CN105085631A

CN105085631A - 一种特异靶向her2蛋白的多肽及其应用

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Publication number: CN105085631A
Application number: CN201510583724.8A
Authority: CN
Inventors: 耿令令; 方巧君
Original assignee: National Center for Nanosccience and Technology China
Current assignee: National Center for Nanosccience and Technology China
Priority date: 2015-09-14
Filing date: 2015-09-14
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2035-09-14
Also published as: CN105085631B

Abstract

本发明涉及一种特异靶向HER2(人表皮生长因子受体2)蛋白的多肽及其应用，所述多肽如以下通式所示：X₁X₂X₃X₄X₅LX₆X₇X₈NPX₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃；本发明还涉及一种编码多肽的核苷酸序列，以及表达该多肽的表达载体及宿主细胞；本发明还涉及了该多肽、其形成的二价体或多价体及其作为靶向多肽与能杀伤癌细胞的制剂和显像制剂形成的药物组合物及其用途，本发明所述多肽能对HER2阳性肿瘤细胞起靶向作用，选择性强，且本发明涉及的肽可以采用化学合成的方法制备得到，其纯度高、分子量小、特异性强、无免疫原性及安全可靠。

Description

一种特异靶向HER2蛋白的多肽及其应用

技术领域

本发明涉及药物化学领域，具体涉及一种多肽，尤其涉及一种特异靶向HER2蛋白的多肽及其应用。

背景技术

癌症是全球一个主要死亡原因，数据显示：2012年全球新增约1410万例癌症病例，癌症死亡人数达820万，与之相比，2008年的数据分别为1270万和760万。世界范围内诊断的最常见癌症依次为肺癌(180万，13％)、乳腺癌(170万，11.9％)和结直肠癌(140万，9.7％)，最主要致死癌症为肺癌(160万，19.4％)、肝癌(80万，9.1％)和胃癌(70万，8.8％)。国际癌症研究机构根据现有数据预计，由于全球人口增长和老龄化，到2025年前，全球每年新增癌症病例数将高达1930万例。2012年，全球总数的一半以上癌症新增病例和癌症死亡人数发生在欠发达地区，分别为56.8％和64.9％。

目前恶性肿瘤的治疗方法主要有手术治疗、化疗、放疗三种，其中化疗是近年来在肿瘤治疗中发展最快的方法。但是化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也杀伤了人体正常细胞，毒副作用大。因此，靶向抗肿瘤药物及分子探针研究势在必行。

癌症靶向治疗成功的前提是找准治疗的靶点。HER2(人表皮生长因子受体2，又名ErbB2)蛋白是一个185kDa的跨膜糖蛋白受体酪氨酸激酶，定位于细胞膜，具有胞外配体结合区，单跨膜区和胞内酪氨酸激酶活性区。HER2参与信号转导途径，激活后引起磷酸化激酶级联反应，导致细胞生长和分化。乳腺癌、卵巢癌，胃癌和子宫等多种肿瘤中都有HER2的过度表达。HER2已经成为治疗癌症的重要靶标。

多肽易于大量合成，分子量小，组织渗透性强，同时可防止网状内皮***的非特异性摄取。此外，多肽可被化学改性以改变其亲和力、电荷、疏水性、稳定性和溶解性，可通过反复的优化修改在体内使用。在肿瘤靶向疗法中，多肽类药物及诊断探针显示出很强的优越性，是抗体的一种有吸引力的替代物。在应用方面，多肽与放射性核素的配合，可作为探针应用于分子成像；一些天然存在的多肽已被用作输送剂；生殖激素的肽和它们的衍生物可用于肿瘤靶向治疗。因此高效率发现有价值的活性多肽已成为癌症诊断与治疗面临的重要任务。

