CN105085711B - 一种壳寡糖的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

一种壳寡糖的制备方法及其应用，本发明涉及一种壳寡糖的制备方法及其应用。本发明提供一种壳寡糖的制备方法及其应用。方法：将壳聚糖溶解于冰乙酸溶液中，然后加入过氧化氢，升温搅拌至40～90℃恒温，反应结束后用乙醇沉淀，过滤，滤渣经过干燥，得到壳寡糖；本发明制备的壳寡糖用于制备抑制5种人源肿瘤的10株肿瘤细胞的药物。有效利用了其生物相容性和肿瘤拮抗活性。通过分析壳寡糖的抗肿瘤活性，有助于推动抗肿瘤药剂发展。本发明用于抗肿瘤药物领域。

Description

一种壳寡糖的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种壳寡糖的制备方法及其应用。

背景技术

几丁质(chitin)广泛存在与甲壳类动物的外壳、昆虫的甲壳和真菌的胞壁中，是自然界中最为丰富的天然高分子，含量仅次于纤维素。几丁质具有多种功能特性，但是其极差的水溶特性和生物降解能力极大的限制了其广泛应用。相对于几丁质不溶于水、稀酸、稀碱、乙醇或其他有机溶剂的特性，壳聚糖(chitosan)可溶于水并在稀酸溶液中呈现出较高的粘度。这种溶解特性也限制了壳聚糖在生物领域的应用。同样作为几丁质降解产物，壳寡糖(chitosan oligosaccharides，COS)的溶解性更好，且在生理条件下粘度较低，这是由于壳寡糖的糖链更短和游离氨基基团。壳寡糖的糖苷残基重复单元中含有一个氨基基团和两个羟基基团，是自然界中唯一带正电荷阳离子碱性氨基低聚糖。壳寡糖的这些特性引起了越来越多研究者的关注。已经有很多文献报道了壳寡糖的生物活性，抗氧化、消炎、拮抗微生物、降低胆固醇和增强免疫活性、抗肿瘤的活性等。壳寡糖在很多领域的应用也有相应的报道，如食品、药物、农业和环境领域。此外，壳寡糖良好的生物相容性、无毒、对活体器官的不致敏特性，也使其作为纳米-/微米体系发展成为一种潜在的药物载体和组织工程支架。

肿瘤是危害人类健康最严重的一类常见病、多发病。肿瘤已成为世界各地发病率和死亡率的一个重要原因，近些年来随着人们生活方式的改变以及环境污染的加剧，其发病率呈逐年上升趋势，特别是发展中国家。目前，我国肿瘤的发病率为285.91/10万，平均每天每分钟就有6人被诊断为恶性肿瘤。WHO预测，到2030年估计全球有2014万新增癌症病例，每年将有1320万患者死于癌症。有文献报道，壳寡糖具有抗肿瘤的生物活性，其机制为直接抑制肿瘤细胞的生长，并且有报道细胞坏死和凋亡，减少肿瘤血管生成从而实现抑制肿瘤细胞转移，也有可能是通过增强机体免疫力，间接实现拮抗肿瘤发生发展的作用。

壳寡糖的体内外抗肿瘤活性研究很多，但是其分子机理仍为未知。壳寡糖具有很好的粘附特性，可以与哺乳动物细胞的表面糖蛋白结合。因此，壳寡糖带正电的特性改变了细胞膜带电性，从而破坏细胞完整性，影响细胞生长。Suzuki等人发现抗肿瘤药物与肿瘤细胞的静电相互作用是壳寡糖具有抗肿瘤活性的重要原因。Huang等人使用具有不同电荷数壳寡糖对三株肿瘤细胞系的拮抗作用，结果表明带电荷量高的壳寡糖衍生物可以显著降低肿瘤细胞的存活率。

除了电荷的影响，Huang等人又发现壳寡糖的分子量对其抗肿瘤活性也发挥着重要作用。Salah等人测定了几丁质、壳聚糖、小分子几丁质对人源肿瘤细胞THP-1的拮抗作用，发现小分子几丁质的抗肿瘤效果较好，并随着分子量降低抗肿瘤效果增加。

血管生成为肿瘤组织的发生、发展和转移提供了代谢产物、氧和营养物质，因此被认为是抗肿瘤研究中新型作用靶点。壳寡糖可以抑制人源纤维肉瘤组织中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的表达，这在肿瘤转移发生具有重要的影响。MMP-9的上调会促进基质中血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)释放和血管生成。VEGF刺激上皮细胞扩增和迁移，这对血管祖细胞和血管新生具有调控作用。Wu等人采用几种不同的生物方法测定了一些壳寡糖组分对血管生成的抑制作用，发现抑制效果取决于组分的脱乙酰度和聚合度。

