CN105105119B - 一种基于接种菌种进行发酵制备水果酵素的方法 - Google Patents

Abstract

本案涉及一种基于接种菌种进行发酵制备水果酵素的方法，包括：选料、剥皮切片、调整糖度、灭菌、添加改性发酵液、发酵和过滤；其中，改性发酵液是在天然发酵液中接种有改性菌种，所述改性菌种选自米曲霉、酵母菌、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌中的至少一种。本案在原有的工艺条件下添加有益菌种，使微生物酵素朝着设计的方向发展，不再局限于酵素原料的选择，能最大限度的提高微生物酵素的抗氧化活性和酶活力；添加改性菌种后，酵素的各项指标的变化规律以及所产生的影响，都能在实验过程中呈现，为研究开发功能性微生物酵素产品，实现工业化生产提供了一定的数据支持和理论基础。

Description

一种基于接种菌种进行发酵制备水果酵素的方法

技术领域

本发明涉及酵素的制备方法，具体涉及一种基于接种菌种进行发酵制备水果酵素的方法。

背景技术

酵素是近几年来人们热衷的健康食品，不管是电视广告，还是网络营销，随处都可见它的身影。其实，它就是人们都非常熟悉的“酶”，人体内几乎所有的器官组织以及细胞都需要依靠酵素的催化反应和能量的供给来维持它们的动力和健康。酵素能促进人体的新陈代谢，使我们身心愉悦，精力充沛；能促进血液的循环，排除体内毒素，净化我们的血液***；能加强我们胃肠道的消化吸收，增强体质；能调节我们体内的酸碱平衡，有利于肝脏的排毒；还能促进受损细胞的修复，活化细胞。

20世纪初酵素开始在日本盛行，紧接着陆续被台湾、新加坡、马来西亚、韩国和美国等地引进，并在所到之处掀起一波又一波的酵素热，反响异常热烈。随着时代向前，人类对健康的重视，酵素相关产业得到迅速发展，酵素食品也越来越受到人们的关注。食物在其发酵的过程中不断的消耗碳水化合物，促使脂肪含量降低，因此，人类投入漫长的时间成本和较高的经济成本把食材进行发酵之后再食用绝不仅仅是为了改变口味，更有营养学方面的考虑。

微生物酵素即指以一种或者多种水果、蔬菜等为原料，经过发酵而产生的富含维生素和矿物质的功能性发酵食品。在酵素的整个发酵过程中，微生物通过自己的新陈代谢，使原料产生多种变化，在不影响原有营养物质的情况下，生成新的生物活性物质和酶类。这些新的生物活性物质包括酚类物质、有机酸和糖类等多种功能性营养成分，为人类的健康做出了一定的贡献。酚类物质主要包括花青素，类黄酮，鞣质，木质素，儿茶素类，苯乙烯，香豆素，黄酮醇，丹宁酸，酚酸等；有机酸主要包括苹果酸，琥珀酸，丙酮酸，没食子酸等。

近些年以来，微生物酵素风靡全球，微生物酵素功能性产品也层出不穷。它的抗氧化、抑菌消炎、促进新陈代谢、提高免疫力、美白抗衰老等功能受到人们的热力追捧。微生物酵素的生产工艺不断更新，然而，大部分的研究都是基于传统的发酵工艺来完成的。这种利用传统发酵工艺自然发酵的微生物酵素，容易受到环境中的微生物、发酵过程以及季节等条件的影响，很难人为的控制产品质量，于是也就影响了对它的开发和利用。目前国内外大部分的研究都以天然发酵为基础，研究发酵过程中产生的代谢产物，发酵机理等，还没有相关研究显示，在发酵初期加入特定的有益菌种，会对其发酵产生怎样的影响，以及这种方案是否可行。

发明内容

针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于探索开发新的功能性微生物酵素产品的工艺，为实现工业化生产提供数据支持和理论依据，采用人工接种菌种，对其抗氧化活性和酶等进行深入的跟踪监测，使产品的发酵受到控制，朝着预期的方向发展。