CN104130315A公开了一种特异靶向HER2(人表皮生长因子受体2)蛋白的多肽，所述多肽如以下通式所示：X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇RX₈YWX₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇RX₁₈X₁₉X₂₀X₂₁YX₂₂，能对HER2阳性细胞起靶向作用。尽管其公开了该多肽用于治疗癌症具有靶向作用，然而，其与HER2结合的相互作用不够高，且靶向作用也相对较差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多肽，一种特异靶向HER2蛋白的多肽及其应用，特别是由该肽所衍生的且能与HER2蛋白结合的产品及上述多肽或其衍生产品在制备靶向HER2抗肿瘤药物或显像制剂中的用途。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种靶向HER2蛋白的肽，其氨基酸序列通式为：X₁X₂X₃X₄X₅LX₆X₇X₈NPX₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃

上述肽链中单字母符号代表的氨基酸残基定义如下：L为亮氨酸，N为天冬酰胺，P为脯氨酸，X_1-13为可变的氨基酸残基。

作为优选技术方案，X₁是带电荷氨基酸残基，优选为赖氨酸或天冬氨酸；X₂是极性氨基酸残基，优选为赖氨酸、苏氨酸或酪氨酸；X₃是芳香族或脂肪族氨基酸残基，优选为苯丙氨酸或异亮氨酸；X₄是芳香性或杂环氨基酸残基，优选为酪氨酸或脯氨酸；X₅是芳香性或杂环氨基酸残基，优选为酪氨酸或脯氨酸；X₆是脂肪族氨基酸残基，优选为甘氨酸或丙氨酸；X₇是脂肪族或芳香族氨基酸残基，优选为亮氨酸、酪氨酸或色氨酸；X₈是芳香族氨基酸残基，优选为酪氨酸或色氨酸；X₉是极性氨基酸残基，优选为苏氨酸或天冬酰胺；X₁₀是极性氨基酸残基，优选为苏氨酸或谷氨酸；X₁₁是芳香族氨基酸残基，优选为酪氨酸或色氨酸；X₁₂是芳香性或极性氨基酸残基，优选为苯丙氨酸、精氨酸或谷氨酰胺；X₁₃是芳香性或极性氨基酸残基，优选为酪氨酸、赖氨酸或谷氨酰胺。

本发明中，所述多肽来源为基于HER2同源蛋白EGFR的多肽序列DTCPPLMLYNPTTYQM而建立的库容量为2×10⁵的多肽文库：

EGFR的多肽序列DTCPPLMLYNPTTYQM是形成EGFR-EGFR二聚体，及EGFR-HER2异二聚体的关键位点，与HER2蛋白胞外区第II结构域相结合。本发明所述多肽与HER2胞外区第II结构域相结合，所述多肽能特异结合人HER2高表达阳性乳腺癌细胞，且结合率在99％以上。

作为优选技术方案，本发明所述肽的氨基酸序列选自SEQIDNO.1-SEQIDNO.59之一所示的氨基酸序列。

氨基酸序列：

SEQ ID NO.1	DTFPYLGWWNPNEYRY
		SEQ ID NO.2	KTIYYLGYYNPNEYRY
SEQ ID NO.3	DYIPYLAYYNPNTYFQ
		SEQ ID NO.4	KKIPYLGWWNPTTWQQ
SEQ ID NO.5	DKFPYLALYNPTTWRQ
		SEQ ID NO.6	DKFPYLALYNPTTYFY
SEQ ID NO.7	DKFYPLGYYNPTEWFQ
		SEQ ID NO.8	DKFYYLAYWNPNEYRQ
SEQ ID NO.9	DTFPPLGWWNPTTWFY
		SEQ ID NO.10	DKFPPLGLYNPNEYFY
SEQ ID NO.11	DTFYYLAWWNPNEWRQ
		SEQ ID NO.12	DTFYYLGYWNPTTYRQ
SEQ ID NO.13	DTIYYLAWWNPTTWFY
		SEQ ID NO.14	DYFPPLGWYNPTTWFY
SEQ ID NO.15	DYFPPLGYYNPNEWQY
		SEQ ID NO.16	DYFPYLAWWNPNEWQQ
SEQ ID NO.17	DYFPYLAYWNPNEWQY
		SEQ ID NO.18	DYFPYLAYWNPNTWRY
SEQ ID NO.19	DYFPYLGLYNPNEWFY
		SEQ ID NO.20	DYFYYLAWWNPNEYFQ
SEQ ID NO.21	DYFYYLAWWNPTTWFQ
		SEQ ID NO.22	DYFYYLGYWNPNEYFY

