CN111100846A

CN111100846A - 表达pd-1结合蛋白的溶瘤病毒及其应用

Info

Publication number: CN111100846A
Application number: CN201811259785.9A
Authority: CN
Inventors: 章康健; 方先龙; 顾锦法; 刘新垣
Original assignee: Shanghai Yuansong Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Yuansong Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-10-26
Filing date: 2018-10-26
Publication date: 2020-05-05
Also published as: US20210403564A1; WO2020083324A1; CN112996909A; CN112996909B

Abstract

本发明公开了一种表达PD‑1结合蛋白的溶瘤病毒，特别公开了一种包含表达PD‑1单链抗体的融合蛋白的溶瘤腺病毒，该溶瘤病毒能够在体外和体内高效抑制肿瘤。

Description

表达PD-1结合蛋白的溶瘤病毒及其应用

技术领域

本发明属于利用溶瘤病毒进行肿瘤治疗的技术领域，具体地，本发明涉及一种表达PD-1结合蛋白的溶瘤腺病毒、其制备方法以及应用。

背景技术

据统计，全世界每年有超过1200万人诊断出癌症，癌症严重影响着全人类的健康和发展。受医疗和环境条件的影响，中国癌症死亡率高于全球平均水平。传统的肿瘤疗法存在疗效差、死亡率高及预后复发率高等缺点，因此对癌症的治疗提出了重大挑战。例如早在肿瘤发展的极早期，微转移就已经产生从而定位于远离肿瘤原发部位的组织中。因此在诊断发现癌症时，许多癌症患者已出现了微转移的现象。

肿瘤反应性T细胞可以寻找并破坏这些微转移，并使周围的健康组织得以保留。然而，天然存在的针对恶性肿瘤的T细胞应答通常不足以有效抑制原发性或转移性肿瘤的消退。新的疗法例如免疫疗法包括PD-1 抗体、PD-L1抗体、以及近年来热门的CAR-T技术，就旨在于加强病人对肿瘤的免疫反应而清除原发性或转移性肿瘤细胞。此外，作为另一个具有前途的疗法，溶瘤病毒能够在肿瘤细胞中复制并裂解细胞，从而持续杀死肿瘤细胞。而且溶瘤病毒中还能够携带抗癌基因等，在利用病毒裂解细胞的同时，发挥基因杀伤肿瘤细胞的能力，从而提高了治疗效果。

目前仍然急需获得新的手段增强溶瘤病毒的效力，从而增加临床上获得成功的机会。

发明内容

本发明首先通过改进溶瘤腺病毒的结构，将病毒基因组中的E1A野生型启动子替换为survivin启动子，使得改造后的溶瘤腺病毒仅在具有 survivin启动子活性的肿瘤细胞中复制而在正常细胞中无法复制，加强了对肿瘤细胞的靶向性；随后失活E1B基因，从而使腺病毒优先在p53功能缺失的癌细胞中复制。进一步，在病毒的基因组中引入外源的PD-1结合蛋白序列，从而使得溶瘤病毒在发挥自身溶瘤特性的同时，还额外具有抑制PD-1后所产生的免疫调节效果。更重要的是，发明人意外发现，所述PD-1结合蛋白的结构会对溶瘤病毒的效果产生至关重要的影响，通过引入特定形式的PD-1单链抗体并且在C端连接免疫球蛋白的Fc序列，能够对溶瘤病毒的体内和体外的抑瘤效果带来预料不到的改善。基于上述发现，完成了本发明。

具体地，本发明的第一个方面提供了一种溶瘤病毒，其包含编码能够抑制PD-1活性的PD-1结合蛋白的核酸序列。

在一个实施方案中，所述病毒是腺病毒。

在另一个实施方案中，所述病毒包含以survivin启动子驱动的E1A 基因，优选地，病毒基因组中E1A的内源启动子被survivin启动子所替换；和/或

在另一个实施方案中，E1B基因的活性降低或者完全失活，优选地，从病毒基因组中敲除E1B基因。

在另一个实施方案中，所述PD-1结合蛋白为包含PD-1单链抗体和免疫球蛋白Fc区的融合多肽。

在另一个实施方案中，所述融合多肽具有以下结构：

S-V_L-L-V_H-Fc；

其中，S为任选存在的信号肽序列，优选地，所述信号肽序列为：

MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO：14)；或者

MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC(SEQ ID NO：16)；

V_L为PD-1单链抗体的轻链可变区，优选地，其包含序列为 RAGQNVQNYLA(SEQ IDNO：17)的CDR1、序列为NAQSLQT(SEQ ID NO：18)的CDR2以及序列为QQYNSWPT(SEQ ID NO：19)的 CDR3，更优选的，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

L为连接序列，例如柔性连接序列，比如包含或主要由Ala、Thr、 Gly和/或Ser构成，具体地比如一段包含或主要由Gly和Ser构成的柔性序列；例如，所述连接序列的长度可以为1-50个氨基酸，例如1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50；

优选地，L为(Gly₄Ser)_m，其中m为1至10之间的自然数，例如1、 2、3、4、5、6、7、8、9或10；更优选地，L为(Gly₄Ser)₆(SEQ ID NO： 15)；或者

L为A(EAAAK)_nA，其中n为1至9之间的自然数，例如1、2、3、 4、5、6、7、8或9；

V_H为PD-1单链抗体的重链可变区，优选的，其包含序列为 GFSLSTSGT(SEQ ID NO：20)的CDR1、序列为CWEDS(SEQ ID NO： 21)的CDR2以及序列为EDSGYFWFPY(SEQ ID NO：22)的CDR3，更优选的，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；

Fc是免疫球蛋白的Fc区；所述Fc可以来自人免疫球蛋白；所述Fc 区可以是来自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的Fc区；优选地，所述Fc 区是来自IgG的Fc区，例如来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区；再优选地，所述Fc区是来自IgG4的Fc区；其中与其来源序列相比，所述Fc区可以替换、添加和/或缺失一个或更多个氨基酸；优选的Fc序列如SEQ ID NO：9所示。

在另一个实施方案中，所述核酸序列与启动子可操作连接；优选地，所述启动子为CMV启动子。

在另一个实施方案中，所述溶瘤病毒于2018年08月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V201853。

本发明的第二个方面提供了第一个方面中的溶瘤病毒在制备治疗增生性疾病的药物中的用途，优选地，所述增生性疾病是肿瘤，例如***癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、黑色素瘤、头颈部肿瘤、淋巴癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、头颈部鳞癌、膀胱癌或者肾癌。

本发明的第三个方面提供了一种药物组合物，其包含第一个方面中的溶瘤病毒，任选的还包含药学上可接受的载体。

在一个实施方案中，所述药物组合物被配制为通过口服、雾化吸入、静脉、肌内、皮下、灌注、病灶内注射或者瘤内途径施用。

在一个具体实施方案中，所述药物组合物包含约10⁸至10¹²病毒粒子 (vp)(例如1.5×10¹⁰vp)的所述溶瘤病毒。

本发明的第四个方面提供了一种治疗增生性疾病的方法，其包括将第一个方面中的溶瘤病毒或第三个方面中的药物组合物施予有需要的对象，优选的，所述增生性疾病是肿瘤，例如***癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、黑色素瘤、头颈部肿瘤、淋巴癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、头颈部鳞癌、膀胱癌或者肾癌。

在一个实施方案中，所述药物组合物通过通过口服、雾化吸入、静脉、肌内、皮下、灌注、病灶内注射或者瘤内途径向所述对象施用约10⁸至 10¹²vp(例如1.5×10¹⁰vp)的所述溶瘤病毒，施用次数1-6次(例如1次、 2次、3次、4次、5次或6次)。所述施用可以是每1天、2天、3天、4 天、5天、6天、7天或更多天进行；或者是1天内施用1次、2次、3次、 4次、5次、6次或更多次。

本发明所提供的溶瘤病毒，具有良好的安全性以及体内和体外抑瘤效果，抑瘤效果显著优于现有临床用药索拉菲尼和吉西他滨，因而具有广阔的临床应用前景。

附图说明

图1是具有不同抗体结构和序列的重组溶瘤腺病毒Ad-sp-E1A-Δ E1B-anti-PD1构建示意图。

图2显示了具有不同抗体序列的重组溶瘤腺病毒在的体外杀伤作用。

图3显示了重组溶瘤腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3与空载病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B杀伤肿瘤细胞能力的比较。

