CN105085938B - 白芨多糖水凝胶、培养基质及其应用与诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及白芨多糖水凝胶、培养基质及其应用与诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的方法。本发明将白芨多糖经硫酸化后与携带多官能团的ε‑聚赖氨酸交联制得多糖水凝胶。该白芨多糖水凝胶呈半透明膜状，其中具有良好的孔隙，适宜细胞的生长与分化。实验表明，以本发明提供的白芨多糖水凝胶为支架，将hUC‑MSCs与羊膜上皮细胞共培养7天后，hUC‑MSCs的分化率可达31.96％。该分化率显著(p<0.01)未采用凝胶支架的对比例。并且，本发明提供的凝胶还能够使细胞生长旺盛，缩短诱导时间。

Description

白芨多糖水凝胶、培养基质及其应用与诱导脐带间充质干细 胞向角膜上皮细胞分化的方法

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及白芨多糖水凝胶、培养基质及其应用与诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的方法。

背景技术

健全的角膜上皮细胞是角膜抵御外界各种有害因素损伤的重要条件，结构与功能健全的角膜缘干细胞是角膜上皮细胞再生的主要来源。多种致病因素，如：眼外伤、手术创伤、炎症、药物毒性均可造成角膜缘损伤，造成角膜缘干细胞功能障碍，导致上皮细胞缺失，从而导致增加角膜感染、穿孔、新生血管化的危险。因此，通过体外培养获得大量用于角膜修复的上皮细胞这一难题亟待解决。临床研究表明，通过体外培养自体角膜缘干细胞作为角膜上皮修复的种子细胞取得了良好疗效。但是，自体角膜缘干细胞体外连续培养所要求的培养液成分复杂，细胞不稳定易分化，细胞不能持续扩增，细胞表型发生改变，所以每次移植都要在患者或其家属的正常角膜上取下部分角膜缘组织进行体外培养，操作繁琐，且给患者带来二次痛苦，并且有研究者发现当取供眼角膜缘组织大于三分之二时，将造成健眼的眼表疾病和视力不可逆的下降，使得大多数患者难以接受。因此，非常有必要寻找新的自体和异体移植的细胞来源。

脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)具有的低污染、来源充足、增殖旺盛等优点，并且，脐带间充质干细胞不受任何伦理及法理限制，因而吸引了众多的研究者。但是，体外诱导hUC-MSCs向角膜上皮细胞分化十分困难。

三维培养技术通过模拟体内细胞生长微环境，建立细胞之间及胞外基质的广泛联系，通过形成一定的三维立体结构，促进细胞近似于在机体内的基因表达、胞外基质分泌及细胞生物学功能活性，故其在干细胞在再生医学及临床转化医学应用方面有着非常大的发展前景。完整的三维细胞培养体系需要由三部分组成，支架、种子细胞、培养***缺一不可。近年来支架材料的研究表明，水凝胶材料成为最热门的研究方向。

水凝胶是一类具有亲水性但不能在水中溶解而只能发生溶胀的材料，是自然界中普遍存在的一类物质形态。水凝胶中的水可使溶于其中的低分子量物质从其中渗透扩散，具有膜的特性，凝胶的这一扩散特性可实现氧、营养物质的传递和代谢废物的排出，为细胞生存提供一个类似活体组织的环境。水凝胶按材料来源可分为天然材料制备的水凝胶和合成材料水凝胶以及两者复合的水凝胶。天然水凝胶材料主要包括胶原、壳聚糖、藻酸盐、琼脂糖、透明质酸等。其优点是细胞信号识别性好，可促进细胞的黏附、增殖和分化，有良好的生物相容性及生物可降解性；缺点是来源有限，难于加工，难以保证不同批次材料的同一性，存在免疫原性，降解速度、力学性能难以控制等问题。合成水凝胶是由亲水性的聚合物经物理或化学交联形成的水溶胀体。聚异丙基丙烯酰胺，聚乙烯醇，聚乙二醇及其衍生物是研究较多的合成材料。人工合成水凝胶材料不受来源的限制，容易加工成型，可根据需要调整物理、化学、生物力学和降解性能。但是在实际运用中也发现了不少缺点：合成材料通常存在细胞亲和力、亲水性以及细胞黏附性较差，缺乏细胞识别信号位点等缺陷。

