TTCTC CTTCG GGAGC AGAGT GACAG GTGGT GCATG GTTGT 1020
CGTCA GCTCG TGTCG TGAGA TGTTG GGTTA AGTCC CGCAA CGAGC GCAAC CCTTG ATCTT 1080
AGTTG CCATC ATTAA GTTGG GCACT CTAAG GTGAC TGCCG GTGAC AAACC GGAGG AAGGT 1140
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CGGTA CAAAG AGCTG CAAGA CCGCG AGGTG GAGCT AATCT CATAA AACCG TTCTC AGTTC 1260
GGATT GTAGG CTGCA ACTCG CCTAC ATGAA GCTGG AATCG CTAGT AATCG CGGAT CAGCA 1320
TGCCT CGGTG AATAC GTTCC CGGGC CTTGT ACACA CCGCC CGTCA CACCA CGAGA GTTTG 1380
TAACA CCCGA AGTCG GTGGG GTAAC CTTTA TGAGC CAGCC GC 1422

Claims (7)

1.一种高效降解仲丁灵的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)LY05，其特征在于：其保藏号为CCTCC NO：M 2015397。
2.根据权利要求1所述的高效降解仲丁灵的蜡状芽孢杆菌LY05，其特征在于：该菌株16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种如权利要求1所述的菌株在降解仲丁灵农药残留中的应用。
4.一种采用如权利要求1所述的菌株生产降解仲丁灵制剂的方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)将蜡状芽孢杆菌LY05的菌株于无机盐培养基中，30～35℃，150～200rpm下振荡培养至对数生长期，获得菌种；
2)将上述菌种按无机盐培养基的体积比的10％的接种量接种入种子瓶，30～35℃，150～200rpm下振荡培养至对数生长期，获得种子液；
3)将获得的种子液按照10％的体积比的接种量接种入发酵培养基中，在30～35℃、150～200rpm下发酵培养45-50h，获得发酵液，发酵液的菌数大于3.0×109cfu/mL，将发酵液直接稀释5-20倍作为液体菌剂。
5.根据权利要求4所述的生产降解仲丁灵制剂的方法，其特征在于：在种子发酵罐和生产发酵罐的培养过程中，无菌空气的通气量为0.40～0.60m3/min，搅拌速度为150～200r/min，温度30～35℃，种子罐的培养时间及生产发酵罐的培养时间均为45-50h，发酵结束后菌体数量大于3.0×109cfu/mL。
6.根据权利要求4所述的生产降解仲丁灵制剂的方法，其特征在于：步骤3)中所述的发酵培养基相同，其组成按质量百分比计算，包括酵母膏0.5％，蛋白胨1％，葡萄糖0.5％，NaCl 1％，其余为水，pH 7。
7.根据权利要求4所述的生产降解仲丁灵制剂的方法，其特征在于：步骤1)及步骤2)中所述的无机盐培养基，KH2PO4 0.4g，K2HPO4 0.4g，NH4Cl 1g，MgCl2 0.1g，Na2SO4 1.425g，FeSO4·7H2O 0.025g，微量元素液10mL，加蒸馏水定容至1100mL，pH 7.0，高压蒸汽灭菌，121℃，20min；其中微量元素液组成如下：ZnSO4·7H2O 1.1g，MgSO4·H2O 0.58g，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.18g，CoSO4·7H2O 0.024g，CuSO4·5H2O 0.077g，H3BO3 0.029g，NaNO3·4H2O0.074g，蒸馏水1L。
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