本案以苹果酵素、梨酵素或柑橘酵素等水果酵素为研究对象，发酵初期接种一定量的米曲霉、酵母菌、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌，以天然发酵(不接种任何菌株)为对比，追踪监测其抗氧化活性及其变化规律、酶活力及变化规律。微生物酵素的菌种控制、功能性成分分析和控制产品质量等多方面以及酵素的综合性开发利用得到体现。

本案研究的关键是，选取4种有益发酵的菌种，在原有的酵素制作基础上，人工接种一定比例的菌株，研究其发酵过程的变化情况。这4种菌株包括米曲霉、酵母菌、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌。在整个发酵过程中，这4种菌种起着不同的作用，但是它们相互之间并不是独立的个体，而是相辅相成的，所以，菌种比例的把握也就至关重要，也决定了酵素的品质。

本发明的技术方案概述具体如下：

一种基于接种菌种进行发酵制备水果酵素的方法，包括：选料、剥皮切片、调整糖度、灭菌、添加改性发酵液、发酵和过滤；其中，所述改性发酵液是在天然发酵液中接种有改性菌种，所述改性菌种选自米曲霉、酵母菌、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌中的至少一种。

优选的是，所述的基于接种菌种进行发酵制备水果酵素的方法，其中，所述改性菌种选自米曲霉、酵母菌、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌中的至少两种。

优选的是，所述的基于接种菌种进行发酵制备水果酵素的方法，其中，所述改性菌种选自米曲霉、酵母菌、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌中的至少三种。

优选的是，所述的基于接种菌种进行发酵制备水果酵素的方法，其中，所述改性菌种为米曲霉、酵母菌、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌四者的组合。

优选的是，所述的基于接种菌种进行发酵制备水果酵素的方法，其中，所述改性菌种的接种量为2～12％。(注：根据本领域人员默认的表述习惯，此处的％代表体积百分比，本文中在表述接种量时所用的％若无特别说明，均为体积百分比)

优选的是，所述的基于接种菌种进行发酵制备水果酵素的方法，其中，所述改性菌种中每种菌种的接种量为0.5～3％。

优选的是，所述的基于接种菌种进行发酵制备水果酵素的方法，其中，所述改性菌种中，米曲霉的接种量为1.5％，酵母菌的接种量为1.0％，嗜热链球菌的接种量为1.0％，保加利亚乳杆菌的接种量为1.0％。

优选的是，所述的基于接种菌种进行发酵制备水果酵素的方法，其中，具体包括：

步骤1)将天然发酵1个月后的水果酵素过滤，得到天然发酵液，将所述天然发酵液在115℃灭菌10min，冷却至室温，在超净工作台下，分别依次单独接种经过活化的所述改性菌种中的米曲霉、酵母菌、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌，在常温下发酵1个月，过滤即得改性发酵液；

步骤2)选取新鲜的水果，用无菌水在无菌条件下将新鲜的水果清洗干净，在无菌操作台中自然晾干，去皮，切片备用；

步骤3)将水果与白砂糖按质量比1:1，加入到已灭菌的玻璃瓶中；

步骤4)将所述改性发酵液加入到玻璃瓶中，封口，存于暗处，在常温下发酵30～90天，过滤即得水果酵素。

本发明的有益效果是：

1)从天然发酵到人工接种的转变

近些年来，微生物酵素食品风靡全球，国内外大部分的研究多倾向于自然发酵，也就是不额外的添加任何菌种。这样传统的工艺方法往往没有办法控制酵素的质量和发酵时间，本案在原有的工艺条件下添加改性菌种，使微生物酵素朝着设计的方向发展，不再局限于酵素原料的选择，能最大限度的提高微生物酵素的抗氧化活性和酶活力。