因此，应当研发一种具备细胞外基质功能，适合细胞生长发育的人工仿生微环境的水凝胶，并将其用于细胞的培养和诱导分化。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供白芨多糖水凝胶、培养基质及其应用与诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的方法。本发明提供的白芨多糖水凝胶为白芨多糖经硫酸化修饰后与ε-聚赖氨酸交联获得，该凝胶能够在体外为细胞提供能贴近体内的微环境。采用该凝胶作为支架诱导诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化能够显著提高细胞的分化率。

本发明提供的白芨多糖水凝胶的制备方法为：由白芨多糖经硫酸化后以ε-聚赖氨酸交联制得白芨多糖水凝胶。

白芨(Bletilla striata)为兰科白芨属多年生草本植物，以干燥的块茎入药。白芨多糖具有的良好吸湿性和亲水性，能促进氧气、营养物质和其它水溶性代谢产物的通透作用，同时还能加强上皮和基质细胞的粘附性。本发明将白芨多糖经硫酸化后与携带多官能团的ε-聚赖氨酸交联制得多糖水凝胶。本发明提供的白芨多糖水凝胶与白芨多糖溶液自身形成的水凝胶相比，具有更加良好的孔隙，和更高的粘度。并且，该制备方法操作简单，成胶时间短。本发明提供的白芨多糖水凝胶能够在体外提供为细胞提供与体内相似的微环境，从而更加有利于细胞的生长和分化。

在本发明的实施例中，白芨多糖的制备方法为：将白芨粉碎后经水提醇沉，所得沉淀以水重悬，以氯仿和丁醇的混合物抽提后，经30000D～50000D透析，干燥制得白芨多糖。

在一些实施例中，水提醇沉具体为：将白芨粉以水浸提后，提取液与乙醇水溶液混合，静置过夜制得沉淀。

在一些实施例中，浸提的温度为80℃，浸提的时间为4h。

在一些实施例中，乙醇水溶液中乙醇的体积分数为95％。

在一些实施例中，乙醇水溶液与提取液的体积比为1:3。

经过氯仿和丁醇的混合液抽提后，提取物中的蛋白被去除。离心后取水相。

在一些实施例中，氯仿和丁醇的混合物中，氯仿和丁醇的体积比为5:1。

在一些实施例中，沉淀溶于水后溶液的体积是氯仿和丁醇混合物的3倍。

在一些实施例中，透析采用的透析液为蒸馏水。

在一些实施例中，干燥为冻干。

本发明制得白芨多糖的分子量为30000D～50000D。

在一些实施例中，干燥后的白芨多糖还经过纯化。

在一些实施例中，纯化为将冻干后的白芨多糖溶解后，过交联葡聚糖G-100柱。

在本发明的实施例中，硫酸化的方法为氯磺酸-吡啶法。

在一些实施例中，硫酸化的试剂为氯磺酸与吡啶。

在一些实施例中，氯磺酸与吡啶的体积比为1:6。

在本发明的实施例中，白芨多糖的硫酸化具体为：将白芨多糖溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，室温搅拌30min后，加入硫酸化试剂(氯磺酸与吡啶的体积比为1:6)，置于60℃水浴搅拌反应3h。

在一些实施例中，经硫酸化后，调整pH值为7.5，减压浓缩后以蒸馏水为透析液透析3d，透析液浓缩后经冷冻干燥得到硫酸化多糖。

在本发明的实施例中，ε-聚赖氨酸溶液的分子量为600Da～4300Da，其中包括25个～30个赖氨酸残基。

在本发明的实施例中，交联具体为，将硫酸化的白芨多糖溶液与ε-聚赖氨酸溶液混合后静置。

在一些实施例中，ε-聚赖氨酸溶液的溶剂为PBS缓冲液，其中ε-聚赖氨酸的质量分数为3％。

在本发明的实施例中，硫酸化的白芨多糖溶液的溶剂为PBS缓冲液，其中硫酸化白芨多糖的浓度为200μg/mL。

在本发明的实施例中，交联的温度为18℃～35℃，时间为20s～40s。

在一些实施例中，交联的时间为30s。

本发明提供方法制备的白芨多糖水凝胶。

本发明提供的白芨多糖水凝胶呈半透明膜状，其中具有良好的孔隙，适宜细胞的生长与分化。实验表明，以本发明提供的白芨多糖水凝胶为支架，将hUC-MSCs与羊膜上皮细胞共培养7天后，hUC-MSCs的分化率可达31.96％。且细胞生长旺盛，呈球圆形。细胞粘附于支架上，与支架包裹在一起；将其放大至2000倍，可见明显的细胞，其“伪足”牢牢抓住支架间隙。

