CN105112322A - 灰霉醌a和b及其制备方法和医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明为灰霉醌A和B及其制备方法和医药用途，提供从海洋沉积物中分离的灰色链霉菌P82SMLY，保藏编号CCTCC？NO：M？2015386。本发明利用该菌株提取分类获得两种具有抗胶质瘤活性的海洋天然产物灰霉醌A和灰霉醌B，所述的灰霉醌A和灰霉醌B为新化合物。本发明提供的灰霉醌A和灰霉醌B具有显著抑制多种脑胶质瘤细胞增殖的特点，并可显著诱导脑胶质瘤细胞凋亡，因此可在制备治疗脑胶质瘤药物方面应用。灰霉醌A和灰霉醌B的化学结构式为：

Description

灰霉醌A和B及其制备方法和医药用途

技术领域

本发明属医药领域，涉及具有生物活性的新海洋天然产物灰霉醌A(streptoanthraquinoneA)和灰霉醌B(streptoanthraquinoneB)及其制备方法，以及在制备抗肿瘤药物中的用途。

背景技术

恶性肿瘤(癌症)对人类的健康和生命危害严重，为当今世界死亡率最高的疾病，也是我国城乡居民的第一死因。化疗是目前世界上肿瘤手术切除后药物治疗的主要方法，但化疗毒性较大，而且疗效有限。虽然分子靶向药物为癌症的治疗开辟了新途径，但其临床疗效并未达到预期效果，而且癌细胞对抗肿瘤药物耐药性的不断增加也严重影响现有药物的疗效。显然，临床上需要研究开发结构新颖、疗效好和安全性高的新型抗肿瘤药物。天然产物，特别是海洋天然产物是新型抗肿瘤药物研究开发的资源宝库。

发明内容

本发明的目的是提供从海洋沉积物中分离具有抗胶质瘤活性的放线菌菌株P82SMLY，所述的菌株分类命名为灰色链霉菌P82SMLY（StreptomycesgriseusP82SMLY），已被中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号CCTCCNO：M2015386，保藏日2015.6.19，保藏地址：中国武汉。

所述的菌株为放线菌灰色链霉菌StreptomycesgriseusP82SMLY,通过以下步骤分离培养而获得：

(1)灰色链霉菌StreptomycesgriseusP82SMLY的分离培养

取空气干燥的海洋沉积物用液体菌种培养液稀释，稀释后的浓度为0.1-0.001g/mL,取一定量的样品稀释液均匀分散到含有固体培养基的培养皿中，在室温条件下培养一定时间后,将不同的菌落分别转移到另一含有固体培养基的培养皿中，在室温条件下继续培养一定时间。最后将生长良好的单一菌落(P82SMLY)接种到斜面培养基培养后置于4℃冰箱保存备用。

所述的海洋沉积物是从浙江舟山东海海域中获得；所述的液体菌种培养液每100mL的组成为：1.5克葡萄糖、1.5克丙三醇、1.5克麦芽提取物、2.5克酵母提取物、0.5克酪蛋白氨基酸和0.1克碳酸钙,或是适宜菌株P82SMLY生长的其它组成的液体培养基；所述的样品稀释液的取样量为100-300；所述培养皿所含的固体培养基为细菌琼脂(Bacto-agar)培养基或其它固体培养基；所述的斜面培养基为高氏合成斜面培养基或其它固体斜面培养基；所述的室温培养温度为20-30℃；所述的培养时间为7-15天。

(2)灰色链霉菌StreptomycesgriseusP82SMLY的菌种鉴定

上述步骤(1)分离培养所得的菌株用目前实验室普遍使用的16SrDNA序列分析方法鉴定菌株P82SMLY的种类，确定为灰色链霉菌，分类命名为StreptomycesgriseusP82SMLY，已被中国典型培养物保藏中心保藏-中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCCNO：M2015386。

本发明的第二个目的是提供两种具有抗胶质瘤活性的海洋天然产物灰霉醌A(streptoanthraquinoneA,1)和灰霉醌B(streptoanthraquinoneB,2)，所述的灰霉醌A和灰霉醌B为新化合物，它们的化学结构式为：

