CN105330725B - 一种pH响应且靶向人肿瘤血管标记物VEGFR2的多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种pH响应且特异靶向人肿瘤血管标记物VEGFR2的多肽和该多肽所衍生的且能与VEGFR2蛋白结合的产品以及上述多肽或其衍生的产品在制备抗肿瘤药物或显像制剂中的应用。所述多肽的氨基酸序列通式为：CX₁X₂DX₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁LSX₁₂GM。所述多肽能对VEGFR2阳性细胞起靶向作用，具有pH响应，选择性强，可以作为靶头增加药物或载有药物的载体如纳米材料、脂质体等在VEGFR2阳性细胞中的含量，再添加药学上可接受的辅料或佐剂制成新型的更有效的靶向抗癌药物。且本发明提供的多肽易被化学改性调整其亲和力、电荷、亲疏水性、稳定性和溶解性，还可以采用化学合成的方法制备得到，纯度高，分子量小，特异性强，无免疫原性，安全可靠。

Description

一种pH响应且靶向人肿瘤血管标记物VEGFR2的多肽及其应用

技术领域

本发明涉及特异性靶向多肽，具体地说，涉及一种pH响应且特异靶向人肿瘤血管标记物VEGFR2的多肽及其应用。

背景技术

肿瘤血管的形成是肿瘤细胞诱导的微血管生长以及肿瘤中血液循环建立的过程。当肿瘤体积达到1mm³时，肿瘤呈现出血管生成表型并从周围基质补充血管。实体瘤的发生、生长和浸润与转移都响应于肿瘤内新生血管形成，为其提供氧及营养物质，已满足代谢生长需要。肿瘤的微环境使得pH由7.4逐渐变成5.5～7.4。

随着对肿瘤发生机制研究的不断深入，肿瘤血管形成在肿瘤发展中的重要地位及抗血管生成***的作用成为肿瘤治疗的一个全新的领域。因此目前，针对新生血管生成的肿瘤靶向治疗成为目前恶性实体瘤研究的热点。

VEGF是高度特异的血管内皮细胞有丝***原，是目前所知作用最强的促血管生长因子和增加血管通透性的因子，主要与血管内皮细胞受体结合促进内皮细胞的***增殖、迁移和血管重建的作用。因此，血管内皮生长因子受体2(VEFGR2)作为其受体之一，作为新生血管生成的肿瘤治疗的靶点。VEGFR2是由1357个氨基酸残基组成，150kDa的跨膜糖蛋白受体酪氨酸激酶，定位于细胞膜，具有胞外配体结合区，单跨膜区和胞内酪氨酸激酶活性区。VEFGR2高表达于实体瘤表面丰富的内皮血管上，对于肿瘤的侵袭、转移以及肿瘤新生血管的形成起重要作用，直接导致及参与了肿瘤细胞浸润与穿透基底膜发生转移的过程。

目前，针对VEFGR2的靶向诊断和治疗药物主要是抗体药物。虽然其具有特异靶向性，但也存在着制备繁琐，稳定性差，费用昂贵，穿透力弱等缺点。因此，为了提高对肿瘤转移诊断和治疗的特异性和准确性，弥补抗体的缺陷，迫切需要寻求针对VEGFR2设计小分子探针，以作为检测和治疗癌症的有效方法。

相比于抗体，多肽易于大量合成，分子量小，成本低，生物相容性好，此外，多肽由氨基酸作为基本单元，氨基酸排列组合的多样性决定了多肽在序列、构象、功能上千差万别。而且，多肽易被化学改性调整其亲和力、电荷、亲疏水性、稳定性和溶解性。这些特征使得多肽类药物及诊断探针在肿瘤靶向给药、癌症诊断等方面彰显出很强的优越性，甚至显示了替代抗体类诊疗试剂的趋势。因此，利用这些特性，高通量的在多肽文库中筛选出具有pH响应且具有特异靶向性的多肽，继而发展成为癌症诊断，肿瘤靶向治疗药物，成为现在面临的重要任务。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供pH响应且特异靶向人肿瘤血管标记物VEGFR2的多肽和该多肽所衍生的且能与VEGFR2蛋白结合的产品以及上述多肽或其衍生的产品在制备抗肿瘤药物或显像制剂中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明首先提供一种pH响应且特异靶向人肿瘤血管标记物VEGFR2的多肽，所述多肽的氨基酸序列通式为：