本发明提供方法制备的白芨多糖水凝胶在细胞培养或诱导分化中的应用。

在本发明的实施例中，诱导分化为诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化。

本发明提供了诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的方法，以白芨多糖水凝胶为支架，在培养液存在条件下，将脐带间充质干细胞与羊膜上皮细胞共培养；培养液包括基础培养基、表皮生长因子和胰岛素。

在本发明的实施例中，表皮生长因子与胰岛素的质量比为(5～25)：(5000～25000)。

作为优选，表皮生长因子与胰岛素的质量比为2:3000～3:2000。

优选的，表皮生长因子与胰岛素的质量比为1:1000。

在本发明的实施例中，表皮生长因子的含量为5ng/mL～25μg/mL；胰岛素的含量为5ng/mL～25μg/mL。

作为优选，表皮生长因子的含量为5ng/mL；胰岛素的含量为5μg/mL。

作为优选，表皮生长因子的含量为10ng/mL；胰岛素的含量为10μg/mL。

作为优选，表皮生长因子的含量为25ng/mL；胰岛素的含量为25μg/mL。

在本发明的实施例中，基础培养液为人干细胞无血清培养基和角朊细胞无血清培养基，人干细胞无血清培养基和角朊细胞无血清培养基的体积比为(50～60):(44～50)。

作为优选，人干细胞无血清培养基和角朊细胞无血清培养基的体积比为55:45。

本发明所用的人干细胞无血清培养基和角朊细胞无血清培养基可为自制也可为购买获得，本发明对此不做限定，其实施皆在本发明的保护范围之内。其中，人干细胞无血清培养基适宜培养干细胞，本发明采用的人干细胞无血清培养基为Lonza UltraCULTURE^TM。角朊细胞无血清培养基适宜培养上皮细胞，本发明采用的角朊细胞无血清培养基为KSFM培养液。本发明采用的基础培养液皆不含有异源血清，降低了动物源血清给人体带来的风险。

在本发明的实施例中，本发明提供的培养基中还包括青霉素和链霉素。

在一些实施例中，青霉素的含量为100U/mL，链霉素的含量为100U/mL。

在本发明的实施例中，共培养为间接共培养。

在本发明的实施例中，脐带间充质干细胞与羊膜上皮细胞的个数比为(1～1.5):(4～6)。

细胞共培养技术是将两种或两种以上的细胞共同培养于同一环境中的技术，由于其具有更好的反映体内环境的优点，因此被应用于现代细胞研究中。间接共培养体系即将2中或2中以上的细胞分别接种于不同的载体上，然后将这两种载体置于同一培养环境中，是不同种类的细胞共用同一种培养体系而不直接接触。间接共培养可采用transwell小室。

在本发明的实施例中，脐带间充质干细胞为第3～5代；所述羊膜上皮细胞为第2代。

在本发明的实施例中，脐带间充质干细胞的原代分离方法为组织块培养法；羊膜上皮细胞的原代分离方法为酶消化法。

具体的，hUC-MSCs的原代分离方法包括以下步骤：

步骤1：将脐带用含有100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的PBS缓冲液漂洗2次，以体积分数为75％的乙醇水溶液浸泡1min～2min后，去除脐带外膜和血管；

步骤2：以人干细胞无血清培养液培养，培养条件为5％CO₂、37℃、湿度95％；第5～7天半量换培养基，继续培养12～14天后全量换液去掉组织块，收集细胞传代培养。

具体的，羊膜上皮细胞的原代分离方法包括以下步骤：

步骤1：将羊膜用含有100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的PBS缓冲液漂洗2次后，破碎，以质量分数为0.25％胰蛋白酶消化；