SEQ ID NO.23	DYIPPLALWNPNEYFY
		SEQ ID NO.24	DYIPYLALWNPTTYFQ
SEQ ID NO.25	DKFPYLALWNPTTYFQ
		SEQ ID NO.26	DYIPYLAYYNPTEYFQ
SEQ ID NO.27	DYIYYLGLWNPTEYQQ
		SEQ ID NO.28	DYIYYLGLWNPTTWFY
SEQ ID NO.29	DYIYYLGYWNPTEWRK
		SEQ ID NO.30	DYIYYLGYYNPTTYQQ
SEQ ID NO.31	KKFPPLALYNPNTWFQ
		SEQ ID NO.32	KKFPPLGYYNPTEYRY
SEQ ID NO.33	KKFPYLAYWNPTTYRY
		SEQ ID NO.34	KKFPYLGYYNPTEYRQ
SEQ ID NO.35	KKFYPLGWWNPNEWRY
		SEQ ID NO.36	KKFYYLGYWNPNEWQY
SEQ ID NO.37	KKFYYLGYWNPNEWRQ
		SEQ ID NO.38	KKFYYLGYWNPNTWFQ
SEQ ID NO.39	KKIPPLAYYNPNTWFY
		SEQ ID NO.40	KKIPPLGWWNPNTWRY
SEQ ID NO.41	KKIPYLAWWNPTTYRQ
		SEQ ID NO.42	KKIPYLAYYNPNTWQQ
SEQ ID NO.43	DKFPYLALYNPTEWQQ
		SEQ ID NO.44	KKIYYLALWNPTEYRY

SEQ ID NO.45	KKIYYLAWWNPTEYFQ
		SEQ ID NO.46	KKIYYLGYYNPNEWRQ
SEQ ID NO.47	KKIYYLGYYNPTEWRQ
		SEQ ID NO.48	KTFYYLGWWNPNEWRQ
SEQ ID NO.49	KTFYYLGYWNPNEWQY
		SEQ ID NO.50	KTIPYLAWWNPNTWFQ
SEQ ID NO.51	DKFPPLGYWNPTTWQQ
		SEQ ID NO.52	KYFPPLGWWNPNTYQY
SEQ ID NO.53	KYFPPLGYWNPNTWQY
		SEQ ID NO.54	KYFPYLGWWNPTTWQY
SEQ ID NO.55	KYFYYLAYWNPTTYRQ
		SEQ ID NO.56	KYFYYLGLWNPNEWFQ
SEQ ID NO.57	KYIPPLAWWNPTEYQY
		SEQ ID NO.58	KYIPPLGWWNPTEYRY
SEQ ID NO.59	KYIYYLALYNPNTWRY

第二方面，本发明还提供了一种DNA片段，其包含编码上述本发明通式的肽的氨基酸序列。

作为优选技术方案，所述DNA片段包含编码所述本发明如SEQIDNO.1-SEQIDNO.59之一所示的肽的氨基酸序列。

第三方面，本发明还提供了一种表达载体，包括至少一个拷贝的编码氨基酸序列为通式所示肽的本发明第二方面所述的DNA片段。

作为优选技术方案，本发明的表达载体，包括至少一个拷贝的编码氨基酸序列为SEQIDNO.1-SEQIDNO.59所示肽的本发明第二方面所述的DNA片段。

第四方面，本发明还提供了一种原核或真核宿主细胞，该宿主细胞含有如本发明第三方面所述的表达载体。

第五方面，本发明还提供了一种二价体或多价体，由本发明第一方面的通式1所述肽及SEQIDNO.1-SEQIDNO.59所述肽组装而成。

如上所述的二价体或多价体是具有靶向HER2阳性的肿瘤细胞的特性并对肿瘤细胞具有杀伤力。

作为优选技术方案，本发明的二价体或多价体是通过连接分子和/或聚合物共价连接形成或通过与连接分子和/或聚合物混合，非共价连接形成的。

优选地，所述多聚体为聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、环糊精、聚酰胺-胺型树枝状高分子(PAMAM)、聚乳酸(PLA)或聚乳酸-乙醇胺(PLGA)中的任意一种或至少两种的混合。