此外，壳寡糖的免疫增强活性也是其具有抗肿瘤活性的重要原因之一。Suzuki等人利用水溶性较好的壳聚糖增强了免疫能力，并且证明壳寡糖随着免疫活性增强抑制了肿瘤增长。还有人认为壳寡糖不能直接杀伤肿瘤，而是通过促进淋巴因子的释放促进T-淋巴细胞扩增发挥肿瘤拮抗活性。Suzuki等人也证实壳寡糖通过激活淋巴细胞释放淋巴因子来抑制肿瘤生长。一般来说，免疫增强剂通过增强巨噬细胞或中性粒细胞的免疫活性发挥非特性免疫活性的。大多数免疫增强剂刺激如干扰素、白介素和配体蛋白等免疫反应化合物的分泌，这些化合物在与巨噬细胞或淋巴细胞表面受体蛋白结合后便会激活免疫***。一些免疫增强剂可与感染组织靶点细胞上特异受体分子竞争性结合。壳聚糖低聚物可有效促进巨噬细胞的迁移活性，这是因为巨噬细胞具有趋化性。Ma等人认为壳聚糖低聚物通过下调MAPK和PI3K/Akt信号通路磷酸化和NF-κB和AP-1的激活进而抑制IL-6和TNF-α的分泌发挥了抗炎症活性。壳寡糖还通过增强抗体应答发挥免疫增强活性的。Chang等人研究了壳寡糖对一种未灭活的流感疫苗的作用效果。结果表明壳寡糖明显提高了血清中的抗体含量，增强了小鼠的抗病毒防御***。壳寡糖还能刺激细胞因子的释放，如白介素IL-1β和肿瘤致死因子TNF-α等。

但现有的壳寡糖在抑制肿瘤上活性欠佳，并且根据已有的国内外参考文献来看，壳寡糖体内肿瘤拮抗作用的给药方式和给药剂量的研究尚为空白，壳寡糖对多肿瘤细胞株抑制筛选的工作鲜有报道。因此制备出活性好的壳寡糖，在制备抑制肿瘤药物上有着良好的应用前景。

发明内容

本发明提供一种壳寡糖的制备方法及其应用。

一种壳寡糖的制备方法，具体是按照以下步骤制备的：

将壳聚糖溶解于质量浓度为0.1～5.0％的冰乙酸溶液中，然后加入壳聚糖5～25倍重的浓度为10％～40％过氧化氢，升温搅拌至40～90℃恒温，反应0.5～10h，再经质量浓度为60～100％的乙醇沉淀，过滤，滤渣经过干燥，得到聚合度2～30的壳寡糖；其中壳寡糖中聚合度2～10的含量不低于80％，不包含水分含量的壳寡糖纯度>98％；壳聚糖与质量浓度为0.1～5.0％的冰乙酸溶液的质量体积比为1g:(10～30)mL。

一种壳寡糖的应用是指用于制备抑制5种人源肿瘤的10株肿瘤细胞的药物。

本发明不仅可有效提高丰富的自然资源的利用率，还有效利用了其生物相容性和肿瘤拮抗活性。通过分析壳寡糖的抗肿瘤活性，有助于拖动抗肿瘤药剂发展。在相同测试浓度范围内本发明的壳寡糖对HCT-116和A549的杀伤能力均高于市售壳寡糖；在相同测试浓度范围内阳性药5-氟尿嘧啶对十种不同来源的人源肿瘤细胞系的半数抑制浓度变化范围为0.04±0.01～12.1±3.0μg/mL，本发明制备的壳寡糖对肿瘤细胞系的半数抑制浓度变化范围为48.6±7.0～1329.9±93.4μg/mL。壳寡糖对于十种不同来源的人源肿瘤细胞系的最大抑制率均可达到90％以上，甚至高达95％。本发明制备的壳寡糖体内外杀伤肿瘤的效果好。

附图说明

图1为实施例1制备的壳寡糖与三种商用壳寡糖对人源肺癌肿瘤细胞A549生长抑制效果图(n＝4，±sd)；其中a为COS，b为COS-a，c为COS-b，d为COS-c；

图2为实施例2制备的壳寡糖与三种商用壳寡糖对人源结肠癌细胞HCT-116生长抑制效果图(n＝4，±sd)；其中a为COS，b为COS-a，c为COS-b，d为COS-c；