图4显示了重组溶瘤腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3对正常细胞的安全性检测结果。

图5显示了Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3感染HCC827细胞(A) 和MDA-MB-231细胞(B)后PD1细胞上清的PD1抗体的分泌情况。

图6显示了在MDA-MB-231裸鼠移植瘤模型中 Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3对肿瘤生长的抑制结果。

图7显示了在HCC827裸鼠移植瘤模型中 Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3对肿瘤生长的抑制结果。

图8显示了在HCC827人源化小鼠移植瘤模型中 Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3对肿瘤生长的抑制结果。

具体实施方式

定义

术语“溶瘤病毒”是指能够在癌症或者具有过度增殖的细胞中选择性复制，从而减缓其生长或者使其死亡的病毒，同时对正常细胞没有影响或影响很小。示例性的溶瘤病毒包括水泡性口炎病毒(VSV)，新城疫病毒 (NDV)，单纯疱疹病毒(HSV)，呼肠孤病毒，麻疹病毒，逆转录病毒，流感病毒，辛比斯病毒，痘苗病毒和腺病毒等(参见，例如，Kirn等，Nat.Med.7：781)。(2001)；Coffey等，Science 282：1332(1998)；Lorence 等，CancerRes.54：6017(1994)；和Peng等，Blood 98：2002(2001))。”

术语“PD-1”，即programmed cell death protein 1，程序性死亡受体 1，是一种重要的免疫抑制分子。以PD-1为靶点的免疫调节对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意义。PD-1的内源性配体是PD-L1(Programmed cell death1ligand 1)，即细胞程序死亡配体-1，是B7家族的成员，表达于大多数的肿瘤细胞表面，例如胃癌、肺癌、乳腺癌、***、肠癌、黑色素瘤、肝癌、卵巢癌、肾癌、胰腺癌、脑胶质瘤和白血病，是一种重要的免疫抑制分子。PD-1通过与PD-1的结合，抑制T细胞的增殖从而抑制免疫反应。

PD-L1与活化的T细胞表面PD-1分子结合,促进SHP-1分子的磷酸化,并抑制了CD3δ和Zap-70的磷酸化，从而阻断了TCR信号传导此外PD-1/PDL1信号还可以通过抑制PI3K和Akt分子活性，进而阻断 CD28信号，抑制了T细胞分泌细胞因子、增殖和杀伤的功能，使其最终发生凋亡坏死被清除。当PD-1/PD-L1相互作用后，不但T细胞活化的第一、二信号被阻断了，效应性T细胞活化与增殖也别抑制了，而且调节性T细胞也发挥更强的免疫抑制性功能，甚至诱导TH细胞向Treg细胞转化。目前有大量的研究表明，阻断PD-1/PDL1信号，可有效的增加效应性T细胞、并减少Treg细胞的数量，抑制了肿瘤的生长和转移，从而大大延长了荷瘤小鼠生存时间。对于那些癌症晚期患者，当不能使用手术，化疗及放疗时，使用免疫治疗是目前最有效的方法，目前对PD-1/PD-L1 信号的阻断已出现大量的抑制性抗体，在临床上对黑色素瘤的治疗取得了很好的效果，有效延长了病人的生存期。

术语“PD-1结合蛋白”是指能够结合PD-1蛋白，并且抑制PD-1蛋白功能的蛋白质。

survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis,IAP)家族的成员，其在大多数恶性肿瘤中特异性高表达，其启动子在肿瘤细胞和组织中具有较强的转录活性,其介导目的基因能特异性表达于各种肿瘤细胞,而不表达于正常分化细胞和静止的血管内皮细胞,具有高度的肿瘤组织特异性。术语“survivin启动子”是指survivin基因的启动子区序列，survivin启动子可以来自于任意来源的动物，优选哺乳动物，例如人。同时，survivin启动子也可以包含一个或多个碱基序列的增加、删除和/或替换，只要其仍然保持了survivin启动子的表达特异性。

术语“单链抗体”，即single chain antibody fragment，scFv，是指由抗体重链可变区和轻链可变区通过连接序列(linker)连接而成的抗体。其中连接序列是包含或主要由A、T、G和/或S构成的柔性肽段，在一个实施方案中是一段由G和S构成的柔性肽段；所述连接序列的长度可以是1-50个或更多个氨基酸，例如例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、50个氨基酸。

在一个实施方案中，连接序列选自下列序列：

(Gly₄Ser)、(Gly₄Ser)₂、(Gly₄Ser)₃、(Gly₄Ser)₄、(Gly₄Ser)₅、(Gly₄Ser)₆(Gly₄Ser)₇、(Gly₄Ser)₈、(Gly₄Ser)₉、(Gly₄Ser)₁₀；在一个优选实施方案中，连接序列为(Gly₄Ser)₆(SEQ ID NO：15)。

在另一个实施方案中，连接序列选自下列序列：

A(EAAAK)₂A、A(EAAAK)₃A、A(EAAAK)₄A、A(EAAAK)₅A、 A(EAAAK)₆A、A(EAAAK)₇A、A(EAAAK)₈A、A(EAAAK)₉A。

术语“免疫球蛋白的Fc区”是指含有免疫球蛋白的重链恒定区1 (CH1)、重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)，而不含免疫球蛋白的重链和轻链的可变区的蛋白质区段。它还可包含重链恒定区处的铰链区。

此外，本发明的免疫球蛋白Fc区可含有包含除了重链和轻链的可变区以外的重链恒定区1(CH1)和/或轻链恒定区(CL)的Fc区的一部分或全部，只要它具有与天然蛋白质基本相似或更好的生理功能即可。此外，它可以是在CH2和/或CH3的氨基酸序列的相对长的部分中具有缺失的片段。例如，本发明的免疫球蛋白Fc区可包含1)CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域；2)CH1结构域和CH2结构域；3)CH1结构域和 CH3结构域；4)CH2结构域和CH3结构域；5)CH1结构域、CH2结构域、CH3或CL结构域；6)一种或更多种恒定区结构域与免疫球蛋白铰链区(或其部分)的组合；或7)重链恒定区和轻链恒定区的各个结构域的二聚体。总之，本发明的免疫球蛋白Fc区是指具有一个或更多个重链/轻链恒定区结构域或其变体形式，例如单链Fc、单体Fc。

此外，本发明的免疫球蛋白Fc区可包括天然氨基酸序列及其序列变体(突变体)。由于一个或更多个氨基酸残基的缺失、***、非保守或保守替换或其组合，氨基酸序列衍生物具有与天然氨基酸序列不同的序列。例如，在IgG Fc中，第214至238、297至299、318至322或327至331 位处的已知对于结合重要的氨基酸残基可用作修饰的适合靶点。此外，其它多种衍生物也可以，包括其中缺失了能够形成二硫键的区域的、缺失了天然Fc形式N-端处数个氨基酸残基的或者向天然Fc形式的N-端添加了甲硫氨酸残基的衍生物。

蛋白质和多肽中一般不改变分子活性的氨基酸替换是本领域已知的(H.Neurath，R.L.Hill，The Proteins，Academic Press，New York，1979)。最常发生的替换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、 Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、 Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly，双向皆可。

上述Fc衍生物是与本发明的Fc区具有相同生物活性或者改善的结构稳定性(例如对热、pH等的结构稳定性)的衍生物。

此外，这些Fc区可以得自从人和包括牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠的其他动物中分离的天然形式，或者可以是得自转化的动物细胞或微生物的其重组体或衍生物。在本文中，它们可通过从人或动物有机体分离完整的免疫球蛋白并用蛋白水解酶对它们进行处理而从天然免疫球蛋白获得。木瓜蛋白酶将天然免疫球蛋白消化成Fab区和Fc区，而胃蛋白酶处理则导致产生pFc’和F(ab’)₂片段。例如，可对这些片段进行尺寸排阻层析以分离Fc或pFc’。

此外，免疫球蛋白Fc区可以是衍生自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM 的Fc区，或者通过其组合或杂合制备而成。优选地，其衍生自IgG或IgM (它们是人类血液中最丰富的蛋白质之一)，最优选衍生自IgG(已知其延长配体结合蛋白质的半衰期)。

另外应注意，如本说明书中所使用的，单数形式包括其所指对象的复数形式，除非清楚且明确的限于一个所指对象。而且如果提到一个特定的数值，至少会包括该数值，除非文章清楚的表明了其另有所指。