CX₁X₂DX₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁LSX₁₂GM

其中，C为半胱氨酸；X₁是亲水性氨基酸，优选为丝氨酸或谷氨酸；X₂是亲水性氨基酸，优选为赖氨酸或天冬氨酸；D为天冬氨酸；X₃是中性或亲水性氨基酸，优选为亮氨酸或谷氨酸；X₄是酸性氨基酸或非极性氨基酸，优选为谷氨酸或者脯氨酸；X₅是芳香族氨基酸，优选为色氨酸；X₆是碱性氨基酸，优选为组氨酸；X₇是碱性或者酸性氨基酸，优选为赖氨酸或者谷氨酸；X₈是中性氨基酸，优选为天冬酰胺或苏氨酸；X₉是中性或芳香族氨基酸，优选为天冬酰胺或酪氨酸；X₁₀是芳香族或者中性氨基酸，优选为苯丙氨酸或丝氨酸；X₁₁为非极性氨基酸，优选为脯氨酸；L为亮氨酸；S为丝氨酸；X₁₂为非极性氨基酸，优选为脯氨酸和苯丙氨酸；G为甘氨酸；M为甲硫氨酸。

本发明所述的多肽与肿瘤细胞表面血管标记物VEGFR2结合力强，并具有良好的特异性。

作为优选，当X₁为丝氨酸的时候，X₂为赖氨酸或天冬氨酸，X₃为谷氨酸，X₄为谷氨酸，X₅为色氨酸，X₆为组氨酸，X₇为赖氨酸或谷氨酸，X₈为天冬酰胺或苏氨酸，X₉天冬酰胺或酪氨酸，X₁₀为苯丙氨酸或丝氨酸，X₁₁为脯氨酸，X₁₂为脯氨酸或苯丙氨酸；

当X₂为赖氨酸的时候，X₁为谷氨酸或丝氨酸，X₃为谷氨酸，X₄为谷氨酸，X₅为色氨酸，X₆为组氨酸，X₇为赖氨酸或谷氨酸，X₈为苏氨酸，X₉天冬酰胺，X₁₀为丝氨酸或苯丙氨酸，X₁₁为脯氨酸，X₁₂为苯丙氨酸或脯氨酸。

这样设计的优势在于使得X₃，X₄能结合序列中固定的天冬氨酸在酸性环境中形成α螺旋结构,使得多肽具有细胞渗透功能。

本发明在上述基础上提供一个优选的多肽，其氨基酸序列为CSKDEEWHKNNFPLSPGM(SEQ ID No.1)。其不仅具有特异性靶向VEGFR2蛋白的功能，而且具有最佳的pH响应功能，利于多肽分子在肿瘤微酸环境下特异性识别肿瘤血管标记物，从而识别肿瘤位点。