本发明的第三个目的是提供灰霉醌A和灰霉醌B的制备方法，由海洋放线菌灰色链霉菌StreptomycesgriseusP82SMLY产生，通过以下步骤实现：

(1)灰霉醌A和灰霉醌B产生菌灰色链霉菌StreptomycesgriseusP82SMLY发酵菌液的制备

取灰色链霉菌StreptomycesgriseusP82SMLY的菌落接种到含有一定量的液体菌种培养基的大三角烧瓶中，将含有P82SMLY菌种的培养液在室温条件下旋转振摇培养一定时间后以制备菌种液。最后将菌种液转入含有一定量的液体发酵培养基的大三角烧瓶，在室温条件下旋转振摇发酵培养一定时间后，得到具有抗菌活性的P82SMLY发酵菌液。

所述的液体菌种培养基每1000mL的配方为:20.0克淀粉、1.0克硝酸钾、0.5克磷酸氢二钾、0.5克硫酸镁、0.5克氯化钠和0.01克硫酸铁，所用量为150-300mL；所述的液体发酵培养基为液体高氏合成培养基，所用量为250-500mL;所述的大三角培养瓶为500或1000mL；所述的室温培养温度为20-30℃；所述的旋转振摇的旋转速度为160-200rpm；所述的培养时间为5-15天。

(2)灰霉醌A和灰霉醌B的提取分离纯化

菌株P82SMLY的发酵菌液用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯萃取物，然后用十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)柱层析分离，分别用70%、85%和100%的甲醇洗脱，得到三个组分。组分3继续用高效液相(HPLC)分离，得到灰霉醌A和灰霉醌B。

所述柱层析的ODS用量与上量的样品量比例是40-60g:1.0g；所述的高效液相分离条件是:Agilent1260高效液相色谱仪，Agilent1260DAD检测器，AgilentZorbaxSB-C₁₈色谱柱(2509.4mm,5)，甲醇/水(85/15)为流动相，柱温26℃,检测波长238nm，流速为1.0mL/min。

(3)灰霉醌A和灰霉醌B的结构鉴定

灰霉醌A和灰霉醌B的结构是根据它们的紫外光谱、一维和二维的NMR光谱和高分辨质谱数据而鉴定。

本发明的第四个目的是提供灰霉醌A和灰霉醌B在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。所述的灰霉醌A和灰霉醌B可显著抑制多种脑胶质瘤细胞的增殖，显著诱导脑胶质瘤细胞的凋亡。

所述药物为灰霉醌A或灰霉醌B活性成分单独，或灰霉醌A和灰霉醌B两者合用，或灰霉醌A和灰霉醌B与其它药物或与有效成分一起，与药学上可接受的载体组成的药物。所述药物的制剂形式为：液体制剂、固体制剂、胶囊制剂、缓释制剂、纳米制剂。

本发明从海洋沉积物中分离培养到活性物质产生菌灰色链霉菌StreptomycesgriseusP82SMLY,并从该菌株的培养液中发现了两个新的生物活性物质灰霉醌A(streptoanthraquinoneA)和灰霉醌B(streptoanthraquinoneB)。灰霉醌A和灰霉醌B显著抑制多种脑胶质瘤细胞增殖，并可显著诱导脑胶质瘤细胞凋亡，所以，灰霉醌A和灰霉醌B在制备治疗脑胶质瘤药物方面具有好的应用前景。