2)可跟踪监测酵素发酵过程

关于微生物酵素发酵过程的跟踪监测，从发酵开始就对酵素进行了总酚含量、还原力以及羟基自由基、超氧阴离子自由基、ABTS自由基、DPPH自由基清除率、超氧化物歧化酶、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶、总酸、总糖、酒精度及pH的***检测。添加改性菌种米曲霉、酵母菌、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌之后，酵素的各项指标的变化规律以及所产生的影响，都能在实验过程中呈现，为研究开发功能性微生物酵素产品，实现工业化生产提供了一定的数据支持和理论基础；同时，进一步解决了微生物酵素的菌种控制、功能性成分和产品质量控制等多方面的问题。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

米曲霉、酵母菌、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌是成熟的市售产品，它们的培养方法也属于现有技术，本领域技术人员可以很容易获得，因此本案无需再提供它们的保藏信息。

实施例1：

菌种活化：

(1)米曲霉培养基

综合马铃薯培养基(PDA)：20％马铃薯1L，葡萄糖20g，KH₂PO₄3g，MgSO₄·7H₂O1.5g，Vitanib B1 Trace 8mg，琼脂20g，pH自然，115℃高压灭菌25min。

(2)酵母菌培养基

10°Bé麦芽汁琼脂培养基：将发酵啤酒的原料(未加酒花)，稀释至10柏林，加琼脂15g/L，溶化后分装，121℃高压灭菌15min。

(3)嗜热链球菌培养基

酵母膏1％，葡萄糖1.5％，牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，CaCO₃1.0％，吐温801mL，琼脂2％，pH6.5～7.0，115℃高压灭菌25min。

(4)保加利亚乳杆菌培养基

酵母膏1％，葡萄糖1.5％，牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，CaCO₃1.0％，吐温801mL，琼脂2％，pH6.5～7.0，115℃高压灭菌25min。

按上述培养基的配方配制固体培养基。将存活的米曲霉、酵母菌、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌分别接种于相对应的固体培养基上，在适宜的条件下培养(米曲霉、酵母菌：25～28℃；嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌：43℃)，活化2～3代，使菌株活力达到最强。

实施例2：

改性发酵液的制作：

天然发酵液(即不额外添加任何菌种)→接种纯菌种→发酵培养→按不同的体积比混合→改性发酵液。

实施例3：

酵素制作的工艺流程：

选取原料(水果)→剥皮→切片→调整糖度→杀灭空气中的微生物和杂菌→菌种活化→添加改性发酵液→发酵→得到含有果肉的酵素液→过滤。

实施例4：

酵素制作过程：

用无菌水在无菌条件下将新鲜的苹果清洗干净，在无菌操作台中自然晾干，去皮，切片备用；将苹果与白砂糖按质量比1:1，加入到已灭菌的玻璃瓶中；将改性发酵液加入到玻璃瓶中，封口，放在暗处，常温下发酵30～90天。为了避免杂菌的污染，制作酵素的过程中所有操作都在无菌条件下进行。

实施例5：

添加单一菌种发酵试验：

将天然发酵1个月后的苹果酵素过滤，得到天然发酵液。将此天然发酵液均匀分成5份，选取其中一份为空白对照，将剩下的4份在115℃灭菌10min，冷却至室温，在超净工作台下，分别单独接种米曲霉、酵母菌、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌。将不同处理方法的5份发酵液密封，常温下发酵1个月。

实施例6：

感官评价：

选取7个人为鉴定小组代表，在同样的环境和条件下，对制得的酵素的感官评价进行打分，包括酵素的色泽、气味以及口感；分数的高低分为四个等级，很好的在80～100分(包括80)，比较好的在70～80分(包括70)、可以接受的在60～70分(包括60)，完全不能接受的低于60分。总分数满分为100分，由三类分数综合相加之后得出，具体的比例为：色泽占30％，气味占25％，味感占45％。