步骤2：以胶原酶Ⅱ和Dnas酶消化后，培养。

胶原酶Ⅱ的浓度为2.5g/L；Dnas酶的浓度为0.05g/L；消化的条件为37℃，200rpm震荡，时间为15min～30min。

培养的培养液为包含表皮生长因子的角朊细胞无血清培养基；其中表皮生长因子的浓度为10ng/mL～15ng/mL。

培养的接种密度为1×10⁷个/L。

培养的条件为5％CO₂、37℃、湿度95％培养2h后，去除未贴壁的细胞后继续培养24小时。

在本发明的实施例中，共培养的时间为7天。

本发明提供了白芨多糖水凝胶、培养基质及其应用与诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的方法。本发明将白芨多糖经硫酸化后与携带多官能团的ε-聚赖氨酸交联制得多糖水凝胶。该白芨多糖水凝胶呈半透明膜状，其中具有良好的孔隙，适宜细胞的生长与分化。实验表明，以本发明提供的白芨多糖水凝胶为支架，将hUC-MSCs与羊膜上皮细胞共培养7天后，hUC-MSCs的分化率可达31.96％。该分化率显著(p<0.01)优于未采用凝胶支架的对比例。并且，本发明提供的凝胶还能够使细胞生长旺盛，缩短诱导时间。

附图说明

图1示经传递3～5代的hUC-MSCs细胞形态(100×)；

图2-a示原代培养12h的羊膜上皮细胞形态(40×)；

图2-b示传代培养12h的羊膜上皮细胞形态(40×)；

图2-c示传代培养24h的羊膜上皮细胞HE染色结果(100×)；

图2-d示传代培养24h的羊膜上皮细胞以CK7为抗体免疫组化鉴定(100×)；

图2-e示传代培养24h的羊膜上皮细胞以CK8为抗体免疫组化鉴定(100×)；

图2-f示传代培养24h的羊膜上皮细胞以CK18为抗体免疫组化鉴定(100×)。

具体实施方式

本发明提供了白芨多糖水凝胶、培养基质及其应用与诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的方法。，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

本发明实施例中用于角膜上皮细胞鉴定的抗体为AE1和AE5，它们都是细胞角蛋白抗体。AE1可以识别相对分子质量分别为56500、50000、48000和40000的酸性细胞角蛋白,能与角膜上皮细胞的一种相对分子质量为48000的酸性角蛋白发生反应,与波形蛋白、结蛋白、胶质纤维酸性蛋白和神经丝蛋白等丝状蛋白无交叉反应。AE5能够与角膜上皮细胞的角蛋白K3(相对分子质量为64000)特异性结合,与人、兔、牛的角膜上皮细胞有反应,而与皮肤上皮细胞无交叉反应。细胞角蛋白K3是分化状态较高的角膜上皮细胞的标志蛋白。因此,如果细胞AE1和AE5的免疫组化染色阳性时,那么这种细胞为角膜上皮细胞。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1白芨多糖的制备

白芨饮片研成粉末在80℃蒸馏水中分散溶解4h后过滤，滤去杂质。

滤液经由3倍体积的95％乙醇浸泡过夜，沉淀物用蒸馏水重悬。

加入1/3体积的氯仿和丁醇的混合液(体积比5:1。)混均离心抽提蛋白成分，提取水相层的液体。

经30000D-50000D透析柱透析(透析液为蒸馏水)，制成冻干粉，得到白芨多糖粗品。将白芨多糖粗品溶解后经交联葡聚糖G-100进一步纯化制得白芨多糖。

实施例2白芨多糖的硫酸化

将实施例1制得白芨多糖氯磺酸-吡啶法进行硫酸化修饰。具体步骤为：

将0.2g多糖粉末溶于35ml无水N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌30min后，加入17.5ml硫酸化试剂(氯磺酸与吡啶的体积比为1:6)，置于60℃水浴搅拌反应3h。反应结束后冷却至室温，反应液加入100ml冰水，用1mol/L NaOH中和至pH7.5，减压浓缩至一定浓度，用蒸馏水透析3d，透析液浓缩后经冷冻干燥得到硫酸化多糖。

实施例3白芨多糖凝胶的制备

将实施例2制得的硫酸化白芨多糖溶解于PBS中，配制成浓度为200μg/ml的多糖溶液。将ε-聚赖氨酸溶解于PBS中，质量分数为3％，制得交联剂。将多糖溶液与交联剂以体积比1:1混合，室温下静置30s，即可形成半透明膜状白芨多糖水凝胶。