附图说明

图1.灰霉醌A(StreptoanthraquinoneA,1)的紫外图谱。

图2.灰霉醌A(StreptoanthraquinoneA,1)的氢谱。

图3.灰霉醌A(StreptoanthraquinoneA,1)的碳谱。

图4和图5.灰霉醌A(StreptoanthraquinoneA,1)的¹H-¹HCOSY谱。

图6-8.灰霉醌A(StreptoanthraquinoneA,1)的HSQC谱。

图9-13.灰霉醌A(StreptoanthraquinoneA,1)的HMBC谱。

图14.灰霉醌A(StreptoanthraquinoneA,1)的HRESIMS谱。

图15.灰霉醌B(StreptoanthraquinoneB,2)的紫外图谱。

图16.灰霉醌B(StreptoanthraquinoneB,2)的氢谱。

图17.灰霉醌B(StreptoanthraquinoneB,2)的碳谱。

图18-20.灰霉醌B(StreptoanthraquinoneB,2)的¹H-¹HCOSY谱。

图21.灰霉醌B(StreptoanthraquinoneB,2)的HSQC谱。

图22-25.灰霉醌B(StreptoanthraquinoneB,2)的HMBC谱。

图26.灰霉醌B(StreptoanthraquinoneB,2)的NOESY谱。

图27.灰霉醌B(StreptoanthraquinoneB,2)的HRESIMS谱。

图28.灰霉醌A(1)和灰霉醌B(2)主要的COSY、HMBC和NOE相关性。

图29.灰霉醌A抑制胶质瘤细胞的活性。

图30.灰霉醌B抑制胶质瘤细胞的活性。

图31.灰霉醌A和B诱导脑胶质瘤细胞凋亡。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述，但本发明不限于这些实施例。

灰霉醌A和灰霉醌B产生菌灰色链霉菌StreptomycesgriseusP82SMLY的分离培养

取空气干燥的海洋沉积物3克用液体菌种培养液稀释到浓度为0.01g/mL。液体菌种培养基每100mL的组成为：1.5克葡萄糖、1.5克丙三醇、1.5克麦芽提取物、2.5克酵母提取物、0.5克酪蛋白氨基酸和0.1克碳酸钙。取200的样品稀释液均匀分散到含有细菌琼脂(Bacto-agar)固体培养基的培养皿中,在室温条件下培养10天后,将不同的菌落分别转移到另一含有细菌琼脂(Bacto-agar)固体培养基的培养皿中,在室温条件下继续培养7天。最后将生长良好的单一菌落(P82SMLY)接种到高氏合成斜面培养基，置于4℃冰箱保存备用。

灰霉醌A和灰霉醌B产生菌灰色链霉菌StreptomycesgriseusP82SMLY的菌种鉴定

使用16SrDNA序列分析方法鉴定所获得菌株P82SMLY的种类。

2.1实验试剂及仪器

PCR试剂：EXTaq酶(TaKaRa)，dNTP(TaKaRa)，引物(Invitrogen合成)，引物序列是:TACGGYTACCTTGTTACGACTT和AGAGTTTGATCMTGGCTCAG

Marker：DL5000

实验仪器：离心机，电泳仪，PCR仪，ABI3730XL测序仪。

2.2实验步骤

细菌基因组DNA抽提

电泳检测

PCR扩增

a.PCR反应体系

10×ExTaqbuffer2.0μl

2.5mMdNTPMix1.6μl

5pPrimer10.8μl

5pPrimer20.8μl

Template0.5μl

5uExTaq0.2μl

ddH ₂ O14.1μl

Totalvolume20.0μl

b.PCR反应条件

c.电泳检测

d.测序:切胶纯化测序

e.分析结果:拼接序列。

2.3实验结果

拼接后的序列为：TGCAGTCGAACGATGAAGCCCTTCGGGGTGGATTAGTGGCG

AACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAACACTCTGTCCCGCATGGGACGGGGTTGAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCC-TTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCC-GGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAAAGCATCAGAGATGGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGG-CTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGG-TGATGGGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATGCCGCGAGGCGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCC

以上获得的16SrDNA序列与美国NIH的NCBIGenBank数据库比较，其结果表明:菌株P82SMLY的16SrDNA序列与GenBank库中的StreptomycesgriseusstrainCB00830的16SrDNA序列有100%的相似性(登录号:KF981731.1)。因此，本发明所获得的海洋菌株P82SMLY分类命名为灰色链霉菌StreptomycesgriseusP82SMLY。灰色链霉菌(StreptomycesgriseusP82SMLY)已被中国典型培养物保藏中心保藏（中国武汉武汉大学），保藏编号CCTCCNO：M2015386。