本发明所述的多肽还含有取代基，所述取代基为烷氧基、烷酰基或酰胺基。

进一步地，组成所述多肽的氨基酸残基为L型和/或D型。优选的，所述的氨基酸残基为L型。

本发明进一步提供了由前述多肽形成的二价体/多价体。

所述的二价体/多价体具有靶向VEGFR2内皮血管细胞的特性，及靶向肿瘤细胞表面血管标记物VEGFR2蛋白的特性。

可选的，所述的二价体/多价体是通过连接分子共价连接形成的。

可选的，所述的二价体/多价体是通过与多聚体混合，非共价连接形成的。

所述多聚体可以根据具体目的进行选择，例如可以是聚乙二醇(PEG)或环糊精等。

本发明还提供了一种药物组合物，其包含能杀伤癌细胞的制剂和前述多肽和/或前述二价体/多价体。

进一步地，所述的多肽、二价体/多价体作为靶向多肽，与能杀伤癌细胞的制剂相缀合或混合。

例如，所述的制剂为能杀伤癌细胞的化学药物、生物药物、纳米药物、放射性药物、光热治疗或光动力治疗药物或包裹这些药物的载体中的任意一种。

进一步地，所述的制剂为烷化剂、抗代谢药物、抗肿瘤天然药物、抗肿瘤抗生素、激素、金属络合物或肿瘤放射靶向标记物中的任意一种。

本发明所述的多肽、二价体/多价体可以使缀合后生成的药物组合物在机体内更稳定地被运输到靶细胞。

本发明涉及的多肽、二价体/多价体也可以和油性化合物或多种油性化合物的混合物相混合，本发明所述的多肽、二价体/多价体也可以使所得到的混合物在机体内更稳定地被运输到靶细胞。

优选地，所述载体为纳米材料，脂质体或油性化合物中的任意一种，或者由多种油性化合物所组成的混合物。

本发明所述的多肽、二价体/多价体具有靶向VEFGR2蛋白的作用，可以作为靶头增加药物或载有药物的载体如纳米材料、脂质体等在VEGFR2阳性细胞中的含量，再添加药学上可接受的辅料或佐剂制成新型的更有效的靶向抗癌药物。

本发明还提供了一种显像制剂，其包含显像剂和前述多肽和/或前述二价体/多价体。

所述的多肽、二价体/多价体与显像制剂相缀合或混合。

优选地，所述的显像剂为放射性核素、放射性核素标记物或分子影像制剂中的任意一种。

本发明还提供了一种多肽偶联物，所述多肽偶联物由前述多肽与载体偶联获得；所述载体为药物、毒素、细胞因子、放射性元素、载体蛋白、抗体、酶、凝集素、荧光基团、量子点或高吸光系数发色团。

所述载体可以根据具体的目的进行选择，例如，载体可以为药物或细胞因子等，可将药物或细胞因子靶向癌细胞，也可用放射性元素、载体蛋白、抗体、酶、凝集素、荧光基团、量子点活高吸光系数发色团作为载体。

作为优选，所述载体为抗体或荧光基团；更为优选，所述抗体为藻红蛋白标记的抗人源VEGFR2抗体；所述荧光基团为异硫氰酸荧光素。

本发明还进一步提供了一种用于检测人固体肿瘤表面血管细胞或者血管内皮细胞生长因子受体2蛋白的试剂盒，其包含前述多肽或前述多肽偶联物。

本发明还提供了前述多肽或二价体/多价体在制备用于治疗、预防或诊断癌症的药物或显像制剂中的应用。

进一步地，所述癌症为肿瘤表面血管VEFGR2蛋白过表达的癌症。例如，所述癌症为乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、卵巢癌或肾癌中的任意一种。

此外，本发明通过实验验证了所述多肽具有pH响应性，可以在酸性条件下特异性识别VEGFR2蛋白。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种pH响应且特异靶向人肿瘤血管标记物VEGFR2的多肽和该多肽所衍生的且能与VEGFR2蛋白结合的产品以及上述多肽或其衍生的产品在制备抗肿瘤药物或显像制剂中的应用。

本发明所述多肽能对VEGFR2阳性细胞起靶向作用，具有pH响应，选择性强，可以作为靶头增加药物或载有药物的载体如纳米材料、脂质体等在VEGFR2阳性细胞中的含量，再添加药学上可接受的辅料或佐剂制成新型的更有效的靶向抗癌药物。

且本发明提供的多肽易被化学改性调整其亲和力、电荷、亲疏水性、稳定性和溶解性，还可以采用化学合成的方法制备得到，纯度高，分子量小，特异性强，无免疫原性，安全可靠。弥补了现有技术中抗体药物制备繁琐，稳定性差，费用昂贵，穿透力弱等缺点。