实施例7：

不同比例米曲霉接种量对酵素感官评定的影响：

嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌接种量优选为2％～3％，菌种比例为1:1或者2:1时发酵所得的质量和口感是最佳的，常用比例为1:1。实验选定酵母菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌的接种量3.0％，在不改变其它工艺条件的情况下，改变米曲霉的接种量分别为0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％。发酵30天后取样得到含有果肉和全部酵素的发酵液，过滤得到酵素上清液。取酵素上清液为实验样品，进行感官评价。

实施例8：

不同比例酵母菌接种量对酵素感官评定的影响:

米曲霉的接种量为2.0％，嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌的接种量为3.0％，在不改变其它工艺条件的情况下，改变酵母菌的接种量分别为0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％。发酵30天后取样得到含有果肉和全部酵素的发酵液，过滤得到酵素上清液。取酵素上清液为实验样品，进行感官评价。

实施例9：

不同比例嗜热链球菌接种量对酵素感官评定的影响:

米曲霉的接种量为2.0％，酵母菌的接种量为1.0％，保加利亚乳杆菌的接种量为3.0％，在不改变其它工艺条件的情况下，改变嗜热链球菌的接种量分别为0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％。发酵30天后取样得到含有果肉和全部酵素的发酵液，过滤得到酵素上清液。取酵素上清液为实验样品，进行感官评价。

实施例10：

不同比例保加利亚乳杆菌接种量对酵素感官评定的影响:

米曲霉的接种量为2.0％，酵母菌的接种量为1.0％，嗜热链球菌的接种量为1.5％，在不改变其它工艺条件的情况下，改变保加利亚乳杆菌的接种量分别为0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％。发酵30天后取样得到含有果肉和全部酵素的发酵液，过滤得到酵素上清液。取酵素上清液为实验样品，进行感官评价。

实施例11：

菌种配比的正交设计

根据单因素试验，选取米曲霉接种量(A)、酵母菌接种量(B)、嗜热链球菌接种量(C)及保加利亚乳杆菌接种量(D)4个因素，每个因素各取3水平，进行正交试验，因素水平见表1。

表1因素水平表

Tab.1 Orthogonal factor level table

正交试验结果及分析见表2。

表2正交试验结果及分析

Tab.2 Result and analysis of orthogonal results

由表2可知，影响酵素感官评价的主要因素是米曲霉的接种量，其次是嗜热链球菌，再次是保加利亚乳杆菌，最后是酵母菌。且当米曲霉接种量1.5％，酵母菌接种量1.0％，嗜热链球菌接种量1.0％，保加利亚乳杆菌接种量1.0％时，混合发酵产生的微生物酵素感官评价分数最高。按正交试验的分析结果进行验证试验，米曲霉的接种量为1.5％，酵母菌的接种量为1.0％，嗜热链球菌的接种量为1.0％，保加利亚乳杆菌的接种量在1.0％，其它工艺条件不变，得到的酵素液感官评价分数为92.3，优于上述试验中的任何一组。

实施例12：

酵素抗氧化活性

实验组酵素的总酚含量、还原力以及超氧自由基、DPPH自由基、ABTS自由基和羟基自由基清除能力均随着浓度的增加而增加，实验组苹果酵素对超氧阴离子自由基、DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力，优于对照组(空白实验)；对照组酵素对羟基自由基有特别好的清除能力；从总体上看，实验组自由基清除能力高于对照组自由基清除能力。

实施例13：

酵素抗氧化活性变化规律

随着发酵时间的延长，实验组和对照组发酵液中各抗氧化活性成分变化趋势不同，且变化复杂多变，根据是否添加菌种和发酵原料的本身有关。总的来说，酵素的总酚含量、还原力和自由基清除能力大体上都呈现上升趋势。

(1)苹果酵素添加菌种与未添加菌种相比

在发酵第60天，总酚含量提高了15％，还原力强弱提高了1.8％，超氧阴离子自由基清除能力提高了36.55％，羟基自由基清除能力降低了4.27％，DPPH自由基清除率提高了59％，ABTS自由基清除能力提高了3.10％。