当数值表示近似值，应理解为特定的数值形成了另一个实施方案。就如所使用的，“约X”(其中X是一个数值)是指±10％(包含)所列出值。如果存在，所有范围都是包括和可以组合的。

本文使用的术语例如“包含”、“含”、“含有”和“包括”不意在限制。此外，除非另有说明，“或”、“或者”意指“和/或”。

本文使用的术语“药物组合物”表示组合在一起以实现某种特定目的的至少一种药物以及任选地可药用载体或辅料的组合。在某些实施方案中，所述药物组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述药物组合物中所含的成分可以以整体施用于对象，或者分开施用于对象。当所述药物组合物中所含的成分分开地施用于对象时，所述成分可以同时或依次施用于对象。优选地，所述药学上可接受的载体是水、缓冲水溶液、等渗盐溶液如PBS(磷酸盐缓冲液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3％甘油、透明质酸、或聚亚烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。所用可药用载体的类型尤其依赖于根据本发明的组合物是否配制为用于经口、鼻、瘤内、灌注、皮内、皮下、肌内、病灶内或静脉施用。

根据本发明的组合物可包含润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色物质、矫味物质和/或芳香物质等作为添加剂。

“施与”或者“施用”意指以在药理学上可用的方式向对象提供物质，例如药物组合物。

向对象提供的药物组合物的剂量，是指足以显示其对于所施用对象产生益处的剂量，在本文中也可以被称为“药物有效量”或“有效量”。施用的实际量，以及施用的速率和时间过程会取决于所治疗者的自身情况和严重程度。治疗的处方(例如对剂量的决定等)最终是全科医生及其它医生的责任并依赖其做决定，通常考虑所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及对于医生来说已知的其它因素。

在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含10⁸至10¹²vp的溶瘤病毒，例如1×10⁸、1.5×10⁸、2×10⁸、2.5×10⁸、3×10⁸、3.5×10⁸、4×10⁸、4.5×10⁸、5×10⁸、5.5×10⁸、6×10⁸、6.5×10⁸、7×10⁸、7.5×10⁸、8×10⁸、8.5×10⁸、9×10⁸、 9.5×10⁸、1×10⁹、1.5×10⁹、2×10⁹、2.5×10⁹、3×10⁹、3.5×10⁹、4×10⁹、4.5×10⁹、 5×10⁹、5.5×10⁹、6×10⁹、6.5×10⁹、7×10⁹、7.5×10⁹、8×10⁹、8.5×10⁹、9×10⁹、 9.5×10⁹、1×10¹⁰、1.5×10¹⁰、2×10¹⁰、2.5×10¹⁰、3×10¹⁰、3.5×10¹⁰、4×10¹⁰、 4.5×10¹⁰、5×10¹⁰、5.5×10¹⁰、6×10¹⁰、6.5×10¹⁰、7×10¹⁰、7.5×10¹⁰、8×10¹⁰、 8.5×10¹⁰、9×10¹⁰、9.5×10¹⁰、1×10¹¹、1.5×10¹¹、2×10¹¹、2.5×10¹¹、3×10¹¹、 3.5×10¹¹、4×10¹¹、4.5×10¹¹、5×10¹¹、5.5×10¹¹、6×10¹¹、6.5×10¹¹、7×10¹¹、 7.5×10¹¹、8×10¹¹、8.5×10¹¹、9×10¹¹、9.5×10¹¹或1×10¹²vp；以及上述两点间任意的剂量。

在另一个实施方案中，单次向所述对象施用溶瘤病毒的剂量为10⁸至 10¹²vp，例如1×10⁸、1.5×10⁸、2×10⁸、2.5×10⁸、3×10⁸、3.5×10⁸、4×10⁸、 4.5×10⁸、5×10⁸、5.5×10⁸、6×10⁸、6.5×10⁸、7×10⁸、7.5×10⁸、8×10⁸、8.5×10⁸、 9×10⁸、9.5×10⁸、1×10⁹、1.5×10⁹、2×10⁹、2.5×10⁹、3×10⁹、3.5×10⁹、4×10⁹、 4.5×10⁹、5×10⁹、5.5×10⁹、6×10⁹、6.5×10⁹、7×10⁹、7.5×10⁹、8×10⁹、8.5×10⁹、 9×10⁹、9.5×10⁹、1×10¹⁰、1.5×10¹⁰、2×10¹⁰、2.5×10¹⁰、3×10¹⁰、3.5×10¹⁰、 4×10¹⁰、4.5×10¹⁰、5×10¹⁰、5.5×10¹⁰、6×10¹⁰、6.5×10¹⁰、7×10¹⁰、7.5×10¹⁰、 8×10¹⁰、8.5×10¹⁰、9×10¹⁰、9.5×10¹⁰、1×10¹¹、1.5×10¹¹、2×10¹¹、2.5×10¹¹、 3×10¹¹、3.5×10¹¹、4×10¹¹、4.5×10¹¹、5×10¹¹、5.5×10¹¹、6×10¹¹、6.5×10¹¹、 7×10¹¹、7.5×10¹¹、8×10¹¹、8.5×10¹¹、9×10¹¹、9.5×10¹¹或1×10¹²vp；以及上述两点间任意的剂量。每个疗程的施用次数为1-6次，例如1次、2次、 3次、4次、5次或6次，所述施用可以是每1天、2天、3天、4天、5 天、6天、7天或更多天进行；或者是1天内施用1次、2次、3次、4次、 5次、6次或更多次。

本发明中，病毒剂量的单位为vp(viral particle)，表示病毒溶液中所含有的病毒颗粒数，是病毒的颗粒滴度。

本文所使用的术语“对象”意指动物，包括温血哺乳动物，例如人和灵长类动物；鸟类；驯养的家养或农场动物，例如猫、狗、绵羊、山羊、牛、马和猪；实验室动物，例如小鼠、大鼠和豚鼠；鱼；爬行动物；动物园动物和野生动物等。

除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。

除非另有说明，任何关于本方法和产品一种实施方案公开的组分、元素、属性或者步骤可以应用于任何其他在此公开的方法和产品。

本公开的每项专利、专利申请、引用的出版物或者本文件中的描述以参考的方式整体并入文本中。

本发明在下面的实施例中进一步的定义。应了解这些实施例仅仅以举例的方式来说明，并不旨在限制本发明的范围。从上面的讨论以及这些例子中，本领域技术人员可以确定本发明的本质特征，而且在不脱离其本质和范围的情况下，能够对本发明做出各方面的改变和修改来使之适应各种各样的用法和条件。

材料与方法

合成pCA13-anti-PD1

合成5’端带有EcoRI酶切位点和3’段带有XbaI酶切位点的anti-PD1基因表达框片段(共计4条，各anti-PD1基因表达框序列分别如SEQ ID NO：6、8、11和13所示(示出表达框序列未包含酶切位点))(永联生物科技(上海)有限公司)，使用EcoRI、XbaI双酶切，回收酶切后基因片段，酶切体系为：

37℃水浴2小时。

同时使用EcoRI、XbaI双酶切pCA13质粒，回收大片段(酶切体系同上)。然后使用Ligation High连接酶(TOYOBO)将上述酶切后的基因片段和载体片段连接起来，连接体系为：

16℃水浴2小时，连接产物即为pCA13-anti-PD1。

pShuttle-sp-E1A-ΔE1B的构建

a、构建pShuttle-E1A-E1B质粒

用XhoⅠ和MfeⅠ双酶切质粒pShuttle(上海吉然生物科技有限公司) 和腺病毒载体质粒pXC2(中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所刘新垣院士惠赠)，酶切体系如下：

XhoⅠ和MfeⅠ双酶切质粒pShuttle体系：

XhoⅠ和MfeⅠ酶切质粒pXC2体系：

将上述反应体系置于37℃水浴2h，然后经琼脂糖凝胶电泳，分别回收pShuttle质粒酶切后的大片段和pXC2质粒酶切后的小片段。然后使用连接酶将上述回收产物连接，构建成pShuttle-E1A-E1B质粒，其中连接反应体系如下：