实施例4脐带间充质干细胞的分离培养

将脐带(乙肝、丙肝、HIV、支原体、梅毒等血清学检查均为阴性)置于含有100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的PBS中漂洗2次，加入预冷的75％酒精，浸泡1-2min，期间不停翻动脐带；加入PBS漂洗2次洗去酒精。用组织剪将脐带剪成2mm左右的小段，每段用眼科剪纵向开，用血管钳去除脐带内三根血管(两条动脉，一条静脉)，同时去除脐带外膜；将分离好的脐带用眼科剪剪成约1mm3大小的组织块，取适量放入直径为10cm的无菌培养皿中，覆盖70％培养皿的底面积。加入LONZA人干细胞无血清培养液(Lonza UltraCULTURE^TM)，5％CO₂、37℃、湿度为95％的CO₂培养箱中培养。第5天～7天半量换培养基，继续培养12天～14天左右全量换液去掉组织块同时收集细胞传代培养。

经传递3～5代的hUC-MSCs细胞形态如图1所示，hUC-MSCs生长旺盛，边界光滑，呈现巢状生长，集落大多呈多角形或椭圆形，集落内细胞排列紧密，边界不清；细胞边界清，胞浆较丰富，细胞核大，核仁大。

取第3代对数生长期细胞，细胞分离液消化，流式细胞术检测表面抗原CD 105、CD45、CD34、CD31、CD40、CD29、CD44、HLA-DR表达情况，Cell-Quest软件分析结果。每个样本分析6000～8000个细胞。结果如表1所示：

表1第3代hUC-MSCs细胞表面标志物表达阳性率

细胞表型

CD29

CD31

CD34

CD40

CD44

CD45

CD105

HLA-DR

hUC-MSCs

94.94±1.06

3.27±0.39

2.13±0.35

1.24±0.06

91.8±1.27

1.22±0.05

99.84±0.17

2.93±0.21

经流式细胞术检测，如表1所示，第3代hUC-MSCs高表达CD105、CD44和CD29，低表达或不表达HLA-DR、CD31、CD45、CD40和CD34等标记物。

实施例5羊膜上皮细胞制备

人羊膜取自健康产妇(乙肝、丙肝、HIV、支原体、梅毒等血清学检查均为阴性),将羊膜置于含有100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的PBS中漂洗2次,将其剪成约30-50cm²大小的组织块,加入足够量0.25％胰蛋白酶消化液,在37℃、200R恒温振荡器中消化15～30min,每10min取出用手剧烈摇晃，2000rpm离心5min,再加入足够2.5g/L胶原酶Ⅱ+0.05g/L Dnas酶,在37℃下消化4h,离心,再加入含角朊细胞无血清培养基(Keratinocyte serum-freemedium,KFSM),10-15ng/ml表皮生长因子(EGF)的培养液,吹打均匀,以1×10⁷个/L接种于直径为10cm的培养皿中,置体积分数为5％CO2、37℃细胞培养箱内培养2h后轻轻将未贴壁的细胞吸出,因羊膜上皮细胞贴壁较慢,混杂的间充质细胞或成纤维细胞贴壁较快,这时吸出重新培养的细胞(即差异黏附法获得的细胞)90％以上是羊膜上皮细胞。继续培养至细胞融合达到80％～90％后，传代。原代培养12h的细胞镜下观察如图2-a所示(40倍)。传代培养12h的细胞镜下观察如图2-b所示(40倍)。将第2代羊膜上皮细胞培养24h后取出(经HE染色镜下观察如图2-c，放大100倍),免疫组化鉴定细胞角蛋白CK7(图2-d)、CK8(图2-e)和CK18(图2-f)。

结果表明，镜下观察第2代羊膜上皮细胞呈圆形、透亮、折光性较强、富有立体感。经差异黏附法培养的原代细胞90％以上为人羊膜上皮细胞，混杂的间充质细胞或成纤维细胞较少,在接种12h内可下沉贴壁生长,2d后细胞进入指数生长期,细胞数量明显增多,呈不规则的多角形,4～5d左右90％细胞融合成片,形成单层(见图2-a)。传代的人羊膜上皮细胞能较快贴壁,接种4～6h后即可贴壁并开始生长,接种24h后细胞生长加速,细胞扁平变大,细胞核清晰,位于胞质中央。3～d左右细胞90％融合,呈典型的铺路石样外观(见图2-c)。苏木素伊红染色,可见细胞大小较均一,呈不规则的多角形,胞质丰富,胞核蓝染,圆形,核膜清晰,核仁明显,可见2～3个核***(图2-c)。免疫组化鉴定，本实施例培养的人羊膜上皮细胞的胞浆中见CK7、CK8、CK18单克隆角蛋白抗体染色阳性,胞浆呈棕黄色,胞核呈蓝紫色。表明成功分离培养了羊膜上皮细胞。