第六方面，本发明还进一步提供了一种药物组合物，包括本发明第一方面的氨基酸序列为通式所述肽、如SEQIDNO.1-SEQIDNO.59之一所述的肽或所述肽的二价体或多价体作为靶向多肽，和能杀伤癌细胞的制剂。

作为优选技术方案，本发明所述肽、二价体或多价体作为靶向多肽，与能杀伤癌细胞的制剂相缀合或混合。

优选地，所述的制剂为能杀伤癌细胞的化学药物、生物药物、纳米药物、放射性药物、光热治疗或光动力治疗药物或包裹这些药物的载体中的任意一种；

进一步优选地，所述的制剂为烷化剂、抗代谢药物、抗肿瘤天然药物、抗肿瘤抗生素、激素及金属络合物或肿瘤放射靶向标记物中的任意一种。

进一步优选地，所述载体为纳米材料，脂质体或油性化合物中的任意一种，或者由多种油性化合物所组成的混合物。

本发明采用将通式如SEQIDNO.1-SEQIDNO.59之一所述肽、及所述肽的二价体或多价体和纳米材料、脂质体等高分子材料缀合，本发明涉及的肽、二价体或多价体可以使缀合后生成的化合物在机体内更稳定地被运输到靶细胞。本发明涉及的肽、二价体或多价体也可以和油性化合物或多种油性化合物的混合物相混合，本发明涉及的肽也可以使所得到的混合物在机体内更稳定地被运输到靶细胞。

第七方面，本发明还进一步提供了另外一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明第一方面的氨基酸序列为通式所述肽、SEQIDNO.1-SEQIDNO.59所述的肽或所述肽的二价体或多价体；和显像制剂。

优选地，所述肽、二价体或多价体与显像制剂相缀合或混合。

优选地，所述的显像制剂为放射性核素、放射性核素标记物或分子影像制剂中的任意一种。

第八方面，本发明还提供了本发明第一方面的氨基酸序列为通式所述肽、SEQIDNO.1-SEQIDNO.59所述的肽或所述肽的二价体或多价体在制备用于治疗、预防或诊断癌症的药物或显像制剂中的用途。

作为优选技术方案，本发明所述癌症为HER2过表达的癌症。

优选地，所述癌症为乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、白血病、膀胱癌或子***。

本发明所述的肽具有靶向HER2蛋白的作用，可以作为靶头增加药物或载有药物的载体如纳米材料、脂质体等在HER2阳性细胞中的含量，再添加药学上可接受的辅料或佐剂制成新型的更有效的靶向抗癌药物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的多肽能对HER2阳性细胞起靶向作用，选择性强，且本发明的多肽可以采用化学合成的方法制备得到，纯度高，分子量小，特异性强，无免疫原性，安全可靠；

(2)本发明的多肽能结合人HER2阳性乳腺癌细胞，结合率皆在99％以上，与HER2低表达人胚肾正常细胞293A细胞的结合作用甚微，表明本发明肽作为特异靶向HER2的多肽，对HER2有选择性结合作用；

(3)本发明的多肽具有靶向HER2阳性肿瘤细胞的特性，还具有对肿瘤细胞具有杀伤力的特性，作为靶向多肽，可用于肿瘤的靶向治疗或靶向肿瘤的分子成像与诊断。

附图说明

图1(A)为流式细胞学方法检测对照组0.01mMPBS对人HER2阳性乳腺癌细胞(SKBR3细胞系)的作用信号；图1(B)为流式细胞学方法检测异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗HER2抗体对人HER2阳性乳腺癌细胞(SKBR3细胞系)的结合作用；图1(C)为流式细胞学方法检测异硫氰酸荧光素(FITC)标记的SEQIDNO.1对人HER2阳性乳腺癌细胞(SKBR3细胞系)的结合作用；图1(D)为流式细胞学方法检测异硫氰酸荧光素(FITC)标记的SEQIDNO.2对人HER2阳性乳腺癌细胞(SKBR3细胞系)的结合作用；图1(E)为流式细胞学方法检测异硫氰酸荧光素(FITC)标记的SEQIDNO.3对人HER2阳性乳腺癌细胞(SKBR3细胞系)的结合作用；图1(F)为流式细胞学方法检测异硫氰酸荧光素(FITC)标记的SEQIDNO.4对人HER2阳性乳腺癌细胞(SKBR3细胞系)的结合作用；图1(G)为结合率直方图。