附图说明

图1为筛选VEGFR2靶向多肽的肽库构建化学式示意图。

图2为筛选VEGFR2靶向多肽原理示意图。

图3为表面等离子共振成像(SPRi)方法检测STP在pH 7.4和pH5.8环境下分别对VEGFR2蛋白的结合作用。

图4为STP在pH5.8环境下特异性识别人内皮血管细胞系HUVEC表面的VEGFR2蛋白位点。

其中：

图4-(a)～(d)是STP在pH5.8环境下与VEGFR2阳性细胞HUVEC表面的VEGFR2蛋白特异性结合，图4-(e)～(h)是STP在pH5.8环境下STP与VEGFR2阴性细胞293T无结合。

图4-(i)～(l)是对照肽TP在pH7.4环境下与VEGFR2阳性细胞HUVEC表面的VEGFR2蛋白特异性结合，图4-(m)～(p)是对照肽TP在pH 7.4环境下与VEGFR2阴性细胞293T无结合。

图4-(a)，(e)，(i)，(m)是带FITC的多肽与细胞结合的荧光图。图4-(b)，(f)，(j)，(n)是抗体与细胞结合的荧光图。图4-(c)，(g)，(k)，(o)是前两次荧光叠加的图。图4-(d)，(h)，(l)，(p)是明场图。

图5为STP分别在pH7.4和pH5.8环境下分别与VEGFR2阳性细胞HUVEC的特异性结合。

其中，图5-(a)～(d)是STP在pH7.4环境下与HUVEC无结合，图5-(e)～(h)是STP在pH 5.8环境下与HUVEC特异性结合。

图5-(i)～(l)和图5-(m)～(p)是对照肽TP在pH7.4和pH5.8环境下分别与VEGFR2阳性细胞HUVEC表面的VEGFR2蛋白特异性结合。

图5-(a)，(e)，(i)，(m)是带FITC的多肽荧光图。图5-(b)，(f)，(j)，(n)是带FITC的多肽与细胞结合的荧光图。图-5(c)，(g)，(k)，(o)是图5-(b)，(f)，(j)，(n)再与明场叠加的图。图5-(d)，(h)，(l)，(p)是荧光强度定量图。

图6为动态细胞验证在pH5.8环境下STP的细胞穿透性。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1多肽文库的构建与APN靶向多肽的筛选

1.实验仪器与材料

N，N二甲基甲酰胺(DMF)，二氯甲烷(DCM)，N-甲基吗啉(NMM)，茚三酮，维生素C，苯酚，四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，六氢吡啶，哌啶，三氟乙酸(TFA)，三异丙基硅烷(TIS)，乙二硫醇(EDT)，无水***，树脂，甲醇，各种Fmoc保护氨基酸，多肽合成管，摇床，真空水泵，旋转蒸发仪，上述试剂和材料均从商业途径获得。

2.溶剂配制

脱保护溶剂——六氢吡啶：N，N二甲基甲酰胺＝1：4

反应液——N-甲基吗啉:N，N二甲基甲酰胺＝1：24

裂解液——三氟乙酸(92.5％)、三异丙基硅烷(2.5％)、乙二硫醇(2.5％)、超纯水(2.5％)。

茚三酮测试液——茚三酮：维生素C：苯酚＝1：1：1

3.“一珠一物”多肽文库的合成

采用Fmoc固相肽合成方法合成多肽文库，筛选VEGFR2靶向多肽的肽库所构建的化学式如图1所示，原理如图2所示。具体方法为通过混合裂分的方式将氨基酸随机地逐个偶联到固相树脂上，然后在强酸下将侧链保护基团去除，进而进行筛选。