实施例6

在transwell小室的下室中制备白芨多糖凝胶。方法如实施例3。将0.5mL多糖溶液加入六孔板，加入等体积的交联剂，室温静置30s。

取增殖对数期的第3-5代hUC-MSCs和第2代羊膜上皮细胞，接种于Transwell共培养体系中，上室植入羊膜上皮细胞接种密度为4×10⁵个/孔，下室植入hUC-MSCs，接种密度为1×10⁵个/孔。每孔加入2.5ml含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，体积分数为55％LONZA人干细胞无血清培养基(Lonza Ultra CULTURE^TM),45％角朊细胞无血清培养基(Keratinocyte serum-free medium,KFSM)的培养液，10ng/ml表皮生长因子(EGF)，10ug/ml胰岛素的完全培养液。

每隔2-3天更换新的培养液。培养7天后取出细胞爬片。

倒置显微镜下观察：培养7d后，细胞生长旺盛，成球圆状，排列紧密，可见许多集落；继续培养至第14d，细胞体积明显增大。

扫描电镜观察：培养7天后可见细胞粘附于支架上，与支架包裹在一起；将其放大至2000倍，可见明显的细胞，其“伪足”牢牢抓住支架间隙。

按照免疫组化染色SP法试剂盒的说明书进行细胞角蛋白AE1和AE5及P63的免疫组化染色,DAB显色。免疫组化染色结果表明，可见大量DAB着色细胞。呈散在分布而且细胞着色较深。

实施例7

在transwell小室的下室中制备白芨多糖凝胶。方法如实施例3。将0.5mL多糖溶液加入六孔板，加入等体积的交联剂，室温静置30s。

取增殖对数期的第3-5代hUC-MSCs和第2代羊膜上皮细胞，接种于Transwell共培养体系中，上室植入羊膜上皮细胞接种密度为4×10⁵个/孔，下室植入hUC-MSCs，接种密度为1×10⁵个/孔。每孔加入2.5ml含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，体积分数为55％LONZA人干细胞无血清培养基(Lonza Ultra CULTURE^TM),45％角朊细胞无血清培养基(Keratinocyte serum-free medium,KFSM)的培养液，25ng/ml表皮生长因子(EGF)，25ug/ml胰岛素的完全培养液。

每隔2-3天更换新的培养液。培养7天后取出细胞爬片。

倒置显微镜下观察：培养7d后，细胞生长缓慢，可见少许集落；培养至第14d，细胞体积有见增大。

扫描电镜观察：继续培养7天后可见细胞粘附于支架上，与支架包裹在一起；将其放大至2000倍，可见明显的细胞，其“伪足”牢牢抓住支架间隙。

按照免疫组化染色SP法试剂盒的说明书进行细胞角蛋白AE1和AE5的免疫组化染色,DAB显色。AE1免疫组化染色结果表明，可见少许AE1抗体DAB着色细胞,呈散在分布，而且细胞着色较淡。AE5抗体淡着色。

实施例8

在transwell小室的下室中制备白芨多糖凝胶。方法如实施例3。将0.5mL多糖溶液加入六孔板，加入等体积的交联剂，室温静置30s。

取增殖对数期的第3-5代hUC-MSCs和第2代羊膜上皮细胞，接种于Transwell共培养体系中，上室植入羊膜上皮细胞接种密度为4×10⁵个/孔，下室植入hUC-MSCs，接种密度为1.5×10⁵个/孔。每孔加入2.5ml含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，体积分数为55％LONZA人干细胞无血清培养基(Lonza Ultra CULTURE^TM),45％角朊细胞无血清培养基(Keratinocyte serum-free medium,KFSM)的培养液，5ng/ml表皮生长因子(EGF)，5ug/ml胰岛素的完全培养液。