将上述反应体系置于16℃水浴锅中反应2小时。连接产物即为质粒pShuttle-E1A-E1B。

b、构建pShuttle-E1A-△E1B质粒

使用Overlap PCR的方法敲除质粒pShuttle-E1A-E1B中的E1B区域，得到pShuttle-E1A-△E1B质粒。设计特异性的扩增引物如下：

XhoI-F1：GCCTCGAGGTCGACTACGTA

△E1B-R1：

TCAGCACCTTCCAGATCTGAGGTCAGATGTAACCAAGATTA

△E1B-F1：

TCTTGGTTACATCTGACCTCAGATCTGGAAGGTGCTGAGGT

MfeI-R1：TCCAATTGTGCCAAAAGAGCCGT

Overlap PCR

PCR反应体系1如下：

PCR反应体系2如下：

PCR的反应程序如下：

最后保存于4℃。

将上述反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳并割胶回收目标条带，分别得到目标条带1和目标条带2，然后通过如下PCR反应过程将目标条带1、 2拼接起来，PCR反应体系：

进行8个cycle的PCR反应后分别加入引物XhoI-F1、MfeI-R1各 1.5μL，然后继续进行PCR反应。PCR的反应程序如下：

最后保存于4℃。

将上述反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳并割胶回收目标条带，分别得到目标条带3。然后使用XhoI、MfeI双酶切上述回收的目标条带3，同时使用同样的限制性内切酶双酶切pShuttle-E1A-E1B质粒，酶切体系如下：

将上述反应体系置于37℃水浴2h，然后经琼脂糖凝胶电泳，分别回收目标条带3酶切后的核酸片段和pShuttle-E1A-E1B质粒酶切后的大片段。然后使用连接酶将上述回收产物连接，构建成pShuttle-E1A-△E1B 质粒，连接反应体系如下：

将上述反应体系置于16℃水浴锅中反应2小时。连接产物即为质粒pShuttle-E1A-△E1B质粒。

c、构建pShuttle-sp-E1A-△E1B质粒

设计特异性的引物，以pDRIVE-Survivin质粒(Invivogen)为模板 PCR扩增Survivin启动子，然后装载到pShuttle-E1A-△E1B质粒中构建 pShuttle-sp-E1A-△E1B质粒。特异性的引物如下：

Survivin-F：GCCTCGAGCGCGTTCTTTGAAAGCAGTCGA

Survivin-R：AGTACGTATGCCGCCGCCGCCACCT

PCR反应体系如下：

PCR的反应程序如下：

最后保存于4℃

将上述反应产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳并割胶回收目标条带，得到目标条带4。然后使用XhoI、SnaBⅠ双酶切上述回收的目标条带4，同时使用同样的限制性内切酶双酶切pShuttle-E1A-△E1B质粒，酶切体系如下：

将上述反应体系置于37℃水浴2h，然后经琼脂糖凝胶电泳，分别回收目标条带4酶切后的核酸片段和pShuttle-E1A-△E1B质粒酶切后的大片段。然后使用连接酶将上述回收产物连接，构建成 pShuttle-sp-E1A-△E1B质粒，连接反应体系如下：

将上述反应体系置于16℃水浴锅中反应2小时。连接产物即为pShuttle-sp-E1A-△E1B质粒。

质粒Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1的构建

在pShuttle-sp-E1A-ΔE1B的基础上进一步改造，将anti-PD1表达框***pShuttle-sp-E1A-ΔE1B的BglII位点。

(一)BglII单酶切pCA13-anti-PD1获得anti-PD1表达框片段

酶切体系为：

将上述反应体系置于37℃水浴2h，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后割胶回收纯化酶切产物。

(二)BglII单酶切质粒pShuttle-sp-E1A-ΔE1B

酶切反应体系：

将上述反应体系置于37℃水浴2h，随后进行1％琼脂糖凝胶电泳并割胶回收纯化，获得经过纯化的线性化质粒pShuttle-sp-E1A-ΔE1B。

(三)构建质粒pShuttle-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1

连接反应体系如下：

将上述反应体系置于16℃过夜。

(四)筛选重组成功的质粒

将上述连接产物通过常规转化步骤转入DH5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，涂Kana抗性平板后培养转化成功菌落，隔天挑取多个单克隆菌落，摇菌后抽提质粒并鉴定是否构建成功，选取构建成功的质粒即为pShuttle-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1。

(五)质粒pShuttle-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1的鉴定

重组质粒pShuttle-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1单酶切鉴定。

酶切鉴定体系如下：

37℃酶切30min后，电泳酶切产物，观察图谱以筛选正确质粒。经单酶切鉴定成功的单克隆送测序，选择正向装载的阳性克隆。

(六)同源重组构建pAd-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1

A).PmeI单酶切鉴定成功的pShuttle-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1，反应体系如下：

将上述反应体系置于37℃水浴锅中2h，随后进行下一步磷酸化实验。

B).将线性化的pShuttle-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1去磷酸化，反应体系如下：

将上述反应体系置于37℃水浴锅中30min后继续下一步转化实验。

C).在BJ5183感受态细胞中重组腺病毒骨架质粒与 pShuttle-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1，从而获得pAd-sp-E1A-ΔE1B- anti-PD1，具体步骤如下：

①取上步实验中的线性化的pShuttle-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1，转化 BJ5183感受态细胞(参见中国专利申请CN201810651914.2)，涂板，挑菌，并摇菌过夜；

②使用质粒少量提取试剂盒对培养的菌液进行质粒提取。

D).酶切鉴定重组成功的pAd-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1质粒，并转化 DH5α中大量扩增。

酶切体系如下：

将上述反应体系置于37℃恒温水浴锅反应30min，然后电泳鉴定。将鉴定正确的pAd-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1质粒转化入DH5α感受态细胞中，涂板后挑出单克隆菌落，摇菌后提取质粒酶切鉴定。酶切反应体系如下：

将上述反应体系置于37℃恒温水浴锅反应30min，然后电泳鉴定。

重组病毒的包装

(1)细胞铺板

在6孔板中培养HEK-293细胞，并使得细胞密度在第二天达到 60％-80％。

(2)使用PacI酶对质粒pAd-sp-E1A-E1B-anti-PD1进行线性化：

将上述反应体系置于37℃恒温水浴锅反应2h。

(3)质粒的转染和病毒的包装

按照Effectene Transfection Reagent转染试剂盒(Invitrogen)的说明书进行，取1μg经上述线性化的质粒pAd-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1转染入铺有HEK-293细胞的6孔板中。约7-10天病毒完全病变后收集病毒液，得到重组腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1，于-80℃中保存备用。

重组病毒鉴定

(1)使用血液基因组提取试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)，根据说明提取病毒基因组DNA

(2)PCR鉴定Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1携带的anti-PD1基因

PCR反应体系如下：

PCR的反应程序如下：

最后保存于4℃

PCR结束后用1％琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。

(3)PCR鉴定Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1中是否存在E1A野生型启动子重组类型的野生病毒

PCR反应体系如下：

PCR的反应程序为：

最后保存于4℃。

PCR结束后用1％琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。

(4)PCR鉴定Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1中是否存在E1B区重组类型的野生病毒

PCR反应体系如下：

PCR反应条件同(3)，PCR结束后用1％琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。

重组病毒的滴度测定

病毒滴度测定的原理是依据免疫细胞化学法统计hexon染色阳性的细胞数来判定具有感染活性的病毒数量，根据腺病毒滴度试剂盒上的说明书对扩增和纯化后的腺病毒测定滴度。

溶瘤腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1抗瘤效果评价

CCK8检测病毒对细胞的毒性

将正常细胞或肿瘤细胞铺于96孔板中，待细胞完全贴壁后向各孔中加入不同MOI的待测重组溶瘤腺病毒，继续培养一定时间后各孔加入 CCK8溶液20μL，4小时后用酶标仪检测每孔的吸光值。代入公式计算细胞生存率并绘制细胞生存曲线。

结晶紫法检测溶瘤病毒的安全性

将细胞铺于24孔板，一天后用适当MOI的待测重组腺病毒感染细胞，37℃继续培养4天后弃培养基，每孔加入500μL结晶紫染色液(2％结晶紫溶于20％甲醇溶液)，染色15min，在净水中将多余的染液洗净，拍照。

实时定量PCR

(一)提取RNA

根据TRIzol Reagent说明书提取RNA，并保存在-80℃中备用。

(二)RNA反转录

(1)测定RNA浓度

(2)反转录体系配置：

反转录反应程序为：

37℃ 15min

98℃ 5min

4℃ forever

(三)q-PCR具体步骤

(1)配制q-PCR反应体系：

(2)将上述反应体系加入96孔板，取Q-PCR专用膜小心盖住加完样品的96孔板，用专用卡片顺着同一个方向压紧膜，注意不要用手直接接触到膜表面。

(3)将96孔板离心1000rpm，1min；

(4)在Bio-Rad荧光定量PCR仪器上进行实时荧光定量PCR 反应，反应程序如下：

(1)95℃ 预变性 5min

(2)95℃ 变性 10s

(3)60℃ 退火与延伸 30s

+plate read(读板)