图3为实施例4制备的壳寡糖灌胃给药对小鼠肉瘤S180移植瘤的抑制效果图(肿瘤体积)(n＝10，±sd)；其中a为空白对照组，b为低剂量组，c为高剂量组；

图4为实施例4制备的壳寡糖灌胃给药对荷瘤小鼠相对体重的影响；其中a为空白对照组，b为低剂量组，c为高剂量组；

图5为实施例5制备的壳寡糖灌胃给药对小鼠肉瘤S180残瘤的抑制效果图(肿瘤体积)(n＝7，±sd)；其中a为空白对照组，b为低剂量组，c为高剂量组；

图6为实施例5制备的壳寡糖灌胃给药对荷瘤小鼠相对体重的影响；其中a为空白对照组，b为低剂量组，c为高剂量组；

图7为实施例6制备的壳寡糖腹腔注射给药对小鼠肉瘤S180残瘤的抑制效果图(肿瘤体积)(n＝10，±sd)；其中a为空白对照组，b为黄芪对照组，c为低剂量组，d为高剂量组；

图8为实施例6制备的壳寡糖腹腔注射给药对残瘤小鼠相对体重的影响；其中a为空白对照组，b为黄芪对照组，c为低剂量组，d为高剂量组。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举的具体实施方式，还包括各具体实施方式之间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式一种壳寡糖的制备方法，具体是按照以下步骤制备的：

将壳聚糖溶解于质量浓度为0.1～5.0％的冰乙酸溶液中，然后加入壳聚糖5～25倍重的浓度为10％～40％过氧化氢，升温搅拌至40～90℃恒温，反应0.5～10h，再经质量浓度为60～100％的乙醇沉淀，过滤，滤渣经过干燥，得到聚合度2～30的壳寡糖；其中壳寡糖中聚合度2～10的含量不低于80％，不包含水分含量的壳寡糖纯度>98％；壳聚糖与质量浓度为0.1～5.0％的冰乙酸溶液的质量体积比为1g:(10～30)mL。

本实施方式不仅可有效提高丰富的自然资源的利用率，还有效利用了其生物相容性和肿瘤拮抗活性。通过分析壳寡糖的抗肿瘤活性，有助于推动抗肿瘤药剂发展。在相同测试浓度范围内本发明的壳寡糖对HCT-116和A549的杀伤能力均高于市售壳寡糖；在相同测试浓度范围内阳性药5-氟尿嘧啶对十种不同来源的人源肿瘤细胞系的半数抑制浓度变化范围为0.04±0.01～12.1±3.0μg/mL，本实施方式制备的壳寡糖对肿瘤细胞系的半数抑制浓度变化范围为48.6±7.0～1329.9±93.4μg/mL。壳寡糖对于十种不同来源的人源肿瘤细胞系的最大抑制率均可达到90％以上，甚至高达95％。本实施方式制备的壳寡糖体内外杀伤肿瘤的效果好。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：将壳聚糖溶解于质量浓度为3.5％的冰乙酸溶液中，然后加入壳聚糖20倍重的浓度为30％过氧化氢。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：所述的升温搅拌至70℃恒温，反应8h。其它与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：所述的过质量浓度为95％的乙醇沉淀。其它与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：所述的干燥的方法为冷冻干燥。其它与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式一种壳寡糖的应用是指用于制备抑制5种人源肿瘤的10株肿瘤细胞的药物。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是：所述的5种人源肿瘤为胃癌、肾癌、肺癌、乳腺癌和结肠癌。其它与具体实施方式六相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式六或七不同的是：所述的10株肿瘤细胞为胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901、肾癌细胞系KCC-853和786-O、肺癌细胞系A549和NCI-H460、乳腺癌细胞系MCF-7和Bcap-37、结肠癌细胞系HCT-116和HT-29。其它与具体实施方式六或七相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式六至八之一不同的是：所述的药物的给药方式为每天灌胃给药，给药剂量为32mg/kg。其它与具体实施方式六至八之一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式六至九之一不同的是：所述的药物的给药方式为隔天腹腔注射给药，给药剂量为4mg/kg。其它与具体实施方式六至九之一相同。

采用以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例1：本实施例壳寡糖的制备方法，具体是按照以下步骤制备的：