图2(A)为流式细胞学方法检测对照组0.01mMPBS对人HER2阴性胚肾正常细胞(293A细胞系)的作用信号；图2(B)为流式细胞学方法检测FITC标记的抗HER2抗体对人HER2阴性胚肾正常细胞(293A细胞系)的结合作用；图2(C)为流式细胞学方法检测FITC标记的SEQIDNO.1对人HER2阴性胚肾正常细胞(293A细胞系)的结合作用；图2(D)为流式细胞学方法检测FITC标记的SEQIDNO.2对人HER2阴性胚肾正常细胞(293A细胞系)的结合作用；图2(E)流式细胞学方法检测FITC标记的为SEQIDNO.3对人HER2阴性胚肾正常细胞(293A细胞系)的结合作用；图2(F)为流式细胞学方法检测FITC标记的SEQIDNO.4对人HER2阴性胚肾正常细胞(293A细胞系)的结合作用；图2(G)为结合率直方图。

图3为免疫荧光方法检测FITC标记的SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4分别对人HER2阳性乳腺癌细胞(SKBR3细胞系)的结合作用；

其中，细胞核用hoechst试剂染色；A-D是SEQIDNO.1多肽和hoechst处理过的细胞，其中A为SEQIDNO.1多肽的结合位点，主要存在于细胞膜，B为细胞核，C为明视野整个细胞，D为A-C的叠合图；E-H是SEQIDNO.2多肽和hoechst处理过的细胞，其中E为SEQIDNO.2多肽的结合位点，主要存在于细胞膜，F为细胞核，G为明视野整个细胞，H为E-G的叠合图；I-L是SEQIDNO.3多肽和hoechst处理过的细胞，其中I为SEQIDNO.3多肽的结合位点，主要存在于细胞膜，J为细胞核，K为明视野整个细胞，L为I-K的叠合图；M-P是SEQIDNO.4多肽和hoechst处理过的细胞，其中M为SEQIDNO.4多肽的结合位点，主要存在于细胞膜，N为细胞核，O为明视野整个细胞，P为M-O的叠合图。

图4为免疫荧光方法检测FITC标记的SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4分别对人HER2阴性胚肾正常细胞(293A细胞系)的结合作用；

其中，细胞核用hoechst试剂染色；A-D是SEQIDNO.1多肽和hoechst处理过的细胞，其中A为SEQIDNO.1多肽的结合位点，B为细胞核，C为明视野整个细胞，D为A-C的叠合图；E-H是SEQIDNO.2多肽和hoechst处理过的细胞，其中E为SEQIDNO.2多肽的结合位点，F为细胞核，G为明视野整个细胞，H为E-G的叠合图；I-L是SEQIDNO.3多肽和hoechst处理过的细胞，其中I为SEQIDNO.3多肽的结合位点，J为细胞核，K为明视野整个细胞，L为I-K的叠合图；M-P是SEQIDNO.4多肽和hoechst处理过的细胞，其中M为SEQIDNO.4多肽的结合位点，N为细胞核，O为明视野整个细胞，P为M-O的叠合图。

图5(A)为表面等离子共振(SPR)方法检测SEQIDNO.1对不同浓度的人HER2蛋白的结合作用；图5(B)为表面等离子共振(SPR)方法检测SEQIDNO.2对不同浓度的人HER2蛋白的结合作用；图5(C)为表面等离子共振(SPR)方法检测SEQIDNO.3对不同浓度的人HER2蛋白的结合作用；图5(D)为表面等离子共振(SPR)方法检测SEQIDNO.4对不同浓度的人HER2蛋白的结合作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本领域技术人员应该理解的是，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