(4)GO TO(2)，39more times

(5)95℃ 15s

(6)60℃ 1min

(7)melt curve 60.0to 95.0℃ increment 0.5℃

15s+plate read(读板)

END

Western Blot

利用Western blot技术检测E1A蛋白、anti-PD1蛋白在肿瘤细胞中的表达水平，其具体步骤如下：

配胶

开始实验前，按照目标蛋白分子量大小配制合适浓度的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，根据分离检测的目的蛋白分子量来决定聚丙烯酰胺分离凝胶的浓度，其中10％分离胶和4％浓缩胶配方如表1所示。

表1SDS聚丙烯酰胺凝胶配方

	10％分离胶(10ml)	5％浓缩胶(5ml)
			超纯水	4.0mL	3.4mL
30％Acr/Bic(29：1)	3.3mL	0.83mL
			1.5mol/L Tris·HCl(pH8.8)	2.5mL	－
0.5mol/L Tris·HCl(pH6.8)	－	0.63mL
			10％SDS	100μL	50μL
10％AP(过硫酸胺)	100μL	50μL
			TEMED	6μL	5μL

电泳与电转

先用无尘纸吸干两块板之间的酒精，灌入分离胶，无水酒精压平胶的界面，等待分离胶凝固后倒掉无水酒精，在通风处待酒精挥发干净后加入按配方配5％的浓缩胶，立即***1.5mm的western blot专用梳子 (Bio-Rad)。待浓缩胶凝固后转移至电泳槽内，向两板间倒入1×电泳缓冲液至长短玻璃板顶端之间，拔出梳子，依次点样后，80/120V电泳至蛋白Marker到达合适位置时停止电泳。电泳结束后，切除浓缩胶，裁剪PVDF膜，在预冷的转膜缓冲液中将海绵片，滤纸，蛋白胶，以及PVDF 膜进行按照电极的正负按顺序进行放置后进行电转，在一侧放入专用冰盒，将整个电转体系置于冰下，一般条件下90V进行电转70min。

封闭

电转完毕，取下PVDF膜，在正面剪角作标记，在进口BD现用现配的封闭液封闭中30min。

抗体孵育

按抗体说明书建议的稀释比例将相关抗体用1％的BSA溶液进行稀释，然后使用稀释后的抗体孵育封闭后的PVDF膜，室温摇床孵育2小时(或4℃过夜孵育)后用1×TBST缓冲液清洗PVDF膜，每次清洗5min，重复两次。然后按相应二抗说明书建议的稀释比例将相应二抗用1％的 BSA溶液进行稀释，用于室温摇床孵育清洗后的PVDF膜。二抗孵育2 小时后，用1×TBST缓冲液清洗PVDF膜，每次清洗5min，重复三次。。

显影

用显影ECL液滴加在上述处理后的PVDF膜上，在化学发光成像***下曝光显影。

MSD分析被携带PD1抗体基因的病毒处理后的细胞培养上清中PD1抗体活性

将PD-1蛋白包被在板底，将待测样本和PD-L1同时加入，待测样本将与PD-L1竞争性结合PD-1。而PD-L1又偶联了sulfo-tag标记，通过电化学发光检测信号即可推算待测样本中PD1抗体的活性。

体内抑瘤实验

裸鼠移植模型中进行的体内抑瘤实验

接种MDA-MB-231细胞：订购3-4周龄的小鼠(裸鼠)，适应培养一周后，以200万/小鼠的细胞量皮下接种MDA-MB-231细胞，每天观察肿瘤大小，从接种第14天开始瘤内注射待测病毒，隔天注射一次，每次注射剂量为1.5×10¹⁰vp，共计注射5次，以PBS溶液为阴性对照，每隔两天测量肿瘤大小1次。

接种HCC827细胞：订购3-4周龄的小鼠(裸鼠)，适应培养一周后，以200万/小鼠的细胞量皮下接种HCC827细胞。每天观察测量瘤子大小，待小鼠肿瘤长到80-100mm³后，瘤内注射待测病毒，隔天注射1次，每次注射剂量为1.5×10¹⁰vp，共计注射4次(第0天、第2天、第4天、第 6天)，以PBS溶液为阴性对照，以临床一线抗肿瘤药索拉菲尼和吉西他滨作为阳性对照，每隔两天测量肿瘤大小1次。

人源化小鼠模型中进行的体内抑瘤实验

自行构建人源化小鼠模型，所述人源化小鼠构建流程如下：选择免疫重度缺陷的NDG或NCG小鼠，在小鼠满3周龄时开始饲喂抗生素，一周后进行辐照，于当天注射hCD34⁺细胞，继续饲喂抗生素两周。在辐照后第二天抽取小鼠骨髓检测mCD45及mCD117阳性细胞的比例，判断清髓效果。在辐照后第三周开始进行外周血流式检测免疫***人源化进程。选择22周龄且经鉴定免疫***人源化构建成功(人CD45+细胞比例大于 15％)后的人源化小鼠，每只小鼠皮下注射2×10⁶个HCC827肿瘤细胞进行成瘤实验，经测量后发现肿瘤大小在80mm³左右且体质健康良好时，将小鼠随机分成三组，施用不同的试剂，即PBS组(n＝6，瘤内给药，每隔1天1次，共5次)、礼进生物的PD-1抗体SSI-361(见专利申请 CN201680079355.1)PD1抗体的阳性对照组(n＝6，腹腔注射，注射剂量 10mg/kg，每周2次，共6次)和Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3组(n＝6，瘤内给药，每隔1天1次，1.5×10¹⁰vp/次，共5次)，每周观察并测量肿瘤大小2次。

实施例1腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1的构建

首先，在野生型腺病毒的基础上通过删除E1B区，且替换了E1A的内源野生型启动子，增强了腺病毒的安全性和靶向性，构建得到肿瘤细胞双靶向型的溶瘤腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B，该病毒具有肿瘤特异性的 survivin启动子来控制腺病毒早期基因E1A的表达，而且在敲除早期基因E1B区后腺病毒会优选在p53功能缺失的癌细胞中复制。

在此基础上，进一步将人类CMV启动子高效启动的含有PD1单链抗体(anti-PD1)的表达盒***到前述腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B的BglII 位点中，构建得到了携带anti-PD1基因的重组溶瘤腺病毒。

具体如图1所示，其中Ad-sp-E1A-ΔE1B为未添加PD1抗体序列的空载病毒；Ad-sp-E1A-ΔE1B-FL是在XhoI位点***了如SEQ ID NO：1 所示的轻链序列和在BglII位点***了如SEQ ID NO：2所示的重链序列而成的表达全长PD-1抗体的重组溶瘤病毒。

Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-1和Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-2中均包含由SEQID NO：3所示的重链可变区和由SEQ ID NO：4所示的轻链可变区经(Gly₄Ser)₆铰链连接而成的单链抗体。其中 Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-1中单链抗体的轻链可变区在N端(即 VL-VH)，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，其编码序列如SEQ ID NO：6所示；而Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-2中则是重链可变区在N端(即VH-VL)，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7 所示，其编码序列如SEQ ID NO：8所示；

轻链序列：

mdmrvpaqllgllllwfpgsrcdiqmtqspsslsasvgdrvtitcragqnvqnylawyqqkp gkapkvlifnaqslqtgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqynswptfgggtkveikrtva apsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltl skadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(SEQ ID NO:1)

重链序列：

mdmrvpaqllgllllwlpgarcqvtlkesgpalvkptqtltltctfsgfslstsgtcvswirqppg kalewlaticwedskgystslksrltiskdtsknqavltmtnmdpvdtatyycarredsgyfwfpyw gqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssg lyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkd tlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwln gkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewe sngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk (SEQ ID NO:2)