灰霉醌A和灰霉醌B产生菌灰色链霉菌StreptomycesgriseusP82SMLY发酵菌液的制备

取灰色链霉菌StreptomycesgriseusP82SMLY的菌落接种到含有200mL的液体菌种培养基的大三角烧瓶中，将含有P82SMLY菌种的培养液在28℃室温条件下旋转(180rpm)振摇培养5天后得到菌种液。将菌种液转入含有250mL液体高氏合成培养基的500mL三角烧瓶，在28℃室温条件下旋转(180rpm)振摇培养10天后，得到具有抗菌活性的P82SMLY发酵菌液。

灰霉醌A和灰霉醌B的提取分离纯化

上述实验3获得的发酵菌液(30.0升),用乙酸乙酯萃取3次，每次10.升，合并乙酸乙酯萃取液，经减压浓缩得到乙酸乙酯萃取物(5.98克)。该萃取物用用十八烷基硅烷键合硅胶(ODS，300克)柱层析分离，先后用70%、85%和100%甲醇洗脱，分别收集洗脱液并减压浓缩得到70%、85%和100%甲醇洗脱物三个组分。组分三(100%甲醇洗脱物，50mg)用HPLC分离纯化(仪器：Agilent1260；层析柱：AgilentZorbaxSB-C₁₈，2509.4mm，5；流动相:甲醇/水：85/15；柱温：26℃；检测波长：238nm；流速：1.0m,L/min)，得到灰霉醌A(1,30.6mg,t _R16.46min)和灰霉醌B(2,11.8mg,t _R21.45min)。

根据灰霉醌A和灰霉醌B的紫外光谱(附图1和15)、旋光光谱、¹H谱(附图2和16)，¹³C谱(附图3和17)、¹H-¹HCOSY谱(附图4,5,18,19和20)，HSQC谱(附图6,7,8和21)，HMBC谱(附图9,10,11,12,13,22,23,24和25)，NOESY谱(附图26)及高分辨质谱(附图14和27)，灰霉醌A和灰霉醌B的结构鉴定为新化合物，其主要的COSY、HMBC和NOE相关性参见附图28。

灰霉醌A的理化性质：暗棕色粉末；分子式C₂₇H₂₅NO₈;[]_D ²⁵+63.7(c0.50,DMSO);UV(MeOH):240,327,443nm;高分辨质谱(HRESIMS)为m/z[M+Na]⁺514.1457(计算值C₂₇H₂₅NNaO₈,514.1478)；¹³C和¹HNMR信号归属见表一。

灰霉醌B的理化性质：暗棕色粉末；分子式C₂₈H₂₂O₈;[]_D ²⁵+51.9(c0.50,DMSO);UV(MeOH):221,237,327,445nm;高分辨质谱(HRESIMS)为m/z[M+Na]⁺509.1233(计算值C₂₈H₂₂NaO₈,509.1212)；¹³C和¹HNMR信号归属见表二。

确定所述的灰霉醌A和灰霉醌B为新化合物，它们的化学结构式为：

。

灰霉醌A和灰霉醌B的生物活性研究

5.1.灰霉醌A和灰霉醌B抑制肿瘤细胞增殖的作用

大鼠脑胶质瘤C6细胞和人脑胶质瘤U251细胞用DMEM和10%FBS培养基在37℃和5%二氧化碳的孵化箱中培养，而人脑胶质瘤U87-MG和HSG-44细胞分别用MEM培养基和RPMI-1640培养基在37℃和5%二氧化碳的孵化箱中培养，经过三代培养的细胞用于本发明的实验研究。

用磺酰罗丹明B(SRB)法测定肿瘤细胞存活率，阿霉素(Doxorubicin)用于阳性药对照。细胞接种于96孔板中，贴壁24h后加入不同浓度的灰霉醌A或灰霉醌B。药物处理72h后用SRB染色，用酶标仪测定515nm处的吸收光度值，检测肿瘤细胞的存活率，计算灰霉醌A和灰霉醌B抑制胶质瘤细胞增殖的IC₅₀值。实验结果表明：灰霉醌A和灰霉醌B显著抑制胶质瘤细胞的增殖，其IC₅₀值分别为0.71-3.93和4.64-10.48(表三,附图29和附图30)。

