CN105087598A

CN105087598A - 水稻淹水胁迫响应rs1基因及其应用

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Publication number: CN105087598A
Application number: CN201510466214.2A
Authority: CN
Inventors: 杜何为
Original assignee: Yangtze University
Current assignee: Yangtze University
Priority date: 2015-08-03
Filing date: 2015-08-03
Publication date: 2015-11-25

Abstract

一种水稻淹水胁迫响应RS1基因，在于所述RS1基因的DNA序列为序列表中的SEQ？ID？NO:1所示；所述水稻淹水胁迫响应RS1基因的编码蛋白的氨基酸序列表如序列表中的SEQ？ID？NO:2所示。其优点是：1、选用ubi启动子驱动RS1基因，过表达的转基因株系显著提高了水稻的耐淹水性，耐淹水效果明显，在淹水环境中，RS1基因可以明显提高水稻的耐淹水性，保证水稻的高产、稳产；2、RS1基因来源于水稻，因此转RS1基因的水稻减少了人们对食品安全性的担忧；3、揭示水稻耐淹水性形成的分子机制，为水稻和其它植物的耐淹水性遗传改良提供了新的基因资源。

Description

水稻淹水胁迫响应RS1基因及其应用

技术领域

本发明涉及水稻淹水胁迫响应RS1基因，属植物基因工程技术领域，具体地说是一种水稻淹水胁迫响应RS1基因及其应用。

背景技术

胁迫反应为植物体在抵抗不良的外界环境的胁迫时，植物体细胞感受外界环境的变化并将信号传递到细胞内，从而诱导细胞表达各种应答基因共同来抵御不良环境对植物体伤害的一个过程。

水稻是世界上重要的粮食作物之一，全世界约有50％的人口以其为主食。目前，环境的不断恶化，引起了全球水资源的严重匮乏与分布不平衡，导致了局部地区洪涝灾害的频繁发生。洪涝灾害已成为限制水稻生产的主要因子之一，据统计，东南亚地区洪涝灾害每年给水稻造成的损失约1亿美金。

水稻是一种半水生作物，对水分的需求量很大，但正常生长的水层深度也有一定范围，长期没顶淹水下不能生存。具体表现为，水稻在淹水条件下，其有氧呼吸受到抑制，水稻由有氧呼吸转成以生成乙醇的无氧酵解途径，进而引发乙醇、ROS、NO等有害物质的生成。同时，淹水条件下，水稻的光合作用也受到严重的抑制，这些都影响了水稻的正常生长，造成减产，甚至绝收。

因此，发掘水稻淹水胁迫响应基因，并应用于水稻的遗传改良，以期提高水稻的耐淹水性，是保证水稻高产、稳产的有效途径之一。

发明内容

本发明的目的在于提供水稻淹水胁迫响应RS1基因，并提供RS1基因在水稻耐淹水性遗传中的改良应用。

一种水稻淹水胁迫响应RS1基因，RS1基因的DNA序列为序列表中SEQIDNO:1所示。

所述水稻淹水胁迫响应RS1基因的编码蛋白的氨基酸序列如序列表中的SEQIDNO:2所示。

所述的水稻淹水胁迫响应RS1基因可用于增强水稻耐淹水性，培育耐淹水性增强的水稻新种质、新材料。

一种重组载体，所述的重组载体含有所述RS1基因的基因序列。

一种培育转水稻RS1基因的植株、组织、器官的方法，所述的方法是通过转基因技术将该基因导入植物组织、细胞、器官中，并通过组织培养等方法，获得转水稻RS1基因的细胞、组织、器官、植株等。

本发明一种水稻淹水胁迫响应RS1基因及其应用，其优点是：

1、选用ubi启动子驱动RS1基因，过表达的转基因株系显著提高了水稻的耐淹水性，耐淹水效果明显，在淹水环境中，RS1基因可以明显提高水稻的耐淹水性，保证水稻的高产、稳产；

2、RS1基因来源于水稻，因此转RS1基因的水稻减少了人们对食品安全性的担忧；

3、揭示水稻耐淹水性形成的分子机制，为水稻和其它植物的耐淹水性遗传改良提供了新的基因资源。

具体实施方式

本发明工作原理如下：

把RS1基因克隆到pCAMBIAubi1300转化载体上，导入农杆菌中，通过农杆菌法介导法将该基因转化到水稻受体细胞中，再采用组织培养等技术手段获得转基因植株。

1、水稻RS1基因的获得

选取生长状况良好的水稻自交系M202和其近等基因系M202(Sub1A)分别进行0、5天的淹水处理，提取各处理的叶片总RNA。所得的RNA样品一部分由深圳华大基因公司进行RNA-seq分析；剩余各处理总RNA，分别反转录合成cDNA第一链。RNA-seq结果发现，一基因在淹水处理下表达量大幅提高，表明该基因受淹水胁迫诱导表达，参与淹水胁迫响应，将该基因命名为RS1。