(2)梨酵素添加菌种与未添加菌种相比

在发酵第60天，总酚含量提高了10.17％，还原力强弱提高了4.90％，超氧阴离子自由基清除能力提高了5.44％，羟基自由基清除能力提高了2.67％，DPPH·自由基清除率提高了39.78％，ABTS自由基清除能力提高了6.84％。

(3)柑橘酵素添加菌种与未添加菌种相比

在发酵第60天，总酚含量提高了30.85％，还原力强弱提高了17.57％，超氧阴离子自由基清除能力提高了7.46％，羟基自由基清除能力提高了6.26％，DPPH自由基清除率提高了38.08％，ABTS自由基清除能力提高了4.76％。

实施例14：

酵素酶活力变化规律

随着发酵时间的延长，酶活力变化并不是呈现单一的递增规律，而是有增有减。这也表明，酵素并不像人们常说的那样，时间越长越好，而应该选择在适宜的时间饮用。

(1)SOD酶活性

对照组在试验第30天时达到最大，最大为296U/mL；实验组在试验第75天时达到最大，最大为268U/mL。

(2)淀粉酶活性

对照组在试验第45天时达到最大，最大为46U/mL；实验组在试验第60天时达到最大，最大为76U/mL。

(3)脂肪酶活性

对照组在试验第30天时达到最大，最大为9.6U/mL；实验组在试验第75天时达到最大，最大为6.8U/mL。

(4)蛋白酶活性

对照组在试验第15天时达到最大，最大为655U/mL；实验组在试验第45天时达到最大，最大为890U/mL。

(5)纤维素酶活性

对照组在试验第45天时达到最大，最大为47.9U/mL；实验组在试验第30天时达到最大，最大为63.7U/mL。

人工接种菌种和天然发酵之间，微生物酵素酶的活性差异很大。添加菌种与未添加菌种相比，在发酵第90天，SOD酶活性降低了22.39％，淀粉酶活性提高了50％，脂肪酶活性降低了69.49％，蛋白酶活性提高了85.71％，纤维素酶活性提高了54.19％。

实施例15：

酵素总酸、总糖、酒精度、pH的变化规律

在发酵时间为30内，酵素溶液的总酸含量是呈现上升趋势的，但是30天后，总酸含量减少，最后趋于平稳。发酵刚开始的15内，总酸含量快速累积，总糖含量明显降低，大量产生酒精，pH值急剧下降。15天后进入慢速发酵阶段。添加菌种与未添加菌种相比，在发酵第90天，总酸含量高出了24.14％，总糖含量降低了12.5％，酒精度含量高出了16.67％，pH降低了5％。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出的实施例。

Claims (1)

1.一种基于接种菌种进行发酵制备水果酵素的方法，包括：选料、剥皮切片、调整糖度、灭菌、添加改性发酵液、发酵和过滤；其中，所述改性发酵液是在天然发酵液中接种有改性菌种；

所述改性菌种为米曲霉、酵母菌、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌四者的组合；

所述改性菌种中，米曲霉的接种量为1.5％，酵母菌的接种量为1.0％，嗜热链球菌的接种量为1.0％，保加利亚乳杆菌的接种量为1.0％；

具体包括：

步骤1)将天然发酵1个月后的水果酵素过滤，得到天然发酵液，将所述天然发酵液在115℃灭菌10min，冷却至室温，在超净工作台下，分别依次单独接种经过活化的所述改性菌种中的米曲霉、酵母菌、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌，在常温下发酵1个月，过滤即得改性发酵液；

步骤2)选取新鲜的水果，用无菌水在无菌条件下将新鲜的水果清洗干净，在无菌操作台中自然晾干，去皮，切片备用；

步骤3)将水果与白砂糖按质量比1:1，加入到已灭菌的玻璃瓶中；

步骤4)将所述改性发酵液加入到玻璃瓶中，封口，存于暗处，在常温下发酵30～90天，过滤即得水果酵素。