5.2.灰霉醌A和灰霉醌B诱导肿瘤细胞凋亡的作用

用AnnexinV-FITC/PI双染色分析方法对灰霉醌A和灰霉醌B诱导人胶质瘤U251细胞凋亡的作用进行了定量分析。将胶质瘤U251细胞用灰霉醌A(0.71)或灰霉醌B(4.65)处理36小时后，收集110⁶个细胞。细胞用冷的PBS缓冲液洗涤后重新分散在100含有5AnnexinV-FITC和1100μg/mlPI工作液的结合缓冲液中。细胞在室温下孵化15分钟后加入400结合缓冲液，用流式细胞仪检测其荧光(激发波长：488nm；发射波长：530nm和575nm)。实验结果表明：与对照组U251细胞凋亡(3.58%)比较，灰霉醌A和灰霉醌B处理后36h，可分别引起人脑胶质瘤U251细胞凋亡率升高38.76%和36.67%(参见附图31)，图中左下角为正常细胞，右下角为早期凋亡细胞，右上角为晚期凋亡细胞，左上角为坏死细胞。

以上结果表明：灰霉醌A和灰霉醌B显著抑制脑胶质瘤细胞增殖，并明显诱导脑胶质瘤细胞凋亡。所以，由灰霉醌A和灰霉醌B制备的相关药物在脑胶质瘤的治疗方面具有应用前景。

<110>浙江大学

<120>灰霉醌A和B及其制备方法和医药用途

<160>3

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

TACGGYTACCTTGTTACGACTT

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

AGAGTTTGATCMTGGCTCAG

<210>3

<211>1255

<212>DNA

<213>灰色链霉菌(StreptomycesgriseusP82SMLY)

<220>

<222>(1)…(1255)

<440>1

ACTGCGTCACCTTCGAAGCTCCCTCCCACAAGGGGTTGGGCCACCGGCTT50

CGGGTGTTACCGACTTTCGTGACGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGG100

GAACGTATTCACCGCAGCAATGCTGATCTGCGATTACTAGCAACTCCGAC150

TTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGACCGGCTTTTTG200

AGATTCGCTCCGCCTCGCGGCATCGCAGCTCATTGTACCGGCCATTGTAG250

CACGTGTGCAGCCCAAGACATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCGTCCCC300

ACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCAGTCTCCTGTGAGTCCCCATCACCCC350

GAAGGGCATGCTGGCAACACAGAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTT400

AACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTAT450

ACCGACCACAAGGGGGGCACCATCTCTGATGCTTTCCGGTATATGTCAAG500

CCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAGCCACATGCTCCGCTG550

CTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTAC600

TCCCCAGGCGGGGAACTTAATGCGTTAGCTGCGGCACCGACGACGTGGAA650

TGTCGCCAACACCTAGTTCCCAACGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTAT700

CTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTAATGGCC750

CAGAGATCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTTCA800

CCGCTACACCAGGAATTCCGATCTCCCCTACCACACTCTAGCTAGCCCGT850

ATCGAATGCAGACCCGGGGTTAAGCCCCGGGCTTTCACATCCGACGTGAC900

AAGCCGCCTACGAGCTCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCGC950

CCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCCGGCGCTTCTTCT1000

GCAGGTACCGTCACTTTCGCTTCTTCCCTGCTGAAAGAGGTTTACAACCC1050

GAAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTTCGCCCAT1100

TGTGCATATTCCCCACTGCTGCCTCCGTAGAGTCTGGTCGTGTCTTCAGT1150

TCCAGTGTGTGTCGCCCCTCCCTCAGCGCCTACCGTCGGTCGCCTTGTTA1200

GCATACCCCACACCAGCTGAATGCGCGGCTCATCCTTCCACCCGCCGGAG1250

CATCA1255

Claims (7)

1.一种灰色链霉菌菌株P82SMLY，其特征在于:所述灰色链霉菌菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2015386，分类命名为：灰色链霉菌P82SMLY（StreptomycesgriseusP82SMLY），保藏日：2015年6月19日。