称取900mg的Tentagel-NH₂树脂，按照上述固相多肽合成程序循环，依次加入650mg Met及等量的HBTU，520mg Gly及等量的HTBU依次进行反应。待反应完成后，把树脂均分成2份，在其中一个管中加入295mg Pro及等量的HTBU，另一个管中加入340mg Phe及等量的HTBU分别进行偶联，待偶联完毕后，把2管树脂混合，脱保护，清洗。加入1g Ser及等量的HBTU，620mg Leu及等量的HBTU依次进行反应两个循环。待反应完成后，把树脂均分为2份，在其中一个管中加入455mg Pro及等量的HTBU，另一个管中加入620mg Tyr及等量的HTBU分别进行偶联，待偶联完毕后，把2管树脂混合，脱保护，清洗。再把树脂均分为3份，向每管分别加入356mg Thr，347mg Phe，510mg Ser与等量的HTBU进行偶联，待偶联完毕后，把3管树脂混合，脱保护，清洗。再把树脂均分为3份，向每管分别加入537mg Asn，413mg Tyr，510mgSer与等量的HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把3管树脂混合，脱保护，清洗。再把树脂均分为2份，向每管分别加入535mg Thr，805mg Asn与等量的HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把2管树脂混合，脱保护，清洗。再把树脂均分为5份，向每管分别加入254mg Lys，214mg Arg，230mgGlu，190mg Leu，306mg Ser与等量的HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把5管树脂混合，脱保护，清洗。再把树脂均分为3份，向每管分别加入356mg Arg，423mg Lys，560mg His与等量的HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把3管树脂混合，脱保护，清洗。再把树脂均分为2份，向每管分别加入710mg Trp，475mg Leu与等量的HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把2管树脂混合，脱保护，清洗。再把树脂均分为5份，向每管分别加入230mg Glu，214mg Arg，222mg Asp，182mg Pro，214mg Thr与等量的HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把5管树脂混合，脱保护，清洗。再把树脂均分为5份，向每管分别加入322mg Asn，330mg His，334mg Glu，190mg Leu，248mg Tyr与等量的HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把5管树脂混合，脱保护，清洗。再加入1.11g Asp与等量的HBTU进行偶联，待偶联完毕后，脱保护，清洗。再把树脂均分为5份，向每管分别加入190mg Ile，254mg Lys，220mg Asp，182mg Pro，306mg Ser与等量的HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把5管树脂混合，脱保护，清洗。再把树脂均分为4份，向每管分别加入382mg Ser，287mg Glu，237mg Leu，267mg Thr与等量的HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把4管树脂混合，脱保护，清洗。最后向管仲加入1.12g Cys与等量的HBTU进行偶联，待偶联完毕后，脱保护，清洗。

向上述树脂中裂解液，脱出侧链保护基团，真空抽干，得到加载有肽库的干燥树脂备用。

4.与VEGFR2特异性结合的多肽的筛选

用1×PBS把多肽文库中的肽珠清洗3次；用5％的脱脂牛奶在混旋仪上对肽珠混合封闭(37℃，2h)；再用1×PBS清洗3次，然后用生物素标记的VEGFR2蛋白与肽库珠在混旋仪上37℃混合孵育2h，用PBS清洗3次，把孵育后的多肽库置1.5mL EP管中，把EP管置于磁力架上。阳性多肽受磁力影响吸附于EP管侧壁，而阴性多肽由于重力沉降在EP管底。阳性微珠与生物素标记的受体蛋白孵育后，阳性肽珠特异性识别蛋白，链霉亲和素标记的磁珠通过识别生物素而识别阳性肽珠。阳性肽珠表面将包覆一层磁珠从而具有磁性从而被磁场捕获，相互作用如图2所示。

用移液枪把EP管底部的肽珠转移到另一个EP管中。将经磁场分选出的肽珠逐个挑出，拨入整合芯片的微阵列芯片上，采用溴化氢原位裂解，经MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)鉴定获得相应序列信息，按序列重新合成部分标记FITC，MALDI-TOF鉴定和HPLC纯化用于后续试验。