实施例1本发明多肽的合成

1)实验仪器与材料

二甲基甲酰胺(DMF)，哌啶，树脂，二氯甲烷(DCM)，茚三酮反应试剂(茚三酮，维C，苯酚)，四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，六氢吡啶(哌啶)，三异丙基硅烷(TIS),乙二硫醇(EDT)，无水***，三氟乙酸(TFA)，N-甲基吗啉(NMM)，甲醇，各种氨基酸，多肽固相合成管。

2)溶液配制

脱保护液——六氢吡啶：DMF＝1：4

反应液——NMM:DMF＝1：24

裂解液——TFA(92.5％)、TIS(2.5％)、EDT(2.5％)、H₂O(2.5％)

茚三酮测试液——茚三酮：维C：苯酚＝1：1：1

3)实验步骤

称量树脂并投入到多肽固相合成管(以下简称反应器)中，加入适量的DMF溶胀半小时以上。抽掉DMF，用脱保护液进行Fmoc去保护反应，置于摇床上10分钟。抽掉去保护液，用DMF、DCM洗涤3次，从反应器中取少量树脂(约5～10mg)于试管中，用乙醇洗涤2次，茚三酮法检测并记录颜色，准备投料，进入氨基酸缩合反应。分别按照SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4肽的氨基酸序列顺序取相应氨基酸、HBTU(氨基酸：HBTU＝1:1)，用反应液溶解，投入到反应器中，搅拌反应。1-2小时后，从反应器中取少量树脂于试管中，用乙醇洗涤2次，茚三酮法检测。抽掉反应器中的液体，用DMF、DCM各洗涤2次，得到第一个氨基酸缩合后的肽树脂。对所得肽树脂重复进行以上“Fmoc去保护——氨基酸缩合”反应步骤，至最后一个氨基酸反应完毕，得到序列号为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4的肽。反应完毕后，DMF、DCM各洗涤树脂2-3次，甲醇洗两次，继续抽干15-20分钟。反应器中取出合成完的部分肽树脂，在室温下于裂解液(裂解液先冰浴20分钟)中裂解两小时。将树脂过滤后，于旋蒸仪蒸干，用无水***(冰浴)洗3次。粗肽使用制备型反相HPLC纯化，使用HPLC检测纯度>90％。所得到的纯肽使用质谱(MS,electrospray)鉴定。

至最后一个肽合成后，取出部分肽树脂加异硫氰酸荧光素(FITC)荧光标记。先将Fmoc-e-Acp-OH按氨基酸偶联方法链接在多肽上，再取适量HBTU与FITC溶于荧光偶联溶剂中，3—5小时后，茚三酮测溶液测试。标记成功后采用上述同样的方法进行裂解、纯化与鉴定。

SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4肽的有关理化性状如表1和表2所示。

表1

表2

实验例1流式细胞学方法检测SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4分别对人HER2阳性乳腺癌细胞的结合作用

一、实验方法

收集人乳腺癌HER2高表达细胞株SKBR3，悬浮于含10％热灭活胎牛血清的RPMI1640培养液中，细胞密度在1x10⁶/mL左右，分装于四个1.5mL的EP管中，200μL/管。分别加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4和抗HER2抗体(ebioscience)，最终浓度为50μM/L，对照组用与多肽等量的0.01mMPBS(磷酸缓冲液pH7.4)代替多肽。避光冰浴孵育30分钟后，1000g离心4分钟收集细胞，加入1mLPBS清洗，重复清洗3次后，加入500μLPBS，混匀，使用流式细胞学方法检测荧光强度及结合比率。

二、实验结果

由图1可以看出，SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4肽可结合人HER2高表达乳腺癌细胞，且结合率皆在99％以上，说明本发明的肽单独使用对HER2阳性肿瘤细胞有亲和作用，可以作为靶向HER2的多肽使用。

实验例2流式细胞学方法检测SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4分别对人HER2阴性胚肾正常细胞的结合作用