2.根据权利要求1所述的一种灰色链霉菌菌株P82SMLY，其特征在于，通过以下步骤分离培养获得：

(1)灰色链霉菌StreptomycesgriseusP82SMLY的分离培养

取空气干燥的海洋沉积物用液体菌种培养液稀释，稀释后的浓度为0.1-0.001g/mL,取样品稀释液均匀分散到含有固体培养基的培养皿中，在室温条件下培养时间7-15天后,将不同的菌落分别转移到另一含有固体培养基的培养皿中，在室温条件下继续培养7-15天，最后将生长良好的单一菌落接种到斜面培养基培养后置于4℃冰箱保存备用；

所述的海洋沉积物是从浙江舟山东海海域中获得；所述的液体菌种培养液每100mL的组成为：1.5克葡萄糖、1.5克丙三醇、1.5克麦芽提取物、2.5克酵母提取物、0.5克酪蛋白氨基酸和0.1克碳酸钙,或是适宜菌株P82SMLY生长的其它组成的液体培养基；所述的样品稀释液的取样量为100-300；所述培养皿所含的固体培养基为细菌琼脂Bacto-agar培养基或其它固体培养基；所述的斜面培养基为高氏合成斜面培养基或其它固体斜面培养基；所述的室温培养温度为20-30℃；

（2）菌种鉴定：将上述步骤(1)分离培养所得的菌株用目前实验室普遍使用的16SrDNA序列分析方法鉴定，确定为灰色链霉菌，分类命名为StreptomycesgriseusP82SMLY，已经保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO：M2015386。

3.抗胶质瘤活性物质灰霉醌A(streptoanthraquinoneA)和灰霉醌B(streptoanthraquinoneB)，其特征在于，所述的灰霉醌A和灰霉醌B具有以下化学结构式：

。

4.根据权利要求3所述的抗胶质瘤活性物质灰霉醌A和灰霉醌B的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

(1)灰霉醌A和灰霉醌B产生菌灰色链霉菌StreptomycesgriseusP82SMLY发酵菌液的制备

取灰色链霉菌StreptomycesgriseusP82SMLY的菌落接种到含有液体菌种培养基的大三角烧瓶中，将含有P82SMLY菌种的培养液在室温条件下旋转振摇培养5-15天后以制备菌种液，最后将菌种液转入含有液体发酵培养基的大三角烧瓶，在室温条件下旋转振摇发酵培养5-15天后，得到具有抗菌活性的P82SMLY发酵菌液；

所述的液体菌种培养基每1000mL的配方为:20.0克淀粉、1.0克硝酸钾、0.5克磷酸氢二钾、0.5克硫酸镁、0.5克氯化钠和0.01克硫酸铁，所用量为150-300mL；所述的液体发酵培养基为液体高氏合成培养基，所用量为250-500mL；所述的大三角培养瓶为500或1000mL；所述的室温培养温度为20-30℃；所述的旋转振摇的旋转速度为160-200rpm；

(2)灰霉醌A和灰霉醌B的提取分离纯化

菌株P82SMLY的发酵菌液用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯萃取物，然后用十八烷基硅烷键合硅胶柱层析分离，分别用70%、85%和100%的甲醇洗脱，得到三个组分，组分3继续用高效液相分离，得到灰霉醌A和灰霉醌B；

所述柱层析的ODS用量与上量的样品量比例是40-60g:1.0g；所述的高效液相分离条件是:Agilent1260高效液相色谱仪，Agilent1260DAD检测器，AgilentZorbaxSB-C₁₈色谱柱：2509.4mm,5，甲醇/水比为85/15作为流动相，柱温26℃，检测波长238nm，流速为1.0mL/min；

(3)灰霉醌A和灰霉醌B的结构鉴定

通过紫外光谱、一维和二维的NMR光谱和高分辨质谱数据鉴定灰霉醌A和灰霉醌B的结构。

5.根据权利要求3所述的灰霉醌A和灰霉醌B在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物为灰霉醌A或灰霉醌B活性成分单独，或灰霉醌A和灰霉醌B两者合用，或灰霉醌A和灰霉醌B与其它药物或与有效成分一起，与药学上可接受的载体组成的药物。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物的制剂形式为液体制剂、固体制剂、胶囊制剂、缓释制剂、纳米制剂。