经化学合成制得本发明的多肽序列为：STP：CSKDEEWHKNNFPLSPGM。

实验例1通过表面等离子共振成像(SPRi)方法检测多肽与VEGFR2蛋白的亲和作用

在芯片原位裂解的同时，在上面放置SPR芯片，将多肽打印到芯片上，在4℃湿润条件下孵育过夜，然后用10×PBS清洗10min，再用1×PBS清洗10min，最后用去离子水清洗2次，每次10min，浸入含5％牛奶的1×PBS中，4℃条件下孵育过夜，然后用10×PBS清洗10min，1×PBS清洗10min，最后用去离子水清洗2次，每次10min，用氮气吹干，装芯片上机(Plexera HT表面等离子共振成像***)。

流动相依次通过1×PBS、2×PBS、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL的VEGFR2纯化蛋白，记录分析SPRi信号。

将PBS的pH用盐酸调成5.8，重复上述步骤。

由图3可以看出，STP的SPRi信号随着VEGFR2蛋白浓度的增加而逐渐增强，说明本发明的多肽在pH5.8情况下对VEGFR2有强结合，可以作为靶向VEGFR2的多肽用于相关的研究应用。

实验例2 STP在pH5.8环境下与VEGFR2的特异性相互作用

STP的异硫氰酸荧光素(FITC)偶联物采用固相合成方法获得，在重新合成的STP多肽微珠上继续偶联ε-氨基己酸。在吡啶/N，N二甲基甲酰胺/二氯甲烷比例为1:5:7的溶液中，将FITC与肽珠混合反应过夜。

经裂解液裂解后得到STP-FITC偶联物，对照肽TP按照上述方法与FITC偶联，获得TP-FITC偶联物作为对照。采用MALDI-TOF鉴定和HPLC纯化用于后续实验。

将人血管内皮细胞系HUVEC和人肾上皮细胞系293T分别培养于含10％胎牛血清的H-DMEM培养液中，以1×10⁵/mL的细胞浓度植入圆形玻底培养皿(Φ＝35mm)，37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24h后，弃去培养液，两种细胞中分别加入含有5μL抗体的200μL H-DMEM培养基中，避光4℃孵育2h后，弃去抗体溶液，加入含有1μmol/L Hoechst 33342的H-DMEM培养基，避光37℃孵育15min后，弃去溶液，加入1mg/mL pH5.8的多肽溶液200μL，避光4℃孵育10min后，弃去多肽溶液，并用预冷的pH5.8的H-DMEM培养基洗3次。对照肽采取同样的方法，在pH7.4环境下操作。

用激光共聚焦显微镜(ZEISS LSM 710，德国)检测细胞中的荧光分布。结果如图4所示，在pH5.8环境下加入STP的HUVEC细胞可以观测到明显的荧光，抗体也特异性结合在HUVEC细胞表面，而293T细胞表面没有荧光。在pH7.4环境下，加入对照肽TP的HUVEC细胞可以观测到明显的荧光，抗体也特异性结合在HUVEC细胞表面，而293T细胞表面没有荧光。同时利用Hoechst 33342(一种显示细胞核的蓝色荧光染料)进行核定位，结果表明在10min时，STP和TP多肽结合在HUVEC细胞的细胞膜上，这与VEGFR2表达部位相同。

上述结果说明，STP-FITC与HUVEC的识别是序列专一性，STP-FITC与高表达VEGFR2的HUVEC细胞是特异性结合，而对VEGFR2阴性的293T细胞则没有特异性结合。

实验例3 STP与VEGFR2的pH响应相互作用

人血管内皮细胞系HUVEC培养于含10％胎牛血清的H-DMEM培养液中，以1×10⁵/mL的细胞浓度植入圆形玻底培养皿(Φ＝35mm)，37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24h后，弃去培养液。加入含有1μmol/L Hoechst 33342的H-DMEM培养基，避光37℃孵育15min后，弃去溶液，加入1mg/mL pH7.4的多肽溶液200μL，避光4℃孵育10min后，弃去多肽溶液，并用预冷的pH7.4的H-DMEM培养基洗3次。重复操作在pH5.8环境下。对照肽采取同样的方法，分别在pH7.4和pH5.8环境下操作。