一、实验方法

收集人胚肾HER2低表达细胞株293A，悬浮于含10％热灭活胎牛血清的H-DMEM培养液中，细胞密度在1x10⁶/mL左右，分装于四个1.5mLEP管中。200μL/管。分别加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、抗HER2抗体(ebioscience)，最终浓度为50μMol/L，对照组用与多肽等量的0.01mMPBS(磷酸缓冲液pH7.4)代替多肽。避光冰浴孵育30分钟后，1000g离心4分钟收集细胞，加入1mLPBS清洗，重复清洗3次后，加入500μLPBS，混匀，使用流式细胞学方法检测荧光强度及结合比率。

二、实验结果

由图2可以看出，SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4肽与HER2低表达人胚肾正常细胞293A细胞的结合作用甚微，说明本发明的肽对HER2有选择性结合作用，可以作为特异靶向HER2的多肽使用。

实验例3免疫荧光方法检测SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4分别对人HER2阳性乳腺癌细胞的结合作用

一、实验方法

将人乳腺癌HER2高表达细胞株SKBR3悬浮于含10％热灭活胎牛血清的RPMI1640培养液中，以3000-5000个/皿的密度接种于三个confocol小皿中。培养24小时后，吸净小皿中的培养基，然后分别加入含有异硫氰酸荧光素(FITC)标记的50μMol/L的SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4多肽的培养基200μL，对照组用含与多肽等量的PBS(磷酸缓冲液pH7.4)的培养基，细胞核用hoechst试剂染色，使用按照1：200稀释。避光冰浴孵育30分钟。PBS清洗，重复洗3次后，加入200μLPBS，使用激光共聚焦显微镜观测荧光信号。

二、实验结果

由图3可以看出，SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4肽可作用于人HER2阳性乳腺癌细胞的表面，说明本发明的肽单独使用对HER2阳性肿瘤细胞有结合作用，可以作为靶向HER2的多肽使用。

实验例4免疫荧光方法检测SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4分别对人HER2阴性胚肾正常细胞的结合作用

一、实验方法

将HER2阴性人胚肾正常细胞株293A悬浮于含10％热灭活胎牛血清的H-DMEM培养液中，以3000-5000个/皿的密度接种于三个confocol小皿中。培养24小时后，吸净小皿中的培养基，然后分别加入含有异硫氰酸荧光素(FITC)标记的50μMol/L的SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4多肽的培养基200μL，对照组用含与多肽等量的PBS(磷酸缓冲液pH7.4)的培养基，细胞核用hoechst试剂染色，使用按照1：200稀释。避光冰浴孵育30分钟。PBS清洗，重复洗3次后，加入200μLPBS，使用激光共聚焦显微镜观测荧光信号。

二、实验结果

由图4可以看出，SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4肽与人HER2阴性胚肾正常细胞没有结合，说明本发明的肽对HER2阳性肿瘤细胞是选择性特异性结合的，可以作为特异靶向HER2的多肽使用。

实验例5表面等离子共振(SPR)方法检测SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4分别对人HER2蛋白的亲和力

一、实验方法

将1mg/mL的SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4肽及0.01mMPBS点到芯片上，在4℃湿润条件下孵育过夜，然后用0.1mMPBS清洗十分钟，0.01mMPBS清洗十分钟，最后用去离子水清洗十分钟，并重复一次，浸入含5％牛奶的0.01mMPBS中，4℃条件下孵育过夜，然后用0.1mMPBS清洗十分钟，0.01mMPBS清洗十分钟，最后用去离子水清洗十分钟，并重复一次，用氮气吹干，上机。流动相依次通过1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL的人HER2蛋白，记录分析SPR信号。

二、实验结果

由图5可以看出，SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4肽的SPR信号随着人HER2蛋白浓度的增加逐渐增强，根据SPR结果计算得出SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4多肽对HER2蛋白的解离常数K_D值分别为：1.86×10^-8M/L、8.12×10^-8M/L、9.06×10^-8M/L、2.67×10^-7M/L，说明本发明的多肽对HER2有强结合作用，可以作为靶向HER2的多肽使用。