将壳聚糖溶解于质量浓度为3.5％的冰乙酸溶液中，然后加入壳聚糖20倍重的浓度为30％过氧化氢，升温搅拌至70℃恒温，反应8h，再经质量浓度为95％的乙醇沉淀，过滤，滤渣经过干燥，得到聚合度2～30的壳寡糖；其中壳寡糖中聚合度2～10的含量不低于80％，不包含水分含量的壳寡糖纯度>98％；壳聚糖与质量浓度为0.1～5.0％的冰乙酸溶液的质量体积比为1g:2mL。

本实施例的壳寡糖与三种市售壳寡糖对人源肺癌肿瘤细胞A549生长的抑制活性比较；所市售的医药级壳寡糖，记为COS-a；市售的食品级壳寡糖，记为COS-b；市售的壳寡糖，记为COS-c；本实施例制备的壳寡糖记为COS；所述的实验方法为MTT法。

一、细胞培养

a、培养液的配制：RPMI1640培养基，购于美国Gibco公司，胎牛血清购于北京元亨圣马生物技术研究所。胎牛血清56℃、30min灭活后，按10％比例加入RPMI1640培养基中，4℃保存。

b、灭菌及无菌操作：操作前紫外灯照射灭菌台面30min，进入超净台前75％乙醇净手并擦拭台面，所有操作应在酒精灯旁进行，所有物须经火焰烧灼灭菌，注意无菌原则。

c、细胞计数：用酒精清洗计数板及盖玻片后，用镜头纸擦干，将盖玻片覆盖在计数板上。胰蛋白酶消化液将对数生长期的肿瘤细胞，离心弃胰酶溶液后，加入适量的培养液，混匀后，用培养液稀释相应倍数后吸取少量细胞悬液，从边缘轻滴在计数板上，使细胞悬液充满计数板与盖玻片之间的空隙。显微镜下观察并计数四角大方格内细胞数，如有压边仅计算压其中固定两边的细胞，计算公式如下：

细胞数/mL＝(4大格细胞总数/4)×10⁴×稀释倍数

d、样品配制：称取一定的壳寡糖或商用壳寡糖，溶解于培养基中，滤菌膜过滤备用。

e、MTT溶液的配制：培养液溶解MTT粉末，制的0.5mg/mL的MTT溶液备用。

二、MTT检测

将100μL细胞悬液接种于96孔板中，每孔为3000个细胞，将培养板至于CO₂培养箱中，37℃，5％CO₂、饱和湿度条件下培养24h使细胞贴壁生长。加入100μL不同浓度的壳寡糖溶液和5-氟尿嘧啶溶液，对照组加入100μL空白培养基后，继续培养72h。弃去上清液，每孔加入100μL MTT溶液，避光孵育4h后，弃上清后，每孔加入200μL DMSO，震荡后于酶标仪上测定在570nm的吸光值。根据下列公司计算细胞生长抑制率：

生长抑制率(IR，％)＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100

实验结果：本实施例的壳寡糖与市售壳寡糖对人源肺癌肿瘤细胞A549生长的抑制效果图见附图1，与商用壳寡糖相比，申请人制备的壳寡糖COS对A549细胞的杀伤效果更为明显。

本实施例的壳寡糖与市售壳寡糖对人源肺癌肿瘤细胞A549生长的抑制中，本实施例的壳寡糖在所测试浓度范围内的抑制率范围为82.0％-88.8％，而市售壳寡糖的抑制率呈剂量依赖性，甚至在1.25mg/mL时抑制率为负值。对测定浓度范围内的市售壳寡糖的半数抑制浓度IC50进行了拟合，其中COS-a和COS-c的IC50值分别为6.6582±0.9814和5.3249±0.8913mg/mL。在所测试浓度范围内，COS-b的抑制率均为负值，无法进行拟合；本实施例的壳寡糖的抑制率较稳定，无法拟合，而根据后续MTT实验结果拟合本实施例的壳寡糖的IC50值为279.1±25.4μg/mL，远远低于三种市售壳寡糖。

本实施例所用的人源肺癌肿瘤细胞A549为市售产品。

具体实施方式2：本实施例壳寡糖的制备方法，具体是按照以下步骤制备的：

将壳聚糖溶解于质量浓度为3.5％的冰乙酸溶液中，然后加入壳聚糖20倍重的浓度为30％过氧化氢，升温搅拌至70℃恒温，反应8h，再经质量浓度为95％的乙醇沉淀，过滤，滤渣经过干燥，得到聚合度2～30的壳寡糖；其中壳寡糖中聚合度2～10的含量不低于80％，不包含水分含量的壳寡糖纯度>98％；壳聚糖与质量浓度为0.1～5.0％的冰乙酸溶液的质量体积比为1g:20mL。