使用GA(赤霉素)、ACC(促进剂1—氨基环丙烷—1—羧酸)对1周大的幼苗M202、M202(Sub1A)进行处理，结果显示，RS1基因受GA、ACC诱导，表达水平显著提高(GA、ACC是植物淹水胁迫响应的重要信号途径)。因此，综合该基因的研究，将RS1基因作为水稻耐淹水的候选基因。

上述总RNA的提取方法以及cDNA第一链合成的实验方法分别与下述中的步骤2、步骤3相同。

2、水稻M202(Sub1A)叶片总RNA的提取

①、取生长状况良好的水稻的叶片0.1g于液氮中研磨后转入2.0mL离心管中，加1.0mLTrizol提取液，涡旋振荡15-20秒后，在4℃环境温度下,以转速12000rpm离心5分钟；

②、取上清液于一无RNase2.0mL离心管，加入体积比为24：1的氯仿与异戊醇,且添加总量为200μL，涡旋振荡15-20秒后，在4℃环境温度下,以转速12000rpm离心5分钟；

③、取②中上清液至一无RNase2.0mL离心管中，添加异丙醇，且添加的异丙醇为上清液体积的2/3，混匀，以转速12000rpm离心10分钟；

④、去③中去溶液后加入1ml70％乙醇，洗涤5分钟；

⑤、去④中所加入的1mL70％乙醇，并将离心管放于工作的超净工作台5分钟，待乙醇挥发殆尽后，加入50μL无RNaseddH₂O，溶解RNA样品，测定浓度后保存于-80℃冰箱，备用。

3、cDNA第一链的合成

取步骤2中获得的RNA合成第一链cDNA；

cDNA第一链合成反应体系如下：10×反转录酶buffer2μL，10mMdNTPs1μL，Randomprimers2μL，RNase抑制剂0.1μL，反转录酶0.5μL，RNA5μg，加无RNaseddH₂O至总体积20μL；

反应程序如下：25℃10分钟，37℃2小时，85℃5分钟，4℃保存；

第一链cDNA的合成参照Promega反转录***A3500操作手册操作，cDNA第一链合成后，用ddH₂O稀释5倍后于-20℃冰箱保存。

4、RS1基因的克隆

使用RT-PCR技术，克隆RS1基因：

RT-PCR反应体系：10×buffer2μL，10mMdNTPs1μL，10mMleftprimer1μL，10mMrightprimer1μL，phusionDNApolymerase0.2μL，cDNAtemplate1μL，ddH₂O13.8μL；

用于RT-PCR扩增反应的RS1基因引物，其序列如下:

leftprimer:5’GGTGGGCTGGGTAGGACGAA3’，rightprimer:5’GCGAGCGGGAAGTAGAAGGG3’；

反应程序如下：95℃3分钟；95℃40秒，55℃1分钟，72℃1分钟，35个循环；72℃延伸5分钟；4℃保存；

将上述获得的RT-PCR产物置于1％琼脂糖凝胶电泳、检测，并于紫外仪下切割目标条带，然后使用凝胶回收试剂盒回收产物。

5、转化载体的构建

①、将步骤4中回收的条带克隆到pENT-D载体中；

反应体系：40-50ngPCR产物，dilutedsalt(稀释5倍的盐溶液)1μL，pENT-D0.5μL，加ddH₂O至6μL；

反应产物混匀后以转速5000rpm离心1分钟，25℃放置1小时。

②、将步骤①中的产物电击法转入DH10B大肠杆菌感受态细胞，然后加入300μLLB液体培养基，于37℃振荡培养1小时，取出200μL均匀涂抹于含有100mg/Lkm的LB平板上，再将含有km的LB平板置于恒温箱中37℃培养12小时；

③、挑选单克隆，PCR检测、DNA测序，获得阳性克隆；

④、从步骤③获得的阳性克隆中提取质粒DNA，并与pCAMBIAubi1300载体进行重组，然后将RS1基因重组到pCAMBIAubi1300载体中，以获得pCAMBIAubi1300-RS1载体；

重组反应体系：pENT-D-RS12μL，pCAMBIAubi13002μL，ClonseII1μL，25℃1小时；

⑤、将步骤④中获得的重组产物电击法转入大肠杆菌DH10B感受态细胞后，均匀涂抹于含有100mg/LAmp(氨苄)的LB平板，然后将含有Amp的LB平板置于恒温箱中，37℃培养12小时；

⑥、挑选单克隆，采用碱变性提取法提取质粒DNA，用NotI、AscI双酶切检测，并用1％琼脂糖凝胶分析酶切图谱，选阳性克隆用于水稻的转基因；

对所克隆的RS1基因进行DNA测序，结果显示，本发明中的水稻RS1全长大小为798bp，详细序列见SEQIDNO:1；RS1基因的编码氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。