重链可变区：

其中方框中依次为重链可变区中三个互补决定区(CDR)序列。

轻链可变区：

其中方框中依次为轻链可变区中三个互补决定区(CDR)序列。

Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-1中单链抗体(anti-PD1-1)的氨基酸序列：

其中，方框中是信号肽序列，下划线部分是连接肽序列。

Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-1中单链抗体(anti-PD1-1)的编码序列：

ATGGATATGAGAGTACCAGCTCAGCTGCTGGGCCTGCTGCT CCTGTGGTTCCCTGGCAGCCGGTGCGACATCCAGATGACGCAG AGCCCCTCCAGTCTCTCTGCTAGCGTGGGCGACAGGGTCACAA TTACATGCAGAGCTGGACAGAACGTCCAGAATTATTTGGCCTGG TACCAGCAGAAACCTGGAAAGGCTCCAAAGGTGTTGATCTTCAATGCGCAATCTCTCCAAACAGGCGTGCCCTCCCGCTTCTCCGGCT CAGGGTCTGGCACCGACTTTACCCTTACCATCTCTAGCCTTCAG CCTGAGGATTTTGCTACTTACTACTGTCAGCAGTATAATTCCTGG CCTACATTTGGTGGTGGTACGAAAGTCGAGATTAAGGGTGGTGG AGGTTCTGGAGGAGGTGGAAGTGGTGGCGGAGGAAGCGGCGG TGGTGGTTCAGGAGGGGGAGGGTCAGGGGGGGGAGGCTCCCA AGTTACACTCAAGGAAAGCGGTCCGGCCCTTGTAAAGCCCACC CAGACACTGACTCTGACCTGTACATTCAGCGGCTTCAGCCTGTC AACGTCCGGCACATGTGTTAGCTGGATACGCCAGCCCCCGGGG AAAGCACTGGAGTGGCTCGCGACCATCTGCTGGGAAGATAGTA AAGGGTACTCTACAAGCCTTAAATCACGCCTGACCATTTCAAAG GATACTAGTAAGAATCAGGCCGTCCTTACAATGACCAATATGGAT CCCGTCGACACTGCAACATACTATTGTGCCCGCCGGGAAGATAG CGGATACTTCTGGTTCCCCTACTGGGGCCAAGGAACTCTCGTGA CAGTCAGTTCCTAA(SEQ ID NO：6)

Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-2中单链抗体(anti-PD1-2)的氨基酸序列：

其中，方框中是信号肽序列，下划线部分是连接肽序列。

Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-2中单链抗体(anti-PD1-2)的编码序列：

ATGGACATGAGAGTCCCAGCCCAGCTGCTTGGTCTGTTGCT TCTCTGGCTCCCGGGTGCCCGCTGCCAGGTGACGCTGAAGGAG TCAGGCCCTGCCTTGGTTAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTCAC ATGTACCTTCTCCGGGTTCTCATTGTCAACCTCCGGCACTTGTG TCAGTTGGATCAGGCAACCCCCTGGCAAAGCCCTTGAGTGGTTGGCTACGATTTGCTGGGAAGACAGTAAAGGATACTCAACAAGCC TCAAATCTCGGCTGACCATTAGTAAAGATACATCCAAGAACCAG GCAGTCCTTACCATGACCAATATGGACCCAGTCGATACCGCCAC CTACTATTGCGCTCGCCGAGAGGATTCTGGCTACTTCTGGTTCC CATATTGGGGCCAAGGAACACTTGTGACCGTATCAAGTGGTGGA GGGGGTAGCGGTGGAGGTGGAAGTGGTGGCGGAGGAAGTGGC GGAGGTGGGTCCGGAGGCGGCGGCTCCGGAGGAGGTGGTTCA GATATTCAGATGACCCAGTCCCCCAGCTCTCTGAGTGCATCCGT CGGCGATAGAGTGACTATCACATGTCGAGCCGGACAGAACGTG CAAAATTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCGGGTAAGGCTC CCAAAGTGCTTATTTTCAATGCCCAATCTCTGCAGACCGGGGTG CCAAGCCGGTTTAGTGGTTCTGGCTCCGGTACTGACTTCACGCTTACCATTTCCAGTCTGCAACCGGAGGATTTCGCTACATATTACTG CCAGCAGTACAACAGCTGGCCAACCTTCGGGGGCGGGACAAAA GTTGAAATCAAGTAA(SEQ ID NO：8)

Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3和Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-4中均包含由SEQID NO：3所示的重链可变区和由SEQ ID NO：4所示的轻链可变区经(Gly₄Ser)₆铰链连接而成的单链抗体，随后再在C端融合抗体的 Fc区域(SEQ ID NO：9)。其中Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3中单链抗体的轻链可变区在N端(即VL-VH)，单链抗体与Fc区域融合后的序列如SEQ ID NO：10所示，其编码序列如SEQ ID NO：11所示；而 Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-4中则是重链可变区在N端(即VH-VL)，单链抗体与Fc区域融合后的序列如SEQ ID NO：12所示，其编码序列如 SEQ ID NO：13所示；

免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列：

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSN TKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSLGK(SEQ ID NO：9)

Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3中单链抗体+Fc(anti-PD1-3)的氨基酸序列：

其中，方框中是信号肽序列，下划线部分是连接肽序列，阴影部分为免疫球蛋白的Fc区序列。

Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3中单链抗体+Fc(anti-PD1-3)的核苷酸编码序列：

ATGGATATGCGGGTGCCGGCACAGCTGTTGGGGCTGCTGC TCCTCTGGTTTCCTGGCTCACGCTGCGATATCCAGATGACTCAG AGTCCCAGTTCCCTGTCTGCCTCTGTGGGCGATAGAGTCACCAT AACCTGTCGCGCCGGACAAAACGTCCAAAATTACCTGGCGTGGT ACCAGCAGAAACCAGGAAAGGCCCCAAAGGTCCTGATTTTCAATGCTCAAAGCCTCCAGACTGGAGTCCCCAGCCGGTTCTCTGGC TCCGGATCTGGCACCGACTTTACCTTGACCATCAGCAGCCTGCA GCCCGAGGATTTCGCAACCTACTATTGTCAGCAGTATAATAGCTG GCCAACATTCGGGGGCGGCACTAAAGTCGAGATCAAGGGTGGA GGAGGCTCTGGTGGCGGGGGCTCAGGGGGAGGAGGAAGCGGT GGCGGTGGTTCTGGCGGAGGTGGCAGTGGTGGTGGCGGTAGC CAAGTAACCTTGAAGGAGTCCGGTCCCGCACTGGTGAAACCCA CACAAACGCTTACGCTCACTTGTACCTTCAGCGGTTTTAGCCTG TCTACGTCCGGAACCTGCGTTTCTTGGATCCGGCAGCCTCCCGG CAAGGCCCTCGAGTGGCTGGCCACCATCTGCTGGGAAGACTCC AAAGGTTACTCAACCAGTCTTAAAAGTAGGTTGACAATCAGCAA GGATACCAGTAAAAATCAGGCAGTTCTTACCATGACAAACATGGATCCCGTAGATACAGCTACCTACTATTGTGCCAGGCGAGAAGAC TCCGGTTACTTTTGGTTCCCCTACTGGGGTCAGGGGACTCTGGT CACGGTCAGCTCTGCCTCCACCAAGGGCCCTTCTGTGTTCCCCC TGGCACCATGTAGCCGGTCCACCTCCGAGAGCACTGCAGCGTT GGGCTGCTTGGTGAAAGACTATTTTCCCGAGCCTGTAACTGTGA GTTGGAACAGCGGCGCCCTCACGAGCGGGGTGCACACCTTTCC CGCAGTCTTGCAGAGCTCCGGTCTCTATTCCCTTTCTAGTGTTG TTACCGTGCCGAGCAGCTCTCTTGGCACCAAGACTTACACCTGC AATGTTGACCATAAACCGTCTAATACTAAAGTTGACAAGAGGGT CGAGAGCAAATACGGCCCACCATGCCCACCTTGCCCAGCACCT GAGTTCCTGGGCGGCCCCTCAGTGTTCTTGTTTCCCCCAAAGCC TAAAGACACCCTGATGATTAGCCGCACACCCGAGGTGACTTGCG TCGTGGTCGATGTGAGTCAGGAAGACCCTGAAGTGCAGTTCAA CTGGTATGTAGACGGGGTTGAGGTACACAACGCAAAGACTAAAC CACGCGAGGAACAGTTTAATAGTACGTACCGGGTGGTGTCCGTG CTTACAGTCCTGCACCAGGATTGGTTGAATGGAAAGGAATATAA GTGCAAAGTGAGCAATAAAGGCCTGCCTTCTTCTATCGAGAAGACAATATCCAAAGCAAAAGGTCAACCTCGGGAGCCTCAGGTGTAT ACCTTGCCCCCGAGCCAGGAGGAAATGACGAAAAATCAGGTTA GTCTGACGTGTCTTGTGAAGGGCTTTTACCCATCTGATATCGCA GTGGAGTGGGAAAGCAACGGGCAGCCCGAGAATAACTATAAGA CGACCCCGCCCGTCCTGGACTCAGATGGTAGCTTCTTCCTGTAT TCCCGCCTGACAGTTGACAAATCTCGCTGGCAAGAAGGAAATG TTTTTTCCTGCAGTGTCATGCATGAAGCCCTGCACAACCATTAC ACACAGAAAAGCTTGAGCCTGAGTCTGGGGAAGTGA(SEQ ID NO：11)

Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-4中单链抗体+Fc(anti-PD1-4)的氨基酸序列：

其中，方框中是信号肽序列，下划线部分是连接肽序列，阴影部分为免疫球蛋白Fc区序列。

Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-4中单链抗体+Fc(anti-PD1-4)的核酸编码序列：

ATGGACATGCGGGTCCCCGCTCAACTGCTGGGCCTTCTTTT GCTCTGGTTGCCGGGTGCAAGATGCCAGGTAACCCTGAAAGAA TCCGGACCGGCCTTGGTAAAGCCGACGCAGACCCTTACTCTCA CATGTACGTTTAGTGGATTCTCATTGTCTACATCAGGAACATGTG TCAGCTGGATCCGGCAGCCGCCCGGTAAAGCCCTGGAGTGGCTTGCCACAATATGTTGGGAGGATAGCAAAGGATACTCCACAAGTC TTAAGAGTCGCCTGACTATTAGCAAAGACACGTCCAAGAATCAG GCCGTGCTCACCATGACCAATATGGACCCAGTAGATACTGCGAC CTACTATTGCGCTAGACGGGAAGATTCAGGGTACTTCTGGTTCC CTTACTGGGGACAGGGGACTCTGGTTACCGTGTCATCTGGTGG AGGGGGTAGCGGTGGAGGTGGAAGTGGTGGCGGAGGAAGTGG CGGAGGTGGGTCCGGAGGCGGCGGCTCCGGAGGAGGTGGTTC AGATATTCAGATGACACAGAGCCCTTCTTCACTTAGTGCCTCAG TAGGGGACCGCGTCACTATCACATGCCGGGCCGGGCAGAACGT GCAGAACTACTTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCCGGAAAAGCG CCCAAAGTGCTGATCTTCAACGCTCAGTCACTGCAGACTGGAGT GCCTTCCAGGTTTTCTGGTAGCGGCTCTGGGACCGATTTCACACTCACAATCTCTTCTCTGCAGCCAGAGGACTTCGCCACTTACTAC TGCCAACAGTACAATTCCTGGCCTACTTTTGGTGGAGGGACAAA GGTAGAGATTAAAGCAAGTACCAAAGGACCATCTGTCTTCCCTC TGGCACCATGCAGCCGGAGCACCAGCGAGTCTACCGCTGCGCT CGGCTGCCTTGTGAAGGACTACTTCCCAGAACCTGTGACTGTGT CATGGAATAGCGGCGCTCTGACCAGTGGAGTTCACACCTTCCCC GCTGTCCTGCAGAGCAGCGGATTGTACTCTCTCTCCAGCGTGGT GACCGTGCCCAGTTCCTCCCTCGGTACTAAGACGTATACATGCA ATGTGGACCACAAGCCCTCCAATACCAAGGTCGACAAGCGGGT AGAATCAAAATATGGGCCGCCTTGTCCCCCCTGCCCTGCTCCTG AGTTTCTCGGAGGGCCCAGCGTCTTCCTCTTTCCACCTAAGCCA AAAGATACACTGATGATCTCCCGGACCCCGGAGGTGACATGTGT GGTGGTGGATGTGTCCCAGGAGGATCCTGAGGTGCAGTTTAAC TGGTACGTCGACGGAGTCGAAGTACACAACGCCAAGACGAAGC CCCGAGAGGAACAGTTTAATAGTACCTATAGAGTCGTCAGTGTG TTGACCGTTCTTCATCAGGATTGGCTGAATGGGAAAGAATATAA ATGCAAGGTTTCCAATAAAGGACTCCCATCCTCAATCGAGAAAACCATTAGCAAAGCCAAAGGACAGCCAAGAGAGCCCCAAGTCTA CACGCTGCCCCCTTCACAGGAAGAGATGACCAAAAACCAGGTT TCCCTTACCTGCTTGGTGAAGGGCTTTTACCCTTCAGATATCGC GGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCCGAGAATAATTACAAA ACAACGCCGCCAGTGCTTGATTCAGACGGCTCATTTTTCCTGTA CTCTCGACTGACTGTGGACAAAAGCAGGTGGCAGGAGGGGAAT GTTTTCTCTTGTTCTGTGATGCATGAGGCTCTCCACAACCACTA CACACAAAAGTCACTGTCCTTGAGCCTCGGCAAGTAA(SEQ ID NO：13)

由于抗体需要分泌到细胞外才能发挥作用，因此以上所有单链抗体的 N端均携带了分泌信号肽(SEQ ID NO：14或16)，其中SEQ ID NO： 14所示的信号肽连接于V_H前，而其中SEQ ID NO：16所示的信号肽连接于V_L前。所有的单链抗体基因均采用直接基因合成的方式构建，然后直接装载到穿梭质粒上。

信号肽序列：

MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO:14)；或者

MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC(SEQ ID NO：16)

连接肽序列：

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：15) 实施例2重组溶瘤腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3对癌细胞具有最强的体外杀伤作用

为了比较携带各单链抗体、全长抗体的重组溶瘤腺病毒对肿瘤的杀伤效果，选取了人乳腺癌细胞系MDA-MB-231作为测试细胞，使用上述各重组病毒与相应空载病毒在相同MOI(20MOI)的情况下杀伤该测试细胞。结果显示，重组溶瘤腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3具有最佳的杀伤能力(如图2A所示)，其对肿瘤细胞的杀伤率达到了90％以上。

由于PD1在免疫调节中的具有重要作用，在测试体系中还进一步添加了外周血单核细胞(PBMC)。结果表明，各重组溶瘤腺病毒在外周血单核细胞(PBMC)存在时(即处于免疫环境下)显示了更强的杀伤作用，重组溶瘤腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3依旧表现出最佳的杀伤能力，不可思议的是，几乎达到了对肿瘤细胞的完全抑制(图2A)。

进一步通过Q-PCR以及Western Bolt检测Ad-sp-E1A-ΔE1B- anti-PD1-3作用后E1A和anti-PD1的表达，结果表明，腺病毒 Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3不管在转录水平上(图2B)还是蛋白水平上(图2C和D)都高水平表达了E1A和外源PD-1单链抗体(anti-PD1-3)，说明将***到腺病毒中的anti-PD1-3基因表达框能够正常转录翻译。并且随着腺病毒的不断复制增殖，PD-1单链抗体的表达量也迅速提高(图 2E和F)，这也更加有利于PD-1单链抗体的生理作用，而利用其它方法例如体外转染等则并不能实现上述表达量随着时间推移而增加的效果。

后将重组溶瘤腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3进行保藏，其保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2018年08月21日，保藏名称：重组人5型腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3，保藏编号为 CCTCC NO：V201853。

实施例3重组溶瘤腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3的体外杀伤作用显著优于未***PD1抗体的溶瘤腺病毒载体

进一步测试了重组溶瘤腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3与空载病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B杀伤肿瘤细胞的能力。具体采用CCK8法检测在不同感染复数(MOI)情况下两种病毒杀伤乳腺癌细胞系MDA-MB-231 以及肺癌细胞系HCC827的效果。结果图3所示，其中Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3对MDA-MB-231和HCC827细胞杀伤作用的IC50分别为8.63MOI与6.56MOI，低于空载病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B 的14.03MOI与10.20MOI，这表明Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3对 MDA-MB-231以及HCC827体外杀伤效果更好，这也说明了***PD1抗体表达序列能够显著增加溶瘤病毒对癌细胞的杀伤作用。