每隔2-3天更换新的培养液。培养7天后取出细胞爬片。

倒置显微镜下观察：培养7d后，细胞生长缓慢，可见少许集落；培养至第14d，细胞体积有见增大。

扫描电镜观察：继续培养7天后可见少量细胞粘附于支架上，与支架包裹在一起；将其放大至2000倍，可见明显的细胞，其“伪足”牢牢抓住支架间隙。

按照免疫组化染色SP法试剂盒的说明书进行细胞角蛋白AE1和AE5的免疫组化染色,DAB显色。免疫组化染色结果表明，可见少许AE1抗体DAB着色细胞。呈散在分布，而且细胞着色较淡。AE5抗体淡着色。

对比例1

取增殖对数期的第3-5代hUC-MSCs和第2代羊膜上皮细胞，接种于Transwell共培养体系中，上室植入羊膜上皮细胞接种密度为4×10⁵个/孔，下室植入hUC-MSCs，接种密度为1×10⁵个/孔。

培养板上不添加任何凝胶，每孔加入2.5ml含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，体积分数为55％LONZA人干细胞无血清培养基(Lonza Ultra CULTURE^TM),45％角朊细胞无血清培养基(Keratinocyte serum-free medium,KFSM)的培养液，10ng/ml表皮生长因子(EGF)，10ug/ml胰岛素的完全培养液。

每隔2-3天更换新的培养液。培养7天后取出细胞爬片。

倒置显微镜下观察：培养7d后，细胞则呈梭形，单层融合生长。继续培养至14d，可见细胞体积有见增大。

按照免疫组化染色SP法试剂盒的说明书进行细胞角蛋白AE1和AE5及P63的免疫组化染色,DAB显色。免疫组化染色结果表明，可见少许DAB着色细胞。呈散在分布而且细胞着色较浅。

实施例9

对实施例6～8及对比例1所得细胞经免疫组化检测后，对AE1、AE5染色的细胞进行计数，计算出两组的分化率进行比较。每组取样3次，分别检测后统计数据。

诱导分化率＝染色阳性细胞数/细胞总数×100％。

统计结果如表2：

表2各组细胞分化率

注：同列肩标不同字母表示具有显著性差异(p<0.01)

实验表明，将脐带间充质干细胞和羊膜上皮细胞共培养，7天后脐带间充质干细胞部分呈分化趋势，细胞呈散在分布，经检测，hUC-MSCs分化为角膜上皮细胞的分化率可达31.96％。而没有采用凝胶支架的对比例中hUC-MSCs的分化率为26.52％；可见，本发明提供的方法能够提高hUC-MSCs向角膜上皮细胞分化的百分率，该效果具有显著性差异(p<0.01)。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.白芨多糖水凝胶的制备方法，其特征在于，由白芨多糖经硫酸化后以ε-聚赖氨酸交联制得白芨多糖水凝胶；

所述白芨多糖的分子量为30000D～50000D；

所述硫酸化为：将白芨多糖溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，室温搅拌30min后，加入硫酸化试剂，置于60℃水浴搅拌反应3h；所述硫酸化试剂由体积比为1:6的氯磺酸与吡啶组成；

所述交联为，将硫酸化的白芨多糖溶液与ε-聚赖氨酸溶液混合后静置；

所述交联的温度为18℃～35℃，时间为20s～40s；

所述ε-聚赖氨酸溶液的溶剂为PBS缓冲液，其中，ε-聚赖氨酸的质量分数为3％；

所述硫酸化的白芨多糖溶液的溶剂为PBS缓冲液，其中，硫酸化白芨多糖的浓度为200μg/mL。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述白芨多糖的制备方法为：将白芨粉碎后经水提醇沉，所得沉淀以水重悬，以氯仿和丁醇的混合物抽提后，经30000D～50000D透析，干燥制得白芨多糖。

3.权利要求1～2任一项所述制备方法制得的白芨多糖水凝胶。

4.权利要求1～2任一项所述制备方法制得的白芨多糖水凝胶在细胞培养或诱导分化中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述诱导分化为诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化。

6.诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的方法，其特征在于，以权利要求1～2任一项所述制备方法制得的白芨多糖水凝胶为支架，在培养液存在条件下，将脐带间充质干细胞与羊膜上皮细胞共培养；所述培养液包括基础培养基、表皮生长因子和胰岛素。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述表皮生长因子与胰岛素的质量比为(5～25)：(5000～25000)。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述脐带间充质干细胞与羊膜上皮细胞的个数比为(1～1.5):(4～6)。