6、转RS1基因水稻植株的获得

将步骤5中获得的pCAMBIAubi1300-RS1载体导入农杆菌菌株中，侵染水稻自交系Kittaka的成熟胚愈伤组织，按如下步骤进行培养：

①、共培养:将水稻的成熟胚愈伤组织浸入农杆菌菌液20-30分钟，再用无菌吸水纸吸干水分，将侵染的愈伤组织置于共培养培养基上，22-25℃暗培养2—4天；

共培养基：N6，脯氨酸0.5-0.7g/L，水解酪蛋白0.5-0.7g/L，2,4-D1.6-2.0g/L，麦芽糖31-36g/L，pH5.4-5.6，组织培养胶2.7-3.1g/L，用前加100-190uM乙酰丁香酮；

②、恢复培养：将上述步骤获得的愈伤组织用无菌水清洗4-8次，直至洗过愈伤组织的水溶液变清亮，再用加入浓度为320-390mg/l噻孢霉素的无菌水洗3-7次，每次10-15分钟，用无菌滤纸吸干愈伤组织并转置恢复培养基中上培养6-10天，在合适温度条件下光照培养；

恢复培养基：N6，脯氨酸1.1-1.5g/L，水解酪蛋白0.4-0.8g/L，2,4-D2.0-2.7g/L，蔗糖31-36g/L，组织培养胶2.7-3.1g/L，pH5.6-6.2，用前加320-390mg/L噻孢霉素；

③、筛选培养：将上述获得的愈伤组织转置筛选培养基中，选择合适温度条件光照培养，随后每隔12-16天换一次培养基，选择一般持续6-9周，得到抗性愈伤组织；

筛选培养基：N6，脯氨酸1.1-1.5g/L，水解酪蛋白0.4-0.8g/L，2,4-D2.0-2.7g/L，蔗糖30-36g/L，组织培养胶2.7-3.1g/L，pH5.6-6.2，用前加160-200mg/L噻孢霉素和10-20mg/L潮霉素；

④、分化培养：将上述步骤获得新鲜、疏散且呈淡黄色的愈伤组织放置于分化培养基中培养，在合适温度条件光照培养，并根据情况适时更换培养基；

分化培养基：Sucrose30g/L、phytagel2.5g/L、6-BA2mg/L、NAA0.2mg/L、Zeatin0.2mg/L、KT0.5mg/L、Hygromycin50mg/L、Cefotaxime200mg/L。

⑤、待分化出的不定芽长到一定长度时，将其小心移入生根培养基中诱导生根，从而得到再生植株；

⑥、将上述获得的再生植株移栽于营养钵中，种植于温室；取成活植株的叶片，提取DNA，使用PCR技术对再生植株进行检测，得到阳性转RS1基因植株。

7、转基因植株耐淹水性试验

将转RS1水稻种植于营养钵，每钵种植6植株，以自交系Kittaka作为对照，设置2个重复。置于温室正常生长3周后，进行16天淹水处理，观察表型，结果显示，转RS1的水稻叶片仍然部分呈绿色，而对照水稻自交系Kittaka的叶片全部呈黄色；淹水条件下，对株高的变化进行测量，结果显示，RS1基因的过表达植株，株高增长较慢，显著低于Kittaka，说明RS1基因的过表达显著提高水稻的耐淹水能力。经过多次重复实验，转RS1基因的水稻均表现出很强的耐淹水性。因此，实验结果证明RS1基因可以显著提高水稻的耐淹能力，是提高水稻耐淹水性的新基因。

本发明一种水稻淹水胁迫响应RS1基因及其应用，其优点是：

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种水稻淹水胁迫响应RS1基因，其特征在于：所述RS1基因的DNA序列为序列表中的SEQIDNO:1。

2.如权利要求1所述的水稻淹水胁迫响应RS1基因的编码蛋白：其特征在于：所述RS1基因的氨基酸序列表为序列表中的SEQIDNO:2。

3.如权利要求1所述的水稻淹水胁迫响应RS1基因在培育耐淹水性增强的水稻新种质、新材料中的应用。

4.如权利要求3所述的水稻淹水胁迫响应RS1基因在培育耐淹水性增强的水稻新种质、新材料中的应用，其特征在于：所述转化采用农杆菌介导转化法或基因枪介导转化法。

5.一种重组载体，其特征在于：所述的重组载体含有如权利要求1所述的基因序列。

6.一种培育转水稻RS1基因的植株、组织、器官的方法，其特征在于：所述的方法是通过转基因技术将如权利要求1所述的RS1基因导入植物组织、细胞、器官中，并通过组织培养，获得含转水稻RS1基因的细胞、组织、器官、植株。