实验例1-5的结果表明，在细胞水平上，流式细胞学和免疫荧光技术两种实验测试均显示SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4多肽是特异与HER2阳性的乳腺癌细胞结合，且结合于有HER2蛋白表达的细胞膜表面，而与HER2阴性的胚肾正常细胞没有明显结合；在分子水平上，表面等离子共振(SPR)实验也同样证实了SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4多肽均与HER2蛋白有强的结合作用，且随着HER2蛋白浓度的提高，结合信号越强。

从实验例1-5可以得出，本发明的多肽具有靶向HER2阳性肿瘤细胞的特性，因而在实际应用中，可以将本发明的肽作为靶向多肽，与能杀伤癌细胞的制剂相缀合或混合，用于肿瘤的靶向治疗，或可与显影剂相缀合或混合，用于靶向肿瘤的分子成像与诊断。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种特异靶向HER2蛋白的肽，其特征在于，所述多肽的通式为：

X₁X₂X₃X₄X₅LX₆X₇X₈NPX₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃

其中，L为亮氨酸，N为天冬酰胺，P为脯氨酸，X_1-13为可变的氨基酸残基；

优选地，X₁是带电荷氨基酸残基，优选为赖氨酸或天冬氨酸；X₂是极性氨基酸残基，优选为赖氨酸、苏氨酸或酪氨酸；X₃是芳香族或脂肪族氨基酸残基，优选为苯丙氨酸或异亮氨酸；X₄是芳香性或杂环氨基酸残基，优选为酪氨酸或脯氨酸；X₅是芳香性或杂环氨基酸残基，优选为酪氨酸或脯氨酸；X₆是脂肪族氨基酸残基，优选为甘氨酸或丙氨酸；X₇是脂肪族或芳香族氨基酸残基，优选为亮氨酸、酪氨酸或色氨酸；X₈是芳香族氨基酸残基，优选为酪氨酸或色氨酸；X₉是极性氨基酸残基，优选为苏氨酸或天冬酰胺；X₁₀是极性氨基酸残基，优选为苏氨酸或谷氨酸；X₁₁是芳香族氨基酸残基，优选为酪氨酸或色氨酸；X₁₂是芳香性或极性氨基酸残基，优选为苯丙氨酸、精氨酸或谷氨酰胺；X₁₃芳香性或极性氨基酸残基，优选为酪氨酸、赖氨酸或谷氨酰胺。

2.根据权利要求1所述的肽，其特征在于，所述肽的氨基酸序列选自SEQIDNO.1-SEQIDNO.59之一所示的氨基酸序列。

3.一种DNA片段，其特征在于，其包含编码权利要求1-2任一项所述肽的核苷酸序列。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个拷贝的如权利要求3所述的DNA片段。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求4所述的表达载体。

6.根据权利要求1-2任一项所述的肽形成的二价体或多价体，其特征在于，所述的二价体或多价体具有靶向HER2阳性肿瘤细胞的特性并对对肿瘤细胞具有杀伤力；

优选地，所述的二价体或多价体是通过连接分子和/或聚合物共价连接形成的；

优选地，所述的二价体或多价体是通过与连接分子和/或聚合物混合，非共价连接形成的；

7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-2中任一项所述的肽和能杀伤癌细胞的制剂；

优选地，所述药物组合物包括权利要求6所述的二价体或多价体和能杀伤癌细胞的制剂；

优选地，所述肽、二价体或多价体作为靶向多肽，与能杀伤癌细胞的制剂相缀合或混合；

进一步优选地，所述的制剂为烷化剂、抗代谢药物、抗肿瘤天然药物、抗肿瘤抗生素、激素、金属络合物或肿瘤放射靶向标记物中的任意一种；

进一步优选地，所述载体为纳米材料，脂质体或油性化合物中的任意一种，或由多种油性化合物所组成的混合物。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-2任一项所述的肽和显像制剂；

优选地，所述药物组合物包括权利要求6所述的二价体或多价体和显像制剂；

优选地，所述肽、二价体或多价体与显像制剂相缀合或混合；

9.权利要求1-2中任一项或权利要求6所述的肽、二价体或多价体在制备用于治疗、预防或诊断癌症的药物或显像制剂中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述癌症为HER2过表达的癌症；

优选地，所述癌症为乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、白血病、膀胱癌或子***或鼻咽癌中的任意一种。