实施例4重组溶瘤腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3具有不低于空载病毒的安全性

为了测试重组溶瘤腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3对正常细胞的安全性，选用MTT法检测了Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3与相应空载腺病毒对人正常肝成纤维细胞HLF的杀伤。结果如图4A所示， Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3与相应空载病毒均表现出良好的安全性，在高达100MOI处理时几乎不杀伤正常细胞。另外更出人意料的是， Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3对正常细胞的安全性甚至还更优于相应空载病毒。

为了进一步确认重组溶瘤腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3对正常细胞良好的安全性，又使用结晶紫法检测了 Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3与相应空载病毒对人正常肝成纤维细胞 HLF的杀伤。结果如图4B所示，显示Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3与相应空载病毒均表现出对正常细胞很好的安全性。

从实施例2-4结果可以看出，重组溶瘤腺病毒 Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3具有优异的体外药效及安全性。

实施例5重组溶瘤腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3体外感染细胞后可分泌活性PD1抗体

由于PD1抗体在体内发挥作用时，需要在胞外阻断PD1与细胞表面存在的PD1受体的结合，因此重组溶瘤病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3 在体内发挥最大功效的前提就是所表达出的PD1抗体能够分泌到胞外，因此在构建重组溶瘤腺病毒时(包括Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3)，还在单链抗体的N端添加了分泌信号肽，以保证表达出的PD1单链抗体在体内施用时可以分泌到胞外发挥生物学效应。

为了检测上述目的是否实现，利用MSD技术来检测感染重组溶瘤腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3的细胞上清中是否存在具有生物活性的PD1单链抗体。该技术的检测原理主要是利用PD1单链抗体与PD-L1 竞争性结合PD-1。将PD-1包被在板底，待测上清和PD-L1同时加入，竞争性与PD-1其结合，而PD-L1上进行了sulfo-tag荧光标记，通过检测其荧光信号的强弱，进而推测待测上清中PD1抗体的生物活性。

结果图5所示，感染重组溶瘤腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3 的HCC827和乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞上清中均存在具有生物活性的PD1抗体，并且其生物学活性强于感染重组溶瘤腺病毒 Ad-sp-E1A-ΔE1B-FL(携带PD1全长抗体)的细胞上清。

实施例6重组溶瘤腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3显著抑制裸鼠移植瘤的生长

本实施例首先测试了Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3对MDA-MB-231 (人乳腺癌细胞)的裸鼠移植瘤模型的肿瘤抑制情况。实验方案见图6A 以及“材料与方法”部分。结果如图6B所示，重组溶瘤腺病毒 Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3可显著抑制MDA-MB-231裸鼠移植瘤的生长，抑瘤率((阴性对照组肿瘤平均体积-实验组肿瘤平均体积)/阴性对照组肿瘤平均体积*100％)高达98.3％。同时在实验过程中，裸鼠体重在阴性对照组和实验组具有相同的变化趋势，组间并未出现显著差异，这也进一步说明腺病毒对肿瘤尺寸的改变是特异性针对肿瘤的。

接下来，又测试了Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3对HCC827(人非小细胞肺癌细胞)裸鼠移植瘤模型的肿瘤抑制情况，实验方案见“材料与方法”部分，结果图7所示。重组溶瘤腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3 也可显著抑制HCC827裸鼠移植瘤的生长，抑瘤率高达84.2％，显著优于现有临床用药索拉菲尼和吉西他滨。此外，各组小鼠的体重变化趋势在实验过程中保持相同趋势，且组间不具有显著差异(数据未显示)。

实施例7重组溶瘤腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3显著抑制人源化小鼠移植瘤的生长

本实施例测试了在重建了人免疫***的人源化小鼠中， Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3对HCC827人源化小鼠移植瘤模型中肿瘤生长的影响，结果如图8所示，重组溶瘤腺病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3 可显著抑制HCC827移植瘤的生长，抑瘤率高达60.5％，显著高于PD1 抗体的抑瘤效果。此外，各组小鼠的体重变化趋势在实验过程中保持相同趋势，且组间不具有显著差异(数据未显示)。

实施例6和7的结果表明，重组溶瘤病毒 Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3在体内也具有非常优异的肿瘤抑制效果，特别是在模拟了人免疫***环境的人源化小鼠中，具有极高的抑瘤率，这也提示了本发明的重组溶瘤病毒在人体中很可能会具有相似的优秀效果。由此可见，重组溶瘤病毒Ad-sp-E1A-ΔE1B-anti-PD1-3具有非常好的临床应用前景。

Claims

1.一种溶瘤病毒，其包含编码能够抑制PD-1活性的PD-1结合蛋白的核酸序列。

2.根据权利要求1所述的溶瘤病毒，其中所述病毒是腺病毒。

3.根据权利要求1或2所述的溶瘤病毒，其中所述病毒包含以survivin启动子驱动的E1A基因，优选病毒基因组中E1A的内源启动子被survivin启动子所替换；和/或

E1B基因的活性降低或者完全失活，例如从病毒基因组中敲除E1B基因。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的溶瘤病毒，其中所述PD-1结合蛋白为包含PD-1单链抗体和免疫球蛋白Fc区段的融合多肽。

5.根据权利要求4所述的溶瘤病毒，其中所述融合多肽具有以下结构：

S-V_L-L-V_H-Fc；

MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO：14)；或者

MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC(SEQ ID NO：16)；

V_L为PD-1单链抗体的轻链可变区，优选地，其包含序列为RAGQNVQNYLA(SEQ ID NO：17)的CDR1、序列为NAQSLQT(SEQ ID NO：18)的CDR2以及序列为QQYNSWPT(SEQ ID NO：19)的CDR3，更优选的，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

L为连接序列，例如包含或主要由Ala(A)、Thr(T)、Gly(G)和/或Ser(S)构成的柔性连接序列，具体地比如一段包含或主要由Gly和Ser构成的柔性连接序列；例如，所述连接序列的长度可以为1-50个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50；优选地，L为(Gly₄Ser)_m，其中m为1至10之间的自然数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选的，L为(Gly₄Ser)₆；或者

L为A(EAAAK)_nA，其中n为1至9之间的自然数，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9；

V_H为PD-1单链抗体的重链可变区，优选的，其包含序列为GFSLSTSGT(SEQ ID NO：20)的CDR1、序列为CWEDS(SEQ ID NO：21)的CDR2以及序列为EDSGYFWFPY(SEQ ID NO：22)的CDR3，更优选的，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；

Fc是免疫球蛋白的Fc区；所述Fc可以来自人免疫球蛋白；所述Fc区可以是来自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的Fc区；优选地，所述Fc区是来自IgG的Fc区，例如来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区；再优选地，所述Fc区是来自IgG4的Fc区；其中与其来源序列相比，所述Fc区可以带有一个或更多个替换、添加和/或缺失；优选的Fc序列如SEQ ID NO：9所示。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的溶瘤病毒，其中所述核酸序列与启动子可操作连接，优选的，所述启动子为CMV启动子。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒于2018年08月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V201853。

8.权利要求1至7中任一项所述的溶瘤病毒在制备治疗增生性疾病的药物中的用途，优选的，所述增生性疾病是肿瘤，例如***癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、黑色素瘤、头颈部肿瘤、淋巴癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、头颈部鳞癌、膀胱癌或者肾癌。

9.一种药物组合物，其包含药物有效量的权利要求1至7中任一项所述的溶瘤病毒，任选的还包含药学上可接受的载体。

10.根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制为通过口服、雾化吸入、静脉、肌内、皮下、灌注、病灶内注射或者瘤内途径施用。

11.根据权利要求8或9所述的药物组合物，其包含约10⁸至10¹²vp(例如1.5×10¹⁰vp)的所述溶瘤病毒。

12.一种治疗增生性疾病的方法，其包括将权利要求1至7中任一项所述的溶瘤病毒或权利要求9至11中任一项所述的药物组合物施予有需要的对象，优选的，所述增生性疾病是肿瘤，例如***癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、黑色素瘤、头颈部肿瘤、淋巴癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、头颈部鳞癌、膀胱癌或者肾癌。

13.根据权利要求12所述的方法，其中通过口服、雾化吸入、静脉、肌内、皮下、灌注、病灶内注射或者瘤内途径向所述对象施用约10⁸至10¹²vp(例如1.5×10¹⁰vp)的所述溶瘤病毒，施用次数1-6次(例如1次、2次、3次、4次、5次或6次)，所述施用可以是每1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或更多天进行；或者是1天内施用1次、2次、3次、4次、5次、6次或更多次。