本实施例的壳寡糖与三种市售壳寡糖对人源结肠癌肿瘤细胞HCT-116生长的抑制活性比较；市售的医药级壳寡糖，记为COS-a；市售的食品级壳寡糖，记为COS-b；市售的壳寡糖，记为COS-c；本实施例制备的壳寡糖记为COS；所述的实验方法为MTT法。

一、细胞培养

a、培养液的配制：RPMI1640培养基，购于美国Gibco公司，胎牛血清购于北京元亨圣马生物技术研究所。胎牛血清56℃、30min灭活后，按10％比例加入RPMI1640培养基中，4℃保存。

b、灭菌及无菌操作：操作前紫外灯照射灭菌台面30min，进入超净台前75％乙醇净手并擦拭台面，所有操作应在酒精灯旁进行，所有物须经火焰烧灼灭菌，注意无菌原则。

c、细胞计数：用酒精清洗计数板及盖玻片后，用镜头纸擦干，将盖玻片覆盖在计数板上。胰蛋白酶消化液将对数生长期的肿瘤细胞，离心弃胰酶溶液后，加入适量的培养液，混匀后，用培养液稀释相应倍数后吸取少量细胞悬液，从边缘轻滴在计数板上，使细胞悬液充满计数板与盖玻片之间的空隙。显微镜下观察并计数四角大方格内细胞数，如有压边仅计算压其中固定两边的细胞，计算公式如下：

细胞数/mL＝(4大格细胞总数/4)×10⁴×稀释倍数

d、样品配制：称取一定的壳寡糖或商用壳寡糖，溶解于培养基中，滤菌膜过滤备用。

e、MTT溶液的配制：培养液溶解MTT粉末，制的0.5mg/mL的MTT溶液备用。

二、MTT检测

将100μL细胞悬液接种于96孔板中，每孔为3000个细胞，将培养板至于CO₂培养箱中，37℃，5％CO₂、饱和湿度条件下培养24h使细胞贴壁生长。加入100μL不同浓度的壳寡糖溶液和5-氟尿嘧啶溶液，对照组加入100μL空白培养基后，继续培养72h。弃去上清液，每孔加入100μL MTT溶液，避光孵育4h后，弃上清后，每孔加入200μL DMSO，震荡后于酶标仪上测定在570nm的吸光值。根据下列公司计算细胞生长抑制率：

生长抑制率(IR，％)＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100

实验结果：本实施例制备的壳寡糖与市售的壳寡糖对人源肺癌肿瘤细胞HCT-116生长的抑制效果图见附图2，与市售壳寡糖相比，申请人制备的壳寡糖COS对HCT-116细胞的杀伤效果更为明显。本实施例的壳寡糖与市售壳寡糖对人源结肠癌肿瘤细胞HCT-116生长的抑制中，本实施例的壳寡糖的抑制率为-12.9～90.3％；而三种市售壳寡糖的最高抑制率分别为88.9％、88.4％和87.2％，均低于本实施例的壳寡糖最高抑制率。对抑制结果进行半数抑制浓度拟合，本实施例的壳寡糖与三种市售壳寡糖对HCT-116细胞的半数抑制浓度分别为2.5396±0.2372、9.5104±1.4619、9.6845±0.2495和4.3789±1.1299mg/mL。由此可看，本实施例的壳寡糖对HCT-116的杀伤能力均高于市售壳寡糖。

本实施例中所用的人源结肠癌肿瘤细胞HCT-116为市售产品。

实施例3：本实施例壳寡糖的制备方法，具体是按照以下步骤制备的：

将壳聚糖溶解于质量浓度为3.5％的冰乙酸溶液中，然后加入壳聚糖20倍重的浓度为30％过氧化氢，升温搅拌至70℃恒温，反应8h，再经质量浓度为95％的乙醇沉淀，过滤，滤渣经过干燥，得到聚合度2～30的壳寡糖；其中壳寡糖中聚合度2～10的含量不低于80％，不包含水分含量的壳寡糖纯度>98％；壳聚糖与质量浓度为0.1～5.0％的冰乙酸溶液的质量体积比为1g:20mL。