用激光共聚焦显微镜(ZEISS LSM 710，德国)检测细胞中的荧光分布。结果如图5所示，在pH5.8环境下加入STP的HUVEC细胞可以观测到明显的荧光，而在pH7.4环境下加入STP的HUVEC细胞没有荧光。对照肽TP在两种环境下均显示出了荧光，但是在pH7.4环境下荧光强度更较强。

上述结果说明，STP-FITC具有pH响应性，可以在酸性条件下特异性识别VEGFR2蛋白。

实验例4动态细胞验证在pH5.8环境下STP的细胞穿透性

人血管内皮细胞系HUVEC培养于含10％胎牛血清的H-DMEM培养液中，以1×10⁵/mL的细胞浓度植入圆形玻底培养皿(Φ＝35mm)，37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24h后，弃去培养液。加入含有1μmol/L Hoechst 33342的H-DMEM培养基，避光37℃孵育15min后，弃去溶液，加入1mg/mL pH 5.8的多肽溶液200μL，避光4℃分别孵育0min，5min，10min，15min，20min后，弃去多肽溶液，并用预冷的pH5.8的H-DMEM培养基洗3次。对照肽采取同样的方法，在pH5.8环境下操作。

用激光共聚焦显微镜(ZEISS LSM 710，德国)检测细胞中的荧光分布。结果如图6所示，在pH5.8环境下，随着时间的增加，多肽开始结合在细胞膜表面，15min之后，STP-FITC逐渐进入细胞质中，在20min时入胞情况更加明显。对照肽在同样的条件下并没有显示出入胞的情况。

上述结果说明，STP-FITC不仅具有VEGFR2靶向性，而且具有pH响应性，可以在酸性条件下缓慢进入细胞内部。

从实验例1-4可以得出，本发明的多肽不仅具有靶向VEGFR2蛋白阳性肿瘤细胞表面血管的特性，而且具有pH响应性，可以在酸性条件下缓慢进入细胞内部。因而在实际应用中，可以将本发明的多肽作为靶向多肽，与能杀伤癌细胞的制剂相缀合或混合，用于肿瘤的靶向治疗。

实施例2二价体/多价体制备及其功能验证

以Fmoc-Lys(Fmoc)-OH为起点制备四价体，首先将赖氨酸进行脱保护10min,真空抽滤，分别用N，N二甲基甲酰胺，二氯甲烷清洗三遍，加入Fmoc-Lys(Fmoc)-OH进行偶联，偶联结束后，脱保护，清洗。再一次加入一定数量的Pro，Ser，Leu，Pro，Phe，Asn，Asn，Lys，His，Trp，Glu，Glu，Asp，Lys，Ser，Cys及等量的HTBU依次进行反应。偶联反应结束后，进行脱保护，清洗。再避光偶联FITC荧光染料，脱保护，清洗。最后向上述树脂中裂解液，脱出侧链保护基团，真空抽干，得到四价体多肽。

进行细胞实验验证其功能，将人血管内皮细胞系HUVEC和人肾上皮细胞系293T分别培养于含10％胎牛血清的H-DMEM培养液中，以1×10⁵/mL的细胞浓度植入圆形玻底培养皿(Φ＝35mm)，37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24h后，弃去培养液，两种细胞中分别加入含有1μmol/L Hoechst 33342的H-DMEM培养基，避光37℃孵育15min后，弃去溶液，加入1mg/mL的多肽溶液200μL，避光4℃孵育10min后，弃去多肽溶液，并用预冷的H-DMEM培养基洗3次。

实施例3显像制剂的制备

称取300mg的wang-Gly树脂，按照固相多肽合成程序循环，依次加入300mg Pro,510mg Ser，320mg Leu，300mg Pro，350mg Phe，540mg Asn，540mg Asn，420mg Lys，560mgHis，470mg Trp，380mg Glu，380mg Glu，370mg Asp，420mg Lys，510mg Ser及等量的HTBU依次进行反应。偶联反应结束后，脱保护，清洗。加入Acp进行反应，偶联结束后，脱保护，清洗。加入FITC进行避光偶联反应，反应结束后，脱保护，清洗。最后向上述树脂中裂解液，脱出侧链保护基团，真空抽干，得到粗品多肽荧光偶联物，再进行HPLC纯化，得到纯度达95％的多肽显像制剂，可用于细胞和动物成像。