通过壳寡糖对10种不同来源的人源肿瘤细胞系生长的抑制活性，评价本实施例制备的壳寡糖体外抗肿瘤活性；

一、细胞培养

a、培养液的配制：RPMI1640培养基，购于美国Gibco公司，胎牛血清购于北京元亨圣马生物技术研究所。胎牛血清56℃、30min灭活后，按10％比例加入RPMI1640培养基中，4℃保存。

b、灭菌及无菌操作：操作前紫外灯照射灭菌台面30min，进入超净台前75％乙醇净手并擦拭台面，所有操作应在酒精灯旁进行，所有物须经火焰烧灼灭菌，注意无菌原则。

c、细胞计数：用酒精清洗计数板及盖玻片后，用镜头纸擦干，将盖玻片覆盖在计数板上。胰蛋白酶消化液将对数生长期的肿瘤细胞，离心弃胰酶溶液后，加入适量的培养液，混匀后，用培养液稀释相应倍数后吸取少量细胞悬液，从边缘轻滴在计数板上，使细胞悬液充满计数板与盖玻片之间的空隙。显微镜下观察并计数四角大方格内细胞数，如有压边仅计算压其中固定两边的细胞，计算公式如下：

细胞数/mL＝(4大格细胞总数/4)×10⁴×稀释倍数

d、样品配制：称取一定的壳寡糖或商用壳寡糖，溶解于培养基中，滤菌膜过滤备用。

e、MTT溶液的配制：培养液溶解MTT粉末，制的0.5mg/mL的MTT溶液备用。

二、MTT检测

将100μL细胞悬液接种于96孔板中，每孔为3000个细胞，将培养板至于CO₂培养箱中，37℃，5％CO₂、饱和湿度条件下培养24h使细胞贴壁生长。加入100μL不同浓度的壳寡糖溶液和5-氟尿嘧啶溶液，对照组加入100μL空白培养基后，继续培养72h。弃去上清液，每孔加入100μL MTT溶液，避光孵育4h后，弃上清后，每孔加入200μL DMSO，震荡后于酶标仪上测定在570nm的吸光值。根据下列公司计算细胞生长抑制率：

生长抑制率(IR，％)＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100

实验结果：本实施例制备的壳寡糖对10种不同来源的人源肿瘤细胞系的抑制效果见表1。阳性药5-氟尿嘧啶对多株肿瘤细胞系的半数抑制浓度变化范围为0.04±0.01～12.1±3.0μg/mL，本实施例制备的壳寡糖对肿瘤细胞系的半数抑制浓度变化范围为48.6±7.0～1329.9±93.4μg/mL。壳寡糖对于肿瘤细胞系的最大抑制率均可达到90％以上，甚至高达95％。

本实施例所用的10种不同来源的人源肿瘤细胞系均为市售产品。

表1壳寡糖对10种不同来源的人源肿瘤细胞系的杀伤效果

实施例4：本实施例壳寡糖的制备方法，具体是按照以下步骤制备的：

将壳聚糖溶解于质量浓度为3.5％的冰乙酸溶液中，然后加入壳聚糖20倍重的浓度为30％过氧化氢，升温搅拌至70℃恒温，反应8h，再经质量浓度为95％的乙醇沉淀，过滤，滤渣经过干燥，得到聚合度2～30的壳寡糖；其中壳寡糖中聚合度2～10的含量不低于80％，不包含水分含量的壳寡糖纯度>98％；壳聚糖与质量浓度为0.1～5.0％的冰乙酸溶液的质量体积比为1g:20mL。

测定壳寡糖灌胃给药对小鼠肉瘤S180移植瘤的抑制效果，评价其体内杀伤肿瘤的效果及毒性。

实验方法：

一、小鼠肉瘤S180移植瘤模型的建立

生理盐水稀释S180细胞悬液，浓度为2×10¹⁰个/L。选取体重18-22g昆明小鼠30只。于小鼠右肩皮下注射细胞悬液，每只0.2mL。将小鼠随机分为3组，每组10只。

1.药物与剂量

分为阴性对照组(灌胃给以生理盐水)、低剂量组(灌胃给以壳寡糖：400mg/kg)及高剂量组(灌胃给以壳寡糖：800mg/kg)。将壳寡糖溶于无菌生理盐水中，稀释成所需浓度。

2.给药方法

于接种肿瘤细胞96h后给药，每天1次，连续给药12天，0.2mL/20g灌胃给药(i.g.)。

3.计算方法

小鼠肉瘤S180移植瘤模型使用游标卡尺测量肿瘤的直径，肿瘤直径的测量每隔2天测量一次，肿瘤体积的计算公式为：

V(mm³)＝1/2×a×b²(式中：a和b分别为肿瘤的长径和短径)

抗肿瘤活性评价指标为瘤重抑制率(WIR％)和瘤体积抑制率(VIR％)，采用下列公式计算：

WIR％＝(1-W_T/W_C)×100％(式中：W_T为治疗组瘤重，W_C为对照组瘤重)

VIR％＝(1-V_T/V_C)×100％(式中：V_T为治疗组瘤体积，V_C为对照组瘤体积)

实验结果：如附图3、4所示，与空白对照组相比，壳寡糖治疗组小鼠的瘤体积得到了有效抑制，其中高剂量组的瘤重和瘤体积与对照组有显著性差异(瘤重P<0.01；瘤体积P<0.05)，而相对体重的变化趋势与空白对照组无明显差异。具体实验结果见表2。

表2壳寡糖灌胃给药对小鼠肉瘤S180移植瘤生长的抑制效果

实施例5：本实施例壳寡糖的制备方法，具体是按照以下步骤制备的：

将壳聚糖溶解于质量浓度为3.5％的冰乙酸溶液中，然后加入壳聚糖20倍重的浓度为30％过氧化氢，升温搅拌至70℃恒温，反应8h，再经质量浓度为95％的乙醇沉淀，过滤，滤渣经过干燥，得到聚合度2～30的壳寡糖；其中壳寡糖中聚合度2～10的含量不低于80％，不包含水分含量的壳寡糖纯度>98％；壳聚糖与质量浓度为0.1～5.0％的冰乙酸溶液的质量体积比为1g:20mL。

采用小鼠残瘤模型模拟人体手术切除肿瘤后壳寡糖对肿瘤生长测定壳寡糖灌胃给药对小鼠肉瘤S180残瘤的抑制效果，评价其体内杀伤肿瘤的效果及毒性。

实验方法：

1、小鼠肉瘤S180残瘤模型的建立

生理盐水稀释S180细胞悬液，浓度为2×10¹⁰个/L。选取体重18-22g昆明小鼠21只。于小鼠右肩皮下注射细胞悬液，每只0.2mL。1周左右待肿瘤体积长至200～300mm³后，手术切除实体瘤，约剩余瘤体积为40mm³，手术当天随机分组，每组7只并当天给药。

2、药物与剂量

分为阴性对照组(灌胃给以生理盐水)、低剂量组(灌胃给以壳寡糖：200mg/kg)及高剂量组(灌胃给以壳寡糖：400mg/kg)。将壳寡糖溶于无菌生理盐水中，稀释成所需浓度。

3、给药方法

随机分组当天给药，每天1次，连续给药12天，0.2mL/20g灌胃给药(i.g.)。

4、计算方法

小鼠肉瘤S180残瘤模型使用游标卡尺测量肿瘤的直径，肿瘤直径的测量每隔2天测量一次，肿瘤体积的计算公式为：

V(mm³)＝1/2×a×b²(式中：a和b分别为肿瘤的长径和短径)

抗肿瘤活性评价指标为瘤重抑制率(WIR％)和瘤体积抑制率(VIR％)，采用下列公式计算：

WIR％＝(1-W_T/W_C)×100％(式中：W_T为治疗组瘤重，W_C为对照组瘤重)

VIR％＝(1-V_T/V_C)×100％(式中：V_T为治疗组瘤体积，V_C为对照组瘤体积)

实验结果：如附图5、6所示，与空白对照组相比，壳寡糖治疗组小鼠的瘤体积得到了有效抑制，其中高剂量组的瘤重与对照组有显著性差异(P<0.05)，而相对体重的变化趋势与空白对照组无明显差异。具体实验结果见表3。

表3壳寡糖灌胃给药对小鼠肉瘤S180残瘤的抑制效果

实施例6：本实施例壳寡糖的制备方法，具体是按照以下步骤制备的：

将壳聚糖溶解于质量浓度为3.5％的冰乙酸溶液中，然后加入壳聚糖20倍重的浓度为30％过氧化氢，升温搅拌至70℃恒温，反应8h，再经质量浓度为95％的乙醇沉淀，过滤，滤渣经过干燥，得到聚合度2～30的壳寡糖；其中壳寡糖中聚合度2～10的含量不低于80％，不包含水分含量的壳寡糖纯度>98％；壳聚糖与质量浓度为0.1～5.0％的冰乙酸溶液的质量体积比为1g:20mL。