实施例4多肽偶联物制备

以多肽荧光偶联物制备为例，称取300mg的wang-Gly树脂，按照固相多肽合成程序循环，依次加入300mg Pro,510mg Ser，320mg Leu，300mg Pro，350mg Phe，540mg Asn，540mg Asn，420mg Lys，560mg His，470mg Trp，380mg Glu，380mg Glu，370mg Asp，420mgLys，510mg Ser及等量的HTBU依次进行反应。偶联反应结束后，脱保护，清洗。继续加入ε-氨基己酸进行反应，在吡啶/N，N二甲基甲酰胺/二氯甲烷比例为1:5:7的溶液中，将FITC与肽珠混合反应过夜。反应结束后，脱保护，清洗。最后向上述树脂中裂解液，脱出侧链保护基团，真空抽干，得到粗品多肽荧光偶联物。

实施例5试剂盒的制备

多肽异硫氰酸荧光素(FITC)偶联物采用固相合成方法获得，在重新合成的多肽微珠上继续偶联ε-氨基己酸。在吡啶/N，N二甲基甲酰胺/二氯甲烷比例为1:5:7的溶液中，将FITC与肽珠混合反应过夜。经裂解液裂解后得到多肽FITC偶联物，采用MALDI-TOF鉴定和HPLC纯化用于后续实验。

将人血管内皮细胞系HUVEC和人肾上皮细胞系293T分别培养于含10％胎牛血清的H-DMEM培养液中，以1×10⁵/mL的细胞浓度植入圆形玻底培养皿(Φ＝35mm)，37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24h后，弃去培养液，两种细胞中分别加入含有5μL抗体的200μL H-DMEM培养基中，避光4℃孵育2h后，弃去抗体溶液，加入含有1μmol/L Hoechst 33342的H-DMEM培养基，避光37℃孵育15min后，弃去溶液，加入1mg/mL的多肽溶液200μL，避光4℃孵育10min后，弃去多肽溶液，并用预冷的H-DMEM培养基洗3次。即可进行细胞成像实验。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种pH响应且特异靶向人肿瘤血管标记物VEGFR2的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为CSKDEEWHKNNFPLSPGM。

2.由权利要求1所述的多肽形成的二价体/多价体，其特征在于，所述二价体/多价体为所述多肽通过连接分子共价连接或通过与多聚体混合，非共价连接形成的。

3.一种药物组合物，其特征在于，包含能杀伤癌细胞的制剂和权利要求1所述的多肽和/或权利要求2所述的二价体/多价体。

4.一种显像制剂，其特征在于，包含显像剂和权利要求1所述的多肽和/或权利要求2所述的二价体/多价体。

5.一种多肽偶联物，其特征在于，所述多肽偶联物由权利要求1所述的多肽与载体偶联获得；所述载体为毒素、细胞因子、放射性元素、载体蛋白、抗体、酶、凝集素、荧光基团、量子点或高吸光系数发色团。

6.根据权利要求5所述的多肽偶联物，其特征在于，所述载体为抗体或荧光基团。

7.根据权利要求6所述的多肽偶联物，其特征在于，所述抗体为藻红蛋白标记的抗人源VEGFR2抗体；所述荧光基团为异硫氰酸荧光素。

8.一种用于检测人固体肿瘤表面血管细胞或者血管内皮细胞生长因子受体2蛋白的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的多肽或权利要求5-7任一项所述的多肽偶联物。

9.权利要求1所述的多肽或权利要求2所述的二价体/多价体在制备用于治疗、预防或诊断癌症的药物或显像制剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述癌症为肿瘤表面血管VEFGR2蛋白过表达的癌症。