采用小鼠残瘤模型模拟人体手术切除肿瘤后壳寡糖对肿瘤生长测定壳寡糖腹腔注射给药对小鼠肉瘤S180残瘤的抑制效果，评价其体内杀伤肿瘤的效果及毒性。

实验方法：

1、小鼠肉瘤S180残瘤模型的建立

生理盐水稀释S180细胞悬液，浓度为2×10¹⁰个/L。选取体重18-22g昆明小鼠30只。于小鼠右肩皮下注射细胞悬液，每只0.2mL。1周左右待肿瘤体积长至200～300mm³后，手术切除实体瘤，约剩余瘤体积为40mm³，手术当天随机分组，每组10只并当天给药。

2、药物与剂量

分为阴性对照组(腹腔注射给以生理盐水)、阳性对照组(腹腔注射给以黄芪多糖：250mg/kg)、低剂量组(腹腔注射给以壳寡糖：50mg/kg)及高剂量组(腹腔注射给以壳寡糖：250mg/kg)。将黄芪多糖或壳寡糖溶于无菌生理盐水中，稀释成所需浓度。

3、给药方法

随机分组当天给药，隔天1次，连续给药11天，0.2mL/20g腹腔注射给药(i.p.)

4、计算方法

小鼠肉瘤S180残瘤模型使用游标卡尺测量肿瘤的直径，肿瘤直径的测量每隔2天测量一次，肿瘤体积的计算公式为：

V(mm³)＝1/2×a×b²(式中：a和b分别为肿瘤的长径和短径)

抗肿瘤活性评价指标为瘤重抑制率(WIR％)和瘤体积抑制率(VIR％)，采用下列公式计算：

WIR％＝(1-W_T/W_C)×100％(式中：W_T为治疗组瘤重，W_C为对照组瘤重)

VIR％＝(1-V_T/V_C)×100％(式中：V_T为治疗组瘤体积，V_C为对照组瘤体积)

表4壳寡糖灌胃给药对小鼠肉瘤S180残瘤的抑制效果

实验结果：如附图7、8所示，与空白对照组相比，壳寡糖腹腔注射治疗组小鼠的瘤体积得到了有效抑制，其中低剂量组的瘤重、瘤体积与对照组有显著性差异(瘤重P<0.05；瘤体积P<0.01)，而相对体重的变化趋势与空白对照组无明显差异。具体实验结果见表4。

综上所述，在相同测试浓度范围内本发明的壳寡糖对HCT-116和A549的杀伤能力均高于市售壳寡糖；在相同测试浓度范围内阳性药5-氟尿嘧啶对十种不同来源的人源肿瘤细胞系的半数抑制浓度变化范围为0.04±0.01～12.1±3.0μg/mL，本发明制备的壳寡糖对肿瘤细胞系的半数抑制浓度变化范围为48.6±7.0～1329.9±93.4μg/mL。壳寡糖对于十种不同来源的人源肿瘤细胞系的最大抑制率均可达到90％以上，甚至高达95％。本发明制备的壳寡糖体内外杀伤肿瘤的效果好。

Claims (4)

1.一种壳寡糖的用途，其特征在于它用于制备抑制5种人源肿瘤的10株肿瘤细胞的药物；

所述的5种人源肿瘤为胃癌、肾癌、肺癌、乳腺癌和结肠癌；

所述的10株肿瘤细胞为胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901、肾癌细胞系KCC-853和786-O、肺癌细胞系A549和NCI-H460、乳腺癌细胞系MCF-7和Bcap-37、结肠癌细胞系HCT-116和HT-29；

该壳寡糖的制备方法是按照以下步骤进行的：

将壳聚糖溶解于质量浓度为3.5%的冰乙酸溶液中，然后加入壳聚糖20倍重的浓度为30%过氧化氢，升温搅拌至40~90℃恒温， 反应0.5~10 h，再经质量浓度为60~100%的乙醇沉淀，过滤，滤渣经过干燥，得到聚合度2~30的壳寡糖；其中壳寡糖中聚合度2~10的含量不低于80%，不包含水分含量的壳寡糖纯度>98%；壳聚糖与质量浓度为3.5%的冰乙酸溶液的质量体积比为1 g:(10~30) mL；所述的药物的给药方式为隔天腹腔注射给药，给药剂量为4mg/kg。

2.根据权利要求1所述的一种壳寡糖的用途，其特征在于，加入过氧化氢后，升温搅拌至70℃恒温，反应8 h。

3.根据权利要求1所述的一种壳寡糖的用途，其特征在于，所述的乙醇的质量浓度为95%。

4.根据权利要求1所述的一种壳寡糖的用途，其特征在于，所述的干燥的方法为冷冻干燥。